Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen Lymphom des Hundes THESE Zur Erlangung des Grades eines Philosophical Doctor -Ph.D.- im Fachgebiet Kleintierkrankheiten durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Katja Culmsee aus Köln Hannover 2004
143
Embed
Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Aus der Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim
malignen Lymphom des Hundes
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
Philosophical Doctor
-Ph.D.-
im Fachgebiet
Kleintierkrankheiten
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Katja Culmsee
aus Köln
Hannover 2004
2
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte
Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Univ.-Prof. Dr. I. Nolte
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik,
Universität Bremen
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. M. Reinacher, Institut für Veterinärpathologie,
Tabelle 1: Ergebnisse einiger in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien zur Wirksamkeit verschiedener Chemotherapieprotokolle bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden
Substanzen (Kurzname) n CR PR Remissionsdauer (Median) Ref.
ASP, CTX, VCR, MTX 59 90% 7% 132 Tage bei CR 1
77 75% 14% 180 Tage bei CR 2 CTX, VCR, Pred (COP)
20 70% 100 Tage bei CR 3
21 76% 206 Tage bei CR 3 DOX
37 59% 22% 151 Tage bei CR 4
VCR, CTX, DOX, Pred (COPA) 45 84% 7% 210 Tage bei CR 5
41 76% 12% 330 Tage bei CR 5
112 73% 25% 238 Tage bei CR 6 ASP, VCR, CTX, Dox, Pred (ACOPA)
34 94% - 214 Tage bei CR 7
ASP, VCR, CTX, CBL, DOX, MTX, Pred (Madison-Wisconsin)
55 84% 7% 252 Tage 8
Abkürzungen und Fußnoten ASP: L-Asparaginase 1 MACEWEN et al. 1981 DOX: Doxorubicin 2 COTTER 1983 CBL: Chlorambucil 3 CARTER et al. 1987 CR: komplette Remission 4 POSTORINO et al. 1989 CTX: Cyclophosphamid 5 STONE et al.1991 MTX: Methotrexat 6 GREENLEE et al. 1990 n: Patientenanzahl 7 MACEWEN et al. 1992 PR: partielle Remission 8 KELLER et al. 1993 Pred: Prednison Ref.: Referenzen VCR: Vincristin
15
Je nach verwendetem Chemotherapieprotokoll kann bei bis zu 90% der behandelten Patienten
ein Rückgang des Tumors erreicht werden (MACEWEN et al 1981; KELLER et al. 1993;
VALERIUS et al. 1997). Heilungen sind jedoch sehr selten (MADEWELL 1999).
Die Hälfte der Patienten entwickelt innerhalb der ersten sieben bis neun Monate nach
Therapiebeginn ein Tumorrezidiv (Tabelle 1). Bei einem Teil der Patienten, die ein Rezidiv
entwickeln, kann durch eine Wiederholung der Chemotherapie der Tumor zurückgedrängt
und eine erneute Remission induziert werden. Die Dauer der zweiten Remission ist zumeist
jedoch deutlich kürzer als die Dauer der ersten Remission. Die Lymphome werden
zunehmend gegen die eingesetzten Zytostatika resistent (ETTINGER 2003).
Durch Verwendung von Zytostatika, die nicht Bestandteil der ursprünglichen Chemotherapie
waren (sogenannte Rettungsprotokolle), können bestehende Zytostatikaresistenzen teilweise
umgangen werden (MADEWELL 1999). Bei fast allen bisher erprobten Rettungsprotokollen
liegen die Remissionsraten jedoch unter 50% (26-65%) und die mittlere Remissionsdauer
unter vier Monaten (61 bis 126 Tage) (VANVECHTEN et al. 1990; MOORE et al. 1994;
LUCROY et al. 1998; MOORE et al. 1999; RASSNICK et al. 2002).
Letztendlich entsteht bei fast allen Patienten nach einer unterschiedlichen Anzahl an
Remissionen eine Vielfachresistenz (multidrug resistance) des Tumors und die Patienten
versterben infolge der Lymhomerkrankung (VANVECHTEN et al. 1990). Die 1-Jahres- und
2-Jahres-Überlebensraten liegen bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen in der Regel
unter 45% bzw. 25% (ETTINGER 2003).
Die zellulären Mechanismen, die zur Ausprägung einer multidrug resistance (MDR) in vitro
führen, sind zahlreich. Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter
Zellmembranproteine und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle
einher (KARTNER et al. 1983). Zu den Zellmembranproteinen, die eine MDR vermitteln,
zählen u.a. das P-Glykoprotein und Mitglieder der Familie der Multidrug resistance-
associated proteins (MRPs). Aufgrund der großen Bedeutung der MDR für den Erfolg
chemotherapeutischer Behandlung wurden diese Proteine nach ihrer Erstbeschreibung in
zahlreichen Studien untersucht (RAPPA et al. 1999).
16
2.2 P-Glykoprotein
Der bisher am weitesten erforschte Mechanismus, der zur Ausprägung einer MDR führen
kann, ist die Expression eines 170 kDa schweren Zellmembranproteins, des sogenannten
P-Glykoproteins (KARTNER et al. 1983; UEDA et al. 1987b; SIKIC 1997). Das
P-Glykoprotein wurde erstmals 1976 von Victor Ling und Mitarbeitern in Colchicin-
resistenten Ovarzelllinien von Hamstern beschrieben (JULIANO u. LING 1976). Es gehört
zur Familie der ABC (adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette) Transporterproteine
und ist eine ATP-abhängige Efflux-Pumpe, welche die Substratmoleküle aus dem Zytoplasma
hinauspumpt und sie damit wirkungslos macht (OBST 2000; DEAN et al. 2001). Substrate für
das P-Glykoprotein sind zahlreiche Substanzen, darunter verschiedene hydrophobe
Zytostatika (Tabelle 2).
Tabelle 2: Zytostatika, die beim Menschen durch das P-Glykoprotein transportiert werden (modifiziert nach GOLDSTEIN 1996)
Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind
weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz
vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die
Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist
weitestgehend unbekannt.
Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997)
Membrantransportmechanismen
P-Glykoprotein
multidrug resistance-associated proteins (MRPs)
lung-resistance protein (LRP)
protein transporter of antigenic peptides (TAP)
DNA-Reparaturmechanismen
Hemmung der Apoptose
P53
BCL-2
Survivin
Alteration der Topoisomerasen
Topoisomerase I
Topoisomerase II
Metabolische Zytostatika-Detoxifikation
Glutathion-S-Transferase-System
27
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.1 Tiere
An malignem Lymphom erkrankte Hunde
In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus
dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule
Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine
Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor
Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten.
Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer
Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer
P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage
P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden 2. Tag per os unbekannt
P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW einmal tägl. per os 4 Tage
P16 unbekannt alle drei Tage parenteral 20 Tage
P27 Dexamethason unbekannt unbekannt
P28 Prednisolon unbekannt 7 Tage
P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage
P34 Prednisolon unbekannt 21 Tage
P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW einmal tägl. per os unbekannt
P44 unbekannt unbekannt unbekannt
P48 Prednisolon unbekannt 8 Tage
28
Kontrolltiere
Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für
Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an
verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine
Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies
klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der
Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit
der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert.
Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente
Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente
K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie -
K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika
K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika
K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika
K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion
K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor -
K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen
K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid
Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei
22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des
Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung,
sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die
anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt.
Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium
entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN,
1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium
bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis,
gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von
Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet.
Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980)
Stadium Definition
I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks)
II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen)
III generalisierter Lymphknotenbefall
IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III)
V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV)
Substadium a ohne Allgemeinsymptome
Substadium b mit Allgemeinsymptomen
30
3.3 Chemotherapie
Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial
wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von
den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut
chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine Langzeit-
Kombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin.
Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
Woche L-Asp1 VCR CTX2 ADM1, 3 Pred
1 X X X
2 X X
3 X X
4 X X
5 X X
6 X X
7 X X
8 X X
9 X X
10 X X
11 X X
12 X X
ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v. 2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os) 3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
31
Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
Woche L-Asp1 VCR CTX ADM1, 2 MTX Pred
Induktion
1 X X X
2 X X
3 X X
4 X
5 X
6 X
Erhaltung: Zyklus 1
8 X
10 X
12 X
14 X
Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen
Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen
Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen
ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v. 2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
32
3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges
Therapieantwort
Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder
keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur
Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom
eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem
gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens
durchgeführt.
Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001)
Therapieantwort Definition
Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Partielle Remission (PR) Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50% der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen Tumormanifestationen.
Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen.
Rezidivfreies Intervall (RFI) Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall
(RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der
Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt.
33
3.4 Entnahme und Lagerung der Proben
Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen
Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie
(Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis
P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und
P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen
einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml
Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren
Bearbeitung bei -80 °C gelagert.
Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen,
umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung
erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik.
Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S.
128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung
erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei
Raumtemperatur gelagert.
3.5 Immunphänotypisierung
Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen
verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische B-
Lymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei
verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11).
Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 105 Zellen) mit jeweils 5 µl
der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem
Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton
Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde
anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus
IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels
einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert.
34
Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die
Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa.
Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert
(FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson).
Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson)
ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und
Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt.
Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss
von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die
Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen
bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle
Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen
Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit
Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-Zell-
Linie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 %
der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten.
Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome
AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-,
MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2
Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein
(FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die
Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1
174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied
Biosystems bezogen.
3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR
Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die
erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen
PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren
123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.
Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP: Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR
Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*
Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C
Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C
Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C
Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C
Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C
Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C
Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C
Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C
42
Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive
Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA
verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen
Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen
Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa.
Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec
bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich
2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer
Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und
550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die
Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest.
Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem
1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-
Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa
100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel
Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad
inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine
Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in
einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule
je einmal mit 500 µl Buffer QB und 750 µl Buffer PE (QIAqick Gel Extraction Kit®) für
1 min bei 10.000 x g gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule für 1 min bei
10.000 x g getrocknet. Die Säule wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zur
Elution der DNA wurden 50 µl autoklaviertes dest. Wasser auf die Säulenmembran pipettiert
und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert.
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte
(OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie. Aus der
DNA-Konzentration wurde die Anzahl an PCR-Produkten errechnet (Formel siehe Anhang
Seite 129). Für jedes Gen wurden Standardverdünnungsreihen um den Faktor 10 mit einer
Kopienzahl von100 bis 108 Kopien pro µl erstellt. Die internen Standards wurden aliquotiert
und bei -20 °C gelagert.
43
3.7.5.3 Durchführung der RT-qPCR
Die real-time RT-qPCR wurde mittels Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System der Fa.
Stratagene durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des jeweiligen Gens wurde in jedem Lauf
die Expression des Housekeeping-Gens HPRT in den Proben gemessen.
In jedem PCR-Lauf wurden Standardverdünnungsreihen für das jeweilige Gen und für HPRT
(MDR1, MRP1 und HPRT: 103 bis 108 Kopien; MRP2: 101 bis 106) mitgeführt. Die Proben
und die Negativkontrollen wurden in jedem Lauf in Dreifach-Ansätzen, die
Standardverdünnungen in Zweifach-Ansätzen gemessen. Alle Messungen wurden einmal
wiederholt.
Als Reaktionsgefäß wurden MicroAmp Optical 96-well plates (Fa. Stratagene) verwendet, die
mit MicroAmp Optical caps (Fa. Stratagene) verschlossen wurden.
Die Komponenten für den Reaktionsansatz wurden einem entsprechenden Kit (Brilliant™
Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene) entnommen. In einem PCR-
Reaktionsvolumen von 25 µl waren 80 µM dNTP mix, 5 mM MgCl2, 300 nM der jeweiligen
Primer, 100 nM der jeweiligen Sonde, 75 nM 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) als
Referenzfarbstoff und 0,025 units / µl SureStart™ Taq DNA Polymerase in 1x PCR-Puffer
enthalten.
An eine initiale Denaturation über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 PCR-Zyklen mit 15 sec
bei 95 °C (Denaturation) und 1 min bei 61 °C (MDR1) bzw. 60 °C (MRP2) oder 59 °C
(MRP1) an (Anlagerung und Verlängerung).
44
3.7.5.4 Auswertung der RT-qPCR
Die Auswertung erfolgte für jeden PCR-Lauf separat unter Verwendung der dem Gerät
zugehörigen Software.
Zunächst wurde aus den in den ersten PCR-Läufen erhobenen Messdaten für jeden Ansatz
eine Grundlinie (baseline) bestimmt. Die Festlegung der Spannweite der PCR-Zyklen für die
Erstellung der baseline erfolgte Software-gesteuert (Software-Einstellung: adaptive baseline).
Durch Subtraktion des Wertes der Gradenfunktion der baseline von den in den Ansätzen in
den PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden die baseline korrigierte
Fluoreszenz (dR) und hinterher als Quotient der dR von Reporterfarbstoff und
Referenzfarbstoff (ROX) das sogenannte normalisierte baseline-korrigierte Reportersignal
(dRn) berechnet.
Anschließend wurde anhand der in fünf der ersten zehn PCR-Zyklen gemessenen
Fluoreszenzintensitäten (Hintergrundfluoreszenz) der sogenannte Grenzwert (Threshold)
bestimmt und für jeden Ansatz der Threshold Cycle (Ct-Wert), d.h. der PCR-Zyklus, bei dem
die dRn den Grenzwert erstmals übersteigt, ermittelt.
Zur Bestimmung der Ausgangskopienzahl in den Proben wurde mittels der Software eine
Standardkurve erstellt. Die Ct-Werte der jeweiligen Standardverdünnungen wurden gegen die
logarithmierte Kopienzahl aufgetragen und die Standardkurve algorithmisch generiert. Aus
der Gradengleichung wurden die Effizienz der Amplifikation und die Ausgangskopienzahl in
den Proben durch Interpolation bestimmt.
Aus den in der gleichen Probe (dreifacher Ansatz) im selben Lauf ermittelten Ct-Werten bzw.
cDNA Kopienzahlen wurden der arithmetischer Mittelwert (MW) und die
Standardabweichung (SD) berechnet. Die mittlere Kopienzahlen des jeweiligen Gens wurden
durch die im selben Lauf in der gleichen Probe ermittelten Kopienzahlen des
Housekeeping-Gens (HPRT) geteilt. Zuletzt wurde aus den in zwei separaten Läufen
ermittelten normalisierten Kopienzahlen für MDR1, MRP1 bzw.MRP2 der MW und die SD
berechnet.
45
3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe
Die Untersuchung der Survivin-Expression in kaninem Gewebe erfolgte mittels RT-PCR.
Die kanine Survivin mRNA- Sequenz wurde der Genbank (Genbank-Nr. AB095108)
entnommen. Die Primerpaare, SURV1 bis SURV3 (Tabelle 14), wurden aus
Sequenzabschnitten ausgewählt, bei denen gemäß den in der Genbank enthaltenen Sequenzen
eine 100% Homologie zwischen Mensch und Hund besteht.
Als Positivkontrolle dienten menschliches Kolonkarzinomgewebe, kanines Plazentagewebe
sowie genomische DNA (c=50ng/ml) von Mensch und Hund. Für die Negativkontrollen
wurde das jeweilige Template durch ein identisches Volumen an destilliertem Wasser ersetzt.
In jedem PCR-Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates
und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen
Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase
zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei
94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C (SURV1 60°C), Elongation für 2 sec im ersten
Zyklus, zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR
wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1%igen Agarosegel.
Etwaige Banden wurden unter UV-Lichtexposition (BiodocAnalyserSystem, Biometra)
beurteilt und fotografiert.
Tabelle 14: Primer (SP: Sense Primer; AP: Antisense Primer) für den Nachweis von Survivin mRNA. Sequenz, Produktlänge und Schmelzpunkt (Tm) bei 100 mM Na+
Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Produktlänge Tm
SURV1 SP GCATGGGTGCCCCGACGTTG 73,2 °C
SURV1 AP GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA 448 bp
71,3 °C
SURV2 SP TGCCCCGACGTTGCC 62,9 °C
SURV2 AP CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT 69 bp
64,2 °C
SURV3 SP GGTAACAGTGGCTGCTTCTCTC 59,5 °C
SURV3 AP TCTAGCAAAAGGGACACTGCCT 120 bp
60,1 °C
46
3.8 Statistische Auswertung
Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SPSS verwendet.
Die in den verschiedenen Stichproben ermittelten normalisierten MDR1, MRP1 und MRP2
mRNA Kopienzahlen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung
geprüft.
Zum Vergleich der Höhe der Genexpression zwischen den Kontrollgeweben (Leber versus
Lymphknoten) und zwischen den Kontrolltieren (Beagle versus Klinikpatienten) wurde der t-
Test nach Student verwendet.
Mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson wurde der Zusammenhang zwischen
der Höhe der MDR1, bzw. MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe
bestimmt.
Zum Vergleich der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen Patienten mit
unterschiedlichen Krankheitscharakteristika (Immunphänotyp, anatomische Form und
Vorbehandlungsstatus) wurde der U-Test nach Mann und Whitney und zum Vergleich der
Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen verschiedenen Messzeitpunkten
(Diagnosestellung und 1. Rezidiv) der Wilcoxon-Test verwendet.
Der Zusammenhang zwischen einer Hyperkalzämie und dem Immunphänotyp sowie
zwischen dem Erreichen einer kompletten Remission und der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-
Genexpression wurde mit dem Fishers exakter Test evaluiert.
Für die Überlebensanalyse wurden die Hunde, die sich bei Ende der Studie in Remission
befanden bzw. bei denen keine Informationen über den Gesundheitsstatus zum Ende der
Studie vorlagen, zensiert. Zur Darstellung des zeitlichen Verlaufs des rezidivfreien
Überlebens wurden eine Kaplan-Meier-Überlebenskurven erstellt und das mittlere RFI sowie
das zugehörige 95% Konfidenzintervall des Medians nach der Methode von Kaplan-Meier
berechnet (KAPLAN 1958). Zum Vergleich der Dauer des rezidivfreien Überlebens zwischen
verschiedenen Patientengruppen wurde der Lok-Rang-Test verwendet (PETO et al., 1977).
