Jurti ai tltmpo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAM20160.pdf · de los creditos totales de que consta la ... forma tal que los sólidos queden suspendidos

Can Jurti ai tltmpo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACADÉMICA ,

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BlOTECNOLOGíA de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO

ALUMNA CRUZ LEYVA IRENE M ATR~CULA 91 333329 LICENCIATURA INGENlERíA DE LOS ALIMENTOS PERIODO

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a seis de septiembre de mil novecientos noventa y nueve.

"CASA ABIERTA AL TIE 6 O" A T E N T A M E N T E ,

M. en C. LlLlA VÁQUEZ CHÁVEZ

"EFECTO DEL TRATAMIENTO TÉRMICO DEL TRIGO SOBRE LAS PROPIEDADES DEL GLUTEN"

OCTUBRE 13,1998 a MAYO 1 1 , 1999

.

M. SECRETARIO ACADÉMICO /

.. .

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Mlchoadn y la Purfsima. col. v?am~. D.F. wY0 Tei. (5) 723 83 51. Fax (5)612 80 83 e-mail: cdcbsuanum.uam.mx.

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNlüAü UTAPAWA

Nombre: Cruz leyva Irene

Matricula: 91333329

Licenciatura: Ingeniero en alimentos.

Universidad Autonoma Metropolitana

Unidad: iztapalapa.

División: Ciancias Biologicas y de la salud.

Telefono: 1364119

Horas semanales: 20 hrs.

Trimestre: 9 8 0

Titulo del proyecto: uEfecIo del Imtamiento tirmico del trigo sobre hupropieakd#s delgiutut. ”

Asesor: M.en C. Lilia VPzquvr CbPvez

Puesto y Adscripción: Profesor categoria “C” tiempo completo.

Lugar: Laboratorio de granos y cereales R-008

Inicio:l3 de Octubre de 1998

Finaliznción:13 de Abril de 1999.

Clave:

Particpnite: Cruz b yva Irene Ingeni8rli de los Alimcator División CBS

Asesor: /

M.en C. Lilia Vázqua C h á v a

üeprrtameato de Eiotcenoiugía . Area de Alimentos

.

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPAUPA

h o m b r e : Cruz leyva Irene

Matricula: 91333329

/Licenciatura: ingeniero en alimentos.

Universidad Autonoma Metropolitana

Unidad: Iztapalapa.

/División: Ciancias Biologicas y de la salud.

Telefono: 7364779

Horas semanales: 20 hrs.

Trimestre: 98-O\

1 /

1 _ - 2'

/Titulo del proyecto: "Efecto del Irafamienlo térmico del frigo sobre las propiedades del glufen. ''

/Asesor: M.en C. Lilia Vázquez Chávez.

Puesto y Adscripción: Profesor categoría "C" tiempo completo.

Lugar: Laboratorio de granos y cereales R-O08

Inicio: 13 de Octubre de 1998

/Finalizaeión:13 de Abril de 1999

Clave: IA.061.98

Participante: Cruz Leyva Irene Ingeniería de los Alimentos División CBS

Asesor: M.en C. Lilis Vázquez Chávez Area de Alimentos Departamento de Biotecnologla

Casslbatadtempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA iMETROPOLITANA

M.en C. José Arredondo Figueroa. Director de la división de C.B.S.

Presente.

México D.F:a 11 de Mayo de 1999.

Por medio de la presente me dirijo a usted para informarie que por motivos administrativos del departamento de Servicio Social de esta institución no se entregará el reporte final de servicio social en la fecha establecida por este departamento destinado para el dia 13 de abril del atio en curso, por tal motivo se pretende entregar dicho reporte en el transcurso del trimestre 99-P. La interesada con numero de matricula 91333329, de la licenciatura de Ingeniería en los alimentos quien realizó el servicio social en el laboratorio de cereales de la misma institución en el proyecto denominado "Efecto del tratnmiento térmico del trigo sobre las propiedades del gluten ". Sin más por el momento quedo de usted.

Irene CNZ Leyva. M.en C. Lilia VBzquez Chávez.

Profesor Asociado "c" de tiempo completo. Area de los Alimentos.

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoach y la Purisima, Col. Vicsntina ,09340 México, D.F. Tel.: 724-4600 TELEFAX: (5) 612 082

C U i b i t i i l t k W O UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México D.F. a 13 de Octubre de 1998

M. en C. José Arredondo Figueroa. Director d e l i diviri6n de C.B.S.

Presente:

Por medio de la presente me dvijo a usted para informarle que acepto hingir como asesor de la alumna Irene Cruz Leyva con n h e r o de matricula 91333329, de la licenciatura en Ingeniería de los alimentos en el proyecto denominado "Determinación del efecto del tratamiento térmico del trigo sobre las propiedades del gluten *I, mismo que se realizad como trabajo de servicio social en esta instiiución y se contempla llevar a cabo del 13 de octubre de 1988 al 13 de abril de 1999.

