1 LAPORAN AKHIR TAHUNAN KEGIATAN PENELITIAN TAHUN ANGGARAN 2017 (Periode 2017) (Dr. Ratih Pangestuti) PUSAT PENELITIAN OSEANOGRAFI LEMBAGA ILMU PENGETAHUAN INDONESIA TAHUN 2017 JUDUL KEGIATAN Mikroalgae Koleksi P2O LIPI untuk Nutraseutikal Masa Depan
43
Embed
KEGIATAN PENELITIAN TAHUN ANGGARAN 2017 (Periode …oseanografi.lipi.go.id/laporan/RATIH_Laporan MIkroalga... · Analisa komposisi asam lemak dilakukan dengan menggnakan GCMS. Sampel
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Puji Syukur kehadirat ALLAH SWT, karena atas perkenanNYA laporan pelaksanaanPengembangan Mikkroalga Koleksi P2O LIPI Untuk Nutraseutikal Masa Depan padaKegiatanTematikP2OLIPItahun2017dapatdiselesaikan.Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan gambaran informasi aktifitasfarmakologismikroalgakleksiP2OLIPIdanmengembangkanproduknutraseutikalnya.Dalampenyusunankaryatulis ilmiahini,penulismendapatbanyak bantuan,masukan,bimbingan, dan dukungan dari berbagai pihak. Untuk itu, melalui kesempatan inipenulis menyampaikan terima kasih yang tulus kepada semua fihak yang turutberkontribusidalamsuksesnyapenelitianini.Tim Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna dan perlupendalaman lebih lanjut. Oleh karena itu, kami mengharapkan kritik dan saran daripembaca yang bersifat konstruktif demi kesempurnaan penelitian tahun selanjutnya.Penulis berharap semoga hasil penelitian pada laporan ini dapat bermanfaat bagipenelitianmikroalga.
A. PENDAHULUAN1. LatarBelakangPotensi mikroalga untuk memproduksi senyawa bioaktif ataupun sebagaipenghasil energi telah diakui secara luas, karena mikroalga mampumemanfaatkan energi sinar matahari dengan lebih efisien dibandingkandengantanamantingkattinggi yangadadidarat [1].Mikroalga(Gambar1)memproduksi beragam metabolit seperti protein, lipid, karbohidrat,karotenoid, vitamin yang dapat dimanfaatkan untuk kesehatan,nutraseutikal,panganfungsional,kosmetikdanuntukproduksienergi[2,3].Penggunaanmikroalgaolehmanusiatelahdimulaisejak2.000tahunsilamdiCina, dimana Nostoc sp dikonsumsi sebagai bahan pangan untuk bertahanselama wabah kelaparan [4]. Bangsa Aztec telah mengkonsumsi Spirulinapadaabad14-16.Produksimikroalgasebagaistokpanganmulaidigalakkansecara masiv pada saat perang dunia kedua, di mana Jepang, Amerika, danJermanwaktuitusedangmenghadapikrisis. Namun,bioteknologimikroalgabaru mulai berkembang pada pertengahan abad ini. Saat ini, ada banyakaplikasikomersialdarimikroalga;antara lainproduk nutraseutikal,panganfungsional,pakanternakdalambudidaya,danjugakosmetik[2,5].
