KLT DENSITOMETER

Insert workgrouplogo on slide master

Insert workgroup name on slide master

Projects

Documents

Team

Links

What’s New

Home

KLT DENSITOMETER

ny Guntarti

FARMASI

2013



Projects

Documents

Team

Links

What’s New

Home

Kromatografi kertas



Projects

Documents

Team

Links

What’s New

Home

Kromatografi lapis tipis

KLT DENSITOMETER

Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT

Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.

Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

Teknik penggunaannya :

- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),

- Sinar yang diserap dan dipantulkan

- Atau sinar yang dipendarkan.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

555

666

Pada era perkembangan teknik kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph Scanner" yang lebih populer dengan nama densitometer makin banyak dipakai .

lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan

noda pada KLT secara : Absorpsi Transmisi Pantulan (refleksi) pendar fluor Pemadaman pendar fluor

777

Sumber Radiasi

• Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm.

• Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada daerah ultra violet dan lampu tungstein pengukuran pada daerah sinar tampak.

• Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi.

• Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang maksimal.

•

8

• Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal.

• Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi

• Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

9

Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.

S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT.

101010

Lanjutan• Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area

noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-zag" menyeluruh.

• Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati

parabola

111111

Kurva hubungan serapan dan kadar• Persamaan Kubelka-Munk • Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area

kromatogram tidak merupakan garis lurus.

• Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan:

• direfleksikan (Is)

• diserap oleh analit lapisan tipis (I)

• diteruskan (It).

• I=10 + Is + It121212

Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai :

Is = I. E

Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :

I0 =I-Is

I0=I-I.E=(I-E)I

Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri.

It =I0. e-KX

131313

E = koefisien permukaan lapis tipis

↓

Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt

x = tebal medium lapis tipis

k = koefisien absorbsi

e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density”

↓

Parameter S (koef. Penghamburan)

It =I0. e-KX

Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter :

K (koefisien absorbsi) S (koefisien penghamburan).

Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam.

151515

Parameter S (koef. Penghamburan)

Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipisSx = tiap pelat berbeda harganya = 0 -10

dldx = + (S + K ) I + Sj-

= - (S + K ) I + Sj

dldx+

I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak lurus menuju permukaan lapis tipis

j = radiasi elektromagnetik yang arahnya meninggalkan permukaan lapis tipis

S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

Pernyataan Kubelkan – Munk :

E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit pada pelat KLTC = kadar analitR = cahaya terpantul pada permukaan lempang

↓Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan

sebagai kurva parabola :A2 = f ( C )

log A = f ( log C )

( I – R )2

2R= E x C

S

Bagan Alat densitometer Gambar

191919

PM

Lempeng

T

S

Mk

PM

IIII

( a )

S

Mk

PM

PSPM

Lempeng( b )

Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

• Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan integrator.

• Integrator dengan sistem mikrokomputer secara langsung dapat menghitung luas puncak atau tinggi puncak secara otomatik. Selain itu mencatat nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y atau waktu retensinya.

• Letak sumbu Y dan X dari lempeng akan mempengaruhi hasil yang diperoleh.

• Kalau Y disesuaikan dengan arah gerak eluen dan sumbuk X tegak lurus padanya atau merupakan deretan penotolan sampel pada lempeng. Dengan cara itu mereka akan mendekati kepastian.

222222

Cara kerja pelacakan bercak Densitometer• Gambar

232323

Cara Kerja DensitometerLempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak.

• Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat

kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer.

• Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan

secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan scanning lebih dulu.

242424

Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :

A. Cara memanjang Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga

bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat semetris.

B. Sistem zig-zag Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu

Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-X2.

252525

• Pelacakan bercak,

• Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner• (a) Model zig-zag. ( b). model lurus

Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak terkecil.

• Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus.

262626

• Keterangan tambahan• Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar

dari garis tengah bercak agar semua bercak teruji.

• Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1 sampai dengan 3.

• Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng terhadap arah scanning, (lihat panah) sesuai garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X.

272727

• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentase yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar).

• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak.

• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk mengumpul ditengah lebih banyak.

282828

Analisis Kualitatif

• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi.

• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji.

292929

`

Cara Menyari/ekstrasi

Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya.

Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring.

Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer.

30

• Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya.

• Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif segala caranya,

31

Gambar Chamber yang banyak digunakan

Chamber

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC)

32

*Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring.*Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap.*Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh

33

Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif

Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)

Lempeng

34

ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

Penotolan

36

37

JALANNYA SINAR (OTIK)

39

HASIL SCANNING SATU BERCAK

Scanning senyawa yang berbeda

Digunakan metode: Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya. Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang

dapat dimiliki oleh semua senyawa.

