KARAKTERISTIK PEPTIDA BIOAKTIF ANTIOKSIDAN DARI HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI SKRIPSI ANNISA SEPTIANA PROGRAMSTUDI KIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2019 M/ 1440 H
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
KARAKTERISTIK PEPTIDA BIOAKTIF ANTIOKSIDAN
DARI HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI
SKRIPSI
ANNISA SEPTIANA
PROGRAMSTUDI KIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M/ 1440 H
KARAKTERISTIK PEPTIDA BIOAKTIF ANTIOKSIDAN
DARI HIDROLISAT PROTEIN SUSU KEDELAI
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
ANNISA SEPTIANA
1113096000052
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 / 1440 H
PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH
HASIL KARYA SAYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN
SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI
ATAU LEMBAGA MANAPUN.
Jakarta, Januari 2019
Annisa Septiana
1113096000052
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-
Nya. Shalawat serta salam tak lupa penulis ucapkan kehadirat Nabi Muhammad
SAW karena yang membawa manusia dari zaman jahiliyah ke zaman yang terang
benderang oleh ilmu pengetahuan. Alhamdulillah penulis dapat menyelesaikan
skripsi yang berjudul “Karakteristik Peptida Bioaktif Antioksidan Dari Hidrolisat
Protein Susu Kedelai”.
Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mengikuti sidang
munaqosah. Dalam penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa pihak-pihak
yang terus memberikan bimbingan serta dukungannya. Oleh karena itu, penulis
menyampaikan banyak terima kasih kepada:
1. Dr. Sandra Hermanto, M.Si., selaku pembimbing I yang telah
mengarahkan, membimbing melalui diskusi ilmiah dan memberi
masukan terkait teknis penelitian selama proses penelitian dan
penulisan skripsi ini.
2. Anna Muawanah, M. Si., selaku pembimbing II yang telah memberikan
bimbingan dan saran kepada penulis selama proses penyusunan skripsi
ini.
3. Dr. Sri Yadial Chalid, M.Si., selaku penguji I yang telah memberikan
saran kepada penulis selama proses penyususnan skripsi ini.
4. Dr. La ode Sumarlin, M.Si., selaku penguji II yang telah memberikan
saran kepada penulis selama proses penyususnan skripsi ini.
5. Drs. Dede Sukandar, M.Si., selaku Ketua Program Studi Kimia Fakultas
Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
ii
6. Dr. Agus Salim, M.Si., selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
7. Isalmi Aziz, M.T., selaku Sekretaris Program Studi Kimia Fakultas
Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
8. Keluarga tersayang Hikmawati (Ibu), Imelia Silviana (Kakak), Pebi
Riswadi (Kakak) dan Alfi Abdullah Afif (Adik), serta Listyo Hadi
Purnomo atas segala doa, nasihat dan dukungan baik moral atau
materiil kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
9. Ibu Pipit selaku pembimbing teknis yang telah membantu penulis
selama penelitian berlangsung.
10. Bayu, Dhiya, ibnu, dan Deni, selaku teman-teman seperjuangan
Laboratorium Kimia yang senantiasa memberikan bantuan, keceriaan
dan semangat dalam proses penelitian ini.
Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi banyak pihak serta
perkembangan ilmu pengetahuan.
Jakarta, Januari 2019
Annisa Septiana
iii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .................................................................................................. i
DAFTAR ISI ............................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL ....................................................................................................... v
DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. vi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. vii
ABSTRAK ................................................................................................................ viii
ABSTRACT ................................................................................................................ ix
BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................... 4
1.3 Hipotesis .............................................................................................................. 4
1.4. Tujuan Penelitian ................................................................................................ 4
1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 6
2.1 Susu Kedelai ........................................................................................................ 6
2.2 Antioksidan ......................................................................................................... 9
2.3 Radikal Bebas .................................................................................................... 12
2.4 Metode DPPH ................................................................................................... 15
2.5 Peptida Bioaktif ................................................................................................ 16
2.6 Peptida Bioaktif Antioksidan ........................................................................... 18
2.7 Elektrofresis SDS-PAGE . ................................................................................ 21
2.8 Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry ......................................... 23
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................................... 26
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................... 26
iv
3.2 Alat dan Bahan .................................................................................................. 26
3.3 Diagram Alir Penelitian ..................................................................................... 27
3.4 Prosedur Kerja ................................................................................................... 28
3.4.1 Preparasi Susu Kedelai ................................................................................. 28
3.4.2 Pemisahan protein susu kedelai dengan presipitasi asam ............................ 28
3.3.3 Pengukuran Kadar Protein Terlarut .............................................................. 28
3.3.4 Hidrolisis Protein Susu Kedelai .................................................................... 29
3.3.5 Perhitungan Derajat Hidrolisis ...................................................................... 29
3.3.6 Uji Aktivitas Antioksidan. ............................................................................. 29
3.3.7 Analisis Fraksi Protein Hidrolisat dengan SDS-PAGE ................................. 30
3.3.8 Pemisahan dan Pemurnian Protein Kromatografi G-10 ................................ 31
3.3.9 Identifikasi Peptide dengan LCMS/MS ........................................................ 31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 32
4.1 Presipitasi Protein Susu Kedelai ........................................................................ 32
4.2 Hidrolisat Protein Susu Kedelai ........................................................................ 33
4.3 Derajat Hidrolisis (DH) ..................................................................................... 35
4.4 Aktivitas Antioksidan Hidrolisat Susu Kedelai ................................................ 38
4.5 Hasil Pemurnian Protein dengan Menggunakan Kromatografi G-10 .............. 41
4.6 Hasil Uji SDS-PAGE setelah Fraksinasi ........................................................... 42
4.7 Hasil Karakterisasi Peptida Bioaktif dengan LCMS/MS .................................. 44
BAB V PENUTUP ..................................................................................................... 46
5.1 SIMPULAN ....................................................................................................... 46
5.2 SARAN ............................................................................................................. 46
v
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Perbandingan Susu Kedelai dan Susu Sapi Per 100 Gram………….….7
Tabel 2. Kadar Protein Kasar Susu Kedelai…………………………………....33
Tabel 3. Nilai IC50 pada Hidrolisat Susu Kedelai…………………………..…..40
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Reaksi Pembentukan Radikal Bebas…………………………….....13
Gambar 2. Reaksi DPPH dengan Antioksidan……………………….………..15
Gambar 3. Peptida Bioaktif Hasil Hidrolisis Enzimatik…………………….…16
Gambar 4. Proses Produksi Peptide Bioaktif dari Protein Makanan…………..17
Gambar 5. Diagram Alir Penelitian………………………………………….…27
Gambar 6. Kadar Protein Setelah Hidrolisis…………..…………………….....34
Gambar 7. Hasil SDS-PAGE Hidrolisat Susu Kedelai setelah Hidrolisis.….…35
Gambar 8. Derajat Hidrolisis………………………………………………......37
Gambar 9. Reaksi Hidrolisis Enzimatik dengan Menggunakan Pepsin..…..….38
Gambar 10. Reaksi Antara Asam Amino Tyr dengan Senyawa DPPH…..…..42
Gambar 11. Hasil Fraksinasi dengan Uji Spektrofotometer UV-VIS………...43
Gambar 12. Hasil Fraksinasi Hidrolisat Protein dengan Sphadex G-10...........44
Gambar 13. Hasil SDS-PAGE Setelah Fraksinasi.............................................45
Gambar 14. Spektrum Fraksi 7,8,9....................................................................46
Gambar 15. Spektrum Massa 12.90...................................................................47
Gambar 16. Spektrum Massa 14.40…………………………………………...47
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Presipitasi Susu Kedelai dan Uji Proks…………………………....57
Lampiran 2. Pembuatan Reagen Derajat Hidrolisis………………………….....58
Lampiran 3. Hasil Analisis Derajat Hidrolisis…………………..……………...59
Lampiran 4. Hasil Pengujian Aktivitas Antioksidan…………………………...60
Lampiran 5. Perhitungan Bobot Molekul Protein LCMS (tR = 14.405)……….64
Lampiran 6. Perhitungan Bobot Molekul Protein LCMS (tR = 12.90)………...65
Lampiran 7. Kacang Kedelai………………………………………………….. 66
Lampiran 8. Susu Kedelai………………………………………………………66
Lampiran 9. Proses Pemisahan Protein dengan Presipitasi Asam………….......67
viii
ABSTRAK
ANNISA SEPTIANA. Karakteristik Peptida Bioaktif Antioksidan dari Hidrolisat
Protein Susu Kedelai dibimbing oleh SANDRA HERMANTO dan ANNA
MUAWANAH
Penelitian mengenai peptida bioaktif antioksidan yang bersumber dari protein
nabati telah banyak dilakukan. Salah satu sumber penghasil peptida bioaktif
adalah susu kedelai. Isolasi dan karakterisasi hidrolisat protein susu kedelai hasil
hidrolisis pepsin sebagai sumber antioksidan telah dilakukan. Preparasi hidrolisat
diawali dengan presipitasi susu kedelai dan selanjutnya dilakukan sentrifugasi.
Endapan protein dilarutkan dalam baffer asetat 0.05 M pH 4.5 dan dihidrolisis
dengan enzim pepsin (37 oC) pada perbandingan enzim : substrat 5% (w/w)
selama 0 – 48 jam. Sampling di lakukan pada interval 0, 2, 6, 16, 24, 40, 48 jam
untuk menentukan DH (derajat hidrolisis) dan profil protein hidrolisat dengan
elektroforesis SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel
electrophoresis). Aktivitas antioksidan diuji dengan metode DPPH. Hidrolisat
yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi selanjutnya difraksinasi dengan
Sephadex G-10. Hasil fraksinasi ditentukan bobot molekulnya dengan LCMS/ESI
MS. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum hidrolisis protein susu
kedelai diperoleh pada waktu 40 jam dengan nilai DH 53,24 % dan aktivitas
antioksidan tertinggi diperoleh dari hidrolisat 48 jam dengan IC50 69,10 ppm.
Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya fragmen-fragmen peptida pada
kisaran 3-15 kDa. Fragmen peptida hasil fraksinasi mengahsilkan aktivitas
antioksidan dengan nilai lC50 281,74 ppm. Berdasarkan analisis LCMS, peptida
bioaktif yang dihasilkan memiliki bobot molekul 8,52 kDa dan 2,69 kDa.
Kata Kunci : antioksidan, peptida bioaktif, hidrolisis, susu kedelai
ix
ABSTRACT
ANNISA SEPTIANA. Characteristics of antioxidative bioactive peptides from
hydrolysates of soy milk protein guided by SANDRA HERMANTO and ANNA
MUAWANAH
Research on antioxidant bioactive peptides derived from vegetable protein has
been carried out. One source of producing bioactive peptides is soy milk. Isolation
and characterization of soy milk protein hydrolyzates from hydrolysis pepsin as a
source of antioxidants have been carried out. Hydrolyzate preparation begins with
precipitation of soy milk and centrifugation is then carried out. Protein deposits
were dissolved in 0.05 M pH 4.5 acetate baffer and hydrolyzed with pepsin
enzyme (37oC) at enzyme ratio: 5% (w / w) substrate for 0 - 48 hours. Sampling
was carried out at intervals of 0, 2, 6, 16, 24, 40, 48 hours to determine DH
(hydrolysis degree) and protein profile of hydrolyzate by SDS-PAGE
electrophoresis (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis).
Antioxidant activity was tested by the DPPH method. Hydrolisate which has the
highest antioxidant activity is then fractionated with Sephadex G-10.
Fractionation results are determined by their molecular weight with MS LCMS /
ESI. The results showed that the optimum hydrolysis of soy milk protein was
obtained at 40 hours with a 53.24% DH value and the highest antioxidant activity
was obtained from a 48 hour hydrolyzate with IC50 69.10 ppm. The results of the
SDS-PAGE analysis indicate the presence of peptide fragments in the range of 3-
15 kDa. Fractional peptide fragments produced antioxidant activity with a value
of lC50 281.74 ppm. Based on LCMS analysis, the resulting bioactive peptide has
molecular weights of 8.52 kDa and 2.69 kDa.
Keywords: antioxidant, peptide, hydrolysis, soy milk
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Eksplorasi sumber antioksidan alami dewasa ini terus berlanjut seiring
dengan tumbuhnya kesadaran manusia akan bahaya dari radikal bebas. Penelitian
yang dilakukan selama beberapa dekade terakhir telah menunjukkan bahwa
beberapa protein yang bersumber dari produk pangan nabati memiliki potensi
sebagai penghasil antioksidan (Agyei et al., 2015).
Pangan nabati yang kaya akan sumber protein adalah kedelai. Kedelai
merupakan salah satu tanaman budidaya yang banyak dibudidayakan di Asia.
Beberapa jenis kedelai telah dikenal memiliki beberapa agen penghasil
antioksidan alami karena kaya akan senyawa fenolik (Murakami et al., 1984;
Drumm et al., 1990 ; Scalbert et al,. 2005). Kedelai juga memiliki beberapa
nutrisi penting termasuk protein dan peptida bioaktif (Huang, et al. 2012).
Menurut penelitian Park, et al. (2010) bahwa suatu antioksidan kuat dari hidrolisat
protein kacang kedelai yang diperoleh dengan perlakuan hidrolisis alkalase
dengan massa molekul rendah (MWCO <3 kDa). Beberapa penelitian lainnya
menunjukkan bahwa peptida bioaktif antioksidan kaya akan asam amino
hidrofobik seperti fenilalanin, alanin dan prolin (Elias et al., 2008).
