Kisspeptin Çelişkili Etkisi

S

Kisspeptinin Çelişkili Etkisi :

Oositin in vitro maturasyon değerini arttırırken, in vitro

kültürde “hatched” blastosist üzerinde olumsuz

etkilere sahiptir.

Arş. Gör. Göktan KUŞPINAR

Moderatör:

Prof. Dr. İlkin ÇAVUŞOĞLU

Bulgular ve Yorum

Giriş ve Çalışmanın Amacı

Gereç ve Yöntem

Deneylerin Tasarımı ve Hedefleri

Giriş ve Çalışmanın Amacı Kisspeptin hakkında genel bilgiler

Kisspeptin, maling melanoma hücrelerinde metastaz-baskılayıcı gen olarak kesfedilen

KISS1 geninin ürünü olan peptit


Kisspeptin hakkında genel bilgiler


Kisspetinology


KISS/KISS1R sisteminin üreme boyutu;



Kp sistemik şekilde üreme aksisinin ana

düzenleyicisi

Kp, GnRH-gonadotrophin salgılayıcı en potensiyel araç




Üreme dönemindeki – cyclic- sıçanlardan alınan ovaryum dokularında Kp ve

KISS1R immünoreaktivitesi,

KISS1R gen ekspresyonu hipofizer LH regülasyonu altındaki döngü içerinde

dalgalanmalar

KISS1 ve KISS1R genlerinin ovaryumdaki ekspresyonları• Balık (Nocillado et al. 2007; Filby et al. 2008)• Hamster (Shahed and Young 2009) • Domuz , keçi(Inoue et al. 2009) • Primatlarda (Gayta´n et al. 2009)

Ovulasyonu ve folikül atılımını engellediği bilinen, siklooksigenaz-II

inhibitörü, sıçan ovaryumunda KISS1 gen ekspresyonunu engelledi.

(Gayta´n et al. 2009)


Kisspeptin

Oosit Maturasyonu



Dişi pubertesi ve pre-ovulatuar gonadotropin artışında Kp kritik

rollerini sunacak potansiyel Kp inhibitörünü (p234) keşfetti.



Kp, trofoblast invasyonunun endokrin – parakrin düzenyeyicisi

Domuz üreme sisteminde ;

Ovaryumda Kisspeptin hiyerarşisinin lokal varlığını ortaya çıkartmak

İn vitro oosit maturasyonunda ve sonrasındaki embriyonik gelişimdeki

etkilerini araştırmak

Kisspeptin eklentisinin blastosist canlılığı ve “hatching” sonraki in vitro

gelişime etkisini göstermek

Çalışmanın Amacı

Gereç ve Yöntem

Ovaryum ve peptidlerin eldesi

Kumulus-Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF) toplama

Oosit in vitro maturasyonu (IVM)

Partenogenetik aktivasyon ve mature oositin in vitro kültürü

Gereç ve Yöntem

Blastosit kültürü

Total Blastosit hücre sayısı

Total RNA eldesi, semiquantitatif (qPCR) ve real-time PCR

Eliza

COC’larda ve erken embriyolarda KISS1R immünoflourasans işaretleme

Gereçler ve Yöntem

Ovaryum ve peptidlerin eldesi

• 0.9% NaCl içerisinde 25–30oC koşullarında 1 saat içerisinde

laboratuvara getirildi.

• Kp peptit analoğu ve Kp antagonist (p234) Phoenix Pharmaceuticals

Inc. (Burlingame, CA, USA)

Gereç ve Yöntem

Kumulus - Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF)

toplama

• Kumulus - oosit kompleksi antral folikülden aspire

• Oositler TCM-199- HEPES ( doku kültürü medium’u ) 3 kere yıkama

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) - in vitro maturasyon seçilim

Gereç ve Yöntem

Kumulus-Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF)

toplama

• Domuz foliküler sıvısı (PFF) 6-8 mm folikül boyutlarından aspire -

1600 g de 1 dk 25 oC santrifüj edildi.

• 1.2 ile 0.45 um por kalınlıklarında filtre edildikten sonra kullanıma

kadar -20 oC’ de saklandı.

Gereç ve Yöntem


Tanımlanmış Besiyeri Tanımlanmamış Besiyeri

FSH

FSH + PFFFSH + p234

FSH + KP

FSH + KP + p234

KP

FSH + PFF + p234FSH + LH

LH

LH + p234

Gereç ve Yöntem


• TCM-199 besiyerine ek olarak ;

10 ngmL-1 epidermal growth factor (EGF), 0.57mM cysteine, 0.91mM sodium

pyruvate, 5 mgmL-1 insulin and 1% (v/v) Pen-Strep (Invitrogen)

• 4’lü well dishes’lerde 25 oC ve nemli havada %5 lik CO2 44 saat – 22 saatlik 2

pasaj

• Tanımlanmayan koşullar besiyerine ek olarak; %10 PFF

• Tanımlanan koşullar 1 mg/mL FSH yada 1 mg/mLLH

Gereç ve Yöntem


• Oosit ve kumulus hücreleri 0.1% hyaluronidase içeren 0.1%

polyvinyl alcohol eklenmiş Dulbecco’s PBS (Invitrogen) de pipetaj

ile ayırıldı.