Gambar1.PeneltianMikroalgadiP2OLIPI.Sejak beberapa tahun yang lalu, mikroalga telah diaplikasikan sebagainutrasetikaldan pangan fungsionaldi berbagaibelahandunia.Mikroalgadapatdigunakan sebagai nutraseutikal dan pangan fungsional karena organisme iniberfungsi sebagaipenyediasumberprotein,karbohidrat,dan lemakalamiyangbermanfaat dalam penyediaan energi dalam tubuh. Namun, mikroalga ternyatajuga mampu berfungsi sebagai sumber vitamin, dan bahkan memberikan efekfarmakologis dalam tubuh manusia seperti melundungi hati, anti-bakteri,antioksidan, anti-kanker, anti-inflamasi [6-8]. Tidak hanya aplikasi sebagaipangan fungsional, metabolit mikroalga juga telah digunakan dalam produkkosmetik komersial. Metabolit tersebut adalah campuran polisakarida, yangdipasarkan dengan nama dagang 'Alguronic Acid'. Terdapat juga beberapa
8
produk kosmetik yang menggunakan campuran dari mikroalga sepertipolisakarida dari Porphyridium dan ekstrak Chlorella, Spirulina danAphanizomenon,ekstrakkayaproteindariSpirulinadanekstrakmikroalgayanglain. Pada Tabel 1, ditampilkan beberapa jenis mikroalga potensial dan produkturunanyayangpotensialuntukdikembangkandalamduniaindustri.Tabel1.Beragamprodukdarimikroalga,sumberdanaplikasipotensialnyaProduk Sumber Aplikasidanmanfaatβ-carotene Dunaliellasalina Pigmen(nutraseutikaldanpanganfungsional),pro-vitaminA,antioksidanAstaxanthin Haematococcuspluvialis,
Dinophyta Melindungidarisinarmatahariatauanti-UV(Kosmetik)2. PermasalahanBeragam jenis mikroalga telah dikoleksi dan dipelihara di Pusat PenelitianOseanografiLIPI(P2O-LIPI)sejakbeberapadekadeyanglalu.Namun,hinggasaat ini, potensi aktifitas biologis dan farmakologis belum diketahui dandimanfaatkan secara optimal. Selain itu, pengembangan produk potensialdarimikroalgakoleksikulturP2OLIPIjugabelumdilakukan.3. TujuandanSasaranTujuan.UntukmengetahuiaktifitasfarmakologismikroalgakoleksiP2OLIPIdanmengembangkanpotensinutraseutikalmikroalgakoleksiP2OLIPISasaran.Diperolehnyakulturmikroalgaoptimaluntuknutraseutikaldanaktifitasfarmakologisnya.4. HipotesisMikroalgamemilikibeberapakriteriadasaryanguntukdapatdiaplikasikansecara komersial. Pertama, secara genetik mikroalga merupakan kelompokyang sangat beragam karakteristik fisiologis dan biokimianya; sehinggasecaraalamimikroalgamenghasilkanasamlemak,protein,karbohidratdan
9
senyawa bioaktif yang unik. Selain itu, mikroalga dapat secara efektifmenggabungkan unsur C, N, dan H menjadi biomassa dan mensintesaberbagaisenyawabioaktif.Mikroalgamerupakansuatukelompokorganismeyang sangat besar dan belum banyak dieksplorasi sehingga secara umumsangatpotensialuntukdikembangkanuntuknutraseutikal.
10
B. PROSEDURDANMETODOLOGIB.1 BahanMikroalga koleksi kultur P2O LIPI, ethanol, aseton, 96 well plate, 10 ml plasticpipet (disposable),25 mlplasticpipet (disposable),DMEMhigh glucosewithLglutamine, Fetal bovine serum, antibiotic-antimycotic, trypsin-EDTA, centrifugetubecentristarcap15mldan50ml,10×Phosphatebufferedsaline,MTT,aquabidestilatasteril,yellowtips,bluetips,whitetips,1.5mlcleartubes,anaerobicjar (Vol. 2.5 L), Lid ofr anaerobic jar, trizol reagent, DMSO, oligo dT, DPPH, β-carotene, linoleicacid,DEPCwater,M-MLVreversetranscriptase,dNTPmix,go-taq