Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- VIS

8/19/2019 Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang …

http://slidepdf.com/reader/full/kiem-tra-do-nhiem-cheo-mot-so-thuoc-khang-sinh-trong-qua-trinh 1/63

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

------

------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA ĐỘ NHIỄM CHÉO MỘT SỐ

THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNHSẢN XUẤT THUỐC THÚ Y BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV- VIS

CÁN BỘ HƯỚ NG DẪN: SV THỰ C HIỆN:

Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi Nguyễn Văn Khi; MSSV: 2112146

Ths. Nguyễn Phương Hải Lê Minh Vấn; MSSV: 2112221

Ngành: CN Kỹ thuật hóa học-Khóa 37

Tháng 5/2015

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ ------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA ĐỘ NHIỄM CHÉO MỘT SỐ

THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNHSẢN XUẤT THUỐC THÚ Y BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV- VIS

CÁN BỘ HƯỚ NG DẪN SV THỰ C HIỆN:

Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi Nguyễn Văn Khi; MSSV: 2112146

Ths. Nguyễn Phương Hải Lê Minh Vấn; MSSV: 2112221

Ngành: CN Kỹ thuật hóa học-Khóa 37

Tháng 5/2015





TRƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC ----------

Cần Thơ, ngày 09 tháng 05 năm 2015

----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚ NG DẪN

1. Tên đề tài

“Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất

thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis”

2. Cán bộ hướ ng dẫn

Ths. Nguyễn Thị Diệ p Chi, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự Nhiên, Trường Đại học

Cần Thơ.

Ths. Nguyễn Phương Hải, Công ty SX - KD vật tư & thuốc thú y Vemedim.

3. Sinh viên thự c hiện

Họ và tên: Nguyễn Văn Khi MSSV: 2112146

Lê Minh Vấn MSSV: 2112221

Ngành: Công nghệ K ỹ thuật Hóa Học

Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét

4.1 Nhận xét về hình thứ c LV

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................





4.2 Nhận xét về nội dung LVTN

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

4.3 Nhận xét đố i vớ i t ừ ng sinh viên tham gia thự c hiện đề tài đề tài (ghi rõ t ừ ng nội

dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thự c hiện nế u có)

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

4.4 K ế t luận, đề nghị và điể m

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................


Cán bộ hướ ng dẫn

Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi





TRƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC ----------


----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện .........................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

2. Tên đề tài

“Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất

thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis”

3. Cán bộ hướ ng dẫn

Ths. Nguyễn Thị Diệ p Chi, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự Nhiên, Trường Đại học

Cần Thơ.

Ths. Nguyễn Phương Hải, Công ty SX - KD vật tư & thuốc thú y Vemedim.

4. Sinh viên thự c hiện

Họ và tên: Nguyễn Văn Khi MSSV: 2112146

Lê Minh Vấn MSSV: 2112221

Ngành: Công nghệ K ỹ thuật Hóa Học

Khóa: 375. Nội dung nhận xét

5.1 Nhận xét về hình thứ c LVTN

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................





5.2 Nhận xét về nội dung LVTN

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

5.3 Nhận xét đố i vớ i t ừ ng sinh viên tham gia thự c hiện đề tài đề tài (ghi rõ t ừ ng nội

dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thự c hiện nế u có)

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

5.4 K ế t luận, đề nghị và điể m

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................


Cán bộ phản biện

Ts. Đoàn Văn Hồng Thiện Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy





i

LỜ I CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn này, chúng tôi đã học hỏi đượ c nhiều kiến thức,

kinh nghiệm và những k ỹ năng thực hành rất bổ ích. Đó chính là nhờ sự giúp đỡ nhiệt

tình của gia đình, thầy cô và bạn bè. Chúng tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:

Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã luôn động viên tinh thần, giúp đỡ và hướ ng dẫn chúng

em trong suốt quá trình làm luận văn.

Chú Nguyễn Phương Hải đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cả về vật

chất lẫn tinh thần giúp chúng tôi hoàn thành tốt luận văn này.

Các anh chị phòng thí nghiệm hóa lý, công ty Vemedim đã tạo điều kiện và giúp

đỡ chúng tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.

Tất cả thầy cô bộ môn Công nghệ Hóa Học, khoa Công Nghệ đã truyền đạt cho

chúng em những kiến thức vô cùng bổ ích trong học tập và nghiên cứu.

Gia đình và người thân đã hổ tr ợ và giúp đỡ chúng tôi trong học tậ p.

Cuối cùng, chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn lớ p K ỹ thuật Hóa Học K37

đã luôn bênh cạnh, động viên và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thờ i gian học tậ p tại trườ ng.

C ần Thơ, tháng 5 năm 2015





ii

MỤC LỤC

LỜ I CẢM ƠN ..........................................................................................................................i

MỤC LỤC ............................................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................................iv

DANH MỤC HÌNH................................................................................................................ v

DANH MỤC BẢNG..............................................................................................................vi

ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: GIỚ I THIỆU TỔNG QUAN ...................................................................... 3

1.1 Nhiễm chéo (Cross – Contamination) trong sản xuất..........................................3

1.2 Khái quát về nhóm Floroquinolones ......................................................................4

1.2.1 Enrofloxacin ...................................................................................................5

1.2.2 Norfloxacin .....................................................................................................6

1.2.3 Marbofloxacin ................................................................................................7

1.3 Khái quát về k ỹ thuật thêm chuẩn ..........................................................................8

1.3.1 Cách thực hiện và công thức tính toán ........................................................8

1.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của k ỹ thuật thêm chuẩn ................................. 11

1.4 Phương pháp phân tích quang phổ ...................................................................... 11

1.4.1 Khái quát về phương pháp quang phổ ...................................................... 11

1.4.2 Định luật Lambert – Beer........................................................................... 12

1.4.3 Ứ ng dụng của quang phổ UV – Vis trong hóa học phân tích................ 15

1.5 Thẩm định k ỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ ........ 16

1.5.1 Mục đích....................................................................................................... 16

1.5.2 Nội dung ....................................................................................................... 16

1.5.3 Phương pháp thực hiện ............................................................................... 17

CHƯƠNG 2: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM ...............................................................22

2.1 Phương tiện thực hiện ........................................................................................... 22

2.1.1 Hóa chất và thuốc thử ................................................................................. 22

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 22

2.2 Cách tiến hành ....................................................................................................... 22

2.3 Hoạch định thí nghiệm.......................................................................................... 22

2.3.1 Thí nghiệm về khảo sát sự phụ thuộc của độ hấ p thu theo nồng độ ..... 22

2.3.2 Thí nghiệm về thẩm định phương pháp ................................................... 23

2.3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật ........................................................ 25

CHƯƠNG 3: THỰ C NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................................27

3.1 Thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của độ hấ p thu theo nồng độ .................... 27





iii

3.2 Thí nghiệm về thẩm định phương pháp.............................................................. 34

3.2.1 Độ chọn lọc .................................................................................................. 34

3.2.2 Độ lặ p lại ...................................................................................................... 35

3.2.3 Độ đúng ........................................................................................................ 38

3.2.4 Khoảng tuyến tính ....................................................................................... 39

3.2.5 Giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)..................... 41

3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật .................................................................. 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................49

4.1 K ết luận................................................................................................................... 49

4.2 Kiến nghị ................................................................................................................ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................51





iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DD, dd: Dung dịch

PTN: Phòng thí nghiệm

Abs: Độ hấ p thu (Absorption)

ADN: Acid Deoxyribonucleic

AOAC: Hiệ p hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of

Official Analytical Chemists)

ER: Enrofloxacin

GMP: Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice)ICH: Hội đồng hòa hợ p Quốc tế (International Conference on

Harmonization)

HLOQ: Giớ i hạn định lượ ng trên (High Limit of Quantification)

LLOQ: Giớ i hạn định lượ ng dướ i (Low Limit of Quantitation)

LOD: Giớ i hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giớ i hạn định lượ ng (Limit of Quantitation)

MB: Marbofloxacin

NL: Norfloxacin

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

Set-ref: Set reference

USFDA: Cục quản lí thực phẩm và dượ c phẩm Mỹ (United States Food

and Drug Administration)

USP: Dược điển Mỹ (United States Pharmacopeia)

UV – Vis: Ultraviolet - Visible

WHO: Tổ chức Y tế Thế giớ i (World Health Organization)





v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1: Quy trình kiểm tra nhiễm chéo trên thiết bị sản xuất......................................... 4

Hình 1-2: Công thức cấu tạo cơ bản của fluoroquinolones ................................................ 4

Hình 1-3: Công thức cấu tạo của Enrofloxacin .................................................................... 5

Hình 1-4: Tr ạng thái tự nhiên của Enrofloxacin .................................................................. 6

Hình 1-5: Công thức cấu tạo của Norfloxacin ...................................................................... 6

Hình 1-6: Tr ạng thái tự nhiên của Norfloxacin .................................................................... 7

Hình 1-7: Công thức cấu tạo của Marbofloxacin ................................................................. 7

Hình 1-8: Tr ạng thái tự nhiên của Marbofloxacin ............................................................... 8

Hình 1-9: Mô tả k ỹ thuật thêm chuẩn một điểm .................................................................. 8

Hình 1-10: Mô tả k ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm ...........................................................10

Hình 1-11: Tìm lại Cx bằng cách dùng đồ thị đối vớ i k ỹ thuật thêm chuẩn nhiều

điểm.......................................................................................................................10

Hình 1-12: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis.......................................................................12

Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự hấ p thụ ánh sáng của một dung dịch.....................................13

Hình 1-14: Máy quang phổ Ultrospec 2000 .......................................................................16

Hình 1-15: So sánh độ nhạy của phương pháp bằng đồ thị ..............................................20

Hình 3-1: K ết quả quét phổ của dung dịch NaOH 0,1 N ..................................................27

Hình 3-2: K ết quả quét phổ của Enrofloxacin ....................................................................28

Hình 3-3: K ết quả quét phổ của Norfloxacin......................................................................28

Hình 3-4: K ết quả quét phổ của Marbofloxacin .................................................................29

Hình 3-5: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 5 mg/L – 25 mg/L ......................31

Hình 3-6: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 0,05 mg/L – 1 mg/L..................32

Hình 3-7: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 5 mg/L – 25 mg/L.....................32

Hình 3-8: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 0,05 mg/L – 1 mg/L .................32

Hình 3-9: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 5 mg/L – 25 mg/L....................33

Hình 3-10: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 0,05 mg/L – 1 mg/L ..............33

Hình 3-11: Đánh giá độ chọn lọc của phương pháp quang phổ đối vớ i ER ...................35

Hình 3-12: Đồ thị sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của dãy mẫu thêm chuẩn ..........38

Hình 3-13: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Enrofloxacin .............39

Hình 3-14: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Norfloxacin ...............40

Hình 3-15: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Marbofloxacin ..........41

Hình 3-16: Phổ đồ k ết quả thí nghiệm 7 .............................................................................43

Hình 3-17: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 7.........................................................................43





Hình 3-22: Phổ đồ k ết quả thí nghiệm 10 ...........................................................................48

Hình 3-23: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 10 ......................................................................48



http://e/LUAN%20VAN/Luan%20van%202015/File-tong-hop%20-%20Copy.docx%23_Toc420528590







































vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1-1: K ỹ thuật thêm chuẩn một điểm ............................................................................ 9