Yalın oosit ve ayrılmış kumulus hücreleri:

• Birinci polar cisimciğin atılım yüzdesini belirlemek için 25 mgmL-1

bisbenzamide (Hoechst 33258) DNA boyaması

• RT-PCR ve qPCR için total RNA eldesi

• Partenogenetik aktiviteyi takiben in vitro kültür

Gereç ve Yöntem

Partenogenetik aktivasyon ve matür oositin in vitro kültürü

• Yalın oositler, mannitol (0.25

M) içeren 4 kuyucuk içren

hücre kültür plate - 1,5 dk

• BTX Electro Cell

Manipulator 2001 (BTX, Inc.,

San Diego, CA, USA)

• Tek bir atım 1.5 kV cm-1 -

100 ms ile aktive edildi.

(Okada et al. 2006)

Gereç ve Yöntem

Partenogenetik aktivasyon ve matür oositin in vitro kültürü

• Elektroaktive edilen oositler TCM – 199 besiyeri ile yıkandı.

• 500 mL lik 4mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) - diploid zigotların üremesi için

4 saat 39OC, 5% CO2, 5% O2 ve 90% N2 koşullarında kültüre edildi.

• Muhtemel diploid zigotlar yıkandı ve mineral yağlar içeren 30-uL microdrops’luk

Domuz zigot medium-3’ e aktarıldı ve 39OC, 5% CO2, 5% O2ve 90% N2 koşullarında kültür

edildi.

• İkinci günde, embriyolar değerlendirildi. Blastosit oluşumu ve yayılımı altıncı günde,

atılımı sekizinci günde tespit edildi.

Gereç ve Yöntem

Blastosit kültürü

• 30 adet atılmış blastosit iki gurup : Kp içeren yada Kp içermeyen DMEM/F12*

*Ek olarak 10% (v/v) FBS (Invitrogen), 1mM glutamine (Invitrogen), 25mM NaHCO3 and 1%

(v/v) minimal essential medium (MEM) nonessential amino acid solution (Invitrogen)

• Mitomycin C uygulanmış fare embriyonik fibroblastları – besleyici hat - üzerinde

39OC nemli havada 5% CO2,ve 95% hava

Gereç ve Yöntem

Total Blastosit hücre sayısı

• Atılan blastositler PBS ile yıkandı

• Nukleus 25 mgmL-1 bisbenzamide ile 1 saat , 37OC de boyandı.

• Gliserol içerisinde lamel ile kaplandı

• 346 nm eksitasyon filtesi mevcut flourasans mikroskobu- hücre sayımı

• ImageJ 1.42q software (NIH, Bethesda, MD, USA) – hücre sayımı, dijital görüntü

Metarial ve Metod

Total RNA eldesi, semiquantitatif (qPCR) ve real-time qPCR

3 Küme 60 adet COC 3 Tekrar

Easy-Spin (DNA-free) Total RNA Extraction

Kit (iNtRON Biotechnology Inc., Kyunggi,

Korea)

RNA

cDNASuperscript III reverse transcriptase

(Invitrogen) - Maxime PCR PreMix kit-

i-starTaq (Intron Biotech., Seoul,

Republic of Korea)

Real time qPCR(Takara Bio Inc. guidelines )

• MOS, CCNB1, GDF9

BMP15

• BAK1 ve BCL2L1 genlerinin

GAPDH ekspresyonu ile

göreceli gen anlatım patternleri

kıyaslanması

Gereç ve Yöntem

Eliza

Domuz kisspeptin ELİSA kit - 450 nm A0

(KISS1; Hölzel Diagnostika GmbH, Cologne, Germany)

Serum Foliküler Sıvı ( PFF ) IVM besiyeri

Gereç ve Yöntem

COC’larda ve erken embriyolarda KISS1R immünoflourasans

isaretleme

COC ve atılmış blastosistler

• %4 parafolmaldehit + PBS 30 dakika - PBS’de yıkama - %0.1 Tritron-X 100 (v/v) içeren

PBS ile inkube

• %1’lik keçi serumu ile 1 saat RT -> +4 0C overnight

• 1:100 dilüsyonda tavşan- anti GRP54 primer antikor (%1’lik keçi serumunda hazırlanan )

ile 2 saat RT

• 1:200 dilüsyonudaki keçi anti tavşan sekonder antikoru ile 1 saat RT

• Blastosit nükleusları 40,60-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Vector Laboratories) içeren

Vectashield kapatma medium’u ile zıt boyandı.