Kedelai memiliki potensi yang sangat besar untuk dijadikan sebagai
alternatif penghasil antioksidan alami. Namun demikian kacang kedelai memiliki
beberapa keterbatasan seperti rasa langu yang tidak menyenangkan dan juga
mengandung rafinosa dan stachyose yang tidak dapat dicerna oleh manusia
1
2
sehingga dapat menyebabkan perut kembung (Thananunkul et al., 1976). Hal ini
dapat dikurangi dengan cara mengolah kacang kedelai melalui proses fermentasi
atau melalui pembuatan susu kedelai sehingga lebih mudah dicerna. Rendahnya
kandungan lemak jenuh dan kolesterol dalam susu kedelai dapat mengurangi
risiko penyakit jantung (Kim et al., 2006; Jinapong, et al., 2008). Susu kedelai
juga aman bagi orang dengan intoleransi laktosa atau alergi susu sapi dan aman
untuk anak-anak dengan galaktosemia. Susu kedelai juga relatif lebih murah jika
dibandingkan dengan susu sapi sehingga secara ekonomis dapat dikonsumsi oleh
sebagian besar orang (Subrota, et al. 2013).
Allah SWT berfirman dalam surah Yaasiin ayat 33-36, yang berbunyi :
Artinya : “Dan suatu tanda (kebesaran Allah) bagi mereka adalah bumi yang mati
(tandus). Kami hidupkan bumi itu dan Kami keluar darinya biji-bijian, maka dari
(biji-bijian) itu mereka makan. Dan Kami jadikan padanya di bumi itu kebun-
kebun kurma dan anggur dan Kami pancarkan padanya beberapa mata air, agar
mereka dapat makan dari buahnya, dan dari hasil usaha tangan mereka. Maka
mengapa mereka tidak bersyukur?”
Berdasarkan ayat tersebut di atas dapat ditafsirkan bahwa salah satu tanda
kebesaran Allah SWT adalah ditumbuhkannya biji-bijian yang menghasilkan
bahan pangan yang dapat dikonsumsi, salah satunya ialah kacang kedelai. Kacang
3
kedelai merupakan salah satu produk pangan yang kaya akan isoflavon dan
memiliki efek estrogenik yang menguntungkan (Adlercreutz, 2002; Brouns, 2002;
Corn et al., 2004) dengan sifat antioksidan yang potensial dari senyawa bioaktif
yang terkandung di dalamnya.
Pemilihan enzim pepsin didasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sheih et
al., (2009) yang menunjukkan bahwa hidrolisat protein limbah alga melalui
pemotongan enzim pepsin menghasilkan peptida antioksidan dengan urutan asam
amino valin, prolin. Penelitian lainnya yang dilakukan oleh Zhang et al., (2013)
menunjukkan bahwa hidrolisat protein whey dari susu sapi yang dihirolisis oleh
tiga jenis enzim protease (tripsin, pepsin dan alkalase 2.4l) menghasilkan peptida
bioaktif antioksidan dengan urutan asam amino Trp–Tyr–Ser–Leu, dan nilai
aktivitas penghambatan radikal DPPH sebesar IC50 273.63 μM sedangkan
aktivitas penghambatan superoksida dismutase sebesar IC50 558.42 μM.
Penelitian ini dilakukan dengan memvariasikan waktu hidrolisis (0-48 jam)
dengan tujuan agar diperoleh kondisi optimum proses hidrolisis yang mampu
menghasilkan komponen peptide bioaktif antioksidan. Menurut Penelitian Lee et
al., 2005 menjelaskan kondisi optimum yang dihasilkan dari hidrolisis dengan
menggunakan enzim pepsin yaitu pada waktu 48 jam dengan suhu 90oC.
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengunakan metode
penghambatan radikal DPPH. Pemilihan metode ini dikarenakan kemudahan
analisis dan telah banyak digunakan sebagai metode screening aktivitas
antioksidan.
Pemisahan peptide bioaktif dilakukan melalui teknik kromatografi gel
filtrasi (Sephadex G-10) dan karakterisasi peptide bioaktif dilakukan dengan
4
LCMS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry). Hasil penelitian ini
diharapkan dapat menghasilkan peptide bioaktif yang potensial sebagai sumber
antioksidan berbasis protein nabati.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah kondisi optimum hidrolisis protein susu kedelai dengan
enzim pepsin untuk menghasilkan peptida bioaktif dengan aktivitas
antioksidan tertinggi?
2. Bagaimana karakteristik peptida bioaktif antioksidan yang dihasilkan
berdasarkan hasil analisis bobot molekulnya?
1.3 Hipotesis
1. Kondisi optimum hidrolisis enzimatik protein susu kedelai yang
menghasilkan peptida bioaktif dengan aktivitas antioksidan tertinggi
diperoleh pada waktu hidrolisis antara 0-48 jam dengan kondisi suhu
optimum 37 oC dan komposisi enzim : substrat (5% w/w).
2. Peptida bioaktif yang dihasilkan dari hasil fraksinasi hidrolisat protein
susu kedelai memiliki bobot molekul < 3 kDa.
1.4. Tujuan Penelitian
1. Menentukan kondisi optimum proses hidrolisis enzimatik melalui variasi
waktu hidrolisis yang mampu menghasilkan peptida bioaktif dengan
aktivitas antioksidan tertinggi.
2. Mengkarakteriasi peptide bioaktif yang dihasilkan dari hasil fraksinasi
hidrolisat susu kedelai berdasarkan bobot molekulnya.
5
1.5 Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi kepada
masyarakat bahwa hidrolisat susu kedelai adalah salah satu cara untuk mencegah
penyakit degenerative melalui pemanfaatannya sebagai sumber penghasil
antioksidan.
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Susu Kedelai
Susu kedelai merupakan minuman hasil olahan kedelai yang telah lama
populer sebagai pengganti susu sapi segar. Susu kedelai tergolong jenis susu
imitasi karena bahan bakunya yang berasal dari bahan nabati. Susu kedelai
memiliki kandungan nutrisinya yang tinggi dan csangat baik bagi tubuh terutama
dalam hal asupan protein. Susu kedelai adalah hasil ekstraksi kedelai oleh air,
komposisinya sangat mendekati susu sapi (Liu, 1997). Pembuatan susu kedelai
dapat menggunakan teknologi dengan peralatan yang sederhana maupun modern
dengan peralatan yang canggih. Secara tradisional, susu kedelai biasanya dibuat
dengan cara menggiling biji kedelai yang telah direndam dalam air kemudian
disaring untuk mendapatkan filtratnya. Pada teknologi yang modern, susu kedelai
disajikan dalam bentuk bubuk melalui metode pengeringan semprot (spray
drying) sehingga dapat meningkatkan masa simpan produk.
Menurut Shurtleff et al.,1984), terdapat beberapa metode dasar pembuatan
susu kedelai yang telah umum digunakan, yaitu metode tradisional dan tradisional
termodifikasi, metode defatted soy meal, metode isolat atau konsentrat, ekstruder,
dan metode whole bean. Dalam penelitian ini, ekstraksi susu kedelai dilakukan
dengan metode whole bean, seluruh biji kedelai yang telah direndam, kulitnya
dikelupas (dehulling), dan digiling dengan air panas (hot grinding). Susu kedelai
memiliki kandungan nutrisi yang sangat baik karena mendekati kandungan nutrisi
pada susu sapi. Kandungan protein yang terdapat pada susu kedelai umumnya
lebih tinggi dibanding kadar protein pada susu sapi, yaitu sekitar 3.2-3.6 %
6
7
(Haytowitz dan Matthews, 1989). Jenis karbohidrat pada kedelai sebagian besar
terdiri dari disakarida dan oligosakarida. Oligosakarida penyebab flatulensi pada
susu kedelai dapat dikurangi melalui proses pengolahan yang sesuai, misalnya
dengan perendaman dan pemblansiran (Shurtleff dan Aoyagi, 1984). Kadar lemak
pada susu kedelai lebih rendah dibanding susu sapi karena susu kedelai berasal
dari tanaman, sedangkan susu sapi berasal dari binatang mamalia yang memiliki
kelenjar susu. Lemak pada susu kedelai merupakan lemak nabati yang biasa
disebut fitosterol. Perbandingan antara susu kedelai dan susu kedelai dapat di lihat
di tabel 1.
Tabel 1. Perbandingan Susu Kedelai dan Susu Sapi Per 100 Gram (Sumber :
Koswara, 2006)
Komposisi Susu Kedelai Susu Sapi
Air (%) 88,60 88,60
Kalori (kal) 52,99 58,00
Protein (%) 04,40 0,14
Karbohidrat (%) 0,18 4,50
Lemak (%) 2,50 0,30
Vit B1 (%) 0,04 0,04
Vit B2 (%) 0.02 0,15
Vit A (%) 0,02 0,20
Kalsium (mg) 15,00 100
Fosfor (mg) 49,00 90
Natrium (mg) 2,00 16
Besi (mg) 1,02 0,01
Asam lemak Jenuh (%) 40-48 60-70
Asam lemak tidak jenuh (%) 52-60 30-40
Kolesterol (mg) 0 9,2-9,90
Abu (gram) 0,02 0,07
Hal yang sering dipermasalahkan dalam pengolahan susu kedelai dan
produk olahan kedelai lainnya yaitu munculnya flavor dan aroma yang tidak
diinginkan seperti bau langu, tengik, rasa pahit (bitterness), dan rasa berkapur
8
(chalky atau painty) (Shurtleff dan Aoyagi, 1984). Bau langu dan tengik terbentuk
dari reaksi peroksidasi asam lemak tidak jenuh (PUFA), yang dikatalisa oleh
enzim lipoksigenase (Liu, 1997). Chalkiness disebabkan oleh senyawa isoflavon
dalam biji kedelai, sedangkan bitterness disebabkan oleh senyawa saponin dan
sapogenol (Shurtleff dan Aoyagi, 1984). Flavor dan aroma yang tidak diinginkan
pada susu kedelai ini dapat dieliminasi dengan beberapa cara. Beberapa
diantaranya yaitu penggilingan dengan panas (hot grinding), pra-blansir atau
pemanasan kering-awal, penghilangan lemak (defatted soy meal), deodorasi
vakum, penggumpalan protein kedelai dengan asam, fermentasi asam laktat,
perendaman dalam larutan alkali, penggilingan dengan asam, dan dehulling
(pengelupasan kulit biji kedelai) (Shutleff dan Aoyagi, 1984)
Manfaat susu kedelai lainnya tidak terlepas dari kandungan yang ada
dalam kedelai. Beberapa kandungan susu kedelai yang baik bagi tubuh antara lain:
1. Susu kedelai mengandung protein yang hampir sama banyaknya dengan
susu sapi, tapi dengan kalori yang lebih rendah.
2. Vitamin D penting untuk kesehatan tulang. Banyak susu kedelai yang
dijual telah ditambahkan dengan vitamin D.
3. Vitamin B12 membantu memproduksi sel darah merah sehingga
mencegah anemia. Sumber Vitamin B12 antara lain telur dan produk susu.
Namun, bagi pemakan sayuran alias vegetarian atau mereka yang alergi
terhadap susu sapi, konsumsi susu kedelai membantu melengkapi
kebutuhan Vitamin B12
4. Susu kedelai juga mengandung seng atau zinc yang penting untuk sistem
kekebalan tubuh.
9
5. Kedelai tinggi akan kandungan asam lemak seperti omega-3 yang dapat
membantu mengurangi kadar lemak darah (kolesterol total dan
trigliserida), sehingga mengurangi risiko penyakit jantung koroner dan
serangan jantung.
6. Kalsium dan magnesium yang terkandung dalam kedelai diduga mampu
membantu mengurangi gejala pra-menstruasi, mengatur kadar gula darah,
dan mencegah sakit kepala sebelah atau migraine (Cahyadi, 2007)
2.2 Antioksidan
Antioksidan merupakan suatu senyawa pendonor elektron atau reduktan.
Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat proses oksidasi
dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif (Winarsi, 2007).
Senyawa antioksidan yang terdapat di dalam tubuh dapat menetralkan radikal
bebas, contohnya enzim SOD (superoxidedismutase), gluthatione, dan katalase.
Antioksidan juga dapat diperoleh dari makanan yang mengandung vitamin C,
vitamin E, betakaroten dan senyawa fenolik (Prakash, 2001).
Menurut Maulida dan Guntarti (2015), berkaitan dengan fungsinya,
senyawa antioksidan diklasifikasikan dalam lima tipe antioksidan, yaitu:
1. Primary antioxidants, yaitu senyawa-senyawa fenol yang mampu memutus
rantai reaksi pembentukan radikal bebas asam lemak. Senyawa fenol
memberikan atom hidrogen yang berasal dari gugus hidroksi senyawa fenol
sehingga terbentuk senyawa yang stabil. Senyawa antioksidan yang termasuk
kelompok ini, misalnya BHA, BHT, PG, TBHQ, dan tokoferol.
2. Oxygen scavengers yaitu senyawa-senyawa yang berperan sebagai pengikat
oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi. Dalam hal ini, senyawa
10
tersebut akan mengadakan reaksi dengan oksigen yang berada dalam sistem
sehingga jumlah oksigen akan berkurang. Contoh dari senyawa-senyawa
kelompok ini adalah vitamin C (asam askorbat), askorbil palminat, asam
eritorbat, dan sulfit.
3. Secondary antioxidants I yaitu senyawa-senyawa yang mempunyai
kemampuan untuk berdekomposisi hidroperoksida menjadi prodak akhir yang
stabil. Tipe antioksidan ini pada umumnya digunakan untuk menstabilkan
poliolefin resin. Contohnya, asam tiodipropionat dan dilauriltio propionat.
4. Antioxidative Enzyme I yaitu enzim yang berperan mencegah terbentuknya
radikal bebas. Contohnya glukosa oksidase, superoksida dismutase (SOD),
glutation peroksidase, dan kalalase.
5. Chelators sequestrants yaitu senyawa-senyawa yang mampu mengikat logam
seperti besi dan tembaga yang mampu mengkatalis reaksi oksidasi lemak.
6. Senyawa yang termasuk didalamnya adalah asam sitrat, asam amino,
ethylenediaminetetra acetid acid (EDTA), dan fosfolipid.
Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama
merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen.
Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai
antioksidan primer. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu
memperlambat laju autooksidasi dengan mekanisme pemutusan rantai
autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon,
1990 dalam Ardiansyah, 2007). Reaksi oksidasi lemak yang terjadi pada makanan
atau bahan makanan berlemak dapat dihambat dengan pemberian zat antioksidan.
Pada umumnya zat antioksidan yang digunakan adalah zat antioksidan sintetik
11
seperti (BHA), (BHT), (PG) dan (EDTA). Sementara itu penggunaan zat
antioksidan sintetik tertentu misalnya BHT dapat menimbulkan akibat buruk
terhadap kesehatan konsumen seperti gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus
dan keracunan. Salah satu usaha untuk mengatasi masalah tersebut adalah
mengganti zat antioksidan sintetik dengan zat antioksidan alami.
Jenis penggolongan antioksidan yang kedua adalah berdasarkan sumber
diperolehnya senyawa tersebut. Penggolongan ini ada dua yaitu antioksidan
sintetik dan antioksidan alami.
1. Antioksidan Sintetik
Antioksidan sintetik efektif dalam mencegah ketengikan pada minyak dan
bahan pangan berlemak (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Contoh antioksidan
sintetik adalah BHA, BHT, propil galat dan lain-lain. Penggunaan antioksidan
tidak boleh berlebihan karena aktivitas antioksidan akan hilang pada konsentrasi
yang tinggi dan mungkin akan menjadi prooksidan. Penggunaan antioksidan
berlebihan akan menyebabkan senyawa lebih bersifat sebagai akselerator daripada
inhibitor dalam oksidasi lemak. Dalam keadaan berlebih, antioksidan akan
meningkatkan dekomposisi oksidasi lemak dan pembentukan produk radikal.
2. Antioksidan Alami
Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari :
a) Senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan,
b) Senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses
pengolahan,
12
c) Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke
makanan sebagai bahan tambahan pangan Kebanyakan senyawa antioksidan
yang diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan.
2.3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan spesi atom dengan elektron tidak berpasangan.
Radikal bebas memainkan peran penting dalam system biologi. Radikl bebas
berasal dari spesi oksigen (reactive oxygen species) dan nitrogen(reactive nitrogen
species). Produksi radikal bebas dihasilkan karena metabolisme endogen normal,
proses dan keadaan patofisiologis atau via paparan kondisi fisikokimia
eksternal(polutan, asap, xenobiotik dan radiasi). Radikal bebas diperlukan oleh
tubuh karena mereka memainkan peran penting dalam aktifitas seluler seluler
yang berkitan dengan signaling dan homeostasis Tubuh memantau dan atau
menghambat produksi radikal bebas yang tinggi dengan menggunakan sejumlah
besar mekanisme untuk meminimalkan radikal bebas (Halliwell, 1994).
Secara alamiah tubuh memiliki pertahanan terhadap aktivitas radikal bebas
tersebut yaitu dengan adanya beberapa enzim, seperti katalase, glutation,
superoksida dismutase dan antioksidan dari sumber makanan (vitamin A, vitamin
C dan vitamin E) memainkan peran kunci dalam mekanisme pertahanan melawan
radikal bebas. Kegagalan mekanisme pengangkalan dampak buruk dari radikal
bebas (ROS) akan menyebabkan cedera jaringan dan sering dikenal dengan
istilah stress oksidatif. Aspek kimia radikal bebas dalam tubuh banyak mendapat
perhatian karena reaksi radikal bebas dengan non-radikal (seperti lipid, protein,
karbohidrat dan asam nukleat) akan menghasilkan reaksi berantai radikal bebas
13
yang pada gilirannya dapat bereaksi dengan makromolekul baru menghasilkan
radikal baru.
X : H + •O-H X• + H-O-H
Radikal hidroksil Radikal baru
Beberapa efek yang membahayakan dari aksi radikal bebas termasuk lipid
peroksidasi, karbonilasi protein, reaksi oksidasi dan cross-linking; pengubahan
struktur dan mutasi DNA (Gambar 1). Semua ini akan mengganggu proses
metabolisme seluler normal dan mekanisme signaling/hormonal. Stress oksidatif
juga dapat mempercepat proses penuaan dan juga dalam etiologi lebih dari seratus
penyakit neurodegenerative (Penyakit Gehrig, penyakit Parkinson, Alzheimer,
Huntington) dan penyakit kardiovaskular (infark miokard, stroke) serta sindrom
kelelahan kronis (Halliwell, 1994).
Gambar 1. Reaksi Pembentukan Radikal bebas
(Sumber:http://tipscarahidupsehat.com/radikal-bebas-dan-reactive-oxygen-
species/)
Penyakit degeneratif yang ditimbulkan oleh radikal bebas bermula dari
kerusakan sel. Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan sel karena merusak
14
protein (mengganggu aktivitas enzim), merusak asam nukleat (menimbulkan
kerusakan DNA, mutasi sel), dan merusak lipida (mengganggu fluiditas
membran). Sebagai akibatnya pertumbuhan dan perkembangan sel menjadi tidak
wajar, bahkan dapat menyebabkan kematian sel. Membran plasma merupakan
tempat utama reaksi radikal bebas karena strukturnya yang mudah teroksidasi
(asam lemak tidak jenuh jamak). Rusak atau hilangnya asam lemak tidak jenuh
pada membran plasma akan mengganggu permeabilitas membran, mengakibatkan
radikal bebas semakin mudah masuk ke dalam sel, mempengaruhi/bereaksi
dengan organel yang terdapat di dalam sel. Misalnya merusak lisosom dan inti sel
serta mengakibatkan kerusakan DNA, sehingga menimbulkan mutagenesis yang
menjadi patogenesis kanker (Halliwell, 1994).
Winarsi (2007) secara umum menjelaskan tahapan reaksi pembentukan
radikal bebas mirip dengan rancidity oxidative, yaitu melalui 3 tahapan reaksi
berikut:
1. Tahap inisiasi, yaitu awal pembentukan radikal bebas. Misalnya:
Fe++
+ H2O2 Fe+++
+ OH- + •OH
R1-H + •OH R1• + H2O
2. Tahap propagasi, yaitu pemanjangan rantai radikal.
R2-H + R1• R2• + R1-H
R3-H + R2• R3• + R2-H
3. Tahap terminasi, yaitu bereaksinya senyawa radikal dengan radikal lain atau
dengan penangkap radikal, sehingga potensi propagasinya rendah.
R1• + R1• R1- R1
R2• + R1• R2- R1
15
R2• + R2• R2- R2 dst
2.4 Metode DPPH (Pengukuran Aktivitas Antioksidan)
Senyawa yang biasa digunakan untuk mengukur radikal bebas sebagai
model dalam pengukuran aktivitas antioksidan adalah DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl) yang merupakan senyawa radikal bebas yang stabil sehingga
apabila digunakan sebagai pereaksi dalam uji penangkapan radikal bebas cukup
dilarutkan. Senyawa ini jika disimpan dalam keadaan kering dan kondisi
penyimpanan yang baik akan stabil selama bertahun-tahun (Winarsi, 2007).
Radikal bebas DPPH dapat menangkap atom hidrogen dari komponen aktif
ekstrak yang dicampurkan, kemudian bereaksi menjadi bentuk tereduksinya
(Gambar 2).
Gambar 2. Reaksi DPPH dengan antioksidan (Yuhernita dan Juniarti, 2014)
Berdasarkan gambar 2 di atas, senyawa antioksidan (AH) melepas atom
hidrogen menjadi radikal senyawa antioksidan (A•). DPPH yang merupakan
radikal bebas direaksikan dengan senyawa antioksidan dan menjadi DPPH bentuk
tereduksi (DPPH2) (Molyneux, 2004).
Metode DPPH secara umum digunakan untuk memindai berbagai sampel
dalam penentuan aktivitas antioksidan. Pengukuran serapan DPPH pada panjang
gelombang maksimum (λ maks) yaitu 515-520 nm. Perhitungan yang digunakan
dalam penentuan aktivitas penangkap radikal adalah nilai IC50 (Inhibition
16
Concentration 50%), Nilai tersebut menggambarkan besarnya konsentrasi
senyawa uji yang dapat menangkap radikal sebesar 50%. Penentuan IC50,
diperlukan persamaan kurva standar dari % inhibisi sebagai sumbu y dan
konsentrasi fraksi antioksidan sebagai sumbu x. IC50 dihitung dengan cara
memasukkan nilai 50% ke dalam persamaan kurva standar sebagai sumbu y
kemudian dihitung nilai x sebagai konsentrasi IC50. Semakin kecil nilai IC50
menunjukkan semakin tinggi aktivitas antioksidasinya (Molyneux, 2004).
2.5 Peptida Bioaktif
Peptida merupakan kumpulan dari 2-20 asam amino yang terikat satu sama
lain melalui ikatan peptida. Menurut Korhonen dan Pihlanto (2006), peptida
bioaktif merupakan fragmen protein spesifik yang mempunyai dampak positif
terhadap fungsional dan kondisi tubuh. Peptida bioaktif umumnya memiliki berat
molekul yang rendah dan bersifat hidrofobik. Peptida bioaktif umumnya terdiri
dari 2-20 asam amino dan banyak peptida bioaktif yang mempunyai sifat
fungsinonal lebih dari satu. Asam amino tersebut dapat berasal dari tumbuhan
maupun hewan seperti susu, keju, yoghurt, ikan, daging, kacang–kacangan dan
kefir (Korhonen dan Pihlanto, 2003).
17
Gambar 3. Peptida bioaktif hasil hidrolisis enzimatik
(Sumber: www.workswithwater.co.uk)
Peptida bioaktif dapat diproduksi dari protein makanan salah satunya yaitu
susu, dengan cara memutus ikatan peptida dari protein tersebut, sehingga
dihasilkan struktur yang lebih pendek dengan komposisi dan urutan asam amino
tertentu (Gambar 3). Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk memutus
ikatan peptida, yaitu hidrolisis enzim (in vitro dan in vivo) dan proses fermentasi
(Gambar 4).
Gambar 4. Proses produksi peptide bioaktif dari protein makanan(López-
Fandiño, et al. 2006).
Fermentasi
Mikroba
In vitro dengan
enzim proteolitik
In vivo dengan enzim
gastrointestinal
Pemurnian
Peptida Bioaktif
Protein Makanan
18
Hidrolisis enzim, tripsin dan pepsin dapat digunakan untuk memutus
ikatan peptida. peptida bioaktif diproduksi di usus kita, yaitu dengan cara
menghidrolisis protein yang kita konsumsi dengan menggunakan enzim tripsin
dan pepsin yang sudah ada dalam tubuh. Proses hidrolisis ini dapat juga dilakukan
secara in vitro. Fermentasi Mikroba banyak produk fermentasi terutama yang
berbasis susu menggunakan kultur starter yang mempunyai daya proteolitik
tinggi, contoh Lactococcus lactis dan Lactobacillus helveticus. Mikroba
proteolitik mempunyai kemampuan memecah protein berbeda-beda, Lb.
helveticus CP90 proteinase akan mengkonversi β-kasein menjadi Lys-Val-Leu-
Pro-Val-Pro-Glu (Maeno et al., 1996). Ikatan peptida tersebut terputus, tahap
selanjutnya adalah fraksinasi untuk mendapatkan peptida yang spesifik
berdasarkan berat molekul (BM) tertentu, di industri besar, fraksinasi dilakukan
dengan ultrafiltrasi sehingga dihasilkan peptida dengan BM 1-300 kDa.
2.6 Peptida Bioaktif Antioksidan
Peptida antioksidan umumnya mengandung 5-16 residu asam amino (Chen
et al., 1996). Peptida antioksidan memiliki beberapa keunggulan dibandingkan
antioksidan enzimatik, karena dengan struktur yang lebih sederhana mereka
memiliki stabilitas lebih baik dalam situasi yang berbeda dan tidak menghasilkan
reaksi imun yang berbahaya terlebih lagi, mereka memiliki komponen nutrisi dan
sifat fungsional di samping aktivitasnya sebagai antioksidan (Hattori et al., 1998).
Studi yang telah dilakukan untuk mengeksplorasi peptida bioaktif dilakukan
dalam dua bentuk yang berbeda: baik sebagai protein prekursor atau sebagai
hidrolisat peptida bioaktif.
19
Hidrolisat adalah campuran hasil hidrolisis protein yang terdiri dari
peptida dan asam amino bebas. Hidrolisis protein dapat dilakukan secara
enzimatik, asam atau fermentasi alkali. Peptida bioaktif, di sisi lain, adalah
beberapa asam amino yang telah dimurnikan dari hidrolisatnya. Berbagai
penelitian telah dilakukan untuk menyelidiki sifat antioksidan dari suatu peptida
hidrolisat hasil hidrolisis dari tumbuhan atau hewan. Sumber pangan seperti
kacang-kacangan (Hwang et al., 2010), susu-kefir dan yoghurt susu kedelai (Liu
et al., 2005), kasein (Suetsuna et al.,2000), limbah protein alga (Sheih et al.,
2009) dan protein soba (Tang et al., 2009) .
Mekanisme yang mendasari aktivitas antioksidan dari peptida tersebut
belum sepenuhnya dipahami, telah dilaporkan pula bahwa peptida antioksidan
mampu menjaga sel tetap aman dari kerusakan akibat ROS melalui induksi gen.
Peptid Bioaktif ditemukan didalam ikan sarden dalam bentuk asam amino Met-
Tyr yang mampu mencegah stress oksidatif dengan merangsang ekspresi
oksigenase-1 (HO-1
) gugus heme dan feritin (protein pertahanan antioksidan) di
dalam sel endotel (Erdmann et al., 2006). Hasil penelitian lainnya menunjukkan
bahwa protein daun mampu meningkatkan aktivitas peroksidase glutathione
(GSH-Px), superoksida dismutase (SOD) dan reduksi malondialdehyde (MDA)
secara in vivo (Fu, 2003).