Sin m& por el momento quedo de usted.

M.en C. Lilia Vbquez Chiivez. Profesor A s o c d o "C " dc l i m p cmpleio.

Ama de Alimentar.

I

UNIDAD IZTAPAWPA Av. Michhoach y la Furlsirna, Col. Vicentinq 09340 MCxico. D.F. Tel.. 724-4600 TELEFAX: (5) 612 OS85

/ Constancia NO. 3

A QUIEN CORRESPONDA:

La Universidad Autonoma Metropolitana Unidad IZTAPALAPA hace constar que

para concluir el pian de estudios de LICENCIATURA EN INGENIERIA DE LOS AtIM

' ENTOS es requisito cubrir 578 í QUINIENTOS SETENTA Y OCHO 1 creditos.

con numero de La alumna CRUZ LEWA IRENE

matricula 91333329, quien se encuentra cursando la LICENCIATURA

antes indicada, tiene cubiertos a la fecha i 567 )

QUINIENTOS SESENTA Y SIETE creditos.

Los creditos acumulados aprobados corresponden al 98.1 por ciento

de los creditos totales de que consta la LICENCIATURA

A solicitud de la interesada y para l o a f i x . que estime convenientes,se

extiende l a PRESEülz en l a Ciudad de Ycx:co. D.F. a los VEINTIUNO

dias del mes de SEPTIEEIBRE de MIL N0VEcSEKTI;S !i~':LxrA Y OCHO.

LIC. Coord

uytBL8ü'FhF&kA?A COORDMACION DE SBTEMAS ESCOLARES Av. Michoacán y la Pwbirna. Col. Vicontina. 09340 Máxico. 3 F Apdo P a w l 55-532. O9000 Mbxico, D.F., Tüls.: 724-4000 y 724-4003

I Justificación.

La evaluación de la calidad del trigo, se puede hacer desde un punto de vista fisico, quimico, reologico o de calidad panadera. Se sabe que la humedad es uno de los principales paranéüos para las condiciones de almacenamiento y conservación de su valor nutritivo. Es por ello importante eliminar la humedad excesiva de los granos de trigo, para evitar alteraciones en dicho grano. Para conseguir este fm se han implementado mttodos de secado artificial, en este caso se empleo un secador por lecho fluidizado, sin embargo cuando la temperanira es excesiva puede llegar a causar daño en el grano por calor, el cual se manifiesta por presentar una coloracih café oscura, ocasionada por el calor excesivo que afecta tanto el embrión como el endospcrmo en forma total (NOM-FF-36- 1982). Además que los enlaces de las proteinas se debilitan debido a la desnaniralización. Estas se encargan de formar el gluten que proporciona a la masa sus propiedades de extensibilidad y elasticidad.

-

Naturaleza del proyecto.

Invatigecidn.

Introducción.

El secado por lecho fluidizado. en el cual se utiliza aire caliente forzado a trav&s de un lecho de sólidos de forma tal que los sólidos queden suspendidos en el aire. El aire caliente actúa tanto como medio fluidizante como desecación. El lecho fluidmdo se aplica fácilmente a los cereales, dentro de un amplio margen de contenidos de humedad. (3) El trigo es un cereal que fundamentalmente se utiliza en la fabricación de los distintos derivados de la panificación. ya que presentan la particularidad de que durante su fermentación se produce un esponjamiento, esta capacidad se debe principalmente a las proteinas. La harina contiene de I O a 12% de proteinas. son basicamente glutelinas y prolaminas del citoplasma de las c6lulas del endospermo, en donde aciúan como componentes estructurales y de merva de nitr6geno para el crecimiento. en menor proporción existen también otros, como las albíuninas y globulinas. que representan s610 aproximadamente un 15 % del total y cuyo peso molecular promedio n de 12. OOO. La separación de cada una de las fracciones que integran las proteinas del trigo se puede efectuar con base en la solubilidad.

Las glutelinas del trigo reciben el nombre de gluteninas. mientras las prolaminas, el de gliadimas y ambas suman el 85 % de la fracci6n proteica ; estas junto con IOJ lipidos y agua forman el llamado " glUten ", responsable de las propiedades de cohesividad y dq vixoelasiicidad de la masa de panificación.