DNA polymerase, primer (housekeeping gene, caspase and pro-survival),agarose, TEAE buffer, bakteri, nutrient broth, brucella agar, agar darah, brainhearthbroth,darah domba,petridish,T-25 flasks,T-75 flasks,96wellplate,6-wellplate,cellculturedish,enzyme.B.2 AlatRotavapor(IKA),tanur,hairdryer,microplatereader(Tecan),centrifuge,vortex,incubator CO2, autoclave, lemari pendingin, incubator bakteri dan sel, ovenvakum,mikropipet,pipetboy,laminarflow,vacusafe.B.3 SterilisasiAlatdanKulturmikroalgaSeluruhperalatandibersihkandengancara dicucidengansabun teepol, setelahitudibilasdenganmenggunkanairtawarhinggabersihdantidakmeninggalkanaromasabunsebelumnya,setelahitudikeringkan.Untukperalatanyangterbuatdarigelassetelahdikeringkan,alat-alattersebutkemudiandimasukkankedalamautoclave disterilisasi dengan autoclave pada temperatur 121°C, selama 15-20menitkemudiandimaskkankedalamovendengansuhu50°Chinggakering.Selanjutnya penyiapan air media. Air laut dan akuades yang telah dituangkandalam toples dan Erlenmeyer 250 ml diukur salinitasnya (28-30) kemudiandisterilisasidenganautoclavpadatemperatur121°C,selama15-20menit.Media kultur mikroalga kemudian disiapkan (F/2). Campuran antara air danmediadiaerasihinggalarutsempurnaini.Bibit/startermikroalgaedituangkansebanyak1%darivolumekultur,sebelummenuangkan bibit, terlebih dahulu hitung kepadatan selnya. Mulut Erlenmeyerditutupdengankertasalumuniumfoilsambildiaerasi.Untuk mendapatkan kepadatan sel yang diinginkan dihitung menggunakanhaemocytometer yang diletakkan pada microskop dengan rumus: N = n x 104Sel/mlKeterangan:N : Jumlahsel fitoplanktonpermln : Jumlahselpadablokhaemacytometer. MIkroalgae dikultur selama 13 hari dan dipanen denganmetodesentrifugasi.
11
B.4. EkstraksimikroalgaSediaan mikroalga yang berupa serbuk ditimbang dan dimaserasi denganmenggunakan menggunakan pelarut etanol (1:10, w/v). Ekstraksi dilakukansebanyak tiga kali. Hasil ekstraksi kemudian disaring dan dipekatkan denganrotaryevaporatorpadasuhu40°C.B.5KarakterisasiMutuEkstrakStandardisasi ekstrak meliputi parameter non spesifik dan parameter spesifik.Parameter non spesifik meliputi: susut pengeringan dan bobot jenis, kadar air,kadar abu, sisa pelarut, cemaran mikroba (meliputi ALT dan AKK). Sedangkanuntuk parameter spesifik meliputi: pemeriksaan makroskopik ekstrak yaitudenganmengamatiwarna,bau,adanyalendir,cendawansertapengotorlainnya,ukuranpartikel dankonsistensi. Ekstrakyangdiperolehdiuji semuaparametertersebutuntukmenjaminmutuekstrakyangdidapat.B.6. AnalisaAsamLemakAnalisa komposisi asam lemak dilakukan dengan menggnakan GCMS. Sampel lemak yangtelah diesterifkasi diinjeksikan ke dalam kolom GC dengan menggunakan metodeautosampler. Pemisahan dilakukan dalam kolom RTx 1-MS Restech, 30 m x 0.25 mm ID,0.25 μm dengan fase diam Poly dimethyl xiloxan, suhu injector 280 °C, suhu kolom70 dinaikkan sampai 300 °C dengan kenaikan 10 °C per menit., laju alir 1.15 mL per menit.Detektor yang digunakan adalah Electron Multifer Detector (EMD) 70 MeV. Hasilanalisa berupa spectrum massa dibandingkan dengan library.B.7 PengujianaktivitaspenangkalradikalbebasPenangkalradikalbebasdi(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium(DPPH)Ekstrakdilarutkandalamethanoldandibuatberbagaiserikonsentrasi. Blankoberupa campuran 75μl ethanol ditambah 75μl ekstrak, sedangkan larutansampel terdiri dari 75μl DPPH ditambah 75μl ekstrak. Blanko maupun sampeldiinkubasiselama30menitdiruanggelap,kemudiandiukurabsorbansinyapadapanjang gelombang 517 nm menggunakan microplate reader (Tecan InfiniteM200Pro-seriesTecan,Austria)Aktivitaspenghambatandihitungmenggunakanrumus:%Penghambatan=