Bảng 1-2: K ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm ......................................................................... 9

Bảng 1-3: Giá trị Rc (%) theo nồng độ chất phân tích ......................................................18

Bảng 1-4: Giá trị RSD (%) theo nồng độ chất phân tích...................................................19

Bảng 3-1: Điều kiện quét phổ thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo .........28

Bảng 3-2: Xây dựng dãy chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin .............30

Bảng 3-3: Điều kiện quét phổ ...............................................................................................30

Bảng 3-4: K ết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của

Enrofloxacin.........................................................................................................30


Marbofloxacin......................................................................................................31


Norfloxacin ..........................................................................................................31

Bảng 3-7: K ết quả thí nghiệm đánh giá độ chọn lọc..........................................................34

Bảng 3-8: Chuẩn bị bãy thêm chuẩn đối vớ i Enrofloxacin...............................................36

Bảng 3-9: K ết quả đánh giá độ lặ p lại trên Enrofloxacin ..................................................37

Bảng 3-10: K ết quả đánh giá độ lặ p lại trên Norfloxacin .................................................37

Bảng 3-11: K ết quả đánh giá độ lặ p lại trên Marbofloxacin.............................................37

Bảng 3-12: K ết quả quét phổ đánh giá độ đúng .................................................................38

Bảng 3-13: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Enrofloxacin ..........................................39

Bảng 3-14: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Norfloxacin ............................................40

Bảng 3-15: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Marbofloxacin .......................................40

Bảng 3-16: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 7 ..........................................42

Bảng 3-17: K ết quả quét phổ thí nghiệm 7 .........................................................................43


Bảng 3-19: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 9 ..........................................46


Bảng 3-21: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 10 ........................................47

Bảng 3-22: K ết quả quét phổ thí nghiệm 10 .......................................................................47





Đặt v n đ

SVTH: Nguy ễn Văn Khi & Lê Minh Vấ n Trang: 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong sản xuất thuốc thú y, quá trình tạo ra một thành phẩm thườ ng tr ải qua nhiều

giai đoạn như: kiểm tra chất lượng và chuẩn bị nguyên liệu, kiểm tra độ sạch của thiết

bị, dung cụ pha chế, kiểm tra chất lượ ng thuốc thành phẩm, phối tr ộn nguyên liệu,....

Trong đó, giai đoạn kiểm tra độ sạch của thiết bị, dụng cụ pha chế r ất quan tr ọng, bở i

nếu không thực hiện tốt giai đoạn này thì rất dễ xảy ra sự nhiễm chéo thành phần giữa

các thuốc thành phẩm trong sản xuất, ảnh hưởng đến chất lượ ng sản phẩm.

Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin là các kháng sinh thuộc nhóm

fluoroquinolones, theo Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25/02/2014 của Bộ

trưở ng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã bị cấm sử dụng trong ngành thủy sản

nhưng vẫn được cho phép sử dụng có giớ i hạn trong ngành thú y. Chính vì vậy, khi sản

xuất thuốc thú y và thuốc thủy sản trên cùng thiết bị, dụng cụ thì nguy cơ nhiễm chéo

chúng vào các loại thuốc thủy sản r ất dễ xảy ra.

Để kiểm soát lượ ng tồn dư Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin trong

thiết bị, dụng cụ pha chế thườ ng dùng các phương pháp quang phổ và HPLC. Nhưng

với phương pháp HPLC thì việc định lượng lượ ng tồn dư kháng sinh mất nhiều thờ i gian

và chi phí cao, không đáp ứng đượ c nhu cầu sản xuất. Mặc khác, hàm lượng kháng sinhtồn dư thườ ng r ất thấp nên kết quả phân tích thườ ng cho sai số lớn khi định lượ ng bằng

phương pháp quang phổ bằng các kỹ thuật thông thườ ng. Vớ i k ỹ thuật thêm chuẩn áp

dụng cho phương pháp quang phổ có thể khắc phục được nhược điểm đã nêu và đáp ứng

đượ c nhu cầu sản xuất.

Vì vậy, để đảm bảo k ết quả định lượ ng Enrofloxacin, Norfloxacin và

Marbofloxacin có hàm lượ ng thấ p trong thiết bị, dụng cụ pha chế có độ chính xác cao,

chúng tôi chọn thực hiện đề tài:

“ Ki ểm tra độ nhi ễm chéo một s ố thu ốc kháng sinh trong quá trình sản xu ấ t

thu ốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis ”

Mục đích nghiên cứu chính của đề tài:

Xây dựng quy trình định lượ ng Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có

hàm lượ ng thấ p trong thiết bị, dụng cụ pha chế bằng k ỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên

phương pháp quang phổ, nhằm tránh sự nhiễm chéo của chúng vào các loại thuốc thủysản, cũng như đảm bảo chất lượ ng thuốc thành phẩm. Thông qua đề tài này, chúng tôi





Đặt v n đ


hy vọng sẽ đưa ra một phương pháp định lượ ng Enrofloxacin, Norfloxacin và

Marbofloxacin có độ tin cậy cao và áp dụng tốt trong điều kiện thực tế sản xuất hiện

nay.

Địa điểm và thờ i gian thự c hiện đề tài: Đề tài đượ c thực hiện tại phòng thí nghiệm Vemedim thuộc Công ty SX - KD vật

tư & thuốc thú y Vemedim, số 7 Đườ ng 30 - 4, Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ.

Thờ i gian thực hiện từ tháng 01/2015 đến hết tháng 04/2015.





Chương 1: Gi ớ i thi ệu t ng quan


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

1.1 Nhiễm chéo (Cross – Contamination) trong sản xuất

Tạ p nhiễm là sự nhiễm không mong muốn các tạ p chất có bản chất hóa học hoặcvi sinh vật, hoặc tiểu phân lạ vào một nguyên liệu ban đầu hoặc thành phẩm trung gian

trong quá trình sản xuất, lấy mẫu, đóng gói hoặ đóng gói lại, bảo quản hoặc vận chuyển.

Như vậy nhiễm chéo là việc tạ p nhiễm của một nguyên liệu ban đầu, sản phẩm trung

gian, hoặc thành phẩm vớ i một nguyên liệu ban đầu hay sản phẩm khác trong quá trình

sản xuất (Cục quản lí dượ c, 2014).

Nhiễm chéo trên các sản phẩm sẽ gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng. Theo Cơ quan

quản lý dượ c phẩm và các sản phẩm y tế Anh thì nhiễm chéo trên các sản phẩm thuốc

là một trong những nguyên nhân hàng đầu trong việc thu hồi sản phẩm. Sự nhiễm chéo

các chất cấm sử dụng vào thuốc, thức ăn thủy sản không những ảnh hưởng đến chất

lượ ng sản phẩm mà còn gây thiệt hại nghiêm trọng cho nhà chăn nuôi.

Việc nhiễm chéo có cả nguyên nhân bên ngoài và bên trong và thườ ng xảy ra do

các nguyên nhân chủ yếu sau:

–

Bố trí các khu vực (sản xuất, kho, kiểm nghiệm,…) không phù hợ p với điều kiện

môi trườ ng.

– Không phân vùng rõ rệt trong sản xuất.

–

Lắp đặt hệ thống thông gió, điều hòa không khí không riêng biệ t.

– Các cấ p lọc trong hệ thống không riêng biệt.

–

Đường đi của nguyên liệu không đảm bảo quy trình một chiều.

–

Đường đi của công nhân không tuân thủ quy định.

–

Công nhân không tuân thủ quy trình vệ sinh công nghiệ p (trang phục bảo hộ lao

động, quy trình rửa tay, thay trang phục, giày dép, đi đường,…).

– Không lắp đặt hệ thống xử lí nướ c thải công nghệp, không có quy trình thu gom

và xử lí chất thải r ắn.

– Quy trình vệ sinh không đượ c thẩm định dẫn đến không phát hiện sự tồn dư các

vết nguyên liệu (nhiễm chéo giữa các sản phẩm), các chất tẩy r ửa, và khả năng

nhiễm vi sinh từ môi trườ ng.







Để hạn chế tình trạng nhiễm chéo trong sản xuất, cần phải khắc phục các nguyên

nhân trên bằng cách thực hiện tốt các nguyên tắc đưa ra trong GMP, cần phải có nhà

xưởng chuyên biệt và khép kín cho việc sản xuất những sản phẩm đặc biệt. Trong những

trườ ng hợ p ngoại lệ, có thể chấ p nhận sản xuất trong cùng nhà xưở ng với điều kiện là phải đặc biệt thận tr ọng và có tiến hành các thẩm định cần thiết.

Hình 1-1: Quy trình kiểm tra nhiễm chéo trên thiết bị sản xuất

1.2 Khái quát về nhóm Floroquinolones

Fluoroquinolones là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolones được tìm ra lần

đầu tiên vào những năm 1960. Cấu trúc phân tử của fluoroquinolones có một nguyên tử

Fluor gắn vào vị trí số 6 của hệ thống trung tâm.

Hình 1-2: Công thứ c cấu tạo cơ bản của fluoroquinolones







Dựa trên sự khác nhau về phổ kháng khuẩn, các fluoroquinolones được chia thành

nhiều thế hệ:

–

Thế hệ thứ nhất: acid nalidicixic

–

Thế hệ thứ hai: enrofloxacin, difloxacin, marbofloxacin và ciprofloxacin

–

Thế hệ thứ ba: obifloxacin, levofloxacin,...

– Thế hệ thứ tư: gatifloxacin, moxifloxacin, pradofloxacin,...

Fluoroquinolones có phổ kháng khuẩn r ộng, tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm

và Gram dương. Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại

bào, phân bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch

não tủy... Fluoroquinolones bài thải chủ yếu qua đườ ng tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt

chất và tái hấ p thu thụ động ở thận.

Cơ chế tác động chính của các fluoroquinolones là ức chế sự tổng hợ p ADN ở

nhân tế bào. Quá trình này đượ c thực hiện thông qua việc ức chế enzyme ADN gyrase,

một enzyme tham gia vào quá trình tháo xoắn và đóng xoắn của AND trong quá trình

nhân đôi, khiến cho AND không thể tổng hợp được. Ngoài ra, chúng còn tác dụng trên

cả mARN nên ức chế tổng hợ p protein ở vi khuẩn (Bermúdez-Almada, 2012; Pallo-

Zimmerman, 2010).

Nhóm Fluoroquinolones nói chung là nhóm kháng sinh có tính độc nên đã bị nhiều

nước đưa vào danh mục các hóa chất cấm sử dụng hoặc sử dụng hạn chế.

1.2.1 Enrofloxacin

Enrofloxacin có tên theo IUPAC là 1-cyclopropyl-7-(4-ethylpiperazin-1-yl)-6-

fluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid, có công thức phân tử là

C18H22FN3O3.

Hình 1-3: Công thứ c cấu tạo của Enrofloxacin







Enrofloxacin đượ c tổng hợ p lần đầu tiên bởi hai nhà nghiên cứu thuộc công ty

Bayer là Grohe và Peterson vào năm 1980, sau đó đượ c giớ i thiệu ra thị trường vào năm

1988. Nó đã trở thành quinolone quan tr ọng nhất trong điều tr ị các bệnh nhiễm trùng do

vi khuẩn (Bayer AG Leverkusen, 1999).