Sifat antioksidan peptida lebih banyak berhubungan dengan
komposisi,struktur, dan hidrofobisitas asam aminonya. Tyr, Trp, Met,Lys, Cys,
dan His adalah contoh asam amino yang memberikan aktivitas antioksidan (Wang
and De Mejia, 2005). Asam amino dengan residu aromatik bisa menyumbangkan
proton pada radikal yang kekurangan elektron. Aktivitas antioksidan dari peptida
20
dalam kaitannya dengan sumbngan ion hidrogen, dalam mekanisme radikal
peroksil lipid dilakukan melalui penjebakan atau pengikatan ion logam pada
kelompok imidazol (Rajapakse et al., 2005., Chan and Decker, 1994). gugus SH
residu sistein memiliki mekanisme tersendiri dimana aktivitas antioksidan
dipengaruhi akibat interaksi langsungnya dengan radikal (Qian et al., 2008).
Adanya asam amino yang posisi urutan peptidanya tepat juga memainkan peran
penting dalam aktivitas antioksidan (Rajapkase et al., 2005). Chen et al., (1996)
merancang 28 peptida sintetis dengan struktur peptida antioksidan (Leu-Leu-Pro-
His-His) dari hidrolisis protein kedelai hasilnya mengungkapkan bahwa aktivitas
antioksidan dari suatu peptida sangat bergantung pada segmen His nya pada
domain Leu-Leu-Pro-His dan aktivitasnya menurun dengan pemutusan residu dari
C-terminus.
Penelitian yang telah dilakukan oleh Saito et al., (2003) menunjukan
bahwa perubahan dalam pengaturan urutan asam amino tripeptida menghasilkan
aktivitas antioksidan yang berbeda. Keterkaitan peptida dan ciri struktural spesifik
dari suatu peptida telah diklaim mampu mempengaruhi aktivitas antioksidannya.
Sebagai contoh, telah ditunjukkan bahwa asam amino tertentu dapat
meningkatkan sifat antioksidan yang lebih tinggi saat digabungkan (Nagasawa et
al., 2001). Berbeda dengan temuan ini, hasil lain menunjukkan ikatan peptida atau
konformasi struktural asam amino bisa menurunkan aktivitas antioksidan dari
asam amino penyusunnya. Karena itu, konformasi peptida memiliki sifat seperti
dua mata pisau yaitu, mampu menunjukkan efek sinergis dan sebaliknya
(antagonis).
21
Penelitian yang dilakukan oleh Chen et al., (1996) menunjukan bahwa
substitusi L-His oleh D-His dalam peptida antioksidan mengarah ke pengurangan
aktivitas. Hasil penelitian mereka menyimpulkan bahwa posisi yang benar dari
kelompok imidazol adalah faktor kunci yang mempengaruhi sifat antioksidan.
Faktor lainnya juga bisa mempengaruhi aktivitas antioksidan antara lain kondisi
operasional yang diterapkan pada saat mengisolasi protein, derajat hidrolisis, jenis
protease yang digunakan, struktur peptida dan konsentrasi peptida (Saito et al.,
2003). Efek konsentrasi protein terhadap aktivitas antioksidan telah dilaporkan
untuk protein hidrolisat kacang tanah (Chen et al., 2007). Berat molekul (BM)
peptida juga dapat mempengaruhi aktivitas antioksidan misalnya pada gluten
jagung, dimana tingkat hidrolisis berkaitan dengan konsentrasi dan berat molekul
hidrolisat. Aktivitas antioksidan peptida dengan BM 500-1500 Da lebih kuat dari
pada peptida di atas 1500 Da dan peptida di bawah 500 Da (Li et al., 2008).
2.7 Elektrofresis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel
Electroforesis).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit
berdasarkan kemampuannya bergerak dalam medium konduksi yang biasanya
berupa larutan bufer dan akan memberikan respons setelah ditambahkan medan
listrik (Harvey, 2000). Jika suatu zat bermuatan diberi potensial, maka zat tersebut
akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katode atau anode sesuai
dengan muatan yang dibawanya. Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke dalam
kelompok elektroforesis zona/wilayah, yaitu kelompok elektroforesis yang
dibedakan berdasarkan medium penyangganya. Elektroforesis SDS-PAGE
menggunakan gel buatan sebagai medium penyangga. Gel yang digunakan
22
terbentuk dari polimerisasi akrilamida dengan N, N’- metilena bis akrilamida
sehingga terbentuk ikatan silang karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya
menghasilkan ikatan linear yang tidak membentuk gel kaku (Girindra, 1993).
Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisis
campuran protein secara kualitatif adalah SDS‐ PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah
migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi-kisi tersebut
berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid
dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi
komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul
suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker,
2000). SDS‐ PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion
rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein termasuk monomerik atau
oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai
subunit atau monomer.
Penggunaan SDS‐ PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif
pada protein yang akan dianalisis. Protein yang terdenaturasi sempurna akan
mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut
(Dunn, 1989). Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer
yang mengandung β‐ merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan
disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan asli protein akan
digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga kompleks
protein‐ SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan
23
Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada suhu kamar dengan adanya
katalis dan inisiator. Katalis dan inisiator yang umum digunakan ialah
N,N’,N’,N’– tetrametilenadiamina (TEMED) dan amonium persulfat (APS)
sebagai sumber radikal bebas yang akan menginisiasi pembentukan polimer
(Caprette 2005). Pada metode ini, digunakan natrium dodesil sulfat (SDS) dan β-
merkaptoetanol. SDS merupakan detergen anionik yang bersama dengan β-
merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi
protein menjadi konfigurasi acak. Hal ini disebabkan oleh pecahnya ikatan
disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfidril.
Pergerakan partikel di dalam medium bergantung pada ukuran partikel dan
ukuran medium penunjang. Ukuran pori dari gel akan ditentukan oleh konsentrasi
gel poliakrilamida. Protein yang besar mempunyai mobilitas yang lebih lambat
dibandingkan dengan kompleks protein yang lebih kecil. Bobot molekul protein
dapat ditentukan dengan kalibrasi menggunakan standar protein yang sudah
diketahui bobot molekulnya. Teknik elektroforesis gel banyak digunakan baik di
bidang kimia maupun biokimia, karena teknik ini memiliki banyak keuntungan,
diantaranya ialah memiliki daya resolusi tinggi, sederhana, dan mudah dibawa
(Girindra 1993).
2.8 Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
merupakan satu-satunya teknik kromatografi cair dengan detektor spectrometer
massa. Penggunaan LC-MS/MS untuk penelitian bio-analisis dimulai pada akhir
1980-an (Bowers, 1989) Kelebihan dari teknologi LC-MS/MS meliputi
24
1. Spesifitas hasil analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan
spektrometer massa sebagi detektor.
2. Aplikasi yang luas dengan sistem yang praktis. Berbeda dengan GC-MS
sebagai spektrometer masa “klasik”, penerapan LC-MS/MS tidak tebatas
untuk molekul volatil (biasanya dengan berat molekul dibawah 500 Da).
Mampu mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan sampel cukup
sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi.
3. Fleksibilitas. Pengujian yang berbeda dapat dikembangan dengan tingkat
fleksibilitas yang tinggi dan waktu yang singkat.
4. Kaya Informasi. Sejumlah data kuantitatif maupun kualitatif dapat diperoleh.
Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat cepat dengan banyak parameter
(Vogeser, et al 2008)
Sampel yang akan dianalisis dengan LC-MS pertama-tama dilewatkan
melalui kromatografi cair untuk memisahkan komponen-komponen yang ada pada
sampel. Selanjutnya, komponen-komponen atau molekul tersebut akan
dilanjutkan ke spektrometri massa. Molekul tersebut akan melalui
proses ionisasi yang dapat dilakukan dengan berbagai cara. Salah satu teknik
ionisasi yang palings sering digunakan adalah electrospray ionisation (ESI).
Sampel yang berupa cairan akan dipompa melalui kapiler dan diubah menjadi
tetesan yang berukuran sangat kecil. Selanjutnya tetesan-tetesan tersebut akan
diubah menjadi fase gas dengan menggunakan panas dan nitrogen. Dalam proses
ini, muatan listrik dari tetesan tersebut akan berpindah ke molekul yang ingin
dideteksi. Molekul yang akan dideteksi dapat bermuatan positif atau negatif dan
dapat dideteksi oleh mesin sesuai pengaturan yang diinginkan.Selanjutnya,
25
spektrometri massa yang terdiri dari empat batang metal yang tersusun secara
pararel akan melakukan seleksi molekul yang ingin dideteksi berdasarkan rasio
massa terhadap muatan (mass-to-charge ratio, m/z) masing-masing molekul.
Molekul dengan rasio m/z yang tidak diinginkan akan dibuang, sedangkan
molekul atau analit dengan m/z rasio yang diinginkan akan diteruskan ke detektor.
Detektor akan menghasilkan puncak-puncak apabila molekul yang diinginkan
terdapat pada sampel. Dengan menggunakan spektroskopi massa yang
dikombinasikan dengan detektor LC informasi yang diperoleh akan jauh lebih
banyak. Misalnya, pada pengunaan dyode array detector (DAD) akan diperoleh
data berupa puncak kromatogram yang akan memberikan informasi yang berguna
dalam mengidentifikasi puncak yang tidak diketahui dan untuk menentukan
kemurnian puncak atau untuk keduanya. Sedangkan data spektroskopi massa akan
memberikan informasi tentang berat molekul dan struktur suatu senyawa. LC-MS
dapat digunakan juga dalam mengidentifikasi sampel yang relative sedikit karena
selektifitas dan sensitifitas detector yang digunakan. Kromatogram dengan MS
untuk satu massa seringmenghasilkan sinyal bebas interferensi yang menawarkan
presisi tinggi dan batas deteksi yang sangat rendah. Dengan menggunakan
detektor UV dan detektor selektif massa akan jauh lebih efektif daripada
menggunakan salah satunya saja. Misalnya pada senyawa (metabolit atau hasil
degradasinya) yang mana spektrum UV-Vis dari dua analit akan sangat mirip dan
mungkin sulit untuk mendeteksi pengotor berdasarkan spektrum UV saja.
26
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, dimulai pada bulan Agustus 2017 hingga Agustus 2018.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat gelas , vortex,
pH meter (Tolledo), spektrofotometri Uv-Vis (Lamda 25 Perkin Elmer), Freeze
dry, Mini Protean Gel Electrophoresis (Biorad) dan LCMS/MS (Shimadzu).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu susu kedelai (kacang kedelai
diperoleh dari pasar tradisional Jatinegara, aquades, asam klorida, natrium
hidroksida, larutan buffer asetat 0.05 M, enzim pepsin (Sigma Aldrich), larutan
BSA (bovin serum albumin), asam asetat, cupri sulfat peta hidrat, natrium
karbonat, Na-Sitrat, asam trikloroasetat, Folin ciocalteu, DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl), metanol, buffer PBS (phosphate buffered saline), Buffer phosfat
0.05M pH 7.4, metanol (MeOH) dan sephadex G-10 grade-Kromatografi gel
filtrasi (Sigma).
26
27
3.3 Diagram Alir Penelitian
Gambar 5. Diagram Alir Penelitian
Hidrolisis Protein 1:20
0, 2, 6, 16, 24, 40, 48 jam
UJi Kadar Protein Total
Analisis data
Susu Kedelai
Hasil Presipat
Uji kadar protein
terlarut
Hidrolisat
Uji DH (%) Uji Antioksidan Uji SDS-PAGE
Hidrolisat dengan aktivitas
antioksidan tertinggi
Fraksi dengan kolom G-
SPHADEX G-10
Fraksi peptide bioaktif
Uji SDS-
PAGE Uji aktivitas Antioksidan Uji LCMS/MS
Presipitasi Asam
28
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Preparasi Susu Kedelai (Firman jaya, 2009)
Sebanyak 200 gram kacang kedelai di cuci dan direndam dalam air
sebanyak 500 mL selama 12 jam. Kacang kedelai dibersihkan dari kulitnya.
Kacang kedelai diblender dan ditambahkan air dengan perbandingan 1 : 3 dari
volume kacang kedelai. Susu kedelai disaring dan dipanaskan selama 15 menit
dengan suhu 80oC, setelah itu susu kedelai disimpan di dalam freezer.
3.4.2 Pemisahan protein susu kedelai dengan presipitasi asam (Smith
and Circle, 1939)
Susu kedelai sebanyak 800 mL ditambahkan NaOH 1N sampai pH 8.5 lalu
diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama 1 jam. Suspensi
disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit, selanjutnya diambil
filtratnya. Filtrat ditambahkan HCl 1N sampai pH 4,5 kemudian di sentrifugasi
dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Protein yang mengendap
dinetralkan sampai pH 7.
3.3.3 Pengukuran Kadar Protein Terlarut (Lowry, 1951)
Sebanyak 1 mL sampel ekstrak protein susu kedelei yang sudah di
encerkan (5x) dimasukkan kedalam tabung reaksi. Sampe ekstrak protein susu
kedekei kemudian ditambahkan larutan lowry A dan B ( Lampiran 6) sebanyak 5
mL ke dalam tabung tersebut. Campuran reaksi dihomogenkan dengan vortex dan
didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 mL larutan folin ciocalteu 1 N,
kocok dan diamkan 30 menit. Campuran reaksi diukur pada 750 nm dan
konsentrasi protein ditentukan dengan kurva standar bovine serum albumin (BSA)
(Lampiran 6)
29
3.3.4 Hidrolisis Protein Susu Kedelai (Alder-Nissen, 1986)
Enzim Pepsin 30 µg/mL ditambahkan ke dalam protein hidrolisat susu
kedelai dengan perbandingan protein : enzim (1:20) dan hidrolisis dilakukan
dalam buffer asetat 0,05 M pada kondisi suhu 37 oC dan pH 4,5.
Sebanyak 5 mL hidrolisat protein susu kedelai, diambil setiap interval 0, 2,
6, 16, 24, 40, 48 jam dan diukur nilai derajat hidrolisisnya. Proses inkubasi
selesai, masing-masing campuran hidrolisat dipanaskan pada suhu 98 oC selama
5-10 menit untuk menginaktivasi enzim.