Bei allen angewandten statistischen Testverfahren wurden Aussagen, die mit einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 behaftet waren, als signifikant bewertet.
47
3.9 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien
3.9.1 Probenentnahme und Lagerung
Tru-cut Biopsienadel, Fa. Allegiance Heathcare Cooperation, USA
Glukokortikoide - vorbehandelt 7 - nicht vorbehandelt 18
Kalziumgehalt im Plasma - im Referenzbereich 25
54
4.5.1.1 Behandlungsergebnisse
Bei 22 Patienten konnte durch die Kurzeit-Chemotherapie eine komplette Remission und bei
2 Hunden eine partielle Remission erreicht werden. Nur bei einem Hund reagierte der Tumor
nicht auf die Chemotherapie.
Von den 24 Patienten mit einer Tumorremission entwickelten 16 im Beobachtungszeitraum
ein Rezidiv. Ein Hund erfüllte die Studienkriterien aufgrund einer langfristigen Gabe von
Prednisolon nach Abschluss der Chemotherapie nicht mehr. 4 Hunde befanden sich bei
Beendigung der Studie noch in der ersten Remission. Bei den restlichen 3 Hunden waren
keine Angaben über den Gesundheitsstatus bei Studienende verfügbar.
Das rezidivfreie Intervall (RFI) war bei den Patienten, die im Beobachtungszeitraum ein
Rezidiv entwickelten, zwischen 30 und 511 Tage lang. Das mittlere RFI betrug 222 Tage, das
zugehörige 95 % Konfidenzintervall für den Median lag bei 143 bis 301 Tagen.
Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Stadium, Substadium oder einer
Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und der Dauer des RFI war bei den Hunden mit einem
multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19) nicht nachweisbar (Tabelle 19). Auf eine
statistische Überprüfung des Einflusses des Immunphänotyps sowie der anatomischen Form
auf die Länge des RFIs wurde aufgrund einer zu geringen Anzahl an Patienten mit einem
T-Zell-Lymphom (n=2) bzw. einem gastrointestinalen Lymphom (n=2) verzichtet.
Tabelle 19: Einfluss des klinischen Stadiums und Substadiums sowie einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls (RFI) bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19)
Faktor n RFI Median Log-Rang-Test
Klinisches Stadium - III und IV 14 222 Tage
- V 3 224 Tage p=0,77
Klinisches Substadium - a 14 224 Tage - b 5 157 Tage
p=0,6
Glukokortikoide - vorbehandelt 6 222 Tage - nicht vorbehandelt 13 273 Tage
p=0,86
55
4.5.2 Zweite Chemotherapie
Bei 7 Patienten, die ein Tumorrezidiv entwickelten, stimmten die Besitzer einer zweiten
Chemotherapie zu. 3 Hunde erhielten eine Langzeitchemotherapie, ein Patient wurde mit
einer Kombination aus Cytarabin und Carboplatin behandelt und bei 3 Patienten wurde das
Durch die erneute chemotherapeutische Behandlung konnte bei 5 Hunden eine komplette und
bei einem Patienten eine partielle Remission erreicht werden. Bei einem Hund reagierte das
Tumorrezidiv nicht mehr auf die Chemotherapie (Tabelle 20). Der Median des zweiten RFI
betrug bei den Patienten mit einem Tumorrückgang (n=6) 139 Tage (95% Konfidenzintervall
59 bis 219 Tage).
Tabelle 20: Behandlungsergebnisse der zweiten Chemotherapie
Tier-Nr. Protokoll Therapie-antwort RFI
P07 Kurzzeitchemotherapie PR 190 Tage
P09 Cytarabin / Carboplatin CR 42 Tage
P11 Langzeitchemotherapie CR 139 Tage
P12 Langzeitchemotherapie CR 128 Tage
P10 Kurzeitchemotherapie CR 94 Tage*
P39 Kurzzeitchemotherapie CR 42 Tage**
P46 Langzeitchemotherapie PD -
Abkürzungen und Fußnoten: CR: komplette Remission PR : partielle Remission PD: progressive Tumorerkrankung RFI: rezidivfreies Intervall * Verlauf nach letzter Vorstellung in der Klinik unbekannt ** bei Studienende in Remission
56
4.6 Real-time RT-qPCR
4.6.1 Sensitivität der qPCR
Zur Überprüfung des sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurden Verdünnungen der
Standards für MDR1, MRP1 und MRP2 von 106 bis 100 Kopien pro µl erstellt und in
dreifachen Ansätzen gemessen. Bei allen drei etablierten qPCR-Assays waren 10 Kopien pro
µl Reaktionsvolumen noch sicher detektierbar (Tabelle 21).
Tabelle 21: Sensitivitätskontrolle der qPCR. Arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der als Triplikate in verschiedenen Verdünnungsstufen der Standards gemessenen Ct-Werte
4.6.2.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere
In allen unveränderten Leber- (n=14) und Lymphknotenproben (21 Proben von 15 Hunden)
war mittels der etablierten RT-qPCR eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar.
Im Lebergewebe (n=14) waren durchschnittlich 147 (Spannweite 69 bis 246) und im
Lymphknotengewebe (15 Proben von 15 Hunden) 14 (Spannweite 5 bis 28) MDR1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar. Der Unterschied in der Höhe der
MDR1-Genexpression zwischen den beiden Geweben erwies sich im t-Test nach Student als
hoch signifikant (p<0,001).
Zwischen den Klinikpatienten und den Beaglen unterschied sich die Höhe der MDR1-
Genexpression im Leber- und im Lymphknotengewebe dagegen nur unwesentlich (Leber:
p=0,956; Lymphknoten: p=0,22) (Abbildung 1).
Lymphknoten LeberGewebe
0
50
100
150
200
MD
R1
Kop
ien
pro
HPR
T K
opie
A B
A B
"Sonstige"Beagle
Beagle "Sonstige"
Abbildung 1: MDR1-Genexpression (arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie) im unveränderten Lymphknoten- und Lebergewebe gesunder Beagle (Leber n=6; Lymphknoten n=9) und Hunde aus der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
58
Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression im
Lebergewebe und im Lymphknotengewebe bestand bei Hunden, bei denen Proben aus beiden
Geweben untersucht wurden (n=10), nicht (Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) =0,056
p=0,88).
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten
3020100
MD
R1
Kop
ien
pro
HP
RT
Kop
ie /
Lebe
r
300
200
100
0
Abbildung 2: Korrelation der Höhe der MDR1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=0,056, p=0,88)
Zum Ausschluss einer relevanten Schwankung in der Höhe der MDR1-Genexpression
zwischen Lymphknoten verschiedener Körperregionen wurde bei einem Beagle (Tier-Nr. K9)
die Höhe der MDR1 Geneexpression in sieben verschiedenen Lymphknoten (ein Popliteal-
sowie je zwei Zervikal-, Mandibular- und Darmlymphknoten) bestimmt. Die gemessene
MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie in den sieben Biopsien schwankte
zwischen 12 und 28 und variierte weniger als zwischen Biopsien aus den
Popliteallymphknoten von 9 verschiedenen Beaglen (Spannweite 5 bis 28).
59
4.6.2.2 Maligne Lymphome
Bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden war bei Diagnosestellung eine
Expression des MDR1-Gens im Tumorgewebe mittels der etablierten RT-q PCR nachweisbar.
Die Höhe der gemessenen MDR1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte
von 0,1 bis 369 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie.
Die Mehrheit der untersuchten Lymphome wies bei Diagnosestellung eine relativ niedrige
MDR1-Genexpression auf (Median 1,7 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Nur
bei drei Lymphomen war die MDR1-Genexpression höher als im unveränderten
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (Abbildung 3). Bei zehn Hunden lag die Höhe der
MDR1-Geneexpression innerhalb des im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Wertebereiches. Bei den restlichen 37 Patienten war die MDR1-Genexpression im
Tumorgewebe bei Diagnosestellung niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere.
< Ln. = Ln. > Ln.MDR1-Genexpression bei Diagnose
0
10
20
30
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
n=37 n=10 n=3
Abbildung 3: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)
60
Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen
Von den 50 untersuchten Patienten wiesen 44 ein multizentrisches und 6 ein gastrointestinales
Lymphom auf. Bei den Patienten mit einem multizentrischen Lymphom waren
durchschnittlich (Median) 1,4 (Spannweite 0,1 bis 369), bei den Hunden mit einem
gastrointestinalen Lymphom durchschnittlich 11,4 (Spannweite 2,4 bis 50) MDR1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung nachweisbar
(Abbildung 4). Im Mittelwertvergleich (U-Test nach Mann und Whitney) erwies sich der
beobachtete Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden
anatomischen Lymphomformen als signifikant (p=0,002).
multizentrisch gastrointestinalanatomische Form
0
100
200
300
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRRRR RRRRRRRRRRRRR R
R
R
RRRR
RRRRRRRRRRRRRRR
R
RRRRRRRRR
Abbildung 4: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6). (U-Test von Mann und Whitney: p=0,002)
61
Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen
Zwischen den Patienten mit einem multizentrischem T-Zell-Lymphom (n=8) und den Hunden
mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=18) unterschied sich die Höhe der MDR1-
Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung dagegen nicht deutlich (U-Test von
Mann und Whitney p=0,54).