%1000
0
DPPH
DPPHDPPH s
0DPPH =KonsentrasiDPPHawal sDPPH =KonsentrasiDPPHakhiryangtersisaPenangkalradikalbebasβ-karotenasamlinoleatAktivitas penangkal radikal bebas ditentukan dengan menggunakan tes β-karotenasamlinoleat.Sekitar5mgβ-karoten(tipeIsintetis,Sigma-Aldrich),25ml asam linoleat, 200 ml tween 40 dilarutkan dalam kloroform (10 ml).Kloroform dievaporasi menggunakan rotary evaporator (RE-52AA) pada 40 °Cselama 5 menit. Sebanyak 200 μl dari emulsi β-karoten asam linoleatdidistribusikan di masing-masing 96-well plate. Methanol digunakan sebagaiblanko.Selanjutnya,96-wellplatediinkubasipada50°C,danabsorbansidiukur
12
menggunakan microplate reader pada 492 nm. Bacaan dari semua sampeldilakukansegerapadawaktunoldansetiap15menithingga180menit.B.8. UjiAktivitasAntibakteriUji aktivitas antibakteri pada penelitian ini menggunakan metode difusi agar.Untukmengetahuiefektivitasbakteriujidigunakanpembandingantibiotik,yaituampisilin karena termasuk salah satu antibiotik dengan spektrum pemakaianyang luas, lebih murah dan mudah diperoleh. Isolat bakteri uji yang telahdikulturdalammedianutrientbrothselama24 jamdioleskanpadapermukaanmediainokulasi(nutrienagaryangtelahdituangpadaPetridish)menggunakankapas lidi steril. Sebanyak 20 µL ekstrak diteteskan pada paper diskmenggunakan pipet mikro, selanjutnya paper disk yang telah mengandungekstrak diletakkan pada permukaan media inokulasi menggunakan pinset.Bakteridiinkubasi selama24 jampadasuhu30°C.Diameterzonahambatyangterbentukdiukurdenganpenggaris(skalaterkecil1mm).Semuaprosesdiatasdilakukansecaraaseptis.
13
C. HASILPENELITIANDANPEMBAHASANKulturmikroalgaP2OLIPItelahdonulaisejakbulanMaret2017(Gambar2).Hinggaakhirtahun2017,17jenismikroalgatelahdikulturdandianalisanutrisimaupunaktifitasfarmakologisnya.Ketujuhbelasmikroalgatersebutadalah:
Gambar19.KurvapertumbuhanmikroalgaTetraselmissp(Ancol)Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh hasil sintasan yang tertinggi yaitu padamikroalga jenis Nannochloris sp. Nannocloropsis sp merupakan genus gangganghijau bersel satu atau tunggal yang dapat hidup di air tawar, laut, dan tempatbasah. Ganggang ini memiliki bentuk seperti bola dan memiliki kloroplasberbentukmangkuk.Perkembangbiakannyaterjadisecaravegetatifdengancaramembelahdiri.Setiapselnyamampumembelahdiridanmenghasilkanempatselbaruyangtidakmemilkiflagel.Secara umum, kurva pertumbuhan mikrolga terbagi ke dalam lima fase antaralain:faselag,logaritmik,penurunanlajupertumbuhan,stasioner,dankematian.Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi laju pertumbuhanmikroalga antara lain pH, salinitas, suhu, cahaya, nutrient, karbondioksida danaerasi.Selanjutnya,mikroalgadipanendandianalisakandunganasamlemaknya.