3.3.5 Uji Derajat Hidrolisis ( Hoyle dan Merrit, 1994 )
Derajat hidrolisis dihitung dengan metode SN-TCA. Sebanyak 2 mL
hidrolisat protein ditambahkan TCA 10% (b/v) (Lampiran 6) sebanyak 2 mL.
Campuran tersebut kemudian didiamkan selama 30 menit agar terjadi
pengendapan, kemudian disentrifugasi (kecepatan 7.800 g, selama 15 menit).
Supernatan dianalisis kadar proteinnya menggunakan metode Lowry (1951).
Derajat hidrolisis dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
3.3.6 Uji Aktivitas Antioksidan (Brand-Williams, et al. 1995).
Metode pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan
metode Brand-Williams et al. (1995). Masing-masing hidrolisat sebanyak 5 mL
yang dilarutkan dengan 5 mL methanol yang digunakan sebagai larutan induk.
Larutan induk pada hidrolisat 1000 ppm dibuat deret sampel dengan konsentrasi
1.000, 500, 250, 125, 62.5 ppm. Larutan sampel dengan masing-masing
30
konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 mL DPPH
0,002%. Larutan sampel divorteks sampai homogen dan diinkubasi selama 30
menit dalam ruang gelap. Diukur nilai absorbansi larutan sampel dengan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 512-520 nm. Pengujian
dilakukan sebanyak dua kali (duplo). Larutan blanko yang digunakan yaitu 2 mL
methanol dan 2 mL DPPH 0,002%.. Ditentukan nilai persentase inhibisi yang
dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% Inhibisi = x 100
3.3.7 Analisis Fraksi Protein Hidrolisat dengan SDS-PAGE (Laemli, 1971)
Elektroforesis SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate poliacrilmide gel
electrophoresis) dilakukan dengan menggunakan metode Laemli, (1971) yang
dimodifikasi dengan menggunakan larutan stacking gel 4% dan separating gel 12
% dalam larutan buffer Tris HCl 3M, 0.3% SDS, pH 8.8). Sampel protein
hidrolisat hasil hidrolisis enzimatik didenaturasi dengan buffer sampel (Tris-Cl
1M pH 6.8, SDS 20%, NO3) dengan perbandingan protein dan buffer 2:1, dan
dididihkan pada suhu 90 oC selama 10 menit serta disentrifugasi selama 5 menit.
Alat elektroforesis disiapkan, Gel poliakrilamid dibuat dari larutan akrilamid
(48%) dan bisakrilamid (1,5%), stacking buffer (Tris-HCl 0,5M pH 6.8),
resolving buffer (Tris-HCl 1,5M pH 8.8), 10%SDS, APS dan TEMED sebagai
katalis. Setelah gel bagian bawah (resolving gel) terbentuk, stacking gel
dimasukkan di bagian atasnya dan dibuat cetakan untuk menempatkan protein
sampel. Elektroforesis sampel dilakukan pada tegangan 150 volt selama 60 menit.
Staining protein digunakan NO3. Hasil staining dicuci dalam larutan destaining .
31
3.3.8 Pemisahan dan Pemurnian Protein Kromatografi G-10
( Maruyama et al., 1985)
Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan metode ultrafiltrasi dan
kromatografi gel filtrasi. Masing-masing protein hidrolisat hasil hidrolisis).
dimurnikan dengan menggunakan kolom sephadex G-10 untuk memisahkan
fraksi peptida yang ukurannya di bawah 10 kDa. Fraksinasi peptida dilakukan
dengan cara memasukkan 1 mL hidrolist susu kedelai ke dalam kolom, kemudian
ditambahkan larutan buffer fosfat 0,01 M pH 7 sebagai larutan elusi, kemudin
fraksi ditampung sebanyak 30 fraksi dengan laju 0,5 mL/ menit. Hasil fraksi diuji
kualitatif dengan menggunakan larutan bradfoed.
3.3.9 Identifikasi Peptide dengan LCMS/MS (Vincent et al., 2016)
Peptida bioaktif hasil fraksinasi kolom sephadex dengan aktivitas
antioksidan tertinggi dianalisis dengan menggunakan intrumen LCMS/MS
(Shimadzu) yang dilengkapi dengan electrospray ionisation (ESI). Campuran
Fraksi 7, 8, 9 sebanyak 10 µL dan di suntikkan ke dalam alat LCMS/MS dan
diionisasi dengan mode ESI electrospray ionization. Bobot molekul sampel
dianalisis berdasarkan spectrum massa (M+H+) yang dihasilkan yang selanjutnya
diolah datanya menggunakan metode protein deconvolution (Trauger et al., 2002)
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Presipitasi Protein Susu Kedelai
Presipitasi protein susu kedelai dilakukan dengan metode presipitasi asam
menggunakan asam klorida (HCl 1 M). Ekstrak protein yang dihasilkan dari hasil
presipitasi sebanyak 72,96 g dari 200 gram kacang kedelai, sehingga rendemen
yang dihasilkan adalah 36,48 % (b/b). Hasil tersebut relatif lebih kecil
dibandingkan hasil penelitian Wu et al., (2003) dimana rendemen yang dihasilkan
yaitu sebesar 72,35%. Perbedaan hasil yang diperoleh kemungkinan disebabkan
oleh jenis kacang kedelai yang digunakan dan proses ekstraksi susu kedelai yang
berkaitan dengan ketepatan pH asam yang digunakan. Sebelum dilakukan
presipitasi susu kedelai dihitung kadar protein kasarnya terlebih dahulu dengan
menggunakan metode Kjedhal sebagai berikut :
Tabel 2. Kadar Protein Kasar Susu Kedelai
Kadar Protein Hasil Analisis% Rata-rata%
Percoban 1 2,56 2,62 + 0.2 Percobaan 2 2.67
Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat bahwa kadar protein kasar yang
diperoleh relatif rendah (kurang dari 4%). Hal ini diduga karena proses ekstraksi
tidak menyebabkan semua protein kacang kedelai larut dalam susu kedelai. Selain
itu faktor suhu dan pemanasan susu kedelai yang terlalu tinggi juga bisa
mendenaturasi protein sehingga protein akan terkoagulasi dan mengendap.
Menurut suhaidi (2003) menurunnya kadar protein seiring dengan lamanya
perendaman pada saat pembuatan susu kedelai menyebabkan komponen protein
terlarut dalam air. Perendaman juga mengakibatkan lunaknya struktur biji kedelai
32
33
sehingga air lebih mudah masuk kedalam sktruktur selnya sehingga kadar air
semakin tinggi.
4.2 Hidrolisat Protein Susu Kedelai
Proses hidrolisis protein susu kedelai dilakukan selama 0-48 jam dan
setiap interval 0, 2, 6, 16, 24, 40, 48 jam, dilakukan sampling/cuplikan hidrolisat
susu kedelai dan kemudian dihitung kadar proteinnya dengan menggunakan
metode Lowry. Kadar protein hidrolisat susu kedelai setelah dilakukan
hidrolisis enzim pepsin dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 6. Kadar protein terlarut hidrolisat susu kedelai
Berdasarkan Gambar 6, terlihat bahwa kadar protein terlarut pada waktu 0
jam merupakan control dengan kadar protein 147,538 ppm. Waktu hidrolisis 2, 6,
16, kadar protein yang dihasilkan mengalami kenaikan sementara pada waktu
hidrolisis 24 mengalami penuruan kembali yaitu sebesar 242,635 ppm. Kadar
protein yang paling tinggi pada hidrolisat susu kedelai adalah pada waktu
hidrolisis 16 jam yaitu sebesar 283,835 ppm.
Hidrolisat susu kedelai yang sudah di ketahui kadar protein nya kemudian
dilakukan uji profil hidrolisat protein dengan menggunakan SDS PAGE. Hasil
analisis profil protein hidrolisat susu kedelai dapat dilihat pada Gambar 7.
34
M 0 2 6 16 24 40 48 ISK
Gambar 7. Profil protein hidrolisat susu kedelai hasil analisis SDS-
PAGE (M = marker, ISK = isolate susu kedelai, 0, 2, 6, 16,
16, 24, 40, 48= waktu hidrolisis)
Berdasarkan Gambar 7 dapat dilihat bahwa hasil profil isolat susu kedelai
sebelum dilakukan hidrolisis dan setelah dihidrolisis. Pada waktu hidrolisis 2-6
jam, ketebalan pita protein terlihat pada bobot molekul ~15 kDa dan tidak
ditemukan protein dengan bobot molekul yang lebih besar dari 15 kDa, sedangkan
pada waktu 16-48 jam ketebalan pita protein BM ~15 kDa mulai hilang dan
muncul pita protein dengan bobot molekul yang lebih rendah sekita r < 10 kDa.
Pada profil isolate susu kedelai sebelum dihidrolisis terdapat 6 buah pita protein
dengan BM yang bervariasi. Keenam pita protein tersebut merupakan protein
glycinin (260 kDa), conglycinin (150 kDa) -conglicinin (72.4 kDa), (’-
conglicinin (62.9 kDa) dan protein dengan bobot molekul ~29-33 kDA (Acidic-
glicinin) dan 17 kDa (Basic glicinin) (Amnuaycheewa and de Mejia 2010). .
Berdasarkan profil protein hidrolisat tersebut terlihat bahwa semakin lama
waktu hidrolisis, struktur molekul protein semakin pendek. Hal ini
mengindikasikan bahwa hidrolisis enzimatik dengan enzim pepsin telah berjalan
dengan baik sehingga menghasilkan peptida dengan bobot molekul yang lebih
rendah. Jika dibandingkan antara susu kedelei sebelum hidrolisis dan setelah
35
hidrolisis menunjukkan adanya pemecahan molekul substrat protein menjadi
produk dalam bentuk fragmen peptide pendek yang ditandai dengan munculnya
pita-pita protein dengan bobot molekul rendah (<15 kDa).
Protein kedelai terdiri dari fraksi 2S, 7S, 11S 15S Komponen 11S
(glycinin), memiliki berat molekul (MW) sekitar 360 KDa dan terdiri dari acid
glycinin (A-glycinin, 34-35 KDa) dan base glycinin (B-glycinin, 18-22 KDa) yang
dihubungkan oleh ikatan disulfida (An-S-S Bn) Glycinin adalah protein tunggal
yang terdiri dari enam subunit, yang masing-masing subunit glycinin terdiri dari
dua komponen polipeptida, satu dengan asam dan satu lagi dengan basa yang
masing-masing memiliki titik isoelektrik yang berbeda .Conglycinin, 7S globulin
(MW sekitar 140-170 KDa) setidaknya terdiri dari tujuh bentuk sebagai hasil dari
berbagai kombinasi dari subunit a- glycinin, a’ glycinin, dan P (MW 57-68 , 57-72
dan 42-52 KDa, masing-masing) (Thanh and Shibasaki, 1976).
4.3 Derajat Hidrolisis (DH)
Pengukuran derajat hidrolisis dilakukan dengan metode Adler-Nissen
(1979). Derajat hidrolisis menunjukkan persentase ikatan peptida yang terputus
pada rantai polipeptida. Hasil pengukuran derajat hidrolisis protein susu kedelai
dapat dilihat pada gambar 8 .
Gambar 8. Derajat hidrolisis protein susu kedelai
36
Berdasarkan data pada Gambar di atas dapat dilihat bahwa nilai derajat
hidrolisis yang dihasilkan fluktuatif, pada waktu hidrolisis 40 jam memiliki nilai
derajat hidrolisis yang paling tinggi yaitu 53,24 %, namun setelah 48 jam terjadi
penurunan menjadi 46,36 %. Perbedaan nilai DH ini terjadi karena kurang
optimalnya proses agitasi selama hidrolisis susu kedelai yang dilakukan sehingga
kontak antara enzim dan substrat belum optimal. Namun demikian jika
dibandingkan dengan penelitian Lee et al. (2005), nilai derajat hidrolisis susu
kedelai yang dihasilkan masih relatif lebih besar daripada hidrolisis susu kambing
dengan enzim yang sama hanya menghasilkan DH < 50% setelah hidrolisis
selama 48 jam.
Tingginya derajat hidrolisis menunjukkan bahwa hampir separuh jumlah
protein pada susu kedelai terhidrolisis selama proses enzimatis. Menurut
Hernandez (2011), besarnya nilai DH menunjukkan tingkat kemudahan protein
tersebut terhidrolisis. DH juga berkaitan dengan jumlah asam amino bebas atau
jumlah protein terlarut. Tinggi rendahnya derajat hidrolisis sangat ditentukan oleh
lamanya waktu inkubasi dan konsentrasi enzim dan rasio enzim : substrat yang
digunakan. Konsentrasi enzim merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi
laju reaksi enzim proteolitik. Pada proses hidrolisis dengan menggunakan enzim
proteolitik, substrat protein akan diubah menjadi produk hidrolisat berupa
senyawa oligopeptida dengan ukuran dan bobot molekul yang lebih rendah.
Nilai derajat hidrolisis juga dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, suhu,
pH dan waktu hidrolisis (Haslaniza et al. 2010). Waktu hidrolisis yang berbeda
akan menghasilkan jenis peptida dan asam amino bebas yang berbeda pula. Pada
penelitian ini dilakukan dengan proses hidrolisis dengan menggunakan enzim
37
proteolotik pepsin. Pepsin dapat memotong peptide menjadi asam amino dengan
rantai pendek dengan spesifitas pemotongan pada residu leusin, fenilalanin,
triftopan dan tirosin (Hernandez, 2011). Hidrolisis secara enzimatis lebih
menguntungkan dibandingkan dengan fermentasi, karena dapat menghasilkan
asam-asam amino bebas dan peptida dengan rantai pendek yang bervariasi
(Pangastuti dan Triwibowo, 1996). Reaksi hidrolisis enzimatik dengan
menggunakan pepsin dapat di lihat pada gambar 9.