Tính chất hóa lý

Enrofloxacin có khối lượng phân tử là 359,4 (g/mol), tồn tại dướ i dạng bột k ết tinh

màu vàng nhạt; nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 219oC đến 221oC; tan ít trong nướ c.

Hình 1-4: Trạng thái tự nhiên của Enrofloxacin

Ứ ng dụng

Enrofloxacin đượ c sử dụng làm kháng sinh chủ yếu cho các chứng bệnh về đườ ng

hô hấ p, nhiễm trùng huyết, xương khớ p,... Ngoài ra, chất này còn đượ c sử dụng để kiểm

soát môi trường và phòng trị bệnh trong nuôi tr ồng thủy sản (nhưng hiện nay đã bị cấm

sử dụng).

1.2.2 Norfloxacin

Norfloxacin có tên theo danh pháp IUPAC là 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-piperazin-

1-yl-1H-quinoline-3-carboxylic acid, có công thức phân tử là C16H18FN3O3.

Hình 1-5: Công thứ c cấu tạo của Norfloxacin







Norfloxacin được công bố lần đầu tiên vào năm 1980 và là fluoroquinolone thế hệ

thứ hai đầu tiên được đưa ra thị trường vào năm 1986 (Bayer AG Leverkusen, 1999).


Norfloxacin có khối lượng phân tử là 319,331 (g/mol), tồn tại dướ i dạng bột k ết

tinh màu tr ắng; nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 220oC đến 221oC; tan ít trong nướ c, độ

tan tăng lên khi pH nằm trong khoảng <5 hoặc > 10.

Hình 1-6: Trạng thái tự nhiên của Norfloxacin

Ứ ng dụng

Norfloxacin đượ c sử dụng làm kháng sinh chủ yếu trong điều tr ị nhiễm trùng tiết

niệu và viêm đài bể thận, bệnh lây qua đường tình dục, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng

da và mô mềm,...

1.2.3 Marbofloxacin

Marbofloxacin có tên theo danh pháp IUPAC là 9-Fluoro-3-methyl-10-(4-methyl-

1-piperazinyl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-[1,3,4]oxadiazino[6,5,4-ij]quinoline-6-

carboxylic acid, có công thức phân tử là C17H19FN4O4.

Hình 1-7: Công thứ c cấu tạo của Marbofloxacin


Marbofloxacin có khối lượng phân tử là 362,356 (g/mol), tồn tại dướ i dạng bột k ết

tinh màu tr ắng đến vàng nhạt; nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 268oC đến 269oC; tan ít

trong nướ c.







Hình 1-8: Trạng thái tự nhiên của Marbofloxacin

Ứ ng dụngMarbofloxacin đượ c sử dụng làm kháng sinh chủ yếu trong điều tr ị nhiễm trùng

hô hấ p, nhiễm trùng da, tuyến vú, tiết niệu,…

1.3 Khái quát về kỹ thuật thêm chuẩn

1.3.1

Cách thực hiện và công thức tính toán

K ỹ thuật thêm chuẩn có thể tiến hành theo hai cách là thực hiện thêm chuẩn một

điểm và thêm chuẩn nhiều điểm.

K ỹ thu ật thêm chuẩ n m ột điể m: chuẩn bị hai bình định mức như nhau, cho vào

hai bình cùng một thể tích mẫu cần phân tích, V0. Thêm vào bình thứ hai một lượ ng

chính xác chất cần phân tích đã biết trướ c nồng độ. Thêm dung môi và thuốc thử cần

thiết vào cả hai bình và mang đi đo tín hiệu phân tích.

Hình 1-9: Mô tả k ỹ thuật thêm chuẩn một điểm







Bảng 1-1: K ỹ thuật thêm chuẩn một điểm

Bình 1 2

Thể tích bình định mức Vf

Thể tích mẫu thử Vo

Nồng độ mẫu thử CA Thể tích thêm chuẩn 0 Vs

Nồng độ thêm chuẩn 0 Cs

Nồng độ chất phân tíchtrong bình định mức

oA

f

VC .

V o o

A sf f

V VC . + C .

V V

Tín hiệu phân tích

0samp A

f

VS = kC

V

0 sspike A S

f f

V VS = k C + C

V V

Ta có công thức tính toán như sau:

samp spike

0 0 sA A S

f f f

S S

V V VC ( ) C ( ) C ( )

V V V

Trong đó:

Ssamp: Tín hiệu phân tích của dung dịch không thêm chuẩn.

Sspike: Tín hiệu phân tích của dung dịch có thêm chuẩn.

CS: Nồng độ chất chuẩn thêm vào.

CA: Nồng độ chất cần xác định trong mẫu ban đầu.

K ỹ thu ật thêm chuẩ n nhi ều điể m: nguyên tắc của k ỹ thuật này là sử dụng ngay

mẫu phân tích làm nền để chuẩn bị một dãy mẫu thêm chuẩn, bằng cách lấy một lượ ng

mẫu phân tích nhất định và thêm vào đó những lượ ng xác định chất cần phân tích theo

từng bậc nồng độ (theo cấ p số cộng) như bảng sau:

Bảng 1-2: K ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm

Mẫu 0 1 2 3 4

Nồng độ chất phân tích Cx Cx Cx Cx Cx

Nồng độ chuẩn thêm vào 0 C1 C2 C3 C4

Tín hiệu phân tích S0 S1 S2 S3 S4







Hình 1-10: Mô tả k ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm

Chọn các điều kiện thí nghiệm phù hợp và tiến hành ghi nhận tín hiệu phân tích.

Dựa vào tín hiệu phân tích theo nồng độ ta dựng đườ ng chuẩn.

K éo dài đườ ng thẳng S = a.C + b đến khi cắt tr ục hoành (tr ục nồng độ) tại một

điểm, giá trị đó chính là nồng độ chất phân tích Cx ta cần tìm.

Tuy nhiên, kỹ thuật thêm chuẩn một điểm thườ ng dẫn đến một số sai sót do thaotác chưa chính xác hoặc các ảnh hưở ng ngẫu nhiên nào đó trong quá trình c huẩn bị mẫu.

Trong khi đó, kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm có thể dễ dàng thấy đượ c các sai sót này

và kết quả thu đượ c dựa vào phương pháp toán thống kê nên sai số mắc phải thườ ng

thấp hơn kỹ thuật thêm chuẩn một điểm. Do đó trong các phép phân tích, ngườ i ta thườ ng

sử dụng k ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm.

S2

S1

S0

S3

S4

S

0 C1 C

2 C

3 C

4 C

x

S = a.C + b

C

Hình 1-11: Tìm lại Cx bằng cách dùng đồ thị đối vớ i k ỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm







1.3.2

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật thêm chuẩn

1.3.2.1

Ưu điểm

– Làm tăng tín hiệu của chất cần phân tích trong trườ ng hợp hàm lượ ng của

chúng trong mẫu ban đầu thấ p, dễ bị các thành phần khác trong mẫu ảnh

hưởng, gây sai lệch tín hiệu phân tích.

–

Có thể sử dụng trong trườ ng hợp các kỹ thuật khác như kỹ thuật so sánh, kỹ

thuật đườ ng chuẩn cho k ết quả phân tích có độ chính xác không cao.

– Có độ đúng và độ chính xác cao hơn so với phương pháp chuẩn ngoại.

1.3.2.2 Nhược điểm

–

Cần phải thực hiện lại thao tác thêm chuẩn đối vớ i mỗi lần phân tích. – Tốn thờ i gian khi phải thực hiện thao tác thêm chuẩn cho một dãy chuẩn.

1.4 Phương pháp phân tích quang phổ

1.4.1

Khái quát về phương pháp quang phổ

Ngày nay các phương pháp vật lý, đặc biệt là các phương pháp phổ đượ c sử dụng

r ộng rãi để nghiên cứu các hợ p chất hóa học cũng như các quá trình phản ứng hóa học.

Những phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối vớ i việc xác định các hợ p chất hữu cơ.

Cơ sở của phương pháp phổ là quá trình tương tác của các bức xạ điện từ đối vớ i

các phân tử vật chất. Khi tương tác với các bức xạ điện từ, các phân tử có cấu trúc khác

nhau sẽ hấ p thụ và phát xạ năng lượng khác nhau. Kết quả của sự hấ p thụ và phát xạ

năng lượng này chính là phổ, từ phổ chúng ta có thể xác định ngượ c lại cấu trúc phân tử

và hàm lượ ng chất phân tích.

Phương pháp quang phổ được chia thành:

Phương pháp quang phổ hấ p thụ phân tử:

Phương pháp phổ quay và dao động: Phương pháp quang phổ hồng ngoại.

Phương pháp phổ Raman

Phương pháp phổ UV-Vis.

Phương pháp phổ cộng hưở ng từ hạt nhân NMR.

Phương pháp phổ khối lượ ng.

Mỗi phương pháp quang phổ có một ứng dụng riêng. Trong luận văn này, chúng

tôi khảo sát các quá trình thí nghiệm trên phương pháp quang phổ UV – Vis.







Phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV – Vis (Ultraviolet -

Visible) là phương pháp phân tích đượ c sử dụng r ộng rãi từ lâu. Phổ UV – Vis có đượ c

do sự tương tác của các điện tử hóa trị ở trong phân tử hay nhóm phân tử với chùm tia

sáng kích thích (chùm tia bức xạ tr ong vùng UV – Vis) tạo ra. Nó là phổ của tổ hợ p sự

chuyển mức các điện tử liên kết, sự quay và dao động của phân tử, có các cực đại và cực

tiểu ở những vùng sóng Δλ nhất định tùy theo cấu trúc và liên kết của phân tử hay nhóm

nguyên tử có trong hợ p chất. Phổ UV – Vis chủ yếu nằm trong vùng sóng từ 190 nm –

800 nm.

Hình 1-12: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis

1.4.2

Định luật Lambert – Beer

1.4.2.1

Nội dung của định luật Lambert - Beer

Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượ ng sử dụng quang phổ

UV – Vis là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định

luật Lambert – Beer:

Nếu ta chiếu một chùm sáng đơn sắc có cường độ Io vào một cuvet chứa dung dịch

phân tích có bề dày nhất định, thì một phần chùm sáng đi qua cuvet, một phần phản xạ

và tán xạ ra các phương do va đập vào thành cuvet và một phần bị các phân tử trong

cuvet hấ p thu. Trong đó phần hấ p thụ bởi các phân tử chất phân tích trong cuvet là chính.

Nếu sau khi đi qua cuvet cường độ ánh sáng còn là I, khi đó sự hấ p thụ ánh sáng đơn

sắc của các phân tử chất phân tích trong cuvet đượ c biễu diễn như Hình 1-13:







Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự hấp thụ ánh sáng của một dung dịch

Đại lượ ng mật độ quang: 0IA = logI

Độ truyền quang :0

IT =I

Theo định luật Lambert – Beer: A = ε.L.C

Trong đó: ε là hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1.cm-1)

L là chiều dài của dung dịch ánh sáng đi qua (cm)

C là nồng độ của chất hấ p thu (mol/L)

Để tăng độ chính xác của việc phân tích bằng quang phổ UV – Vis, có thể k ết hợ p

các k ỹ thật đườ ng chuẩn, chuẩn ngoại, thêm chuẩn, phổ đạo hàm, ma tr ận, ….