Hasil Rekaman Hasil

Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

45

Scanning serentak beberap puncak/bercak

46

MENGHITUNG WAKTU RETENSI

Rf = a/c (cm)

b/c (cm)

Contoh 1 Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam :

seluluse F, Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993).

Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat dibawah sinar UV, 366 nm

1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),

2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)

3. Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu) 494949

OH O OH

OH

O

H3C CH3

N

CH3H3C

OH

C

O

NH3

78

910

6

11

5

12

43

21

D C B A

Tetrasiklin C22H24N2O8 sda

Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl 7-Cl

Oksitetrasiklin C22H24N2O9 5-OH

Penjelasan Tetrasiklin

• Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila digunakan silika gel GF.

• Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks dengan Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna.

• Bila digunakan selulusa sebagai fase diam, terdapat batas kelarutan dalam selulusa, dan terjadi ikatan hidrogen.

• Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding yang lain.

515151

Struktur kimia• Gambar

525252

• Contoh 2. Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel, fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan

amoniak 10% (65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)

Kromatogram zat warna lipstik1. Tartasin Rf =0, 12 (merah muda)2. Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)3. Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)4. Oranye I C, Rf=0,88 (putih)5. Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)

535353

Penjelasan Zat Warna• Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin

poncou, oranye I, kuning AB, kuning OB (paling kurang larut dalam air).

• Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin kurang larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut dalam pelarut organik. Tartrazin sifat base lebih kuat, dari pancou sehingga paling lambat migrasinya dalam suasana basa (amoniak 10%).

• Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml. Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya:

545454

Analisis Kuantitatif

• Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku pembanding, dan dibuat kurva regresi linier.

• Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami degradasi digunakan cara analisis dengan KLT

• Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas puncak (mV).

Data Kadar Luas puncak• 0,0 mcg 1,96 mV• 5 mcg 8,5468 mV• 10 mcg 13,6856 mV • 15 mcg 19,0454 mV• 20 mcg 23,9754 mV• 25 mcg 29,356 mV• 30 mcg 38,675 mV

53

Kurva regresi linier normal

565656

Y= 2.396 X + 1.097

Aplikasi Garis regresi Persamaan kurva kromatogram yang didapat

pada pengamatan tetrasiklin mempunyai persamaan regresi linier sebagai berikut:

Y = 0,513 X + 1,487 , R- 0,9996 Contoh menghitung: Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV, Maka harga X : = (24,487-1,487): 0,513 = (23)70,513 =44,834 mcg/ ml

57

Untuk analisis kuantitatif zat watna tidak discanner tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol, dan diencerkan sampai 5,0 ml.

Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran harus optimal. Untuk membuat kurva baku diperlukan lempeng yang besar untuk elusi senyawa baku yang berbeda kadarnya.

58

Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif

Hasil penelitian Rhodamin a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)

No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil Uji

1 Kerupuk bunga (tersanjung)

Merah muda +

2 Kerupuk bawang Tidak merah muda -

3 Kerupuk ketela Merah muda +

4 Kerupuk rengginang ketan

Tidak merah muda -

5 Kerupuk rengginang beras

Tidak merah muda -

6 Kerupuk slondok Tidak merah muda +

7 Kerupuk unyil Merah muda +

8 Kerupuk taro Tidak merah muda -

9 Kerupuk lotek Tidak merah muda -

10 Kerupuk angin Tidak merah muda -

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan 366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nma. Kerupuk ketela

b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil

A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela: 1. Standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk ketela

Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt)

0,005 0,7092

0,015 0,8493

0,030 0,8582

0,060 2,8790

0,090 3,2248

0,120 4,5278

Replikasi Luas area (milivolt)

1 1,3010

2 1,0251

3 1,1926

4 1,4120

5 1,2412

6 1,0307

7 0,7282

B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga 1. Standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk bunga

Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)

0,005 0,4425

0,015 1,1420

0,030 1,5273

0,060 3,0667

0,090 4,2450

0,120 5,1967


1 2,1328

2 1,7314

3 1,2856

4 1,4730

5 1,0555

6 1,0966

7 0,6985

C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil 1. standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk unyil

Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)

0,005 0,4865

0,015 0,9649

0,030 1,3910

0,060 1,6812

0,090 2,1991

0,120 2,2197


1 0,5340

2 0,7687

3 0,5636

4 0,5116

5 0,5502

Kesimpulan penggunaan HPTLC

a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan menganalisis campuran senyawa antara 20 sampai 30 senyawa.

b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah dari HPLC.

c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng lebih banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan pereaksi warna.

d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari 10 menit, sedangkan HPLC mungkin lima menit sudah selesai.

e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.66