Gambar 9. Mekanisme reaksi hidrolisis enzimatik dengan pepsin
(Garrett et al., 1997)
Pepsin paling aktif berada di lingkungan asam dengan suhu antara 37 °C
hingga 42 °C. Dengan demikian, situs sintesis primer dan aktivitasnya berada di
dalam lambung (pH 1,5 sampai 2). Pepsin akan mencerna hingga 20% ikatan
amida yang tertelan dengan memotong secara istimewa pada sisi N-terminal asam
amino aromatik seperti fenilalanin, triptofan, dan tirosin. Menurut penelitian
Lehninger et al., (2008) Pepsin menunjukkan pemotongan istimewa untuk residu
hidrofobik, terlebih aromatik, pada posisi P1 dan P1'. Peningkatan kerentanan
terhadap hidrolisis terjadi jika terdapat asam amino yang mengandung sulfur
berdekatan dengan ikatan peptida yang dimiliki asam amino aromatik. Pepsin
menunjukkan aktivitas maksimum pada pH 2,0 dan tidak aktif pada pH lebih dari
6,5, tetapi pepsin tidak sepenuhnya terdenaturasi atau diinaktivasi secara
38
ireversibel hingga pH 8,0. Oleh karena itu, pepsin dalam larutan berpH hingga 8,0
dapat diaktifkan kembali saat reasidifikasi (Johnston et al., 2007)
4.4 Aktivitas Antioksidan Hidrolisat Susu Kedelai
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH (2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl). Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam nilai IC50
yakni besarnya konsentrasi yang dapat menghambat aktivitas radikal bebas
(DPPH) sebanyak 50% (Molyneux 2004). Hidrolisat protein susu kedelai dengan
waktu hidrolisis yang berbeda menghasilkan nilai aktivitas antioksidan yang
berbeda. Hasil pengujian aktivitas antioksidan hidrolisat susu kedelai dengan
perlakuan waktu hidrolisis yang berbeda dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Nilai IC50 pada Hidrolisat Susu Kedelai Variasi Waktu
Waktu
Hidrolisis(Jam)
IC50 ppm±SD
0 86,92 ± 0
2 95,41 ± 0,03
6 82,41 ± 0,009
16 474,78 ± 0,02
24 711,51± 0,004
40 172,24 ± 0,08
48 69,10 ± 0,03
Berdasarkan table 3 dapat dilihat bahwa aktivitas antioksidan hidrolisis
susu kedelai tertinggi dicapai pada waktu hidrolisis 48 jam dengan nilai IC50
sebesar 69,10±0,03%. Waktu hidrolisis yang berbeda menghasilkan aktivitas
39
antioksidan yang berbeda, semakin lama waktu hidrolisi aktivitas antioksidannya
semakin tinggi, hal ini dapat ditunjukan pada nilai lC50 yang semakin kecil.
Aktivitas antioksidan peptida bioaktif sangat dipengaruhi oleh struktur protein dan
asam-asam amino yang menyusunnya. Semakin lama proses hidrolisis
menyebabkan protein berubah menjadi fragmen peptide yang lebih kecil sehingga
aktivitas antioksidannya semakin besar. Beberapa penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa peptida yang ditemukan dalam kacang kedelai seperti β-
conglycinin, glysisnin dan lunacin yang terdeteksi dalam hidrolisat protein susu
kedelai dengan residu asam amino histidin sebagai komponen utamanya.
Beberapa asam amino lain misalnya leusin, tirosin, metionin dan sistein pada
umumnya berperan sebagai antioksidan dengan menyumbangkan elektron untuk
radikal bebas (Mendis et al. 2005, Sarmadi dan Ismail 2010). Penelitian lainnya
oleh Park et al., (2014) menunjukkan bahwa peptida bioaktif antioksidan yang
diperoleh dari kacang kedelai kaya akan asam amino hidrofobik dan aromatik
seperti fenilalanin yang akan tereduksi menjadi tirosin ketika terjadi serangan
radikal gugus hidroksil. Elektron stabil peptida dapat disumbangkan untuk
menonaktifkan radikal bebas sementara cincin aromatik memastikan elektron
yang hilang tidak merubah peptida ke radikal bebas lain. Kehadiran beberapa
residu asam amino dalam rantai peptida dapat meningkatkan sifat antioksidan
sebagai penangkap elektron radikal bebas.
Menurut penelitian Zou et al., (2016) sebanyak 20 asam amino dapat
membentuk 42 peptida yang dapat berfungsi sebagai antioksidan bagi tubuh
manusia. Proporsi asam amino hidrofobik yang tinggi pada peptida mempunyai
aktivitas antioksidan yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan asam amino
40
hidrofilik lainnya yang dianggap sebagai faktor kunci dalam kemampuan peptida
tersebut dalam menangkal senyawa radikal. Penelitian Sudhakar et al., (2015)
melaporkan aktivitas antioksidan tertinggi dari Sepia brevimana terdapat dalam
hidrolisat pepsin yang mungkin disebabkan oleh peningkatan asam amino
hidrofobik selama hidrolisis pepsin berlangsung.
Mekanisme asam amino hidrofobik dapat masuk dengan mudah ke organ
target melalui interaksi hidrofobik dengan lapisan membran lipid sehingga secara
mudah dapat menangkal radikal bebas (Pouzo et al., 2016). Penelitian
Samaranayaka et al., (2011) menunjukkan bahwa asam amino hidrofobik yang
sering diuji meliputi, Trp, Phe, Pro, Gly, lys, Ile dan Val, asam amino terbukti
memiliki aktivitas penangkalan radikal yang kuat dalam reaksi oksidatif, terutama
untuk reaksi enzimatis, karena adanya cincin imidazole sebagai pendonor proton.
Cincin indol dan pirolidin pada Trp dan Pro dapat juga mendonorkan hidrogen
melalui gugus hidroksilny, gugus tersebut dapat menangkal radikal bebas. Berikut
adalah contoh reaksi antara asam amino triptopan dengan senyawa DPPH sebagai
representasi radikal bebas .
As. Amino Trp DPPH DPPH Tereduksi
Gambar 10. Reaksi antara asam amino Trp dengan senyawa DPPH (Girgih et al.,
2014)
Penelitian lebih lanjut yang dilakukan oleh Mendis et al., (2005),
menunjukkan penangkalan radikal bebas yang tinggi pada peptida yang
41
mengandung residu dari Phe dan His. Reaksi berikut ini menunjukkan hubungan
yang tepat antara struktur peptida yang mengandung asam amino seperti Trp, Tyr,
His, Phe, Pro, Gly, lys, Ile dan Val dalam menangkal senyawa radikal bebas
seperti DPPH.
4.5 Hasil Pemurnian Protein dengan Menggunakan Kromatografi G-10
Kromatografi filtrasi gel yaitu metode pemisahan protein yang berdasarkan
perbedaan ukuran molekul dari suatu protein. Proses pemisahan menggunakan
matriks gel berpori yang dipak di dalam kolom dan dikelilingi oleh solven. Pada
penelitian ini tahapan fraksinasi di mulai dengan membuat kolom sphadex G-10
yang sebelumnya telah diekuilibrasi dengan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0 sebagai
buffer elusi dengan laju elusi yaitu 0,5 mL/menit. Fraksi fraksi yang didapat
kemudian ditampung dan diuji kualitatif dengan menggunakan larutan Bradford,
Comassie blue yang terdapat dalam reagen Bradford mengikat protein dan
terbentuk kompleks berwarna biru (Poernomo et al., 2014). Berikut hasil
fraksinasi hidrolisat protein susu kedelai 48 jam (gambar 11).
Gambar 11. Hasil Fraksinasi hidrolisat protein dengan sphadex G-10
42
Dapat dilihat pada gambar 11, setelah dilakukan fraksinasi terdapat 30
fraksi yang dihasilkan dan setelah dilakukan pengujian diperoleh 3 fraksi yang
diduga positif mengandung protein/peptida yaitu fraksi 7, 8 dan 9. Ketiga fraksi
tersebut selanjutnya dilakukan pengujian dengan metode spektrofotometri Uv vis
pada 280 nm. Hasil pengujian dapat dilihat pada gambar 12.
Gambar 12. Hasil Pengujian Fraksi Hidrolisat dengan Spektrofotometer
UV-VIS.
Dapat dilihat pada gambar 12, bahwa fraksi 7, 8, memiliki nilai absorbansi
yang lebih besar di bandingkan hasil fraksi yang lain, tetapi pada fraksi 9
absorbansi yang dihasilkan cukup kecil yaitu 0,03. Hasil fraksinasi yang telah
diuji dengan spektrofotometer selanjutnya di uji kembali dengan SDS-PGE untuk
mengetahui profil protein pada masing-masing fraksi yang memiliki absorbnsi
yang tinggi.
4.6 Hasil Uji SDS-PAGE setelah Fraksinasi
Hasil yang telah diperoleh pada fraksinasi dengan kolom sephadex G-10
selanjutnya diuji dengan SDS-PAGE untuk mengetahui kemurnian dan kisaran
bobot molekul fragmen peptida yang dihasilkan. Berikut Hasil SDS PAGE dari
fraksi campuran 7,8,9 dan dibandingkan dengan fraksi yang lain
43
Gambar 13. Hasil SDS-PAGE setelah fraksinasi, M =marker protein, 1 : fraksi 7-
9, 2 : fraksi 10, 3 : fraksi 11, 4 : fraksi 30.
Berdasarkan Gambar 13 di atas terlihat bahwa hasil fraksinasi dengan
kolom sephadex G-10 mengashilan dua fragmen peptida yang muncul pada
kisaran bobot molekul < 10 kDa. Kedua peptide tersebut diduga merupakan
peptida yang memiliki aktifitas antioksidan. Memastikan hal tersebut, selanjutnya
dilakukan uji kembali aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH. Hasil
pengujian aktifitas antioksidan fraksi 7-9 memperoleh nilai IC50 218,74 ppm. Jika
dibandingkan dengan hasil pengujian antioksidan sebelum difraksinasi telihat
bahwa aktivitas antioksidan fraksi peptida hasil kromatografi relatif lebih rendah
daripada hidrolisat proteinnya. Hal ini diduga karena beberapa peptida bioaktif
dengan ukuran yang lebih kecil yang tedapat dalam campuran hidrolisat tertahan
di dalam kolom ketika dilakukan fraksinasi atau sebagian peptida bioaktif hilang
selama proses fraksinasi sehingga menurunkan aktivitas antioksidan yang
dihasilkan.
44
4.7 Hasil Karakterisasi Peptida Bioaktif dengan LCMS/MS
Untuk menentukan bobot molekul peptida hasil fraksinasi 7-9 dilakukan
pengukuran bobot molekul peptida melalui analisis LCMS/MS, kelebihan dari
analisis ini dalam pengukuran bobot molekul adalah memiliki sensifitas yang
tinggi untuk molekul yang berukuran besar. Pengujian LCMS/MS ini dilakukan
dengan menggunakan kolom C18. Hasil analisis peptida dari fraksi 7-9
menghasilkan 2 puncak kromatogram sebagaimana dapat terlihat pada gambar 14.
Biokimia IPB
Time12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00
%
0
100
Anisa Septiana 1 1: TOF MS ES+ BPI
4.42e5
14.40
12.90
12.12
12.4813.29
13.11 14.00
15.62
Gambar 14. Spektrum fraksi 7,8,9
Kedua puncak kromatogram muncul pada waktu retensi 12,90 dan 14,40
menit. Kedua puncak tersebut menunjukan adanya dua peptida dengan BM yang
berbeda yang diduga mengandung sekuen asam amino yang berbeda pula. Untuk
memastikan bobot molekul peptida tersebut, masing-masing puncak kromatogram
di analisis lebih lanjut berdasarkan spektrum massanya. Berikut adalah spektrum
massa dari senyawa peptida pertama dengan waktu retensi 12.90 menit.
45
Biokimia IPB
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
Anisa Septiana 1 576 (12.898) 1: TOF MS ES+ 3.85e5399.3603
400.3638
468.3915
549.3494819.6910 1140.7067 3013.22902088.03541507.1583 2845.3147 3174.7673
3643.0271
Gambar 15. Spektrum massa senyawa peptida pada waktu retensi 12.90 menit
Spektrum massa senyawa kedua yang muncul pada waktu retensi 14.40
menit dapat dilihat pada gambar sebagai berikut:
Biokimia IPB
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
Anisa Septiana 1 643 (14.405) 1: TOF MS ES+ 4.42e5427.3904
428.3935
449.3717
628.4979 853.76831340.5985 1732.4231 2367.9399 3353.2139
Anisa Septiana 1 643 (14.405) 1: TOF MS ES+ 4.42e5427.3904
428.3935
449.3717
628.4979 853.76831340.5985 1732.4231 2367.9399 3353.2139
Gambar 16. Spektrum massa senyawa peptida pada tr 14.40 menit.
Hasil pada spektrum kemudian dilakukan perhitungan protein
doconvolution berdasarkan data m/z dari masing-masing spektrum massa yang
dihasilkan, diduga senyawa peptida yang muncul pada waktu retensi 12.90 menit
merupakan fragmen peptida dengan bobot molekul 2,69 kDa ( data perhitungan
terlampir ) dan senyawa peptida yang muncul di waktu retensi 14.40 menit diduga
merupakan fragmen peptida dengan bobot molekul 8,95 kDa. Jika dilihat dari
kedua hasil pengukuran fragmen peptida hasil fraksinasi baik dari analisis SDS-
PAGE maupun analisis LCMS/MS.
46
BAB V
PENUTUP
5.1 SIMPULAN
1. Kondisi optimum hidrolisis protein susu kedelai dengan enzim pepsin yang
menghasilkan aktifitas antioksidan tertinggi diperoleh pada waktu hidrolisis
48 jam dengan nilai IC50 69 ppm.