1.4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến định luật Lambert – Beer

a) Ảnh hưở ng của nồng độ

Định luật Lambert – Beer chỉ đúng trong khoảng nồng độ xác định đối vớ i từng

chất.

Tại những nồng độ cao (thườ ng lớn hơn 0,01M) khoảng cách trung bình giữa các

phân tử chất tan hấ p thụ ánh sáng bị thu hẹ p tớ i mức tác động đến sự phân bố điện tíchcủa các phân tử xung quanh. Điều này làm thay đổi khả năng hấ p thụ bức xạ đơn sắc,

dẫn đến làm sai lệch mối quan hệ tuyến tính giữa Abs và nồng độ C của chất hấ p thu

bức xạ đó.

Tại những dung dịch có nồng độ thấ p, Abs của chất cần đo không lớn hơn nhiều so

vớ i Abs của dung môi nên Abs tổng hợ p của dung dịch đo bao gồm hai giá trị Abs của

chất đo và dung môi. Điều này làm sai lệch định luật.







Trong thực tế, khoảng nồng độ từ thấp đến cao mà trong khoảng đó hàm số

Abs = f(C) có hệ số tương quan R ≥ 0,9990 thì được xem như khoảng tuyến tính của

định luật.

b)

Ảnh hưở ng của tia đơn sắc

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch đo là tia

đơn sắc.

Mỗi tia đơn sắc có một tương ứng (Ví dụ tia đỏ có = 800nm; tia xanh lam có

= 435nm). Mỗi tia đơn sắc tương ứng vớ i một độ hấp thu riêng (). Nếu ánh sáng

truyền qua không đơn sắc thì của dung dịch đo là tổng hợ p của các ở các khác nhau

có trong ánh sáng truyền qua.

Tuy nhiên, trong thực tế r ất khó tạo được ánh sáng đơn sắc mà chỉ tạo đượ c một dải

bước sóng quanh giá trị mong muốn, tức là λ + Δλ. Thiết bị có bộ đơn sắc hóa càng tốt

thì Δλ càng nhỏ. Các máy quang phổ hiện đại có Δλ trong khoảng ±1nm.

c) Ảnh hưở ng của độ trong dung dịch

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch thật (dung

dịch hoàn toàn trong suốt).

Đối vớ i dung dịch thật, quang trình là bề dày của cốc đo chứa dung dịch mà ánhsáng chiếu qua (l).

Khi dung dịch không trong suốt (chứa các tiểu phân li ti), ánh sáng chiếu qua dung

dịch bị các tiểu phân này cản lại nên không đi hết quang trình, do đó giá tr ị l không còn

là hằng số như dung dịch thật.

d) Ảnh hưở ng của chất gây nhiễu

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch đo chứa

đơn chất hay là hỗn hợp có chứa thành phần không gây nhiễu.

Thành phần gây nhiễu là thành phần có max gần vớ i max của chất khảo sát. Nếu

tại max của chất khảo sát, Abs của chất gây nhiễu < 5% Abs chất khảo sát thì xem như

chất đó không gây nhiễu.

Ngoài ra, để triệt tiêu sự gây nhiễu của dung môi hòa tan chất khảo sát thì cốc so

sánh phải chứa dung môi hòa tan. Thực hiện tính năng Set reference (Set-ref) của máy

sẽ triệt tiêu nhiễu do dung môi hòa tan gây ra.







1.4.3

Ứng dụng của quang phổ UV – Vis trong hóa học phân tích

Phương pháp quang phổ UV-Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích

định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắc của phương

pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa Abs và nồng độ dung dịch theo

định luật Lambert – Beer.

Phương pháp UV-Vis còn đượ c sử dụng để xác định hằng số cân bằng, hằng số phân

li và nghiên cứu động học phản ứng.

Ưu điểm:

Độ nhạy cao: giớ i hạn dò tìm của phổ hấ p thụ phân tử trong khoảng

10 -4 M đến 10 -5 M, thậm chí lên đến 10 -7 M nếu áp dụng thêm các k ỹ thuật

thích hợ p. Sai số tương đối nhỏ (chỉ 1% - 5%).

Độ chọn lọc từ trung bình đến cao tùy thuộc vào max của chất khảo sát.

Trong vùng tử ngoại (UV), nhiều chất có max gần nhau nên có thể gây nhiễu

lẫn nhau dẫn đến độ chọn lọc không cao. Trong vùng khả kiến (Vis), chất

nào có màu đặc trưng sẽ có max đặc trưng nên ít gây nhiễu lẫn nhau dẫn

đến độ chọn lọc cao hơn.

Ngoài ra, đối với các máy có tính năng quét phổ theo và lấy đạo hàm của

hàm số Abs = f(C) thì tính năng chọn lọc được nâng cao rất nhiều.

Độ chính xác cao: thang đo Abs trong các máy quang phổ UV-Vis hiện nay

là 0,001 3,000 hoặc 0,0001 4,0000. Như vậy sai số tương đối về Abs

nằm trong khoảng 0,01% 0,1%.

Dễ thao tác và thực hiện nhanh chóng.

Chi phí tương đối thấ p (thấp hơn phương pháp HPLC).

Trong đề tài luận văn này, chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – Vis Ultrospec

2000 của Pharmacia – Anh, thuộc phòng thí nghiệm Vimedim của Công ty SX - KD vật

tư & thuốc thú y Vemedim với các thông số k ỹ thuật như sau:







Hình 1-14: Máy quang phổ Ultrospec 2000

1.5

Thẩm định kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ

1.5.1 Mục đích

Thẩm định phương pháp phân tích là sự thực hiện các thí nghiệm nhằm cung cấ p

bằng chứng khách quan chứng minh r ằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu

đặt ra. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu trong việc xây

dựng một phương pháp phân tích.

1.5.2

Nội dung

Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối với các phương pháp

phân tích hóa học, các yêu cầu cần thẩm định bao gồm:

–

Tính đặc hiệu, độ chọn lọc (Specifility/Selectivity)

–

Độ tuyến tính và đườ ng chuẩn (Linearity and Calibration curve)

–

Độ đúng (Trueness)

– Độ chụm (Precision)

–

Độ bền vững (ổn định) của phương pháp (Robustness/Ruggedness)

– Giớ i hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

–

Giớ i hạn định lượ ng (Limit of Quantitation – LOQ)

Việc lựa chọn các yêu cầu thẩm định phụ thuộc vào đối tượng áp dụng của phương

pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm. Trong nội dung đề tài, chúng tôi

lựa chọn các thông số thẩm định phương pháp phân tích bao gồm:

– Độ chọn lọc

–

Độ đúng

–

Độ lặ p lại – Độ tuyến tính

Khoảng quét: 190 – 1100nm

Độ phân giải bước sóng: 1nm

Thang đo (Abs): 0 – 3

Độ phân giải Abs: 0,001

Số cốc đo: 5 cốc và 1 cốc đối chứng

Quét phổ theo và lấy đạo hàm đến bậc 4







–

Giớ i hạn phát hiện

– Giớ i hạn định lượ ng

1.5.3 Phương pháp thực hiện

1.5.3.1 Độ chọn lọc

a) Định nghĩa:

Độ chọn lọc là k hả năng của phương pháp có thể xác định chính xác thành phần

khảo sát trong sự hiện diện của các thành phần khác có trong mẫu thử (như các tạ p chất,

các thành phần tiền chất, các chất chuyển hóa,...).

b) Yêu cầu:

Sự khác biệt giữa giá trị tìm lại của thành phần khảo sát ở mẫu đơn và mẫu đathành phần phải nhỏ hơn độ không đảm bảo đo (U) của giá trị tìm lại ở mẫu đơn. Độ

chọn lọc có thể tính toán theo công thức:

∆R =Ñôn Ña

R - R ≤ 2UĐơn. (1)

Hay có thể tính đơn giản hơn bằng công thức:

Ñôn

R

R

=

Ñôn Ña

Ñôn

R - R100%

R ≤ 0,5% (2)

c) Cách xác định:

So sánh kết quả của mẫu chỉ chứa chất khảo sát (R đơn) vớ i mẫu chứa chất khảo sát

và nhiều thành phần khác (R đa) ở cùng nồng độ. Áp dụng công thức (2) để tính toán.

Nói chung, sự khác biệt của hai k ết quả càng nhỏ thì độ chọn lọc của phương pháp

thử càng cao

1.5.3.2 Độ đúng

a) Định nghĩa:

Độ đúng là một đặc trưng quan trọng trong một phép phân tích định lượng. Độ

đúng biểu thị độ gần của k ết quả đo so với giá trị thực của mẫu (hoặc với giá trị chấ p

nhận là đúng). Độ đúng là một khái niệm tương đối, bở i một phương pháp có độ đúng

hay không còn phụ thuộc nhiều vào yêu cầu của phòng thí nghiệm và mức độ khó khăn

của vấn đề cần phân tích.

b)

Cách xác định:

Có thể xác định độ đúng R c theo một trong các cách sau:







–

Đo tín hiệu phân tích của dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết chính xác (từ

50% – 150% nồng độ dự kiến). Tỉ số giữa k ết quả đo và trị số đã biết thể hiện

độ đúng của phương pháp.

–

So sánh kết quả của phương pháp mớ i vớ i phương pháp cũ đã biết độ đúng. –

Phương pháp thêm chuẩn: thêm lượng đã biết (từ 50 – 150% nồng độ dự kiến)

của chất chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ. Dùng phương pháp thử để tìm lại

giá trị sau khi thêm vào.

R c (%) = Recovery

Theory

X100

X

Trong đó: XRecovery = Xsau Xtrước

XTheory = lượng chất chuẩn thêm vào

–

Phương pháp mẫu tr ắng: thêm lượng đã biết (xấ p xỉ nồng độ dự kiến) của chất

chuẩn vào mẫu tr ắng. Dùng phương pháp thử để tìm lại giá trị sau khi thêm

vào.

c) Yêu cầu:

Tùy theo nồng độ đo của mẫu mà R c phải nằm trong khoảng sau:

Bảng 1-3: Giá trị Rc (%) theo nồng độ chất phân tích

Nồng độ C(%) R c(%)

C 10,0 98,0 102,0

1,0 ≤ C < 10,0 90,0 110,0

0,1 ≤ C < 1,0 80,0 120,0

C < 0,1 75,0 125,0

*: C ục Nông dược và thuốc thú y Australia

1.5.3.3 Độ lặp lại

a) Định nghĩa:

Độ chụm diễn tả mức độ gần nhau của một dãy kết quả đo (hay còn gọi là độ phân

tán – degree of scatter).

Độ chụm gồm: độ lặ p lại (repeatability) và độ tái lặ p (reproducibility).

– Độ lặ p lại: áp dụng cho dãy kết quả đo một mẫu trong cùng điều kiện trong

khoảng thời gian liên tục (khoảng thờ i gian ngắn)

–

Độ tái lặ p: áp dụng cho dãy kết quả đo một mẫu trong cùng điều kiện trongkhoảng thời gian không liên tục (khoảng thời gian dài và đo cách khoảng).







b) Cách xác định:

Có thể xác định độ lặ p lại bằng các cách sau:

–

Tiến hành thí nghiệm lặ p lại ít nhất 6 lần trên cùng một mẫu (mỗi lần lặ p lại

từ khâu cân hay đong mẫu). Mẫu phân tích là mẫu chuẩn hoặc mẫu tr ắng cóthêm chuẩn.

