Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 5. Metody určování struktury proteinů Ivo Frébort
Struktura a funkce biomakromolekulKBC/BPOL
5. Metody určování struktury proteinů
Ivo Frébort
3D struktury
Pochopení funkce proteinů, mechanismu enzymových reakcí, design nových léčiv, atd.
Experimentální vyřešení struktury je velmi obtížné.
PDB ~80.000 proteinových strukturGenebank ~10.000.000 proteinových sekvencí
Z 80.000 struktur, 8.000 tvoří proteiny s méně než 30% identity sekvence a jen 1.100 je unikátních, reprezentuje proteiny, které jsou výrazně strukturně odlišné
Smysl určování 3D struktur
PDB
Protein Data Bank (PDB) - založena 1971 http://www.rcsb.org/pdb/
3D strukturní data makromolekul Data pocházejí z rentgenostrukturní
krystalografie nebo NMR Celkový počet struktur 116.258 (25/02/2016)
Vývoj obsahu PDB
Nárůst nových typů struktur v PDB
Informační portál PDB
http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html
Struktury membránových proteinů
25.2. 2016Unique proteins in database = 595
Number of coordinate files in database = 1882
Strukturní databáze virů v PDB
Cytokinin dehydrogenasa + substrát iP/iP9G
Možnost stanovení struktury komplexu ES/EI
IMUNOGLOBULIN-G
Určení funkčních domén proteinu
STRUKTURY MYOGLOBINU A HEMOGLOBINU
Určení struktury neproteinových složek
Je nutný extrémně čistý proteinový vzorek Protein musí tvořit relativně velké a kvalitní
krystaly. Obvykle největší problém Řadu proteinů není možno zkrystalovat vůbec
(např. membránové proteiny)
Rentgenová krystalografie proteinů
Krystaly enzymů vykazují katalytickou aktivitu
Proteinové krystaly obsahují velký podíl vody, ~50%
Výsledky získané chemickou modifikací a
proteinovým inženýrstvím většinou potvrzují
krystalové struktury
Metody pracující s proteiny v roztoku, zejména
NMR potvrzují krystalové struktury
Odpovídá krystalová struktura skutečnosti?
Krystaly lidského insulinu Rentgenokrystalografický experiment
Krystalografie proteinů
MAX FERDINAND PERUTZ(1914-2002)
1962 Nobelova cena za chemii
„za studium struktury globulárních proteinů“
2d.sin = n.
Fourierova transformace: řešení matematického vztahu mezi elektronovou hustotou a difrakcí rentgenova záření
F(h) odraz na krystalové mřížce v bodě h, f(x) rozptylová funkce elektronové hustoty v bodě x. F(h) je komplexní číslo (vektor) skládající se z amplitudy a fáze odrazu.Integrace je možná pouze na úrovni celé krystalové jednotky. Každý atom tedy přispívá k amplitudě a fázi každého individuálního odrazu, ale různým způsobem (závisí na počtu elektronů atomového obalu). Tedy i částečná data dávají informaci o kompletní proteinové struktuře.
Elektronová hustota ρ(x) v bodě x je dána sumou všech odrazů v krystalové jednotce. Ke získání kvalitní mapy elektronové hustoty (s dobrým rozlišením) je třeba kompletní data.
Braggův zákon
Difrakční záznam proteinového krystalu
Princip řešení fáze pomocí metody isomorfní výměnyJe možné změřit pouze amplitudu !!!
Kapalný dusík se používá ke zmražení a stabilizaci krystalu.
Detektor
Zařízení pro rentgenovou difrakci
Krystalizační kity a metodiky
Hanging drop Sitting drop Microdialysis
Činidla kitu „Crystal screen“ – Hampton Research
Molecular Dimensions – Mosquito Robot
http://www.moleculardimensions.com
Zdroj záření - synchotron
Synchrotronové záření je vyzářeno elektronem letícím téměř rychlostí světla, když je jeho dráha ohýbána magnetickým polem (obj. 1947)
Nejvýznamnější synchotrony
www.spring8.or.jp
SPring-8
109 x silnější RTG záření než konvenční zdroje
Linac akcelerátor urychluje elektrony generované elektronovým dělem na energii 1 GeV pomocí vysokofrekvenčního elektrického pole.
Synchrotron je kruhový akcelerátor, který dále urychluje elektrony na energii 8 GeV přenáší je do zásobního okruhu.
Zásobní okruh – elektrony s energií 8 GeV cyklují a jsou používány k produkci synchotronníhozáření, které je vyvedeno do jednotlivých výzkumných pracovišť.
1 km světelná dráha – slouží ke studiu koherentní optiky rentgenova záření, např. vliv gravitace na světlo.
SPring-8
Linac
Synchotron
Storage ring
Experimental station
Řešení proteinové struktury
Purifikace
Krystalizace Synchotron
Záznam dat
Zpracování dat
Isomorfní výměna
Řešení fázeMolekulární výměna
Mapa elektronové hustoty
Modelování
Optimalizace
Validace
Porovnání s PDB
Publikace
Struktura
Mapa elektronové hustoty a tvorba modelu
Validace struktury - Ramachandránův diagram
3: CORE (dark green), 2: ALLOWED (light green), 1: GENEROUS (yellow), 0: OUTSIDE (red)
Morris A L, MacArthur M W, Hutchinson E G & Thornton J M (1992). Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins, 12, 345-364.
Nukleární magnetická resonance
NMR lze použít pro řešení struktury malých proteinů (do 20 kDa)
Určení proteinové struktury pomocí NMR
Triple resonance experiments
NMR model Proteinový krystal
NMR vs. krystalové struktury
Struktura vyřešená pomocí NMR – priony PrP and PrP*
R Riek, S Hornemann, G Wider, M Billeter, R Glockshuber & K Wuethrich: NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature 382, 180-182 (1996).
Sekvence obsahuje všechny informace o struktuře
Existuje nepřeberné množství možných konfigurací peptidového řetězce
„Ab initio“ modelování – zatím neuskutečnitelné
„Homologní modelování“ na základě podobnosti aminokyselinové sekvence (nad 25% identity)
Teoretické předpovědi proteinové struktury
Literatura
Garett, R. and Grisham, C.: Biochemistry 2nd ed., Harcourt Brace & Company, Orlando, FL, USA 1999.
Jones, C., Mulloy, B., and Sanderson, M. R.: Crystallographic methods and protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 56, Humana Press, Totowa, NJ, USA 1996.
Spring-8 web page (www.spring8.or.jp) and other Internet resources