2. Fragmen peptida bioaktif yang dihasilkan dari hasil fraksinasi hidrolisat susu
kedelai memiliki bobot molekul 2,696 kDa dan 8,954 kDa.
5.2 SARAN
1. Optimasi proses fraksinasi peptida dengan menggunakan teknik ultra-
filtration dengan ukuran MWCO (molecular weight cut off) membrane < 3
kDa.
2. Hidrolisis dengan enzim protease lainnya (tripsin, papain dan alkalase) dan
membandingkan efektifitas derajat hidrolisis dan aktifitas komponen peptide
bioaktif yang dihasilkan.
3. Analisis sekuen asam amino secara eksperimental dengan mengunakan
LCMS/ MALDI TOF-MS.
46
47
DAFTAR PUSTAKA
Adlercreutz, H. (2002). Phyto-oestrogens and cancer. Lancer Oncology 3: 364–373.
Adler-Nissen J. (1979). Determination of the degree of hydrolysis of food proteins
hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. Journal Agricultural Food
Chemistry, 27(6). 1256-1262.
Amnuaycheewa, P., and E. G. de Mejia. (2010). Purification, characterisation, and
quantification of the soy allergen profilin (Gly m 3) in soy products. Food
Chem.119:1671–1680.
Agyei D, Dantuah M.K., Sauethy I.P., and Pan S. (2015).Antioxidative Peptides Derived
from Food Proteins. Crit Rev Food Sci Nutr, 48. 430–441.
Budimarwanti. (2010). Komposisi dan Nutrisi pada Susu Kedelai. Yogyakarta : FMIPA
UNY, hal. 5.
Bowers LD. (1989). High-performance liquid chromatography/mass spectrometry: state
of the art for the drug analysis laboratory. Clin Chem, 35. 1282– 7.
Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. (1995). Use of a free radical method to
evaluate antioxidant activity. Lebbens mittel Wissenschaft und Technologie, 28.
25-30.
Brouns, F. (2002). Soya isoflavones: a new and promising ingredient for the health foods
sector. Food Research International, 35. 187–193.
Cahyadi. W. (2007). Kedelai Kasiat dan Teknologi. Bumi Aksara. Jakarta.
Caprette DR. (2005). Preparing SDS-Gels. Experimental Biosciences. Introductory
Laboratory-Bios 211. Rice University
Chan KM, Decker EA. (1994). Endogenous skeletal muscle antioxidants. Crit Rev Food
Sci Nutr, 34. 403–26.
Chen HM, Muramoto K, Yamauchi F, Nokihara K. (1996).Antioxidant activity of design
peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean
protein. J Agric Food Chem, 44. 2619–23.
Chen HM, Muramoto K, Yamauchi F. (1995).Structural analysis of antioxidative peptides
from soybean-Conglycinin. J Agric Food Chem, 43. 574–8.
Corn Well, T., Cohick, W. and Raskin, I. (2004). Phytoestrogen and human health
effects. Phytochemistry, 65. 995– 1016.
48
Cox M, Nelson DR, Lehninger AL (2008). Lehninger principles of biochemistry. San
Francisco: W.H. Freeman. ISBN 0-7167-7108-X.
Day, R. A. and A. L. Underwood. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi Keenam.
Jakarta. Penerbit Erlangga. 394, 396-404
Drumm, T.D., Gray, J.I. and Hosfield, G.L. (1990). Variability in the saccharide, protein,
phenolic acidand saponin contents for cancer prevention. Fruits andVegetables.
American Chemical Society, Washington,DC. 353–360.
Dziuba M. and Darewicz M. (2007). Food proteins as precursorsof bioactive peptides –
division into families. Food Sci.Technol, Int. 13. 393-404.
Elias RJ, Kellerby SS, Decker EA (2008) Antioxidant activity of proteins and peptides.
Crit Rev Food Sci Nutr, 48. 430–441.
Erdmann K, Grosser N, Schipporeit K, Schroder H. (2006). The ACE inhibitory dipeptide
Met-Tyr diminishes free radical formation in human endothelial cells viainduction
of heme oxygenase-1 and ferritin. J Nutr, 136. 2148–52.
Fukushima, D (2001). Recent Progress in Research and Tech- nology on Soybeans,”
Food Science and Technology Re-search, Vol. 7, No. 1. 8-16.
Fox PF, Morrissy PA, Mulvihill DM. (1991). Chemical And Enzymatic Modification of
Food Protein. Developments in Food Protein. London (UK).
Fu X. (2003).Effect of plant leaf protein on lipotropy peroxidase system of rats. Chin J
Vet Sci Technol, 11. 49–50.
Garrett and Grisham. (1997). Principles of Biochemistry with a Human Focus,
Brooks/Cole.
Giese J. (1994). Protein as Ingredients: types, functions, applications. Journal Food
Technology, 11(4). 50-60.
Girgih, A.T.; He, R.; Malomo, S.; Offengenden, M.; Wu, J.P.; Aluko, R.E. (2014).
Structural and functional characterization of hemp seed (Cannabis sativa L.)
protein-derived antioxidant and antihypertensive peptides. J. Funct. Foods, 6.
384–394.
Girindra, A. 1993. Biokimia 1. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Gordon MH. (1990). Measuring Antioksidan Activity. New York : CRC Press.
Halliwell B. (1994). Free Radical, Antioxidant and Human Disease : Curiosity, Cause or
Consequence. The Lancet , 344. 721-724.
Harvey David. 2000. Modern Analytical. McGraw-Hill Comp. New York.
49
Haslaniza H, Maskat MY, Wan A, Mamot S. (2010). The effects of enzyme
concentration, temperature and incubation time on nitrogen content and dgree of
hydrolysis of protein precipitate from cockle (Anadara granosa) meat wash water.
International Food Research Journal, 17(5). 147-152.
Hattori M, Yamaji-Tsukamoto KA, Kumagai H, Feng Y, Takahashi K. (1998).
Antioxidative activity of soluble elastin peptides. J Agric Food Chem, 46. 2167–
70.
Haytowitz, D.B. dan R.H. Matthews. (1989). Nutrient Content of Other Legume
Products. Legumes (Chemistry, Technology, and Human Nutrition), Inc., New
York.
Hernandez-Ladesma B, del Mar Cobtreras M, Recio. (2011). Anthyhipertensi peptide;
Production, bioavailability and incorporation into foods. Adv Colloid Interface
Sci, 165. 23:25.
Huang W.Y, Davidge S.T, Wu J. (2012). Bioactive natural constituents from food sources
– potential use inhypertension prevention and treatment. Crit Rev Food Sci Nutr,
53, 615–630.
Hwang JY, Shyu YS, Wang YT, Hsu CK. (2010). Antioxidative properties of protein
hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase. Food Sci Technol,
43. 285–90.
Imam Suryo dan Imam Tohari. (1995). Aktivitas Antioksidan Buah Jambu Mete dan
Penerapannya pada Abon . Biosains, 1(7). 124 – 135
Jinapong, N., Suphantharika, M. and Jamnong, P. (2008). Production of instant soymilk
powdersby ultrafiltration, spray drying and fluidized bed agglomeration. Journal
of Food Engineering, 84. 194–205.
Johnston N, Dettmar PW, Bishwokarma B, Lively MO, Koufman JA (Juni 2007).
Activity/stability of human pepsin: implications for reflux attributed laryngeal
disease. The Laryngoscope, 117 (6). 1036–9.
Kikuzaki, H., and Nakatani, N., (1993), Antioxidant Effects of Some Ginger
Constituents. J.Food Sci, 58(6). 1407.
Kim, S., Berhow, M., Kim, J., Chi, H., Lee, S. and Chung, I. (2006).Evaluation of
soyasaponin, isoflavone, protein,lipid and free sugar accumulation in developing
soybean seeds. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 54. 10003–10010.
Korhonen H, Pihlanto A. (2003).Food-derived bioactive peptides-- opportunities for
designing future foods. Curr Pharm Des, 9(16). 1297- 1308..
Laemmli UK. (1970). Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the
Headof Bacteriophage T4. Nature, 227. 680-68
50
Lee K. J., Kim S. B., Ryu J. S., Shin H. S. and Lim J. W. (2005). Separation and
Purification of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from
Goat’s Milk Casein Hydrolysates. Asian-Aust. J Ani Sci, Vol 18, No. 5. 741-746
Lehninger, A.L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid 1, 248-249, Penerbit Erlangga,
Jakarta.
Li X, Han LJ, Chen LJ. (2008). In vitro antioxidant activity of protein hydrolysates
prepared from corn gluten meal. J Sci Food Agric, 88. 1660–6.
Liu, K. 1997. Soybean: Chemistry, Techology, and Utilization. Chappman and Hall, New
York.
Liu JR, Chen MJ, Lin CW. (2005). Antimutagenic and antioxidant properties of milkkefir
and soymilk-kefir. J Agric Food Chem, 53. 2467–74.
Lopez-Fandino, R.; Otte, J.; van Camp, J. (2006). Physiological, chemical and
technological aspects of milk-protein-derived peptides with antihypertensive and
ACE-inhibitory activity. Int. Dairy J, 16. 1277–1293.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951). Protein
Measurement with the Folin Phenol Reagent. J Biol. Chem, 193. 265–275.
Maeno M, Yamamoto N, Takano T (1996). Identification of an antihypertensive peptide
from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus
CP790. J Dairy Sci, 79(8). 1316-1321.
Marcuse R. (1960). Antioxidative effect of amino-acids. Nature, 186. 886–7.
Maruyama, S., K. Nakagomi, N. Tomizuka and H. Suzuki. (1985). Angiotensin I-
converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein. II.
Isolation and bradykininpotenting activity on the uterus and the ileum of rats.
Agric Biol Chem, 49. 1405.
Maulida dan Guntarti, A. (2015). The influence of particle size of black rice (Oryza sativa
L.) on extract yield and total anthocyanin content. Pharmaciana, 5(1) 9-16.
Megías C, Pedroche J, Yust MM, Girón-Calle J, Alaiz M, Millán F. (2008). Production of
copper-chelating peptides after hydrolysis of sunflower proteins withpepsin and
pancreatin. Food Sci Technol, 41. 1973–7.
Mendis, E.; Rajapakse, N.; Byun, H.G.; Kim, S.K. (2005). Investigation of jumbo squid
(Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects. Life
Sci, 77. 2166–2178.
51
Michael Vogeser, Christoph Seger. (2008). A decade of HPLC-MS/MS in the routine
clinical laboratory-goals for futher development. Clinical Biochemistry Rev, 41.
649-662.
Moure A, Domínguez H, Parajó JC. (2006). Antioxidant properties of
ultrafiltrationrecovered soy protein fractions from industrial effluents and
theirhydrolysates. Process Biochem, 41. 447–56.
Molyneux, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)
for estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal ofScience and
Technology, 26(2). 211-219.
Murakami, H., Asakawa, T., Terao, J. and Matsushita, S. (1984). Antioxidative stability
of tempeh and liberationof isoflavones by of four market classes of ediblebeans.
Journal of Science Food and Agriculture, 51.285–297.
Nagai T, Suzuki N, Tanoue Y, Kai N, Nagashima T. (2007). .Antioxidant and
antihypertensive activities of autolysate and enzymatic hydrolysates fromyam
(Dioscorea opposita Thunb.) ichyoimo tubers. J Food Agric Environ, 5. 64–8.
Nagasawa T, Yonekura T, Nishizawa N, Kitts DD. (2001). In vitro and in vivo inhibition
of muscle lipid and protein oxidation by carnosine. Mol Cell Biochem, 225. 29–
34.
Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K, Takano T. (1995). Antihypertensive effects of sour
milk and peptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin I-converting
enzyme. J Dairy Sci, 78(6). 1253-1257.
Oliveira, C. F., Coletto, D., Correa, A. P. F., Daroit, D. J., Toniolo, R., Cladera-Olivera,
F. Brandelli, A. (2014). Antioxidant activity and inhibition of meat lipid oxidation
by soy protein hydrolysates obtained with a microbial protease. International
Food Research Journal, 21(2). 775-781.
Pangastuti, H. P. dan S. Triwibowo. (1996). Pengaruh Lama Fermentasi Terhadap
Kandungan Asam Fitat Dalam Tempe Kedelai. Cermin Dunia Kedokteran No.
108.
Park S.Y, Lee J.S., Baek H.H. (2010). Purificationand characterization of antioxidant
peptides from soyprotein hydrolysate. J Food Biochem, 34. 120–132.
Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E. (2001), Antioxidant Activity, Medalliaon
Laboratories Analitical Progress, Vol 10. N0. 2.
Poernomo, A.T. Sudjarwo dan Parasati, R.A. (2014). Purifikasi Parsial Enzim Fibrinolitik
Tempe Kacang Koro (Canavalia ensiformis) Produk Fermentasi Rhizopus oryzae
FNCC 6078. Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, 3(2). 23–30.
52
Pouzo, L.B.; Descalzo, A.M.; Zaritzky, N.E.; Rossetti, L.; Pavan, E. (2016). Antioxidant
status, lipid and color stability of aged beef from grazing steers supplemented
with corn grain and increasing levels of flaxseed. Meat Sci, 111. 1–8.
Qian ZJ, Jung WK, Kim SK. (2008). Free radical scavenging activity of a novel
antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin, Rana catesbeiana
Shaw. Bioresour Technol, 99. 1690–8.
Rajapakse N, Mendis E, Jung WK, Je JY, Kim SK. (2005). Purification of a radical
scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties.
Food Res Int, 38.175–82.
Revilla E, Maria CS, Miramontes E, Bautista J, García-Martínez A, CremadesO. (2009).
Nutraceutical composition, antioxidant activity and hypocholesterolemic effect of
a water-soluble enzymatic extract from rice bran. Food Res Int, 42. 387–93.
Roblet C, Amiot J, Lavigne C. (2012). Screeningof in vitro bioactivities of a soy protein
hydrolysateseparated by hollow fiber and spiral-wound ultrafiltration membranes.
Food Res Int, 46. 237–249.