– Tính toán kết quả dựa trên các kết quả phân tích các mẫu thực đã làm.

Tiêu chí đánh giá độ lặ p lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Nồng độ chất

phân tích càng thấp thì RSD càng cao.

Cách tìm RSD bằng phần mềm Excel:

–

Tìm trị số trung bình (mean): Ở một ô trống muốn hiển thị mean, gõ

= AVERAGE (Chọn (bôi đen) dãy số cần tìm), enter .

– Tìm độ lệch chuẩn (Standard Deviation – SD). Đưa chuột đến ô trống muốn

hiển thị SD, gõ = STDEV(chọn (bôi đen) dãy số cần tìm), enter .

–

Tìm RSD (%): Ở một ô trống muốn hiển thị RSD, gõ = “ô SD”*100/“ô mean”,

enter .

c) Yêu cầu:

Độ lặ p lại xác định dựa trên RSD. RSD càng nhỏ, phương pháp thử càng chínhxác. Giá trị RSD yêu cầu do mỗi PTN đưa ra.

Bảng 1-4: Giá trị RSD (%) theo nồng độ chất phân tích

Nồng độ C(%) RSD(%)

C 10,0 ≤ 2,0

1,0 ≤ C < 10,0 ≤ 5,0

0,1 ≤ C < 1,0 ≤ 10,0

C < 0,1 ≤ 20,0

*: C ục Nông dược và thuốc thú y Australia

1.5.3.4

Độ tuyến tính

Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các dung

dịch đo của mẫu thử vớ i k ết quả phân tích của phương pháp. Sự tương quan tuân theo

phương trình bậc nhất: y = f(C) = ax + b.

Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R). R được tính bằng phần

mềm Excel. R càng gần 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao. Ngoài ra cũng

cần xem xét các giá trị a và b như sau:







–

Hệ số góc a: thể hiện độ nhạy của phương pháp phân tích, a càng lớn thì phương

pháp càng nhạy.

–

Tung độ góc b: thể hiện độ nhiễu của phương pháp phân tích, b càng nhỏ thì

phương pháp phân tích càng ít bị nhiễu.

Theo hình 1-15 , phương pháp 1 có hệ số góc lớn hơn nên có độ nhạy hơn so vớ i phương pháp 2.

1.5.3.5 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giớ i hạn phát hiện là nồng độ thấ p nhất của chất cần phân tích trong mẫu thử còn

có thể phát hiện đượ c bằng phương pháp đề xuất. Đây là nồng độ thấ p nhất của chất

phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối vớ i

phương pháp định lượ ng). Giớ i hạn phát hiện thườ ng biểu diễn dướ i dạng phần trăm,

phần ngàn của chất thử có trong mẫu.

Cách xác định:

LOD có thể xác định dựa vào công thức sau:

3,3.SDLOD =

a

Trong đó, a là độ dốc của đường chuẩn và SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu phân

tích. SD có thể tính bằng nhiều cách khác nhau như:

+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng.

Phương pháp 1

Phương pháp 2

Cùng giá trị S

Giá trị nồng độ nhỏ hơn

=> Pp nhạy hơn

Giá trị nồng độ lớn hơn

=> Pp kém nhạy hơn

T í n

h i ệ u

Hình 1-15: So sánh độ nhạy của phương pháp bằng đồ thị







+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD .

1.5.3.6

Giới hạn định lượng (LOQ)

Giớ i hạn định lượng là giá trị nồng độ tớ i hạn của chất cần phân tích chứa trong

mẫu thử mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được mà vẫn đảm bảo độ

đúng và độ chụm của phương pháp.

LOQ được phân thành hai loại:

– Giớ i hạn định lượng dướ i (LLOQ): giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất cần phân

tích chứa trong mẫu thử mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượ ng

đượ c.

– Giớ i hạn định lượng trên (HLOQ): giá trị nồng độ lớ n nhất của chất cần phân

tích chứa trong mẫu thủ mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượ ng

đượ c.

Cách xác định:

Phương pháp xác định LOQ tương tự như trườ ng hợp LOD nhưng theo công thức

sau:

10SDLOQ

a

.





Chương 2: Ho ạch định thí nghiệm


CHƯƠNG 2: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM

2.1 Phương tiện thực hiện

2.1.1

Hóa chất và thuốc thử Enrofloxacin (chuẩn)

Norfloxacin (chuẩn)

Marbofloxacin (chuẩn)

Dung dịch NaOH 0,1 N

Nướ c cất, nướ c RO

2.1.2

Dụng cụ và thiết bị

Cân phân tích – CP 224S Sartorius

Bể siêu âm – 1510 Branson

Quang phổ k ế UV-Vis Ultrospec 2000 Pharmacia

Bình định mức, pipet, cuvet thạch anh đạt cấp chính xác loại A

2.2 Cách tiến hành

Đầu tiên, tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của của độ hấ p thu (Abs) vào bước sóng

() và nồng độ đối vớ i Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin. Sau đó tiến hành

các thí nghiệm về thẩm định phương pháp và thực hiện các thí nghiệm xác định mức độ

nhiễm chéo trên mẫu thật.

2.3 Hoạch định thí nghiệm

2.3.1 Thí nghiệm về khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ

Thí nghiệm 1: Kh ảo sát sự ph ụ thu ộc c ủa Abs theo c ủa m ẫ u tr ắng

a) Mục đích:

Xác định sự ảnh hưở ng của mẫu tr ắng đối vớ i chất khảo sát.

b) Nội dung:

Thực hiện quét phổ toàn dãy với dung môi sử dụng là dung dịch NaOH 0,1 N.







Thí nghiệm 2: Kh ảo sát sự ph ụ thu ộc c ủa Abs theo đố i v ớ i Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin

a) Mục đích:

Xác định bước sóng mà tại đó Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có độ

hấ p thu cực đại (max)

b) Nội dung:

– Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin.

–

Tiến hành quét phổ trên máy quang phổ UV-Vis.

–

Từ k ết quả thu đượ c, xác định max của mỗi chất.

Thí nghiệm 3:

Kh ảo sát sự ph ụ thu ộc Abs theo n ồng độ đố i v ớ i Enrofl oxacin,Norfloxa cin và Marbofloxacin

a) Mục đích:

Khảo sát khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Enrofloxacin, Norfloxacin và

Marbofloxacin.

b) Nội dung:

Tạo dãy dung dịch chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin với các

nồng độ khác nhau và tiến hành đo trên máy quang phổ UV-Vis tại max của mỗi

chất.

Từ k ết quả thu được, xác định sự phụ thuộc của Abs theo nồng độ của mỗi chất

2.3.2

Thí nghiệm về thẩm định phương pháp

2.3.2.1

Độ chọn lọc

Thí nghiệm 4: Đánh giá độ ch ọn l ọc c ủa k ỹ thu ật thêm chuẩn áp dụng trên phương

pháp quang phổ

a) Mục đích:

Đánh giá mức độ chọn lọc của k ỹ thuật thêm chuẩn trên áp dụng trên phương pháp

quang phổ.

b) Nội dung:

– Tạo các mẫu đơn thành phần có hàm lượ ng biết trướ c (chọn Enrofloxacin để thực

hiện thí nghiệm).







– Tạo mẫu đơn thành phần của chất có khả năng gây nhiễu (chọn thành phần gây

nhiễu là Norfloxacin).

– Tạo mẫu đa thành phần gồm Enrofloxacin và Norfloxacin có hàm lượ ng

Enrofloxacin biết trước tương tự trong mẫu đơn. – Đo phổ của các mẫu trên và rút ra nhận xét.

2.3.2.2 Độ đúng

Thí nghiệm 5:

Đánh giá độ đúng của k ỹ thu ật thêm chuẩn trên phương pháp quang

ph ổ

a) Mục đích:

Đánh giá độ đúng của k ỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ dựa vàogiá trị độ tìm lại R c.

b) Nội dung:

–

Chuẩn bị mẫu của một chất khảo sát có hàm lượ ng biết trướ c (chọn Enrofloxacin).

–

Tạo dãy mẫu thêm chuẩn và đo tín hiệu phân tích bằng máy quang phổ UV-Vis.

–

Xác định độ đúng của k ết quả, yêu cầu đặt ra: 95% ≤ R c ≤ 105%.

2.3.2.3

Độ lặp lại

Thí nghiệm 6: Đánh giá độ l ặp l ại c ủa k ỹ thu ật thêm chuẩn trên phương pháp quang

ph ổ

a) Mục đích:

Đánh giá độ lặ p lại của k ỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ dựa trên

độ lệch chuẩn tương đối RSD.

b) Nội dung:

Chuẩn bị các mẫu Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có hàm lượ ng

biết trướ c.

Tạo dãy mẫu thêm chuẩn và đo tín hiệu phân tích trên máy quang phổ UV-Vis

đối vớ i các mẫu trên.

Lặ p lại các thao tác thí nghiệm như trên 6 lần.

Từ k ết quả thu được, xác định RSD với yêu cầu RSD < 2%.







2.3.2.4 Độ tuyến tính

a) Mục đích:

Xác định độ tuyến tính của Abs và nồng độ đối vớ i k ỹ thuật thêm chuẩn áp dụng

trên phương pháp quang phổ. Đánh giá dựa vào hệ số tương quan R và hàm số tươngquann tuyến tính Abs = a.C + b.

b) Nội dung:

Dựa vào các kết quả của thí nghiệm 3, xác định khoảng tuyến tính của

Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin. Khoảng tuyến tính phải thõa điều

kiện R > 0,9990.

Tìm phương trình hồi quy tuyến tính của mỗi chất.

2.3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

a) Mục đích:

Xác định Giớ i hạn phát hiện (LOD) và Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) của phương

pháp.

b) Nội dung:

Dựa vào kết quả thí nghiệm 3 và thí nghiệm 6, tính toán LOD và LOQ theo công

thức đã nêu ở mục 1.5.3.6.

2.3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật

Thí nghiệm 7: Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Enrofloxacin trong bồn tr ộn VMDX1068

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn mã số VMDX1068 sau khi tr ộn mẻ thuốc VIMENRO concentrated có

chứa hàm lượ ng Enrofloxacin 50% đượ c vệ sinh sạch.

Tráng k ỹ bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose.

Định lượ ng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) K ết quả:

Tính lượ ng Enrofloxacin còn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

Yêu cầu: hàm lượ ng Enrofloxacin tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấp hơn

10 mg/kg tá dượ c.







Thí nghiệm 8: Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Enrofl oxacin tr ong b ồn tr ộn VMD1078

Thực hiện và tính toán tương tự thí nghiệm 7 nhưng áp dụng vớ i mẫu từ bồ tr ộn

VMD1078 sau khi tr ộn mẻ thuốc VIMENRO chứa hàm lượ ng Enrofloxacin 10%.

Thí nghiệm 9:

Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Nor f loxacin trong b ồn tr ộn VMD1070

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn mã số VMDX1070 sau khi tr ộn mẻ thuốc NORFLOXACIN 50 có chứa

hàm lượ ng Norfloxacin 50% đượ c vệ sinh sạch.


Định lượ ng Norfloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) K ết quả:

Tính lượ ng Norfloxacin còn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

Yêu cầu: hàm lượ ng Chloramphenicol tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấp hơn

10 mg/kg tá dượ c.