Durchschnittlich (Median) waren bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Hunden im
Tumorgewebe 2,8 (Spannweite 0,1 bis 132) und bei den an einem B-Zell-Lymphom
erkrankten Patienten 1,2 (Spannweite 0,2 bis 10) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA
Kopie nachweisbar (Abbildung 5).
B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp
0
50
100
150
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRRRRR RRRRRRRR
R
R
RRRR RRRRRR
R
RRRRRRRR R
Abbildung 5: Vergleich der MDR1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,54)
62
Einfluss von Glukokortikoiden auf die MDR1-Genexpression
Ein Einfluss einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Höhe der MDR1-
Geneexpression war anhand der vorliegenden Daten nicht nachweisbar (U-Test von Mann
und Whitney p=0,52). Der Median der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie
betrug bei den 11 vorbehandelten Hunden 2,6 (Spannweite 0,2 bis 132) und bei den 33 nicht
vorbehandelten Hunden 1,3 (Spannweite 0,1 bis 369) (Abbildung 6).
ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden
0
100
200
300
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RR RR RRR RRRRRR RR
R
RRRRRRR RRRRR RRRRRR
R
RRR RRRR RR
Abbildung 6: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=11), und von an malignem Lymphom erkrankten Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=33) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,521)
63
Einfluss der MDR1-Genexpression auf die Therapieantwort
Von 3 Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe höher als im
unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (>Ln.), reagierte keiner auf die
Chemotherapie mit einer Vollremission (CR). Bei einem Hund honnte eine Teilremission
(PR), bei den anderen beiden Hunden kein Rückgang des Tumors (NC) erreicht werden. Im
Vergleich dazu reagierten 27 von 29 Hunden, bei denen die MDR1-Genexpression gegenüber
dem Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war (≤ Ln.), auf die Chemotherapie
mit einer kompletten Remission (Abbildung 7).
Die Überprüfung des beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe der
MDR1-Genexpression (> Ln. gegenüber ≤ Ln.) und der Therapieantwort (CR gegenüber PR
oder NC) auf statistische Signifikanz ergab eine deutliche Assoziation zwischen dem
Fortbestehen klinischer Anzeichen einer Tumorerkrankung (PR oder NC) und einer erhöhten
MDR1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (Fishers exakter Test; p= 0.002)
MDR1 Genexpression vor Therapiebeginn
> Ln.= Ln.< Ln.
Anz
ahl a
n P
atie
nten
30
20
10
0
NC
PR
CR2
4
23
Abbildung 7: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe an malignem Lymphom erkrankter Hunde vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und jeweilige Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NC: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission
64
Einfluss der MDR1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall
Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem
Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien
wurden nur Hunde mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten
RFIs in der Analyse berücksichtigt.
Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden
wiesen 16 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unverändertem
Lymphknotengewebe erniedrigte MDR1-Genexpression auf (Gruppe IIb). Bei den restlichen 3
Hunden entsprach die Höhe der MDR1-Genexpression den in den Lymphknoten der
Kontrolltiere gemessenen Werten (Gruppe IIa). Die Spannweite des ersten RFI reichte in der
Gruppe IIa von 30 bis 93 Tagen und in der Gruppe IIb von 126 bis 511 Tagen. Der Log-
Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,0001 (Abbildung 8).
RFI in Tagen
6004002000
Kum
. re
zidi
vfre
ies
Übe
rlebe
n
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Abbildung 8: Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls (RFI) der Hunde mit multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=19) als Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve. Gestrichelte Linie: Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumor niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (Gruppe IIb, n=16). Durchgezogene Linie: Hunde, bei denen die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumor den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (Gruppe IIa; n=3)
65
MDR1-Genexpresssion in Tumorrezidiven
Bei 12 Hunden konnte sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten
Tumorrezidivs eine Gewebeprobe entnommen werden.
Ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv war bei 7
Hunden nachweisbar (Tabelle 22). Bei einem Hund wurde ein undeutlicher Anstieg (Faktor
1,8), bei 4 Patienten keine nennenswerte Änderung (Faktor 0,6 bis 1,1) der MDR1-
Genexpression vermerkt.
Im Wilcoxon-Test erwies sich der Anstieg der MDR1-Genexpression zum Zeitpunkt des
ersten Rezidivs als signifikant (p=0,032).
Tabelle 22: MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden (n=12) bei Diagnosestellung und bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs sowie der errechnete Anstiegsfaktor (1.Rezidiv/Diagnose)
Beim Vergleich der Länge des ersten RFIs von Patienten mit und ohne Anstieg der MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv zeigten sich deutliche Unterschiede. Die mittlere Dauer des
ersten RFI war bei den 8 Patienten, bei denen eine gesteigerte (≥ Faktor 1,8) MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv nachweisbar war, deutlich kürzer (Median 133 Tage,
95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den 4 Hunden ohne einem Anstieg der
MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv (Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis
408 Tage). Im Log-Rang-Test erwies sich der Unterschied als signifikant (p=0,012).
RFI in Tagen
6004002000
Kum
. re
zidi
vfre
ies
Übe
rlebe
n
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Abbildung 9: Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve des rezidivfreien Intervalls (RFI), getrennt für Hunde mit einem Anstieg (≥ Faktor 1,8) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (durchgezogene Linie) und für Hunde ohne einem deutlichen Anstieg (< Faktor 1,1) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (gestrichelte Linie)
67
4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression
4.6.3.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere
Eine Expression des MRP1 Gens war sowohl in allen untersuchten Leber- (n=14) als auch
Lymphknotenproben (n=14) mittels der etablierten qPCR nachweisbar. Die Höhe der
Expression war im unveränderten Lebergewebe mit durchschnittlich 25 (SD 13) MRP1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich niedriger als im Lymphknotengewebe (130 (SD 57)
MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie; p<0,001) (Abbildung 10).
Zwischen den gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und den Hunden aus dem
Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
unterschied sich die Höhe der MRP1-Genexpression in beiden Geweben nur undeutlich
Abbildung 10: MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe von gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
68
Die Höhe der MRP1-Geneexpression im unveränderten Lymphknotengewebe variierte
zwischen Biopsien von verschiedenen Beaglen (nur Popliteallymphknoten; n=9) stärker als
zwischen Biopsien von verschiedenen Lymphknoten (n=7) desselben Beagles (Spannweite 59
bis 247 bzw. 114 bis 221 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie).
Es bestand keine deutliche Korrelation zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression im
Lebergewebe und im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10; R=-0,007; p=0,985)
(Abbildung 11).
MRP1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten
3002001000
MR
P1 K
opie
n pr
o H
PRT
Kop
ie /
Lebe
r
100
75
50
25
0
Abbildung 11: Korrelation der Höhe der MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=-0,007; p=0,985)
Eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) war nur in
den Leberproben, nicht aber im unveränderten Lymphknotengewebe nachweisbar.
Durchschnittlich waren im Lebergewebe 21 (SD 13) MRP2 cDNA Kopien pro HPRT cDNA
Kopie enthalten. Ein signifikanter Unterschied in der Höhe der MRP2-Geneexpression
zwischen den Beaglen (n=6) und den Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik (n=8)
bestand nicht (p=0,662).
69
4.6.3.2 Maligne Lymphome
Eine Expression des MRP1-Gens war bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden
bei Diagnosestellung im Tumorgewebe nachweisbar. Die Höhe der MRP1-Genexpression
variierte zwischen den Patienten und reichte von 11 bis 2499 (Median 268) MRP1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie.
Eine in Relation zu den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten
(Spannweite 55 bis 247 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie) erniedrigte MRP1-
Genexpression wiesen acht Lymphome auf (Abbildung 11). Bei 28 Lymphomen lag die Höhe
der MRP1-Genexpression über den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Werten.
< Ln. = Ln. > Ln.MRP1-Genexpression bei Diagnose
5
10
15
20
25
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
n=8 n=14 n=28
Abbildung 12: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)
Im Gegensatz zu MRP1 war eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2 cDNA
Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung
nachweisbar.
70
Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen
Durchschnittlich (Median) waren bei den Hunden mit multizentrischem Lymphom (n=44) im
Tumorgewebe 273 (Spannweite 11 bis 2499) und bei den an einem gastrointestinalen
Lymphom erkrankten Patienten (n=6) 192 (Spannweite 11 bis 542) MRP1 cDNA Kopien pro
HPRT cDNA Kopie bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 13). Der Unterschied
zwischen Lymphomen unterschiedlicher anatomischer Lokalisation erwies sich im U-Test
nach Mann und Whitney als nicht signifikant (p=0,179).
multizentrisch gastrointestinalanatomische Form
0
1000
2000
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
R R
R
R
R
RRRR
R
RR
RR
R
RR
R
R
R
R
RR
R R
R
RRR
R
R
RRRRRRRRR
R
RRRRR
R
R
R
R
Abbildung 13: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6) (U-Test von Mann und Whitney: p=0,179)
71
Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen
Die Höhe der MRP1-Genexpression unterschied sich im U-Test nach Mann und Whitney
deutlich (p=0,001) zwischen Hunden mit multizentrischem T- Zell- und B-Zell-Lymphom.