Las glidmas solublu m aanol al 70 % representan el $0 Y del total de las proteinas, son de una clase heterogénea de 40 a 60 polimm que por medio de elcctmforesis se han dividido en cuatro grupos (alfa, beta, gamma y omega ). En una proponi6n de I S , 30. IO. y 25 % respectivamente. Sua cadmas simples tiene estructuras primMas con diferentes composición de mtnodcidos y su peso molecular varia de IS, O00 a 80,OOO con un promedio de 36, OOO.

Su conformación se estabiliza por medio de enlaces disulfuro intramolecularmente; al hidrauirse forman una masa viscosa extmsiblc, flu* pero poco elbtita y son responsables de la expansión de las masas durante la elaboración del pan. Cuando existe un exceso de gliadinas en relación con las glutelinas el gluten se vuelve débil, permeable y no retiene el anhidro carbónico, entonces la masa en lugar de esponjarse se colapsa.

Se han identificado IS glutelinas en forma monomerica que tienen pesos moleculares desde 12, O00 hasta 135, O00 y que se caracterizan por su elevado número de enlaces disulfuro que le confieren una gran estabilidad y permiten la asociación para formar polimeros de un peso molecular de varios millones. Son solubles en soluciones salinas neutras y en etanol al 70 % solubles o dispersas en ácidos y en bases debiles, al hidratarse producen una masa muy tenaz, elástica y cohesiva. Para elaborar el pan, estas proteinas deben estar en proporción adecuada ya que un exceso; en el gluten presenta tanta cohesividad que inhibe la expansión de la masa y provoca una reducción del volumen final. El gluten en conjunto tiene una composición de aminoácidos aproximadamente de 6% ionizables, 45 % polares y 49 % apolar, se caracterizan por su elevado contenido de prolina y glutamina 24 y 37 % respectivamente. Del total de los aminoácidos. la alta proporción de este irninoácido hace que los polipeptidos carezcan de una conformación helicoidal, lo que a su vez causa que el grupo amida de la glutamina tenga facilidad de establecer puentes de hidrógeno intermoleculares e intramoleculares. Su baja concentración de amonoácidos ionizables y el alto porcentaje de hidrofóbos hace que sea poco soluble a pH neutro. Contiene además un gran número de residuos de sisteina que le permite producir enlaces disulfuro i n m e intremoleculares aun cuando las proteinas del trigo no forman una estructura tridimensional con base a enlaces covalentes. Durante el amasado manual, las gluteninas y las giadinas se desnaturalizan y establecen uniones disulfuro, hidrófobas e hidrófilas que hacen que estos polheros se orienten longitudmalmente, los esfuerzos mecánicos inducen un intercambio de grupos azufrados entre las multiples cistehas. El resultado de este proceso es la formación de una red elástica y cohesiva necesaria para el esponjamiento ocasionado por la presión del anhidm de carbono. Dicha red se crea por una interacción de las gliadinas y las glutelinas y se estabiliza más por medio de un gran número de puentes de hidrógeno por parte de la glutenina y de las uniones hidrofóbas y enlaces disulfuro intra e intermoleculares. La tenacidad de las harinas se debe a la composición del gluten; las conocidas como fuertes producen masas cohesivas que requieren tiempos de mezclado largos, los llamados dbbiles; que desarrollan estructuras adeacuadas y colapsan al amasarse. Es práctica común el empleo de agentes oxidantes y reductores para regular la cantidad de los enlaces disulhuo cnmdos y son parcialmente responsables de las propiedades reológicas de la masa, los agentes oxidantes que más se emplean son los peidxidos, bromatos, pemlfatos y entre los reductores destacan los sulfites, la cisteina, el glutatión o cualquier compuesto que tenga grupos sulfidrilos libres.( I)

Durante el tratamiento thnico, se debilitan los enlaces entre los lípidos polares, especialmente los glicolípidos, y las proteinas del gluten debido a la desnaturalización proteíca. A medida que aumenta la temperatura mayor a 50°C. el almidón, los lípidos se aaslocan y sus moldculas pasan a formar complejos con el almidón. (2)

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i

. .

La solubilidad de proteínas y sus propiedades viscoelasticas del gluten son marcadamente modifica& por calentamiento en agua a ebullición. El gluten presenta cambios en SUS propiedades viscoelasticas las cuales se han observado que tienen una relación directa en un cambio de la solubilidad de la proteha. Muchas pruebas de cuantificación de proteínas utilizan el criterio de la pérdida de solubilidad de las proteinas del trigo, que han sufndo dailo por calentamiento. También se ha llegado a establecer que hay una relación lineal entre la calidad panadera y el dailo por calentamiento en trigo. Entre los métodos que se emplea se encuentra : Electroforesis, Bradford ( tincion de los enlaces de proteína ), y la prueba de sedimentación de Zeleny.