Thí nghiệm 10:

Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Marbofloxacin trong b ồn tr ộn

VMD1077

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn mã số VMDX1077 sau khi tr ộn mẻ thuốc MARBO VIRYL ONE có chứa

hàm lượ ng Marbofloxacin 20% đượ c vệ sinh sạch.


Định lượ ng Marbofloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) K ết quả:

Tính lượ ng Marbofloxacin còn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

Yêu cầu: hàm lượ ng Marbofloxacin tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấ p hơn 10

mg/kg tá dượ c lactose.





Chương 3: Th ự c nghi ệm và k t qu ả


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ

Thí nghiệm 1: Kh ảo sát Abs theo c ủa m ẫ u tr ắng

a) Thự c hiện:

Chuẩn bị mẫu tr ắng: dung dịch NaOH 0,1N

Quét phổ:

+ Set-ref: 271 nm

+ Cốc so sánh là cốc r ỗng

+ Quét trong khoảng từ 190 nm – 1100 nm.

b) K ết quả:

Hình 3-1: K ết quả quét phổ của dung dịch NaOH 0,1 N

c) Nhận xét:

Ở vùng bước sóng từ 250 nm – 850 nm: Mẫu tr ắng NaOH gần như khônghấ p thu quang phổ.

Chọn cốc so sánh là NaOH 0,1N cho các thí nghiệm về sau đối vớ i ba chất

khảo sát.

Thí nghiệm 2: Kh ảo sát sự ph ụ thu ộc c ủa Abs theo đố i v ớ i Enrofloxacin,


a) Thự c hiện:

Chuẩ n bị mẫ u chuẩ n:

Enrofloxacin: cân 100 mg chất chuẩn Enrofloxacin, cho vào BĐM 100 ml, phaloãng 1/50.

Norfolxacin: chuẩn bị tương tự Enrofloxacin.







Marbofloxacin: chuẩn bị tương tự Enrofloxacin.

Quét phổ :

Bảng 3-1: Điều kiện quét phổ thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo

Enrofloxacin Norfloxacin Marbofloxacin

Dung môi NaOH 0,1N

Cốc so sánh NaOH 0,1N

Set-ref = 271 nm =273 nm = 290 nmKhoảng quét phổ Trong khoảng 190 nm – 1100 nm

b) K ết quả:

Hình 3-2: K ết quả quét phổ của Enrofloxacin

Hình 3-3: K ết quả quét phổ của Norfloxacin







Hình 3-4: K ết quả quét phổ của Marbofloxacin

c) Nhận xét: Vớ i Enrofloxacin:

Dung dịch có hấ p thu cực đại ở = 271 nm (max = 271 nm).

Chọn max = 271 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.

Vớ i Norfloxacin:

Dung dịch có hấ p thu cực đại ở = 273 nm (max = 273 nm).

Chọn max = 273 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.

Vớ i Marbofloxacin:

Dung dịch có hấ p thu cực đại ở = 290 nm (max = 290 nm). Chọn max = 290 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.

Thí nghiệm 3: Kh ảo sát sự ph ụ thu ộc Abs theo n ồng độ đố i v ớ i Enrofl oxacin,


a) Thự c hiện:

–

Chuẩ n bị các dãy dung d ịch chuẩ n Enrofloxacin:

Cân 103,9 mg chất chuẩn Enrofloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm dung dịch

NaOH 0,1 M đến vạch.

Tạo dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2.

– Chuẩ n bị các dãy dung d ịch chuẩ n Norfloxacin:

Cân 111,7 mg Norfloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm nướ c cất đến vạch. Tạo

dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2.

–

Chuẩ n bị các dãy dung d ịch chuẩ n Marbofloxacin:

Cân 112,8 mg Marbofloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm nướ c cất đến vạch. Tạo

dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2.







Bảng 3-2: Xây dựng dãy chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin

Chất Dãy chuẩn

Nồng độ (mg/L)

1 2 3 4 5

ER

0,05 mg/L – 1 mg/L

0,052 0,104 0,260 0,520 1,039

1 mg/L – 5 mg/L

1,039 2,078 3,117 4,156 5,1955 mg/L – 25 mg/L

5,195 10,390 15,585 20,780 25,975

NL

0,05 mg/L – 1 mg/L 0,056 0,112 0,279 0,559 1,117

1 mg/L – 5 mg/L 1,117 2,234 3,351 4,468 5,585

5 mg/L – 25 mg/L 5,585 11,170 16,755 22,34 27,925

MB

0,05 mg/L – 1 mg/L 0,056 0,113 0,282 0,564 1,128

1 mg/L – 5 mg/L 1,128 2,256 3,384 4,512 5,64

5 mg/L – 25 mg/L 5,640 11,280 16,920 22,560 28,200

– Đo trên máy quang phổ:

Bảng 3-3: Điều kiện quét phổ

Enrofloxacin Norfloxacin Marbofloxacin

Dung môi NaOH 0,1N

Cốc so sánh NaOH 0,1N

Set-ref = 271 nm =273 nm = 290 nmKhoảng quét phổ 190 nm – 450 nm 190 nm – 450 nm

190nm – 450 nm

Cốc đo Các cốc từ 1 -5

– Vẽ đồ thị và xác định sự phụ thuộc của độ hấ p thu theo nồng độ của mỗi chất.

b) K ết quả:

Bảng 3-4: K ết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Enrofloxacin

Dãy nồng độ Giá trị 1 2 3 4 5

0,05 mg/L – 1 mg/L

C 0,052 0,104 0,260 0,520 1,039

Abs 0,011 0,012 0,022 0,050 0,110Hàm số y = 0,1027x + 0,0004 (R = 0,9944)

1 mg/L – 5 mg/L

C 1,039 2,078 3,117 4,156 5,195

Abs 0,106 0,217 0,322 0,432 0,535

Hàm số y = 0,1033x + 0,0005 (R = 0,9999)

5 mg/L – 25 mg/L

C 5,195 10,390 15,585 20,780 25,975

Abs 0,541 1,074 1,606 2,138 2,477

Hàm số y = 0,095x + 0,0868 (R = 0,9968)







Bảng 3-5: K ết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Marbofloxacin


0,05 mg/L – 1 mg/L

C 0,056 0,113 0,282 0,564 1,128

Abs 0,006 0,008 0,019 0,047 0,104

Hàm số y = 0,0933x - 0,0032 (R = 0,9968)

1 mg/L – 5 mg/L

C 1,128 2,256 3,384 4,512 5,640

Abs 0,102 0,183 0,265 0,347 0,428

Hàm số y = 0,0724x + 0,021 (R = 1,000)

5 mg/L – 25 mg/L

C 5,640 11,280 16,920 22,560 28,200

Abs 0,430 0,848 1,272 1,679 2,065

Hàm số y = 0,0727x + 0,0285 (R = 0,9998)

Bảng 3-6: K ết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Norfloxacin


0,05 mg/L – 1 mg/L

C 0,056 0,112 0,279 0,559 1,117

Abs 0,012 0,014 0,031 0,064 0,130

Hàm số y = 0,1134x + 0,0021 (R = 0,9987)

1 mg/L – 5 mg/L

C 1,117 2,234 3,351 4,468 5,585

Abs 0,139 0,255 0,370 0,485 0,600

Hàm số y = 0,1032x + 0,024 (R = 0,9999)

5 mg/L – 25 mg/L

C 5,585 11,170 16,755 22,34 27,925

Abs 0,605 1,199 1,771 2,340 2,743

Hàm số y = 0,097x + 0,1065 (R = 0,9977)

Hình 3-5: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 5 mg/L – 25 mg/L







Hình 3-6: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 0,05 mg/L – 1 mg/L

Hình 3-7: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 5 mg/L – 25 mg/L

Hình 3-8: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 0,05 mg/L – 1 mg/L







Hình 3-9: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 5 mg/L – 25 mg/L

Hình 3-10: K ết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 0,05 mg/L – 1 mg/L

c) Nhận xét:

Đối vớ i Enrofloxacin:

+ Ở khoảng nồng độ từ 0,25 mg/L – 20 mg/L thì Abs tuyến tính vớ i nồng độ.

+ Ở khoảng nồng độ trên 20 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết.+ Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,25 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lý

thuyết.

Đối vớ i Norfloxacin:


+ Ở khoảng nồng độ trên 20 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết.

Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,5 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lý

thuyết.







Đối vớ i Marbofloxacin:


+ Ở khoảng nồng độ trên 25 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết.

+ Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,25 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lýthuyết.

3.2 Thí nghiệm về thẩm định phương pháp

3.2.1 Độ chọn lọc

Thí nghiệm 4:

Đánh giá độ ch ọn l ọc c ủa k ỹ thu ật thêm chuẩn áp dụng trên phương

pháp quang phổ

a)

Thự c hiện:

Thực hiện thí nghiệm trên mẫu Enrofloxacin.

–

Tạo dung dịch đơn thành phần:

+ Dung dịch ER (DD1): Lấy 100,1 mg ER cho vào BĐM 100 mL, thêm dung

dịch NaOH 0,1 M đến vạch đượ c dung dịch chuẩn ER. Pha loãng dung dịch

chuẩn theo tỉ lệ 1/250, nồng độ ER trong dung dịch theo lý thuyết là 4,004 mg/L.

+ Dung dịch Norfloxacin (DD2): Lấy 100,4 mg Norfloxacin cho vào BĐM 100

mL, thêm dung dịch NaOH 0,1 M đến vạch đượ c dung dịch chuẩn Norfloxacin.

Pha loãng dung dịch chuẩn theo tỉ lệ 1/250, nồng độ Norfloxacin trong dung

dịch theo lý thuyết là 4,016 mg/L.

– Tạo dung dịch đa thành phần (DD3): Lấy 1 mL dung dịch chuẩn ER và

Norfloxacin cho vào BĐM 250 mL, thêm dung dịch NaOH

0,1 M đến vạch.

–

Đo trên máy quang phổ: điều kiện đo phổ tương tự thí nghiệm 3.

b) K ết quả:

+ Bảng k ết quả:

Bảng 3-7: K ết quả thí nghiệm đánh giá độ chọn lọc

Chất Mẫu DD1 DD2 DD3

EnrofloxacinC (mg/L) 4,004 0 4,016

Abs 0,415 0,468 0,874







+ Phổ đồ:

Hình 3-11: Đánh giá độ chọn lọc của phương pháp quang phổ đối vớ i ER

c) Nhận xét:

Tại bước sóng max = 271 nm của Enrofloxacin, Norfloxacin có hấ p thu dẫn đến

làm tăng Abs của dung dịch hỗn hợ p.

K ỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ có tính chọn lọc không

cao đối vớ i các chất khảo sát khi chứa các thành phần gây nhiễu.

3.2.2

Độ lặp lại

Thí nghiệm 5: Đánh giá độ l ặp l ại c ủa k ỹ thu ật thêm chuẩn trên phương pháp quang

ph ổ

a) Thự c hiện:

Thực hiện thí nghiệm đối vớ i cả 3 chất: Enrofloxacin, Norfloxacin, Marbofloxacin.

Đánh giá độ lậ p lại đối vớ i Enrofloxacin:

– Cân chính xác 101,1 mg Enrofloxacin cho vào BĐM 100 mL, thêm dung dung

dịch NaOH 0,1 N đến vạch, đượ c dung dịch chuẩn gốc.