Gereç ve Yöntem

GraphPad Prism 4.02 .(Graphpad Software Inc, San Diego, CA, USA)

Tukey testi - tek yönlü ANOVA ile analiz

P<0.05 yada P<0.01 ise veriler anlamı

İstatistiksel Analiz

Gereç ve Yöntem

Dizayn 1: Domuz ovaryumunda Kp ve hiyearşisinin ekspresyonu

Kp ve KISS1R, domuz ovaryumunda tespit edildiği için,domuz COC

örneklerinde;

• RT-PCR araçılığı ile KP hiearşik elementleri (KISS1, KISS1R, GNRH1, GNRHR,

LHB ve LHCGR) ekspresyon seviyeleri

• Serum - domuz foliküler sıvısı ( PFF ) kıyaslanan KP seviyeleri ölçümü

Gereç ve Yöntem

Dizayn 2: IVM’ de COC’larda KP hiyeraşisinin ekpresyonu

Kumulus hücrelerinde ve oositlerde ;

Ayrı ayrı ve zamana bağlı olarak (0,4,8,22,26, 30 ve 44 Saatlerde )

Kp sistemin ekspresyonu - pulsatif ekspresyon tespiti

Gereç ve Yöntem

Dizayn 3: Oositin ın vitro maturasyonunda ve gelişim yeteneğinde

Kp eklenmesinin etkileri

• Homojen kulumus

yayılımını sağlayan en

düşük FSH

konsantrasyonunu

Gereç ve Yöntem



• IVM besiyerine farklı

konsantrasyonlarda Kp

eklenmesi – oosit nuklear

maturasyon etkisi

Gereç ve Yöntem



• 10-6 M Kp ye ek olarak antagonistinin -p224-eklendiği yada

eklenmediği durumdaki etkileri

Nuklear maturasyon - ilk polar cismin atılımı

Oosit maturasyon markerlerı olan MOS, CCNB1, GDF9 ve BMP15

gen ekspesyonları,

Onları takip eden hiyerarşinin ekspresyonlarını (GnRHa and LHb

subunitleri),

Bu oositlerden gelişen embriyoları

Gereç ve Yöntem

Dizayn 4: FSH’ın KISS1R ekspresyonundaki etkisi

IVM’den elde edilen sonuçlar,

FSH’ın Kp aktivasyonu için kritik rolu

Kumulus hücreleri ile oositlerde RT-qPCR ile FSH’ın KISS1R ekspresyonu üzerine

etkilerini

Gereç ve Yöntem

Dizayn 5: Kp eklenmesinin blastosist canlılığı ve gelişimide etkileri

Partoneogenetik uyarım sonucu “expanded” hemde “hatched” domuz

blastosistlerinde KISS1R ekpresyonları

Kp eklenmesinin ;

• Blastosit canlılığı

• Trofoektoderm gelişimine etkisi

• Erken embriyolojik gelişime etkileri

Domuz ovaryumunda kisspeptin sistemi mRNA elementlerinin ekspresyonu

ve foliküler sıvıdaki seviyesi

Bulgular

ELISA Kp seviyesi

Foliküler sıvıda.

335±22.5 pgmL-1

Serum

25±,.2 pgmL-1, P<0.05).

Bulgular

IVM medium ELISA Kp seviyesi : 111±45.5 pgmL-1

_

Bulgular

KISSR1 immünoflorans isaretleme

Oosit Kumulus Yorum

KISS1 IVM 26-30 saat ---

Otokrin ve parakrin etki

KISS1R IVM süresince

GNRH1 Kesikli Pulsatif salgı

GNRHRIVM süresince

GNRH’nın doğrudan etkileri

LHB Kesikli – IVM 8.saat sonrasıGNRH bağımlı - Pulsatif

salgı

LHCGRIVM süresince

LHB, kumulus yayılımı için

gerekli

Bulgular

HİPOTEZ : Kp, GnRH’yı aktive ediyor, böylelikle oosit maturasyonunu

etkileyebilecek LH sentezi artıyor.

Bulgular

KISS1R ekspresyonu olan hücrelerde

Kp, Ca+2 salınımını arttırdığı - oositin sitoplazmik ve nüklear olgunlaşma

Bulgular

er

C-mos

MAPK

ERK 1- 2

Siklin - B1

Cdc – 2

GDF9 ve BMP15

Fertilizasyonun düzenlenmesinde önemli rolleri bulunan bir çok

üyesi olan ”Transforming growth factor” süper ailesi üyesi

Granüloza hücrelerinin regülasyonu

Folikülogenesis

Oosit maturasyonuda ilişkili oositten salgılanan faktörler

Bulgular

Kp eklentisinin GNRH1 ve LHB

ekspresyonlarına etkisi - 22. Saat IVM

Bulgular

FSH’ın KISSR1 ekspresyonuna etkisi - 11

Saat IVM

Bulgular

Sonuçlar

KP - Apoptotik etki

Literatüre Katkıları

Domuz ovaryumunda ilk defa Kp hiyerarşisinin, varlığını ve

etkileşimlerini,

Oosit maturasyonunda ve embriyo gelişim yeteğindeki otokrin-

parakrin etkileşimi arttırıcı rollerini gösterdi.

Ancak,Kp eklentisinin, “hatched” blastositlerin gelişiminde sistemik

ya da lokal regülasyonunu yansıtan çelişkili etkileri olabilir.

Teşekkür Ederim …

Kisspeptin Çelişkili Etkisi

Science