Bei Hunden mit einem B-Zell-Lymphom (n=28) waren durchschnittlich 406 (Spannweite 142
bis 2499), bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Patienten (n=8) durchschnittlich 95
(Spannweite 11 bis 735) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie nachweisbar.
B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp
0
1000
2000
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRR
R
RR
R
R
RR
RRR
R
R
RRR
R
R
RR
RRRR
R
RR RRR
R
R
R
R
Abbildung 14: Vergleich der MRP1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,001)
72
Einfluss von Glukokortikoiden auf die MRP1-Genexpression
Aufgrund des Einflusses des Immunphänotyps auf die Höhe der MRP1-Genexpression
wurden nachfolgend nur Hunde mit einem B-Zell-Lymphom berücksichtigt.
Hunde, die bei Diagnosestellung mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren, wiesen im
Durchschnitt eine höhere MRP1-Genexpression im Tumorgewebe auf (Median 508,
Spannweite 407 bis 2499 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie) als nicht mit
Kopien pro HPRT Kopie) (Abbildung 15). Im U-Test nach Mann und Whitney erwies sich
der Unterschied jedoch als nicht signifikant (p=0,055).
ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden
500
1000
1500
2000
2500
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRR
R
RR
R
R RRRR
R
RRR
R
R
RRRRRRR
R
R
R
Abbildung 15: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem B-Zell-Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=7), und von Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=21) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,055)
73
Einfluss der MRP1-Genexpression auf die Therapieantwort
Ingesamt reagierten 8 von 9 (89%) der Patienten, bei denen die Höhe der MRP1-
Genexpression im Tumorgewebe den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Werten entsprach (=Ln.), mit einer Vollremission auf die erste bzw. zweite Chemotherapie.
Bei den Patienten mit einer in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erhöhten
MRP1-Genexpression (>Ln.) konnte in 19 von 23 (83%) der Fälle eine Vollremission erzielt
werden. Die Überprüfung auf statistische Signifikanz ergab keine deutliche Assoziation
zwischen der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) und der MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe vor Therapiebeginn (>Ln. gegenüber =Ln.) (Fishers exakter Test: p= 0,65).
MRP1-Genexpression
>Ln.= Ln.
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
30
20
10
0
Therapieantwort
NR
PR
CR
2
2
19
8
Abbildung 16: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NR: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission
74
Einfluss der Höhe der MRP1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall
Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem
Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien
wurden nur Hunde mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten
rezidivfreien Intervalls in der Analyse berücksichtigt.
Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden
wiesen 15 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unveränderten
Lymphknotengewebe erhöhte MRP1-Genexpression auf (Gruppe I). Bei den restlichen
4 Hunden entsprach die Höhe der MRP1-Genexpression den in den Lymphknoten der
Kontrolltieren gemessenen Werten (Gruppe IIa).
Das mittlere erste RFI (Median) war bei den Hunden der Gruppe IIa (MRP1-Genexpression =
Ln.) 224 Tage (95% Konfidenzintervall 67 bis 381 Tage) und bei Hunden der Gruppe I
(MRP1-Genexpression > Ln.) 281 Tage (95% Konfidenzintervall 166 bis 396 Tage). Der
Log-Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,323.
75
MRP1-und MRP2-Genexpresssion bei Tumorrezidiven
Bei 12 Hunden konnten sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten
Tumorrezidivs Gewebeproben entnommen werden.
Im Wilcoxon-Test erwiesen sich die Unterschiede in der MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten (Diagnose und erstes Rezidiv)
als nicht signifikant (p=0,53).
Nur bei einem Hund war ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MRP1-Genexpression
zwischen Diagnose und erstem Rezidiv nachweisbar (Tabelle 23). Bei allen anderen
schwankte die Höhe der MRP1-Genexpression zwischen den Untersuchungszeitpunkten nur
unwesentlich (Faktor 0,5 bis 1,4).
Im Gegensatz zum MRP1-Gen war keine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2
cDNA Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in den untersuchten Tumorrezidiven nachweisbar.
Tabelle 23: MRP1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung und Ausbildung des ersten Tumorrezidivs bei 12 an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden und errechneter Anstiegsfaktor
Mit allen drei PCR-Assays war eine Expression von Survivin mRNA in menschlichem
Kolonkarzinomgewebe nachweisbar (Tabelle 24). In Plazentagewebe vom Hund war dagegen
mit keinem der Primerpaare eine Expression von Survivin mRNA detektierbar.
Bei zwei Primerpaaren ließ sich das jeweilige PCR-Produkt aus genomischer DNA vom
Menschen, nicht aber aus genomischer DNA vom Hund amplifizieren (Tabelle 24).
Tabelle 24: Ergebnisse der zum Nachweis von Survivin durchgeführten PCR-Assays
Primerpaar Template Spezies
SURV1 SURV2 SURV3
cDNA Kolonkarzinom Mensch positiv positiv positiv
cDNA Plazenta Hund negativ negativ negativ
gDNA Hund negativ negativ negativ
gDNA Mensch negativ positiv positiv
77
4.8 Immunhistochemische Untersuchung der P-Glykoproteinexpression
Zum immunhistochemischen Nachweis von P-Glykoprotein wurde der Antikörperklon C219
verwendet. Die Färbung wurde an Lebergewebe etabliert. Das Färbemuster im Lebergewebe
(multifokale Färbung der kanikulären Oberfläche der Hepatozyten) entsprach den Angaben
zur P-Glykoproteinexpression im Lebergewebe aus der Literatur (GINN 1996).
Nach Etablierung des Antikörpers wurde bei 20 der an malignem Lymphom erkrankten
Hunden die Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe bei Diagnosestellung
untersucht. Bei 19 von 20 Hunden reagierten nur einzelne Tumorzellen mit dem Antiköper
gegen P-Glykoprotein (< 1%) (Abbildung 17). Nur bei einem Patienten (Tier-Nr.P20) ließen
sich multifokal Tumorzellgruppen mit dem Antikörperklon C219 anfärben (Abbildung 17).
Bei dem Tumor dieses Patienten handelte es sich um ein gastrointestinales, nicht mit
Glukokortikoiden vorbehandeltes Lymphom, welches nicht auf eine Chemotherapie reagierte.
Die Höhe der MDR1-Genexpression betrug bei dem Lymphom mit der deutlichen
P-Glykoproteinexpression 50 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Bei den
restlichen 19 Hunden, bei denen nur sehr wenige Tumorzellen mit dem Antikörperklon C219
reagierten, war die mittels RT-qPCR gemessene Höhe der MDR1-Genexpression im
Tumorgewebe dagegen mit 0,4 bis 16 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich
niedriger.
78
Abbildung 17: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein. Oberes Bild. Lymphom, bei dem nur einzelne Zellen mit dem Antikörperklon C219 reagierten. Umteres Bild. Lymphom mit deutlicher Immunreaktivität gegen den Antikörperklon C219 (Balken = 50 µm)
79
5 DISKUSSION
Voraussetzung für die Durchführung von klinischen Studien zur MDR beim Hund ist die
Möglichkeit, die Expression von Zellmembranproteinen, die eine Vielfachresistenz vermitteln
können, in Tumorbiopsien reproduzierbar quantifizieren zu können. Zur Untersuchung der P-
Glykoprotein-, MRP1- und MRP2-Expression stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung
(BECK et al. 1996; BROXTERMAN et al. 1996). Die Proteine können mittels monoklonaler
Antikörper nachgewiesen werden oder die Expression der für die Proteiene kodierenden Gene
kann untersucht werden (NOONAN et al. 1990; HERZOG et al. 1992; FLENS et al. 1994;
HIPFNER et al. 1994). Zwar können hohe Expressionsdichten mit allen Verfahren
zuverlässig bestimmt werden, die Messung geringer Expressionsdichten bereitet jedoch
häufig Schwierigkeiten (BECK et al. 1996, BROXTERMAN et al. 1996; MARIE et al. 1997).
Beim Hund werden zur Untersuchung der P-Glykoproteinexpression sowohl
immunhistochemische Techniken als auch Western Blots eingesetzt und zur Bestimmung der
MDR1-Genexpression konventionelle RT-qPCRs verwendet (MOORE et al. 1995; GINN
1996; STEINGOLD et al. 1998). Mit keiner dieser Techniken können jedoch präzise
quantitative Daten, die einen Vergleich der Expressionshöhe zwischen verschiedenen
Geweben, Tumorentitäten oder Krankheitsstadien ermöglichen, erhoben werden.
