PENDAHULUANKolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang
panjangnya antara 3 15 cm dan pada dinding bagian dalam kadang
kadang dilapisi dengan material inert seperti kaca atau PEEK Kolom
bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge atau terbuat
dari stainless steel Dimensi: diameter dalam 2-5 mm dan panjang
10-30 cm. Kolom dapat dibeli sudah termasuk bahan isiannya, tapi
juga dapat dibeli dalam keadaan kosong lalu diisi sendiri.
LATAR BELAKANGKolom pada HPLC merupakan bagian yang sangat
penting sebab pemisahan komponen - komponen sampel akan terjadi di
dalam kolom.Pemilihan kolom pada HPLC merupakan langkah yang
pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Kolom adalah
jantung kromatografi, Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang
sesuaiKetepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap
performa kromatogramOleh karena itu ada beberapa hal yang harus
diperhatikan :1. Pemilihan kolom yang sesuai2. Pemeliharaan kolom3.
Uji terhadap spesifikasi kolom( walaupun kolom tersebut merupakan
kolom yamg siap dipakai)Kolom akan menjadi penentu keberhasilan
pemisahan komponen sampel serta hasil akhir analisis dengan
HPLC,itulah sebabnya mengapa makalah ini dibuat
ISI / PEMBAHASANKolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :1.
Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.2. Kolom
preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm.Kolom biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur yang lebih
tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi
eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang
digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid
Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution
Chromatography (EC)Ada 2 jenis kolom padaHPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagianHPLC yang
mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding
dengan kolom konvensional, yakni: Konsumsi fase gerak kolom
mikrobor hanya 80 % atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak
lebih lambat (10 -100 l / menit). Adanya aliran fase gerak yang
lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan
karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis
rutin.Kebanyakan fase diam padaHPLC berupa silika yang dimodifikasi
secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional
yang lain.Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang
tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
Jenis-jenis kolom HPLCNama kolomJenis adsorbanUltrasil-SiSiO2
(silika)Ultrasil-octyl Octana (C8)Ultrasil-ODSOctadecana
(C-18)LiChrosorb SiSiO2 (silika)LiChrosorb RP-2Etana
(C-2)LiChrosorb RP-8Octana (C8)LiChrosorb RP-18Octadecana
(C-18)LiChrosorb NH2Amina LiChrosorb CNCyanoBentuk Partikel
Spherical atau irregularPartikel spherical mengurangi tekanan dan
kolom lebih awet
Ukuran Partikel Umumnya 3-10mMakin kecil ukuran partikel, makin
tinggi efisiensi
Ukuran Pori-pori Bervariasi antara 60-10,000 Makin besar
pori-pori analit molekul besar dapat tertahan lebih lama. Pilih 150
untuk sampel BM 2000.
KOLOM MONOLITIKBatangan silika monolitik Kecepatan alir dapat
ditingkatkan dengan resolusi yang baik, t analisis cepat. Boros
eluen
Pori-pori besar kecepatan alir dapat ditingkatkan waktu analisis
makin cepat
High Pure Silica Spherical particles Almost no metal impurities
(< 5 ppm) Excellent peak symmetry Extended stability: pH range
1.5 to 10.5
irregular
spherical
monolithik
Kolom analitik 5 30 cm, 4 10 mm, paking dengan 3 10 cm, N =
40.000 60.000 plat / meter.
jenis : C18, C8, sianopropil, penukar iondibuat dari CH3 CH3Cl
Si R+ Si-OH + Si O Si R CH3 CH3
Kolom pengaman/guard kolom: 5 cm, 4 6 mm, partikel > dari a
FUNGSI :Menyaring kotoranMenjenuhkan fasa diam
BAHAN ISIANBahan isian kolom biasanya terbuat dari silika, untuk
tujuan tertentu kadang-kadang digunakan polymeric gelatau
resin.
Kolom pada HPLC dibuat lurus ( tidak dibuat melingkar
sebagaimana kolom pada kromatografi gas ataupun bentuk U ) Hal ini
dimaksudkan untuk efisiensi kolom