23
ProfilasamlemakmikroalgakoleksiP2OLIPIdisajikanpadaTabel2-18.Secaraumum mikroalga tersebut mengandung asam lemak esensial (Linoleic Acid)dalam jumlah yang cukup signifikan. Linoleic acid termasuk ke dalam PolyUnsaturated Fatty Acid (PUFA) atau asam lemak tak jenuh merupakan asamlemakyangmemilikiikatanrangkapduaataulebihyangmemilikititiklelehlebihrendahdibandingMonoUnsaturatedFattyAcid(MUFA).Fungsi PUFA adalah metabolisme lemak, imunitas serta intergritas dan fungsimembran sel dipertahankan. Asam linoleat dan asam alfa linolenat hanya dapatberasal dari makanan contohnya mikroalga karena tubuh tidak mempunyaienzim ∆12 dan ∆15-desaturase. Hal ini menjadikan mikroalga potensial untukdikembangakan sebagai nutraseutikal bagi manusia.Tabel2.KomposisiAsamLemakChlamydomonassp
Setelah diekstraksi dengan ethanol, ekstrak mikroalga kemudian diuji aktifitasantioksidannya. Uji aktivitas antioksidan dilakukan secara kuantitatif. Ujikuantitatif dilakukan dengan menghitung persentase inhibisi seri larutan uji.AktivitasantioksidandiekspresikandengannilaiIC50yangmenunjukkanbahwakonsentrasilarutanujiyangdibutuhkanuntukdapatmenginhibisi50%aktivitasradikal bebas. Pengujian dengan absorbansi peredaman radikal bebas DPPHdilakukan terhadap BHT, ekstrak etanol mikroalga dibuat dengan berbagaikonsentrasi. Absorbansi sampel dihitung aktivitas antioksidan dalam bentuk %inhibisi. BHT sebagai kontrol positif memiliki IC50 sebesar 0.15 mg/mL danekstrak kasar etanol mikroalga jenis Nannochloris sp (Serayu) mempunya IC50terendah(1.45mg/mL)diikutiolehNanochlorisatomusdanChlamydomonas sp.Semakin kecil nilai IC50 menunjukkan semakin besar aktifitas antioksidan suatuekstrak. Hasil uji menunjukan bahwa Nannochloris sp. memiliki aktivitas antioksidanterkuat.Dalam penelitian ini jika dilihat dari nilai uji DPPH, mikroalga yang diuji sangat potensial sebagai sumber antioksidan karena rendahnya nilai IC50
yang diperoleh. Bahan dikatakan sebagai antioksidan sangatkuat apabila memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm,kuat apabila nilai IC50 antara 50–100 ppm, sedang apabila nilai IC50 antara 10–150 ppm, lemah apabila memiliki nilai IC50 antara 150–200 ppm, danangat lemah apabila memiliki nilai IC50 lebih dari 200 ppm (Molyneux, 2004).Aktifitas antibakteri ekstrak mikroalga ditunjukkan pada Tabel 20. Hampirsemua eksrak mikroalga emenunjukkan aktifitas anti bakteri (Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) yang potensial.Hasil uji fitokimia dari biomassa mikroalga menunjukkan bahwa mikroalgamengandung senyawa pigmen (klorofil dan karotenoid) dan fenol yangbervariasi (Table 21). Kandungan senyawa fitokimia dipengaruhiberbagai faktor yaitu spesies, varietas, kondisipertumbuhan, variasi musim, metode pengolahan dan penyimpanan. Hasil ujikandungan total fenol menunjukkan bahwa miktoalga mengandung fenolbervariasi antara 0,34 sampai dengan 19.25 mg GAE/g DW. Adanyaperbedaan total fenol pada spesies yang samadimungkinkan karena total fenol dipengaruhi beberapa faktor diantaranyaadalah stress yang dapat memicu kandungan senyawa fenol.Kandungan total fenol pada tanaman dipengaruhi bebrapa faktor antara laingenetik, lingkungan dan teknologi yang diterapkan setelah proses pemanenan.Kandunganfenolikberperanpentingdalamaktifitasantioksidandanantibakterimikroalga. Hal ini sesuai dengan beberapa penelitian yang menyimpulkanbahwa fenolik menjadi senyawa aktif utama di banyakspesies tanaman tingkat tinggi seperti, sayuran, buah dan tanaman medis.Senyawa fenolik dapat berperan sebagai antioksidan karena kemampuannyauntuk mendonasikan atom hydrogen atau electron dalam membentukintermediate radikal bebas yang stabil. Hasil ini sejalan dengan penelitianHajimahmoodi et al. (2009) serta Shetty (2015) yang menyimpulkan bahw fenolmerupakancontributorutama terhadap aktivitas antioksidan mikroalga.