Saito K, Jin DH, Ogawa T, Muramoto K, Hatakeyama E, Yasuhara T, (2003).
Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial
chemistry. J Agric Food Chem, 51. 3668–74.
Sakanaka S and Tachibana Y. (2006). Active oxygen scavenging activity of egg-
yolkprotein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna
homogenates. Food Chem, 95. 243–9.
Samaranayaka, A.G.P.; Li-Chan, E.C.Y. (2011). Food-derived peptidic antioxidants: A
review of their production, assessment, and potential applications. J Funct Foods.
3, 229–254.
Scalbert A, Johnson IT, Saltmarsh M. (2005). Polyphenols: antioxidants and beyond. Am
J Clin Nutr, 81. 215S–217S.
Sheih I.C, Fang T.J, Wu T.K. (2009). Anticancer and antioxidant activities of the peptide
fraction from algae protein waste. J Agric Food Chem. 58, 1202–1207.
Shurtleff, W. dan A. Aoyagi. (1984). Tofu and Soymilk Production: The Book of Tofu.
Vol. II. The Soyfoods Center, Lafayette, California.
Smith, A. K. and Circle, S. J. 1978. Soybean : Chemistry and Technology, Vol. I
Proteins, AVI Publishing Co., Westport, CT.
Subrota, H., Shilpa, V, Brij, S., Vandna, K. and Surajit, M. (2013). Antioxidative activity
and polyphenol content in fermented soy milk supplemented with WPC-70 by
probiotic Lactobacilli. Int Food Research Journal, 20(5). 2125-2131.
53
Sudhakar, S.; Nazeer, R.A. (2015). Preparation of potent antioxidant peptide from edible
part of shortclub cuttlefish against radical mediated lipid and DNA damage. LWT-
Food Sci. Technol, 64. 593–601.
Suetsuna K, Ukeda H, Ochi H. (2000). Isolation and characterization of free radical
scavenging activities peptides derived from casein. J Nutr Biochem, 11. 128–31.
Suhaidi, I. (2003). Pengaruh Lama Perendaman Kedelai Dan Jenis Zat Penggumpal
Terhadap Mutu Tahu. Artikel. Universitas Sumatera Utara. Padang.
Tang-Bin Zou, Tai-Ping He, Hua-Bin Li, Huan-Wen, and En-Qin Xia. (2016). The
Structure-Activity Relationship of the Antioxidant Peptides from Natural Proteins.
MDPI, Switzerland.
Tang CH, Peng J, Zhen DW, Chen Z. (2009). Physicochemical and antioxidant properties
of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) protein hydrolysates. Food
Chem, 115, 672–8.
Thanh VH, Shibasaki K. (1976). Major proteins of soybean seeds, subunit structure of β-
conglycinin. J Agric Food Chem, 26. 692-698
Thananunkul, D., Tanaka, M., Chichester, C.O. and Lee,T.C. (1976). Degradation of
raffinose and stachyose insoybean milk and storage of cultured soy milk
drink.Food Microbiology, 19. 501–508.
Trauger, SA, Webb W and Siuzdak G. (2002). Peptide and protein analysis with
mass spectrometry. Spectroscopy 16 15–28.
Vogeser M., Seger C., (2016). Mass spectrometry methods in clinical diagnostics – state
of the art and perspectives. TrAC-Trend Anal. Chem., 84: 1-4.
Wang WY and De Mejia EG. (2005). A new frontier in soy bioactive peptides that
mayprevent age-related chronic diseases. Compr Rev Food Sci Food Saf, 4. 63–
78.
Wilson K, Walker J. 2000. Principle and Technique of Practical Biochemistry. Edisi ke-
5. London: Cambridge University Press
Winarsi, H. (2007).Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Wu CH, Chen HM, Shiau CY. (2003). Free amino acids and peptides as related to
antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber
austriasicus).Food Res Int, 36. 949–57.
Xie Z, Huang J, Xu X, Jin Z. (2008). Antioxidant activity of peptides isolated from
alfalfaleaf protein hydrolysate. Food Chem, 111. 370–6.
Yuhernita dan Juniarti. (2011). Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak
Metanol Daun Surian yang Berpotensi sebagai Antioksidan. Makara Sains, 15(1).
48-52.
54
Zayas JF. 1996. Functionality of Protein in Food. Berlin (DE): Springer
Zhang J, Zhang H, Wang L, Guo X, Wang X, Yao H. (2010). Isolation and
identificationof antioxidative peptide from rice endosperm protein enzymatic
hydrolysateby consecutive chromatography and MALDI-TOF/TOF MS/MS.
Food Chem, 119. 226–34.
Zhang Q.X., Wu H., Ling Y-F. and Lu R.R. (2013). Isolation and identification of
antioxidant peptides derived from whey protein enzymatic hydrolysate by
consecutive chromatography and Q-TOF MS. Journal of Dairy Research, 80.
367–373.
Zou W, Xiao Z, Wen X, Luo J, Chen S, Cheng Z, et al. The antiinflammatory effect of
Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees on pelvic inflammatory disease in rats
through down-regulation of the NF-κB pathway. BMC Complement Altern Med.
2016;16:483.
55
Lampiran 1. Uji Proksimat Kadar Protein Susu Kedelai
1. Randemen
200 gram kacang kedelai = 800 mL susu kedelai
Presipitat protein = 72, 965 gram
% Randemen = 72,965 gram/200 gram
= 36.4825 %
2. Proksimat
Uji kadar protein kasar (presipitat) dengan menggunakan Metode Kedjhal
Sampel Ulangan
Volume (mL) Sampel
(mg)
Kadar
Protein
(%bb) Awal Akhir Terpakai Sampel
1 0,0 0,60 0,60 0,60 506,2 2,56
2 0,0 0,55 0,55 0,55 508,5 2,67
Contoh Perhitungan Kadar Protein Susu Kedelai
Diketahui : Volume blanko : 0,00 mL
N HCl : 0,0671 N
Faktor konversi Nitrogen : 5,75
%N = (mL HCl sampel – mL HCl blanko) x Ar N x FP x 100 / mg sampel
= (0,60 – 0,0 ) x 14,007 x 4 x 100 / 506,2
= 0,4456 %
Kadar Protein = %N x Faktor Konversi
= 0,4456 % x 5,75
= 2,562 %
Rata-rata kadar Protein = 2,62 + 0.2 %
56
Lampiran 2. Pembuatan Reagen Uji Derajat Hidrolisis
Pembuatan Larutan TCA 10% (b/v)
Larutan TCA dibuat dengan cara melarutkan 10 g TCA dalam 100 mL Aquades,
lalu di aduk dengan pengaduk magnetic hingga homogeny.
Komposisi Reagen Lowry
Pereaksi A : (2 gr Na2CO3 dilarutkan dalam NaOH 0,1 N hingga batas 100 mL
dalam labu takar).
pereaksi B : (0,5 gr CuSO4.5H20 dilarutkan dalam Natrium Kalium Tartrat 1%
hingga batas 100 mL dalam labu takar)
pereaksi 1 : ( 50 mL pereaksi A ditambah 1 mL pereaksi B dan dihomogenkan).
Pembuatan Larutan Standar BSA
Prosedur :
1. 5 mg BSA dilarutkan dalam 5 mL H2O dan ditepatkan 10 mL dalam labu ukur
10 mL untuk menghasilkan larutan BSA dengan konsenterasi 1000 ppm
2. Dibuat larutan BSA Standar dengan cara mengencerkan larutan standar BSA
1000 ppm kedalam variasi konsenterasi 0, 100, 200, 400, 600, dan 800 ppm.
3. Perbandingan jumlah BSA 1000 ppm dan aquadest yang digunakan untuk
membuat deret standar BSA disajikan dalam tabel dibawah ini.
Konsentrasi
(BSA)
(ppm)
0 100 200 400 600 800
BSA Induk
(mL)
0 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6
H2O (mL) 2 0,8 0,6 0,2 0,8 0,4
4.Masing-masing larutan standar divortex sampai homogen
57
Lampiran 3. Hasil Analisis Derajat Hidrolisis
Waktu
(jam)
Konsentrasi (ppm) DH
(%) Sebelum Hidrolisis Setelah Hidrolisis
0 562,89 147,35 26,17
2 406,91 170,55 41,91
6 460,61 232,23 50,41
16 785,05 283,47 36,1
24 621,18 242,83 39,09
40
48
509,48
592,1
271,26
274,53
53,24
46,36
Perhitungan Derajat Hidrolisis (%DH)
% DH 0 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 147,35 / 562,89 x 100%
` = 26,17 %
% DH 2 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 170,550 / 406,915 x 100%
= 41,91 %
% DH 6 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 232,233/ 460,619x 100%
= 50,41%
% DH 16 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 283,479/ 785,053x 100%
= 36,1%
% DH 24 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 242,835/ 621,18x 100%
= 39,09%
% DH 40 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 271,268/ 509,486 x 100%
= 53,24%
% DH 48 jam = Protein terlarut TCA 100% / Protein total sample x 100%
= Protein Sesudah Hidrolisis / Protein sebelum hidrolisis x 100
= 274,538/ 592,1x 100%
= 46,36%
58
Lampiran 4. Hasil Pengujian Aktivitas Antioksidan
A. 0 Jam
Sampel Absorbansi %inhibisi
Blanko 0,2775
8,5793 0,2455 11,53153
17,1586 0,2285 17,65766
34,3173 0,2195 20,9009
68,6346 0,142 48,82883
Perhitungan
IC50
Y = 0,474x + 8,798
50 – 8,798 = 0.474x
X = 86,92
B. 2 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
Blanko 0,2105
5,32 0,22 -9,02
10,65 0,22 -6,17
21,31 0,18 10,92
42,63 0,18 13,53
85,27 0,11 43,7
IC50
Y = 0.632x -10,30
50+5.9013 = 0.632 x
X = 95.41
59
C. 6 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
BLANKO 0,178
7,2572 0,1755 1,404494
14,5145 0,147 17,41573
29,0291 0,131 26,40449
58,0582 0,1195 32,86517
IC50
Y = 0.551x + 4,588
50 – 4,588 = 0.551 x
X = 82,41
D. 16 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
Blanko 0,32
17,7174 0,236 26,25
35,4349 0,228 28,75
70,8698 0,21 34,375
141,7397 0,2 37,5
IC50
Y = 0.046x + 28,16
50 – 28,16 = 0.046 x
X = 474,78
60
E. 24 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
BLANKO 0,334
15,1772 0,2605 22,00599
30,3544 0,2405 27,99401
60,7088 0,2335 30,08982
121,4177 0,211 36,82635
IC50
Y = 0.033x + 26,52
50 – 26,52 = 0.033 x
X = 711,51
F. 40 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
BLANKO 0,3515 8,4771 0,259 26,31579
16,9542 0,252 28,30725
33,9085 0,238 32,29018
67,817 0,2245 36,13087
135,6341 0,195 44,52347
61
IC50
Y = 0.138x + 26,23
50 – 26,23 = 0.138 x
X = 172,26
G. 48 Jam
Sampel Absorbansi %Inhibisi
Blanko 0,22
4,61 0,20 6,68
9,22 0,20 9,79
18,44 0,18 15,81
36,88 0,16 26,28
IC50
Y = 0.677x + 3,127
50 – 3,127 = 0.677 x
X = 69,10
62
Lampiran 5. Perhitungan Bobot Molekul Protein LCMS (tR = 12.898)
Biokimia IPB
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
Anisa Septiana 1 576 (12.898) 1: TOF MS ES+ 3.85e5399.3603
400.3638
468.3915
549.3494819.6910 1140.7067 3013.22902088.03541507.1583 2845.3147 3174.7673
3643.0271
m/z = (M+nH+)/n
n = (m/z2-H)/(m/z2-m/z1)
M = n(m/z-H)
m/z2 = 468,3915
m/z1 = 399,3603
n = (m/z2-H)/(m/z2-m/z1)
n = 467,3915/(468,3915-399,3603)
n = 467,3915/69,03 = 6,77
M = n (m/z1 – H)
= 6,77 (398,3603)
= 2,69 kDa
63
Lampiran 6. Perhitungan Bobot Molekul Protein LCMS (tR = 14.405)
Biokimia IPB
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
m/z500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
%
0
100
Anisa Septiana 1 643 (14.405) 1: TOF MS ES+ 4.42e5427.3904
428.3935
449.3717
628.4979 853.76831340.5985 1732.4231 2367.9399 3353.2139
Anisa Septiana 1 643 (14.405) 1: TOF MS ES+ 4.42e5427.3904
428.3935
449.3717
628.4979 853.76831340.5985 1732.4231 2367.9399 3353.2139
m/z2 = 449,3717
m/z1 = 427,3904
n = (m/z2-H)/(m/z2-m/z1)
n = 448,3717/(448,3717 – 427,3904)
n = 448,3717/20,98 = 21
M = n (m/z1 – H)
= 21 (426,3904)
= 8,95 kDa
64
Lampiran 7. Kacang Kedelai
Lampiran 8. Susu Kedelai
65
Lampiran 9. Proses Pemisahan Protein dengan Presipitasi Asam
BIODATA MAHASISWA
IDENTITAS PRIBADI
Nama Lengkap : Annisa Septiana
Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 25 September 1995
NIM : 1113096000052
Anak ke : 2 dari 3 bersaudara
Alamat Rumah : Jl. Penghulu, No 07, RT/RW 009/010 Kelurahan
Bidaracina, Kecamatan Jatinegara, Jakarta-Timur
Telp/HP. : 082258522705
Email : [email protected]
PENDIDIKAN FORMAL
Taman Kanak-kanak : TK Assalafy Lulus tahun 2001
Sekolah Dasar : SDN Cipinang Cempedak 04 PG Lulus tahun 2007
Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 36 Lulus tahun 2010
Sekolah Menengah Atas : SMA Muhammadiyah 4 Jakarta Lulus tahun 2013
Perguruan Tinggi : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Masuk tahun 2013
Related Documents