In der vorliegenden Studie wurde zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-
Genexpression in kaninen Lymphomen eine RT-qPCR im real-time-Modus etabliert. Die
Untersuchungsmethode wurde erstmals 1996 von GIBSON und Mitarbeitern beschrieben
(GIBSON et al. 1996). Als allgemeine Vorzüge der RT-qPCR im real-time-Modus gelten u.a.
eine hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten, (BUSTIN 2002;
GINZINGER 2002). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphophoribosyltransferase
(HPRT) verwendet. HPRT wird im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen sehr niedrig
und konstant exprimiert (FOSS et al. 1998). Die in der eigenen Studie gemessenen HPRT
cDNA Kopienzahlen entsprachen in etwa den in den MDR1 niedrig exprimierenden
Lymphomen gemessenen MDR1 cDNA Kopienzahlen. HPRT ist somit als endogenes
Kontrollgen für die etablierten qPCR-Assays geeignet.
80
Zur Beurteilung der Sensitivität der etablierten RT-qPCR wurden Verdünnungen der MDR1-,
MRP1- und MRP2-Standards mit 106 bis 100 Kopien pro 25 µl PCR-Ansatz analysiert.
Sowohl bei MDR1 als auch bei MRP1 und MRP2 konnten 10 Kopien pro PCR-Ansatz sicher
nachgewiesen werden. Die Streuung der Ct-Werte innerhalb der als Triplikate gemessenen
Ansätze war relativ gering (SD < 1,25). Dies unterstreicht die Zuverlässigkeit der
Messergebnisse. Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurde der
Variationskoeffizient der Ct-Werte herangezogen. Alle cDNA-Proben wurden in zwei
verschiedenen Messdurchgängen jeweils als Triplikat untersucht. Der Variationskoeffizient
der Ct-Werte innerhalb der Messdurchgänge und zwischen den Messdurchgängen reichte von
0,1% bis 5% und entsprach den von BUSTIN veröffentlichten Empfehlungen (BUSTIN
2000).
Aufgrund der in verschiedenen Studien nachgewiesenen Expression von P-Glykoprotein,
MRP1 und MRP2 in der Leber beim Hund (GINN 1996; CONRAD et al. 2001) wurde
unverändertes Lebergewebe als Positivkontrolle verwendet. Lymphknotengewebe diente als
Vergleichsgewebe. In allen untersuchten Lymphknoten- und Leberproben war eine
Expression von MDR1 mRNA und MRP1 mRNA mittels der etablierten RT-qPCR
nachweisbar. Eine Expression des MRP2-Gens war dagegen nur in unverändertem
Lebergewebe, nicht aber in Lymphknotengewebe sicher detektierbar. Die Höhe der
MRP2-Genexpression war jedoch auffallend niedrig. Beim Menschen wird MRP2 in der
Leber relativ hoch exprimiert. Unterschiede im MRP2-Expressionsmuster zwischen Hund und
Menschen werden vermutet (CONRAD et al. 2001).
Zur Verbesserung der Repräsentativität der Vergleichswerte wurden neben gesunden Beaglen
auch Patienten der Klinik für kleine Haustiere als Kontrolltiere verwendet. Die Höhe der
MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- bzw. Lymphknotengewebe unterschied
sich zwischen den Klinikpatienten und den gesunden Beaglen nicht deutlich. Dies
unterstreicht die Repräsentativität des Kontrollkollektivs.
Die interindividuelle Variation der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- und
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war verhältnismäßig hoch. Ähnliche Messwert-
schwankungen wurden auch in Lebergeweben von gesunden Menschen gefunden (SCHUETZ
et al. 1995). Ursache und Bedeutung der Schwankungen sind ungeklärt. Möglicherweise
spielen Alter, Abstammung oder Ernährung eine Rolle.
81
In früheren Studien zur P-Glykoproteinexpression beim Hund wurde unverändertes
Lymphknotengewebe als Negativkontrolle verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et
al. 1996; LEE et al. 1996). Bemerkenswerterweise war in der eigenen Studie in allen
untersuchten Lymphknotenproben eine Expression des MDR1-Gens mittels RT-qPCR
nachweisbar. Die Höhe der Expression war jedoch deutlich niedriger als in den untersuchten
Lebergeweben. Es ist anzunehmen, dass die in der vorliegenden Studie etablierte RT-qPCR
sensitiver ist als die in anderen Studien verwendeten immunhistochemischen
Nachweisverfahren. Studien, in denen eine Expression von P-Glykoprotein in Lymphozyten
des peripheren Blutes beim Menschen nachgewiesen wurde, unterstützen diese Annahme
(KLIMECKI et al. 1994; LOHRI et al. 1997).
Die Chemotherapie ist derzeit fast immer die Therapie der Wahl bei an malignem Lymphom
erkrankten Hunden (MADEWELL 1999). Zu Beginn der Behandlung kann bei bis zu 90%
der an einem multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde ein Tumorrückgang erreicht
werden (ETTINGER 2003). Mittels der etablierten real-time RT-qPCR wurde die MDR1-,
MRP1- und MRP2-Genexpression in 50 Lymphomen bei Diagnosestellung und in
12 Tumorrezidiven quantifiziert. In allen Lymphomen war eine Expression des MDR1-Gens
nachweisbar. In der Mehrzahl der untersuchten Fälle war die Expression jedoch relativ
niedrig. Nur 3 von 50 Lymphomen wiesen bei Diagnosestellung eine in Relation zu gesundem
Lymphknotengewebe gesteigerte MDR1-Genexpression auf. Dieser niedrige Anteil steht im
Einklang mit der im Allgemeinen guten chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit der
Lymphome des Hundes zu Behandlungsbeginn.
In früheren Studien konnte eine Expression von P-Glykoprotein mittels Western Blot oder
Immunhistochemie in 3 bis 33 % der Lymphome des Hundes bei Diagnosestellung
nachgewiesen werden (MOORE et al. 1995; GINN 1996; LEE et al. 1996). Ähnlich
variierende Angaben werden für das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen berichtet
(YUEN u. SIKIC 1994). Zumeist wurden zum Nachweis von P-Glykoprotein beim Hund die
Antikörperklone C219 und C494 verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et al. 1996;
GINN 1996; LEE et al. 1996) Es ist bekannt, dass die Verwendung unterschiedlicher
Antikörperklone gegen P-Glykoprotein beim Menschen zu abweichenden Färbeergebnissen
führen kann (PILERI et al. 1991; BECK et al. 1996). Ähnliches könnte unter Umständen auch
82
für den Hund gelten. In der eigenen Studie war nur bei einem der 20 immunhistochemisch
untersuchten Lymphome eine deutliche Immunreaktivität mit dem Antikörperklon C219
feststellbar. Im Vergleich zu früheren Studien erscheint dieser Anteil zunächst als
verhältnismäßig gering. In zwei von drei Studien, die ebenfalls den Antikörperklon C219
verwendeten, wurden jedoch ähnlich niedrige Anteile P-Glykoprotein-positiver Lymphome
gefunden (MOORE et al. 1995; GINN 1996).
Interessanterweise wies das stark P-Glykoprotein-positive Lymphom eine deutlich höhere
MDR1-Genexpression auf als die restlichen 19 immunhistochemisch untersuchten
Lymphome. Eine Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und der
Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen u.a. bei Non-Hodgkin-Lymphomen
beschrieben (LIU et al. 2001). Im Allgemeinen war nur bei Non-Hodgkin-Lymphomen mit
einer relativ hohen MDR1-Expression auch eine Expression von P-Glykoprotein
immunhistochemisch nachweisbar (LIU et al. 2001). Nach den eigenen Untersuchungs-
ergebnissen kann eine Korrelation zwischen der Expressionsdichte von P-Glykoprotein und
der Höhe der MDR1-Genexpression ebenfalls vermutet werden.
Die etablierte RT-qPCR bietet zwar gegenüber dem immunhistochemischen Nachweis den
Vorteil der höheren Sensitivität, ermöglicht aber im Gegensatz zur Immunhistologie keine
morphologische Zuordnung der Expression. Somit ist eine Beeinflussung der
Untersuchungsergebnisse durch einen hohen Gehalt an nicht neoplastisch entarteten Zellen
denkbar. Bisher gelang es jedoch nicht, einen deutlichen Einfluss einer Kontamination mit
T-Lymphozyten auf die gemessene Höhe der MDR1-Genexpression in Lymphomen des
Menschen nachzuweisen (KANG et al. 1995). Dennoch erscheint eine gewisse Beeinflussung
möglich. Der Einsatz neuerer Techniken zur Gewebeisolierung könnte zur Klärung dieser
Problematik dienlich sein.
Maligne Lymphome können sich sowohl in ihrem pathologisch-anatomischen
Erscheinungsbild als auch in ihren tumorbiologischen Eigenschaften erheblich unterscheiden
(FAN 2003). Unter anderem gelten gastrointestinale Lymphome als im Allgemeinen
schlechter chemotherapeutisch beeinflussbar als multizentrische Verlaufsformen (COUTO et
al. 1989). Interessanterweise war in der vorliegenden Studie die mittlere Höhe der MDR1-
Genexpression im Tumorgewebe von Hunden mit gastrointestinalen Lymphomen bei
Diagnosestellung deutlich höher als bei Patienten mit multizentrischen Verlaufsformenn. Bei
83
gesunden Hunden unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen
Darmlymphknoten und Lymphknoten anderer Körperregionen dagegen nicht. Eine
Chemotherapie wurde nur bei zwei der Hunde mit einem gastrointestinalen Lymphom
durchgeführt. Ein Patient reagierte mit einer Teilremission, der andere mit einem stationären
Tumorverhalten. Ein direkter Zusammenhang zwischen der höheren MDR1-Genexpression
und der schlechteren therapeutischen Beeinflussbarkeit gastrointestinaler Lymphome lässt
sich somit vermuten. Inwieweit sich dieser Zusammenhang in zukünftigen Studien bestätigt,
bleibt allerdings abzuwarten.