D. KESIMPULANDANSARANSemogapengadaanbahanygindentdapatberlangsunglebihcepatdemikelancaranpenelitian.MikroalgakoleksiP2OLIPImempunyaaktifitasfarmakologisyangbaik.Olehkarenaitudiperlukanpenelitianlanjutanuntukdapatdikembangkansebagainutraseutikal.E. REKAPITULASIPENGGUNAANDANA(PERIODE1FEBRUARI-30NOVEMBER2017)NO JENISBELANJA PAGU
F. DAFTARPUSTAKA1. Borowitzka, M. A., High-value products from microalgae—theirdevelopmentandcommercialisation.JApplPhycol2013,25,(3),743-756.2. Priyadarshani,I.;Rath,B.,Commercialandindustrialapplicationsofmicroalgae–Areview.Jalgalbiomassutln2012,3,(4),89-100.3. Pangestuti,R.;Kim,S.-K.,Biologicalactivitiesandhealthbenefiteffectsofnaturalpigmentsderivedfrommarinealgae.JournalofFunctionalFoods2011,3,(4),255-266.4. Gao, K., Chinese studies on the edible blue-green alga, Nostocflagelliforme:areview.JApplPhycol1998,10,(1),37-49.5. Wang,H.-M.D.;Chen,C.-c.;Huynh,P.;Chang,J.-S.,Exploringthepotentialofusingalgaeincosmetics.Bioresourcetechnology2015,184,355-362.6. Hoseini, S.; Khosravi-Darani, K.; Mozafari, M., Nutritional and medicalapplications of spirulina microalgae. Mini reviews inmedicinalchemistry2013,13,(8),1231-1237.7. Deng, R.; Chow, T. J., Hypolipidemic, antioxidant, and antiinflammatoryactivitiesofmicroalgaeSpirulina.Cardiovasculartherapeutics2010,28,(4),e33-e45.8. Yuan,J.P.;Peng,J.;Yin,K.;Wang,J.H.,Potentialhealth-promotingeffectsofastaxanthin:Ahigh-valuecarotenoidmostlyfrommicroalgae.Molecularnutrition&foodresearch2011,55,(1),150-165.
38
G. LAMPIRAN DatadananalisisdataEkstrak microalgae potensial yang potensial untuk dikembangkanmenjadiutraseutikalInformasiaktifitasnutrisimicroalgaekoleksiP2OLIPI.InformasiaktifitasfarmakologismicroalgaekoleksiP2OLIPI. RencanakerjatahunberikutnyaOptimasikulturmikroalgaygpotensialdanidentifikasimaterialfungsionalyangterkandungdalammikroalgayangpotensialuntuknutraseutikalOutcome:2KTI Abstrakpublikasiilmiah/makalahdijurnal(jikaada)BukuInternasional1. Ratih Pangestuti, Dedy Kurnianto. (2017). Green seaweeds-derivedpolysaccharides Ulvan: Occurrence, Medicinal Value and PotentialApplications. Seaweed polysaccharides. Academic Press, Elsevier,Chapter11,205-221
39
2. Evi Amelia Siahaan, Ratih Pangestuti, Se-Kwon Kim. (2017). Marinealgae: valuable ingredients for the pharmaceuticals industries. GrandChallengesinMarineBiotechnology.Springer,Accepted.
40
KTIInternasional1. Ratih Pangestuti, Se-Kwon Kim. (2017). Bioactive peptide of marineoriginforthepreventionandtretamentofnon-communicablediseases.MarineDrugs15(67),1-23.DOI::10.3390/md15030067
41
2. Ratih Pangestuti, Zainal Arifin. (2017). Medicinal and Health Benefiteffects of High-Value Sea Cucumber in Asia. Journal of Traditonal andComplementaryMedicine.InPress