–

Chuẩn bị dung dịch chuẩn ER có nồng độ 202,2 mg/L từ dung dịch chuẩn gốc.

– Chuẩn bị dung dịch mẫu giả ER có nồng độ 5,055 mg/L từ dung dịch chuẩn gốc.

–

Tạo dãy mẫu thêm chuẩn như bảng 3-8.







Bảng 3-8: Chuẩn bị bãy thêm chuẩn đối vớ i Enrofloxacin

Mẫu 1 2 3 4 5

BĐM 50 50 50 50 50

Vm (ml) 5 5 5 5 5

VER (ml) 0 2 3 4 5

Đánh giá độ chọn lọc đối vớ i Norfloxacin:

Cân chính xác 100,4 mg Norfloxacin cho vào bình định mức 100 mL, thêm nướ c

đến vạch, đượ c dung dịch chuẩn gốc.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Norfloxacin có nồng độ 251,00 mg/L từ dung dịch

chuẩn gốc.

Chuẩn bị dung dịch mẫu giả Norfloxacin có nồng độ Cm = 5,02 mg/L từ dung

dịch chuẩn gốc.


Đánh giá độ lặ p lại đối vớ i Marbofloxacin:

Cân chính xác 100,6 mg Marbofloxacin cho vào bình định mức 100 mL, thêm

nước đến vạch, đượ c dung dịch chuẩn gốc.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Marbofloxacin có nồng độ 251,50 mg/L từ dung dịch

chuẩn gốc.

Chuẩn bị dung dịch mẫu giả Marbofloxacin có nồng độ Cm = 5,03 mg/L từ dung

dịch chuẩn gốc.


Đo trên máy quang phổ: điều kiện đo phổ tương tự thí nghiệm 3.

Lặ p lại thí nghiệm 6 lần trên mỗi chất.

Đánh giá độ lặ p lại:

+ Xác định nồng độ thực nghiệm tại Abs = 0

+ Tính độ đúng và tìm RSD







b) K ết quả:

Bảng 3-9: K ết quả đánh giá độ lặp lại trên Enrofloxacin

Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6

Lượng tìm lại (mg/L) 5,059 5,053 5,06 5,059 5,061 5,047Độ đúng (%) 100,079 99,96 100,098 100,079 100,118 99,841

Lượng tìm lại trung bình 5,059 (mg/L)

Độ lệch chuẩn SD 0,0054

Độ lệch chuẩn tương đối

RSD0,107%

Bảng 3-10: K ết quả đánh giá độ lặp lại trên Norfloxacin

Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6Lượng tìm lại (mg/L) 5,042 5,029 5,051 5,038 5,045 5,040

Độ đúng (%) 100,454 100,197 100,628 100,197 100,302 100,412




RSD0,164%

Bảng 3-11: K ết quả đánh giá độ lặp lại trên Marbofloxacin

Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6

Lượng tìm lại (mg/L) 5,036 5,032 5,033 5,028 5,041 5,038

Độ đúng (%) 100,119 100,040 100,060 99,960 100,219 100,159




RSD0,101%

c)

Nhận xét:

RSD < 2%, phù hợ p với yêu cầu của thẩm định phương pháp.

K ỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ có độ lặ p lại.







3.2.3 Độ đúng

Thí nghiệm 6:

Đánh giá độ đúng của k ỹ thu ật thêm chuẩn trên phương pháp quang

ph ổ

a)

Thự c hiện:

–

Cách chuẩn bị mẫu giả và dung dịch chuẩn Enrofloxacin tương tự thí nghiệm 5.

– Đo trên máy quang phổ: điều kiện đo phổ tương tự thí nghiệm 3.

– Vẽ đồ thị và xác định lại hàm lượ ng Enrofloxacin trong mẫu giả:

+ Vẽ đồ thị hàm số Abs = f(Cc)

+ Xác định giá trị nồng độ Enrofloxacin thực nghiệm tại Abs = 0

+ Tính tỉ lệ thu hồi R c

b)

K ết quả:

Bảng 3-12: K ết quả quét phổ đánh giá độ đúng

Mẫu 1 2 3 4 5

Vm (ml) 5 5 5 5 5

CER (mg/L) 0 8,016 12,024 16,032 20,04

Abs 0,052 0,882 1,285 1,71 2,107

–

Đồ thị hàm số Abs = f(Cc)

Hình 3-12: Đồ thị sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của dãy mẫu thêm chuẩn

– Xác định giá tr ị Cm tại Abs = 0: Dựa vào đồ thị thêm chuẩn, ta tính đượ c nồng độ

thực nghiệm của Enrofloxacin, Cm = 5,078 mg/L.

– Tính tỷ lệ thu hồi của hàm lượ ng Enrofloxacin:







5 078100 100 100 454

5 055

thöïc nghieämc

lyù thuyeát

C ,R % % , %

C ,

c) Nhận xét:

Tỉ lệ thu hồi nằm trong khoảng 95% - 105%, phù hợ p với yêu cầu thẩm định.

K ỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ có độ đúng.

3.2.4 Khoảng tuyến tính

a) Thự c hiện:

Xác định khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của 3 chất dựa trên kết quả thí

nghiệm 3. Dùng phần mền Excel để tính toán.

b)

K ết quả:

Bảng 3-13: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Enrofloxacin

Khoảng nồng độ ERHàm số

Abs = a.CER + b

Hệ số tương quantuyến tính R

0,05 mg/L – 1 mg/L 0,1027x + 0,0004 0,99440,25 mg/L – 1 mg/L 0,1133x – 0,0008 0,9998

1 mg/L – 5 mg/L 0,1033x + 0,0005 0,9999

5 mg/L – 20 mg/L 0,1025x + 0,009 0,9999

5 mg/L – 25 mg/L 0,095x + 0,0868 0,9968

0,25 mg/L – 20 mg/L 0,1030x + 0,0094 0,9999

Hình 3-13: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Enrofloxacin

y = 0,103x + 0,0094

R 2 = 0,9999







Bảng 3-14: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Norfloxacin

Khoảng nồng độ

NL (mg/L)

Hàm số

Abs = a.CNL + b

Hệ số tương quantuyến tí nh R

0,05 mg/L – 1 mg/L 0,1134x + 0,0021 0,9987

0,5 mg/L – 1 mg/L 0,1162x - 0,0003 0,99971 mg/L – 5 mg/L 0,1030x + 0,0240 1,000

5 mg/L – 20 mg/L 0,1034x + 0,0345 0,9999

5 mg/L – 25 mg/L 0,0970x + 0,1065 0,9977

0,5 mg/L – 20 mg/L 0,1051x + 0,0145 0,9998

Hình 3-14: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Norfloxacin

Bảng 3-15: K ết quả khảo sát độ tuyến tính của Marbofloxacin

Khoảng nồng độ

MB (mg/L)

Hàm số

Abs = a.CMB + b

Hệ số tương quantuyến tính R

0,05 mg/L – 1 mg/L 0,1027x + 0,0004 0,9944

0,25 mg/L – 1 mg/L 0,1006x – 0,0095 0,99981 mg/L – 5 mg/L 0,0724x + 0,0210 0,9999

5 mg/L – 25 mg/L 0,0727x + 0,0285 0,9999

0,25 mg/L – 25 mg/L 0,0738x + 0,0045 0,9998







Hình 3-15: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Marbofloxacin

c) Nhận xét:

Đối vớ i Enrofloxacin:

Trong khoảng nồng độ từ 0,25 mg/L – 20 mg/L, hệ số tương quan R thỏa mãn

yêu cầu của độ tuyến tính.

Hàm số tương quan tuyến tính là: Abs = 0,1030.CER + 0,0004

Đối vớ i Norfloxacin:

Trong khoảng nồng độ từ 0,5 mg/L – 20 mg/L, hệ số tương quan R thỏa mãn yêu

cầu của độ tuyến tính.

Hàm số tương quan tuyến tính là: Abs = 0,1051.CNL + 0,0045

Đối vớ i Marbofloxacin:

Trong khoảng nồng độ từ 0,25 mg/L – 25 mg/L, hệ số tương quan R thỏa mãn

yêu cầu của độ tuyến tính.

Hàm số tương quan tuyến tính là: Abs = 0,0738.CMB + 0,0004

3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Dựa vào kết quả của thí nghiệm 5 và 6 để xác định giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn

định lượ ng của k ỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ đối vớ i cả 3 chất.

Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượng đối vớ i Enrofloxacin:

Giớ i hạn phát hiện (LOD):

Vớ i độ lệch chuẩn:

2

ix x

SD 0 0054n 1 ,







LOD có thể xác định dựa theo công thức:

3,3.SDLOD =

a=

3,3.0,0054

0,1030= 0,173 (mg/L)

Giớ i hạn định lượ ng (LOQ): xác định tương tự LOD, nhưng theo công thức:10.SD

LOQ =a

=10.0,0054

0,1030= 0,524 (mg/L)

Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượng đối vớ i Norfloxacin:

Tính toán tượ ng tự như Enrofloxacin.

LOD = 0,195 mg/L

LOQ = 0,589 mg/L

Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượng đối vớ i Marbofloxacin:

Tính toán tượ ng tự như Enrofloxacin.

LOD = 0,205 mg/L

LOQ = 0,623 mg/L

3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật

Thí nghiệm 7: Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Enrofloxacin trong bồn tr ộn VMDX1068

a)

Thự c hiện:

Bồn tr ộn VMDX1068 sau khi tr ộn mẻ thuốc VIMENRO concentrated có chứa

hàm lượng Enrofloxacin 50% đượ c vệ sinh sạch.

Tráng bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose trong 15 phút.

Định lượng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn: Lấy 25,078 gam tá dược tráng

bồn cho vào BĐM 200 mL thêm NaOH 0,1N đến vạch, đem siêu âm và lọc lấy

dung dịch trong suốt. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Enrofloxacin có nồng độ

254,50 mg/L. Lập dãy thêm chuẩn như bảng sau:

Bảng 3-16: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 7

Mẫu 1 2 3 4 5

Vtá dượ c (mL) 25 25 25 25 25

Vchuẩn ER (mL) 0 1 2 3 4

Cchuẩn ER (mg/L) 0 5,090 10,180 15,270 20,360

Quét phổ: điều kiện quét phổ tượ ng tự thí nghiệm 3.







b) K ết quả:

Bảng 3-17: K ết quả quét phổ thí nghiệm 7

Mẫu 0 1 2 3 4

Cchuẩn ER (mg/L) 0 5,09 10,18 15,27 20,36

Abs 0,061 0,594 1,125 1,637 2,123

Hình 3-16: Phổ đồ k ết quả thí nghiệm 7

Hình 3-17: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 7

Hàm lượng Enrofloxacin trong 25,078 gam tá dược trơ lactose:

ER

0,0592 0,2 0,224

0,1053 m (mg).

Hàm lượng Enrofloxacin trong 1 kg tá dược là: 0,224×1000 = 8,93225,078

(mg/kg).

y = 0,1053x + 0,059

R 2 = 0,9999







c) Nhận xét:

Hàm lượng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn đạt yêu cầu đặt ra (< 10 mg/kg)

Bồn tr ộn đủ điều kiện sử dụng để tr ộn mẻ thuốc tiế p theo.