In zwei früheren Studien wurde bereits eine prognostische Relevanz der Expression von
P-Glykoprotein für die Überlebenszeit von Hunden mit malignem Lymphom beschrieben
(BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Dagegen konnten Steingold und Koautoren keinen
Zusammenhang zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und dem Therapieerfolg
nachweisen (STEINGOLD et al. 1998).
In der eigenen Studie bestand eine deutliche Assoziation zwischen der Höhe der MDR1-
Genexpression und der Therapieantwort. So konnte bei keinem der Lymphome mit einer
gesteigerten MDR1-Genexpression durch die Chemotherapie eine vollständigen Rückbildung
des Tumors erreicht werden. Auch die Länge des ersten rezidivfreien Intervalls war bei den
Patienten mit einer erniedrigten MDR1-Genexpression vor Therapiebeginn deutlich länger als
bei Hunden, bei denen die gemessenen Werte den in gesundem Lymphknotengewebe
ermittelten normalisierten MDR1 cDNA Kopienzahlen entsprachen. Die Ergebnisse lassen
eine Relevanz der gesteigerten MDR1-Expression für den Behandlungserfolg bei einem Teil
der untersuchten Patienten vermuten.
Bei verschiedenen Tumoren des Menschen wurde eine Zunahme der P-Glykoprotein- bzw.
MDR1-Genexpression im Therapieverlauf nachgewiesen. 1979 wurde von GOLDIE und
COLDMAN ein Modell aufgestellt, nach dem - ausgehend von einer Mutationsrate von 10–5
bis 10–6 - die Wahrscheinlichkeit, bereits in einem Tumor mit 107 Zellen keine resistenten
Tumorzellen zu finden, äußerst gering ist (GOLDIE u. COLDMAN 1979). Etwaige resistente
Tumorzellen weisen unter dem Selektionsdruck der Chemotherapie einen Überlebensvorteil
auf. Letztendlich entsteht ein therapierefraktäres Tumorrezidiv (NÜSSLER u. GIESELER
2000). In der vorliegenden Studie konnte bei 7 von 12 Patienten ein deutlicher Anstieg der
MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung nachgewiesen
84
werden. Interessanterweise war bei diesen Patienten auch die Länge des rezidivfreien
Intervalls gegenüber den Patienten ohne Anstieg der Höhe der MDR1-Genexpression im
Tumorrezidiv deutlich verkürzt.. Bei vier der Patienten mit einem Anstieg der MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv wurde die Chemotherapie wiederholt. Bei einem Patienten
erwies sich das Lymphom als therapierefraktär, bei den restlichen drei Patienten konnte eine
vollständige Remission erzielt werden. Bemerkenswerterweise war bei dem Patienten mit
dem therapierefraktären Lymphom die MDR1-Genexpression deutlich höher als bei den
restlichen Patienten. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass bei einem Teil der Lymphome
des Hundes die MDR1-Genexpression im Therapieverlauf ansteigt. Ein Zusammenhang
zwischen einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv und der Abnahme der
chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit ist zu vermuten.
Im Gegensatz zur Expression von P-Glykoprotein ist über die klinische Relevanz der
Expression von MRP1 und MRP2 beim malignen Lymphom des Hundes, soweit aus der
Literatur ersichtlich, noch nichts bekannt. In der vorliegenden Studie konnte bei einem
Patienten mit einer geringen MDR1-Genexpression kein vollständiger Tumorrückgang
erreicht werden. Somit ist ein Vorkommen alternativer Resistenzmechanismen bei kaninen
Lymphomen zu vermuten.
Beim Menschen wurde bereits eine Expression des MRP1 in Non-Hodgkin-Lymphomen
nachgewiesen und eine Beteiligung bei der Ausprägung von Zytostatikaresistenzen bei einem
Teil der Patienten vermutet (FLENS 1996; ZHAN et al. 1997). In der vorliegenden Studie war
MRP1 mittels real-time RT-qPCR in allen untersuchten Lymphomen nachweisbar. Ein
Zusammenhang zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression und der Therapieantwort oder
der Länge des rezidivfreien Intervalls war jedoch nicht feststellbar. Ein deutlicher Anstieg der
MRP1-Expression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs war ebenfalls nur bei einem von 12
Patienten nachweisbar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MRP1 bei der Mehrheit der
untersuchten Hunde als Resistenzmechanismus nicht von wesentlicher Bedeutung war.
Inwieweit die MRP1-Überexpression bei dem Patienten mit der gesteigerten MRP1-
Expression bei Rezidivausbildung von klinischer Relevanz war, ist ungewiss. Zwar kann in
vitro durch eine Steigerung der MRP1-Expresssion um 50% eine deutliche Herabsetzung der
Empfindlichkeit von Zellen gegen Doxorubicin (Senkung der IC50 um 50%) erzielt werden,
85
jedoch ist die Höhe der MRP1-Genexpression, die in vivo eine MDR vermitteln kann, bisher
nicht bekannt (GRANT et al. 1994; ZHAN et al. 1997).
In Transfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass neben P-Glykoprotein und MRP1
auch MRP2 eine Resistenz gegen verschiedene Zytostatika in vitro vermitteln kann (CUI et
al. 1999). In der vorliegenden Studie war weder in den unveränderten Lymphknotengeweben
noch in den Lymphomen zum Zeitpunkt der Diagnose oder Rezidivausbildung eine deutliche
Expression von MRP2 nachweisbar. Dieses weist darauf hin, dass MRP2 kein
Resistenzmechanismus bei den untersuchten Patienten war.
Schon seit einiger Zeit ist bekannt, dass die MDR1-Genexpression in Zellkulturen beim
Menschen durch Dexamethason zelltypspezifisch aktiviert werden kann (ZHAO et al. 1993).
Eine Behandlung mit Glukokortikoiden vor Chemotherapiebeginn gilt bei Hunden mit
Lymphomen als prognostisch ungünstig (PRICE et al. 1991). BERGMAN (2003) vermutet,
dass die schlechtere chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von mit Glukokortikoiden
vorbehandelten Hunden möglicherweise mit einer Induktion der Expression von
P-Glykoprotein im Zusammenhang steht. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde in der
vorliegenden Studie die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den mit Glukokortikoiden
vorbehandelten und den nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphomen verglichen.
Ein deutlicher Unterschied war jedoch nicht feststellbar. Auch bestand zwischen diesen
beiden Patientengruppen kein deutlicher Unterschied in der Länge des ersten rezidivfreien
Intervalls. An Zellkulturen gelang es ZHAO und Mitarbeitern zu zeigen, dass die Induktion
der MDR1-Genexpression durch Dexamethason sowohl zeit- als auch dosisabhängig ist
(ZHAO et al. 1993). Die Intensität und Dauer der Vorbehandlung variierten im eigenen
Patientenkollektiv stark. Es kann somit nicht ausgeschlossen werden, dass die Dosis und
Dauer der Glukokortikoidbehandlung bei einem Teil der untersuchten Patienten zu niedrig
waren, um eine Induktion der MDR1-Genexpression auszulösen.
Über den Effekt von Glukokortikoiden auf die MRP1-Expression ist bisher wenig bekannt.
ZHU und CENTER zeigten, dass der Promotor des humanen MRP1-Gens ein sogenanntes
glucocorticoid response element (GRE) enthält und vermuteten eine mögliche
Expressionssteigerung des MRP1-Gens durch Glukokortikoide (ZHU u. CENTER 1994). In
vitro konnte jedoch kein Einfluss von Dexamethason auf die Expression von MRP1 in
kaninen Osteosarkomzellinien oder humanen Kapillarendothelzellen nachgewiesen werden
86
(MEALEY et al. 2003, TOROK et al. 2003). Überraschenderweise wiesen in der
vorliegenden Studie die mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphome eine höhere MRP1-
Genexpression auf als die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Tumoren. Eine
systematischere Prüfung des Zusammenhanges wäre wünschenswert.
Der Immunphänotyp gilt derzeit als einer der wichtigsten prognostischen Faktoren beim
malignen Lymphom des Hundes (MADEWELL 1999). In zahlreichen Studien ist ein
Zusammenhang zwischen dem Immunphänotyp und der Remissionsdauer oder der
Überlebenszeit aufgezeigt worden (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al. 1994; DOBSON et
al. 2001). Es stellt sich somit die Frage, inwieweit sich T-Zell- und B-Zell-Lymphome
hinsichtlich der Höhe der MDR1-Genexpression unterscheiden. Beim Menschen ist eine
Korrelation zwischen der P-Glykoproteinexpression und dem Immunphänotyp von
Lymphomen bereits beschrieben worden (CHENG et al. 1993). Lee und Mitarbeiter konnten
dagegen beim Hund keinen Zusammenhang nachweisen (LEE et al. 1996). In der
vorliegenden Studie unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen T-Zell-
und B-Zell-Lymphomen ebenfalls nicht deutlich. Überraschenderweise wiesen Hunde mit
einem T-Zell-Lymphom jedoch eine deutlich niedrigere MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe auf als die Patienten mit einem B-Zell-Lymphom. Zukünftige Studien sind
erforderlich, um diese unerwarteten Studienergebnisse zu überprüfen.
Im Gegensatz zu MDR1, MRP1 und MRP2 gelang eine Etablierung einer RT-PCR zum
Nachweis einer Expression von Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund in dieser Studie
nicht. Alle zum Nachweis verwendeten Primer wurden so ausgewählt, dass eine 100%iger
Sequenzhomologie des Amplikons zwischen Mensch und Hund bestand. Zwar gelang der
Nachweis von Survivin in Kolonkarzinomgewebe und genomischer DNA vom Menschen,
jedoch nicht in genomischer DNA oder Plazentagewebe vom Hund. Die Integrität der
verwendeten cDNA und genomischen DNA wurde überprüft. Die Ergebnisse der
durchgeführten Vorversuche lassen weitere Untersuchungen, wie eine Überprüfung der aus
der Genbank entnommenen Survivinsequenz, als notwendig erscheinen.
In verschiedenen Studien wurde das maligne Lymphom des Hundes als mögliches Modell für
das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen vorgeschlagen. Als Voraussetzung für Studien
zur Modulation bestehender Vielfachresistenzen beim malignen Lymphom des Hundes wird
die Etablierung eines sensitiven und reproduktiven Untersuchungsverfahrens zum Nachweis
87
möglicher, mit der Ausprägung einer MDR in Zusammenhang stehender Mechanismen
angesehen. Mit den in der vorliegenden Studie etablierten RT-qPCR-Assays steht ein solches
Nachweisverfahren zur Verfügung.
Die Ergebnisse der Studie lassen vermuten, dass ein Teil der an malignem Lymphom
erkrankten Hunde von einer Modulation der P-Glykoprotein-Transporterfunktion profitieren
würde. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese Patienten prospektiv zu erfassen und
die Wirksamkeit und Sicherheit einer etwaigen Therapie zu prüfen.
88
6 ZUSAMMENFASSUNG
K. Culmsee
Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen
Lymphom des Hundes
Eine systemische Chemotherapie ist derzeit die Therapie der Wahl bei Hunden mit
multizentrischen Lymphomen. Zwar spricht zu Behandlungsbeginn die überwiegende
Mehrheit der Tumoren sehr gut auf die Chemotherapie an, jedoch sind Rezidive aufgrund
erworbener Vielfachresistenzen (multidrug resistance, MDR) im Therapieverlauf relativ
häufig. Es wird angenommen, dass eine Steigerung der Expression verschiedener Gene, wie
z.B. des multidrug resistance 1–Gens (MDR1); der multidrug resistance associated-protein 1
(MRP1)- und 2 (MRP2)-Gene zur Ausprägung einer MDR führen können.
In der vorliegenden Studie wurde eine Reverse Transkription quantitative-Polymerase-
Kettenreaktion (RT-qPCR) im real time Modus zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und
MRP2-Genexpression in gesunden und neoplastischen Geweben beim Hund etabliert.
Die MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression wurde bei 50 an malignem Lymphom
erkrankten Hunden gemessen. Tumorgewebeproben wurden bei allen Patienten zum
Zeitpunkt der Diagnosestellung und bei 12 Hunden zusätzlich bei Ausbildung eines
Tumorrezidivs entnommen. 25 Hunde wurden mit einer Kombinationschemotherapie aus
L-Asparaginase, Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin und Prednisolon behandelt.
In allen untersuchten Tumorproben war eine Expression des MDR1- und MRP1-Gens
nachweisbar. Die Höhe der Expression variierte bei beiden Genen zwischen den untersuchten
Proben. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung wiesen 3 von 50 Lymphomen eine im Vergleich
zu unveränderten Lymphknotengewebe erhöhte MDR1- und 28 von 50 Lymphomen eine
erhöhte MRP1-Genexpression auf. Im Gegensatz zum MDR1- und MRP1-Gen war eine
Expression des MRP2-Gens in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung
oder zum Zeitpunkt des ersten Tumorrezidivs nachweisbar. Gastrointestinale Lymphome
wiesen eine höhere MDR1-Genexpression auf als multizentrische Lymphome (p=0,002).
Lymphompatienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Vergleich zum
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war, reagierten deutlich häufiger auf eine
89
Chemotherapie mit einer Vollremission als Hunde, bei den die MDR1-Genexpression
gesteigert war (p=0,002). So konnte bei keinem von drei Tumoren mit einer MDR1-
Genexpression höher als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere, aber bei 27 von 29
Tumoren ohne gesteigerter MDR1-Genexpression eine Vollremission erreicht werden. Ein
Zusammenhang zwischen der Therapieantwort und der Höhe der MRP1-Genexpression
bestand bei den untersuchten Patienten dagegen nicht (p=0,56).
Bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom unterschied sich die Länge des
ersten rezidivfreien Intervalls in Abhängigkeit zur Höhe der MDR1-Genexpression (p<0,001),
nicht aber in Abhängigkeit zur Höhe der MRP1-Genexpression.
Ein deutlicher Anstieg (≥ Faktor 2) der MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und
Rezidivausbildung war bei 7 von 12 Hunden nachweisbar. Dagegen war die Höhe der MRP1-
Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung mit Ausnahme eines
Hundes nicht wesentlich verändert. Bei den Hunden mit einem deutlichen Anstieg der MDR1-
Genexpression zwischen Diagnose und erstem Rezidiv war die mittlere Dauer des
Für 1 ml Reagenz werden 1ml PBS, 15 µl Avidin-Lösung (Reagenz A) und 15 µl biotinylierte
Peroxidase (Reagenz B) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (nach Zugabe der
Reagenzien A und B Lösung jeweils kurz mischen).
Lösung für die enzymhistochemische Farbreaktion (3,3 Diaminobenzidin 0,05%)
Für 200 ml Lösung werden 100 mg 3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in
50 ml PBS über mehrere Stunden gelöst (Stammlösung 0,2%ig, Lagerung bei –25 °C im
Dunkeln). Vor Gebrauch wird die Stammlösung 1:4 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
verdünnt und filtriert (Faltenfilter, Fa. Schleicher & Schuell). Der filtrierten Lösung werden
2 ml Wasserstoffperoxid (3%ig) zugesetzt.
Färbelösung Hämalaun nach MAYER
Für 2 l Färbelösung werden 1g Hämatoxylin mit 1 l dest. Wasser gelöst. Anschließend werden
in der Hämatoxylinlösung 200 mg Natriumjodat (NaJO3) und 50 g Kalialaun unter Schütteln
gelöst (blauviolette Lösung). Die Lösung wird mit 50 g Chloralhydrat und 1 l Zitronensäure
versetzt (rotviolette Lösung).
129
DEPC-behandeltes destilliertes Wasser (0,01%)
100 mg Diethylpyrocarbonat (DEPC) mit 1 l dest. Wasser in Glasflasche vermischen. Über
Nacht stehen lassen und autoklavieren.
Tris-Borat-EDTA-(TBE)-Puffer (5 x)
Für 1 l einer 5-fach konzentrierten Stocklösung des TBE-Puffers werden 54 g TRIS,
27,5 g Borsäure (H3BO3) und 20 ml 0,5 M EDTA (pH=8) mit dest. Wasser auf 1 l aufgefüllt.
1% iges Agarosegel
Für ein 1%iges Agarosegel werden 1 g Agarose in 100 ml 0,5 x TBE-Puffer suspendiert, in
der Mikrowelle kurz aufgekocht und bei Raumtemperatur auf 50-60 °C abkühlen gelassen.
Nach Zugabe von Ethidiumbromid (10 µg) wird die Lösung in die abgedichtete Gelkammer
mit eingesetzter Taschenschablone gegossen und 30-60 min bei Raumtemperatur bis zur
Gelbildung stehen gelassen.
9.3 Verwendete Formeln und Gleichungen
Berechnung der Gesamt-RNA-Konzentration
c (µg/ml) = OD260 x VF x 40 mg/µl
(c: Gesamt-RNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)
Berechnung der DNA-Konzentration
c (µg/ml) = OD260 x VF x 50 µg/ml
(c: DNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)
Berechnung der PCR-Produktanzahl
1µg eines 4361 bp langen PCR-Produktes entsprechen 2,1 x1011 Moleküle
130
9.4 Ergebnisse der RT-qPCR-Messdurchgänge
Tabelle 26: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
Tabelle 27: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
Tabelle 28: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
Tabelle 29: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
C -Wert t Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
Tabelle 30: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertenmLeber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
31
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
Tabelle 32: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
Tabelle 33: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP2-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I und II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
34
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP2 HPRT MRP2 HPRT Nr.