Thí nghiệm 8:

Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Enrofloxacin trong bồn tr ộn VMDX1078

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn VMDX1078 sau khi tr ộn mẻ thuốc VIMENRO có chứa hàm lượ ng

Enrofloxacin 10% đượ c vệ sinh sạch.

Tráng bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose, tr ộn trong 15 phút.

Định lượng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn: Lấy 25,054 gam tá dược tráng

bồn cho vào BĐM 200 mL thêm NaOH 0,1N đến vạch, đem siêu âm và lọc lấydung dịch trong suốt. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Enrofloxacin có nồng độ

254,50 mg/L. Lập dãy thêm chuẩn tương tự như thí nghiệm 7.

b) K ết quả:


Mẫu 0 1 2 3 4

Cchuẩn ER (mg/L) 0 5,09 10,18 15,27 20,36

Abs 0,025 0,556 1,085 1,607 2,119









Hàm lượng Enrofloxacin trong 25,054 gam tá dược trơ lactose:

ER

0,03062 0,2 0,117

0,105m (mg).

Hàm lượng Enrofloxacin trong 1 kg tá dược là:0,0117 1000

4,75025,054

(mg/kg).

c) Nhận xét:

Hàm lượng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn đạt yêu cầu đặt ra (< 10 mg/kg).

Bồn tr ộn đủ điều kiện sử dụng để tr ộn mẻ thuốc tiế p theo.

Thí nghiệm 9: Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Norfloxacin trong b ồn tr ộn VMDX1070

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn VMDX1070 sau khi tr ộn mẻ thuốc NORFLOXACIN 50 có chứa hàm

lượ ng Norfloxacin 50% đượ c vệ sinh sạch.


Định lượ ng Norfloxacin trong tá dược tráng bồn: Lấy 25,038 gam tá dược tráng

bồn cho vào BĐM 200 mL thêm nướ c đến vạch, đem siêu âm và lọc lấy dung

dịch trong suốt. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Norfloxacin có nồng độ 279,25 mg/L.

Lập dãy thêm chuẩn như bảng 3-19:








Mẫu 1 2 3 4 5

Vtá dượ c (mL) 25 25 25 25 25

Vchuẩn NL (mL) 0 1 2 3 4

Cchuẩn NL (mg/L) 0 5,585 11,17 16,755 22,340

Quét phổ tương tự thí nghiệm 3.

b) K ết quả:


Mẫu 0 2 3 4 5

C NL (mg/L) 0 5,585 11,17 16,755 22,34

Abs 0,050 0,651 1,221 1,792 2,32









Hàm lượ ng Norfloxacin 25,038 gam tá dược trơ lactose:

0,0542 0,2 0,203

0,1065 NL

m (mg).

Hàm lượng Norfloxacin trong 1 kg tá dược là: 0,203 1000 8,10825,038

(mg/kg).

c) Nhận xét:

Hàm lượ ng Norfloxacin trong tá dược tráng bồn đạt yêu cầu đặt ra (< 10 mg/kg).

Bồn tr ộn đủ điều kiện sử dụng để tr ộn mẻ thuốc tiế p theo..

Thí nghiệm 10:

Xác đị nh m ức độ nhi ễm chéo Marbofloxacin trong b ồn tr ộn

VMDX1077

a) Thự c hiện:

Bồn tr ộn VMDX1077 sau khi tr ộn mẻ thuốc MARBO VIRYL ONE có chứa

hàm lượ ng Marbofloxacin 20% đượ c vệ sinh sạch.


Định lượ ng Marbofloxacin trong tá dược tráng bồn: Lấy 25,046 gam tá dượ c

tráng bồn cho vào BĐM 200 mL thêm nước đến vạch, đem siêu âm và lọc lấy

dung dịch trong suốt. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Marbofloxacin có nồng độ

282,0 mg/L. Lập dãy thêm chuẩn như bảng sau:


Mẫu 1 2 3 4 5

Vtá dượ c (mL) 25 25 25 25 25

Vchuẩn MB (mL) 0 1 2 3 4

Cchuẩn MB (mg/L) 0 5,640 11,280 16,920 22,560

Quét phổ tương tự thí nghiệm 3.

b) K ết quả:


Mẫu 1 2 3 4 5

CMB (mg/L) 0 5,64 11,28 16,92 22,56

Abs 0,044 0,469 0,893 1,296 1,705









Hàm lượng Marbofloxacin trong 25,046 gam tá dược trơ lactose:

0,0502 0,2 0,267

0,0749 MB

m (mg).

Hàm lượng Marbofloxacin trong 1 kg tá dược là:0,267 1000

10,66025,046

(mg/kg).

c) Nhận xét:

Hàm lượ ng Marbofloxacin trong tá dược tráng bồn không đạt yêu cầu đặt ra (< 10

mg/kg).

Bồn tr ộn không đủ điều kiện sử dụng để tr ộn mẻ thuốc tiế p theo, bồn tr ộn phải đượ c

vệ sinh lại.





Chương 4: K t lu ận và Ki n ngh ị


CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Qua quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi rút ra được các kết luận sau:

K ỹ thuật thêm chuẩn đượ c thực hiện tương đối đơn giản, nhanh chóng nên rất

hữu ích cho công tác kiểm soát nhiễm chéo trong sản xuất. K ỹ thuật thêm chuẩn

hoàn toàn có thể áp dụng đượ c với các phương pháp khác như HPLC, sắc ký

ion,….

Xây dựng được phương pháp định lượng các chất Enrofloxacin, Norfloxacin và

Marbofloxacin để kiểm tra độ nhiễm chéo của chúng trong quá trình sản xuất

thuốc thú y bằng cách áp dụng k ỹ thuật thêm chuẩn vào phương pháp quang phổ

UV-Vis, vớ i các đặc điểm:

Độ đúng đạt yêu cầu, vớ i hệ số tìm lại 95% < R c < 105%.

Độ lặ p lại r ất cao:

+ RSD = 0,107% đối vớ i Enrofloxacin.

+ RSD = 0,164% đối vớ i Norfloxacin.

+ RSD = 0,101% đối vớ i Marbofloxacin. Độ tuyến tính rất cao:

+ Hệ số tương quan tuyến tính: R = 0,9999

+ Phương trình tương quan tuyến tính:

Vớ i Enrofloxacin: Abs = 0,1030.CER + 0,0004

Vớ i Norfloxacin: Abs = 0,1051.CNL + 0,0145

Vớ i Marbofloxacin: Abs = 0,0738.CMB + 0,0045

Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng thấp (phương pháp nhạy):

+ Vớ i Enrofloxacin: LOD = 0,173 mg/L; LOQ = 0,524 mg/L

+ Vớ i Norfloxacin: LOD = 0,195 mg/L; LOQ = 0,589 mg/L

+ Vớ i Marbofloxacin: LOD = 0,205 mg/L; LOQ = 0,623 mg/L

K ết quả kiểm tra thực tế trên bốn mẫu bồn tr ộn trong sản xuất, chỉ có ba bồn đạt

yêu cầu để tiế p tục sản xuất và một bồn cần phải thực hiện vệ sinh lại.





Chương 4: K t lu ận và Ki n ngh ị


4.2 Kiến nghị

Do thờ i gian thực hiện có hạn nên đề tài còn một số hạn chế:

Chỉ xây dựng phương pháp định lượng đối vớ i ba đối tượng là Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin. Vì vậy, cần mở r ộng thực hiện trên các đối tượ ng

khác.

Chỉ thực hiện trên phương pháp phân tích quang phổ UV-Vis. Vì vậy, cần phải tiế p

tục thực hiện trên phương pháp phân tích khác như HPLC để đưa ra các kết quả so

sánh.

Có thể mở r ộng phạm vi áp dụng của phương pháp cho các quy trình thẩm định khác.





Tài liệu tham kh ảo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hoàng Minh Châu,Từ Vọng Nghi và Từ Văn Mạc, 2007. Cơ sở hóa học phân tích. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 377 trang.

2. Nguyễn Thị Diệ p Chi, 2008. Giáo trình "Các phương pháp phân tích hiện đại".

Khoa Khoa học Tự Nhiên, Đại học Cần Thơ. 3. Cục quản lý dượ c, 2014. Hướ ng d ẫ n thực hành tố t sản xuấ t thuố c theo WHO.

4. Tr ần Tứ Hiếu, 2003. Phân tích trắ c quang : Phổ hấ p thụ UV - Vis. NXB Đại học

quốc gia Hà Nội. 226 trang.

5. Lê Thị Mùi, 2008. Bài giảng Phân tích công cụ. Trường Đại học Sư phạm - Đại học

Đà Nẵng.

6. Võ Văn Ninh, 2002. Kháng Sinh Trong Thú Y. NXB Tr ẻ. 138 trang.

7. Nguyễn Thị Thanh Nga, 2009. Nghiên cứu quy trình xác định dư lượ ng

ciprofloxacin và enprofloxacin trong thự c phẩ m bằng phương pháp HPLC -MS/MS .

Thạc sĩ, mã số: 1.04.03. ĐH Khoa học Tự Nhiên. 8. Tr ần Cao Sơn, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh

vật. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 103 trang.

9. Lâm Ngọc Thụ, 2005. Cơ sở hóa học phân tích. NXB Đại học quốc gia Hà Nội.10. Vincent T. Andriole, 2000. The Quinolones. 3 ed, Academic Press.

11. M.C. Bermúdez-Almada và A. Es pinosa-Plascencia, 2012. The Use of Antibiotics

in Shrimp Farming . Health and Environment in Aquaculture. tr. 199-214.

12. Graham R. Bruce và Paramjit S. Gill, 1999. Estimates of Precision in a Standard

Additions Analysis . Journal of Chemical Education. số 76(6), tr. 805.

13. S. L. Ellison và M. Thompson, 2008. Standard additions: myth and reality. Analys t.

số 133(8), tr. 992-7.14. EU-GMP, 2015. Cross Contamination: New EU requirements for use of

multipurpose equipment.

15. David Harvey, 2000. Modern analytical chemistry, McGraw-Hill. tr. 104-134.

16. Bayer AG Leverkusen, 1999. History of Antimicrobial Therapy.

17. L. M. Pallo-Zimmerman,J. K. Byron và T. K. Graves, 2010. Fluoroquinolones: then

and now. Compend Contin Educ Vet. số 32(7), tr. E1-9; quiz E9.

18. Chemistry 321, 2013. Calibration Methods.http://www.csun.edu/~hcchm003/321/32191213.pdf , truy cập ngày 5/01/2015.

19. Nguyễn Thanh Tùng. Kháng sinh nhóm flouroquinolone và những điều cần lưu ý.

http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1497 , truy cập ngày5/01/2015.

20. Wikipedia. Marbofloxacin. http://en.wikipedia.org/wiki/Marbofloxacin , truy cậ pngày 04/01/2015.

21. Wikipedia. Norfloxacin. http://en.wikipedia.org/wiki/Norfloxacin, truy cập ngày04/01/2015.

22 Wikipedia Standard addition http://en wikipedia org/wiki/Standard addition truy


http://www.csun.edu/~hcchm003/321/32191213.pdf


http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1497


http://en.wikipedia.org/wiki/Marbofloxacin


http://en.wikipedia.org/wiki/Norfloxacin


http://en.wikipedia.org/wiki/Standard_addition







Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- VIS

Documents