Objetivo general.

Determinar el grado de daño en las proteínas del gluten de trigo (variedad Oasis ), mediante la aplicación de técnicas para determinación de proteha.

Objetivos particulares.

Aplicar diversas técnicas para la determinación y cuantificación de las protehas: Electroforesis, Bradford, sedimentación.

Comparar los resultados obtenidos de cada una de las técnicas mencionadas . Establecer la relación que guarda el dailo por tratamiento térmico que sufren las protehas .

Metodología.

Electroforesis

La electoforesis es una iécnica univenamente utilizada por los bioqulmicw de péptidos y protehas. El fundamento de separación de esta técnica, se basa en el movimiento que tiene un componente proteico a través de un medio eléckicammte conductive, en respuesta a una aplicación de voltaje. Por lo cual, la carga elécüica efectiva y/o el radio molecular son las caracteristicas bioqulmicas de las protehas. que se han usado para el d e sm i l o de los procedimientos electroforéticos. Alternativamente, la hidrofobasidad, la quiralidad y la afinidad qeclfiq son otras propiedades fisicoquimicas consideradas en algunas modalidades de

Fundamento: Las protehas y los péptidos son anfolitos, es decir poskn grupos ionizables tanto aniónicos como catiórticos. Su carga neta y movilidad son una funcion del'pH del medio que los rodea. Una proteha en solución, a un pH diferente a su punto ixKltkico puede tener tanto carga positiva como negativa. Esto ocasiona una movilidad a travCs de un campo elkmco. \íoitculas con carga positiva emigram hacia el catodo negativo, mientras que aquellar con una carga negativa lo hacen hacia el an6do positivo. Además del pH, la fuerza iónica y la conductividad del medio son otros factores importantes, que hfluyen en la movilidad de las moléculas durante el desarrollo del proceso elctroforCtico.

separación. I

Materialea.

Sistemas de amoriiguadores

El pH y la fuerza iónica son especificamente controlados con el uso de amortiguadores con una conductividad y fuerza iónica bajas. En general tales reguladores tienen componentes orgiinicos relativamente grandes, no cargadas y por lo tanto con una movilidad eletroforética baja lo produce la velocidad de separación alta y una resolución aceptable. El pH de elección es neutro o ligeramente alcalino, los reactivos más populares y comunmente usados son el TRiS ( hidroxymethyl ).

'

Condiciones diroaciantes.

El empleo de un sistema disellado para disociar a todas las proteinas es útil para estudiar la complejidad y el peso molecular de los polipdptidos que constituyen una muestra. El reactivo disociante empleado es el dodecil sulfato de sodio (SDS). otros agentes reductores, como el 2-mercaptoctanol se puede usar en combin~ión para romper lo$ enlaces disulfuro. En presencia del SDS, se rompe la eshuctura cuatcrnaria, terciaria y secundaria de la proteína. La cadena polipltidica se desemolla y sc rodea por las moléculas de SDS y se forma una micela. Las numemsas cargas negativa que proveen las molécula de SDS hacen que las cargas que llevan las proteínas se vwlvan insigai&antas. PW lo tanto, la cedetu polipóptidica se transforma en una micela elongada, cuya longitud y carga son proporcionales al peso molecular de la cadena. La mezcla de proteinas es desnaturalizada por calentamiento a 100 "C en presencia de SDS y el agente reduntor bajo dichas condiciones, los complejos polipeptidicos-SDS cargados negativamente, con densidades de carga idCnticas pueden emigrar en un gel y su separación es realizada unicamente de acuerdo al tamaño del poliplptido. Ademb se agrega glicerol, para aumentar la densidad de la muestra. Requisito importante cuando se aplica en el gel, ya que evita que K mezcle con la solución reguladora dispuesta en los reservorios de la cámara de electroforcsis. El colorante como es el anll de bromofenol también es includo para dar seguimiento de la distancia recorrida por la muestra de proteinas. Los geles como un medio de soporte. El uso de geles como un medio anticonvectivo ha permitido controlar los efectos de calentamiento y de difusión pos elcctroforCtica generados d w t c la electroforesis en solución debido a que es posible fijar las proteínas en su posiciki dc miguci6n iiuncdietmrentc &spuds de que finaliza la ekctroforesis. Un gel cs w a m&iz sblida coinpucrro da un gvtihero hidrofiiiio. poroso con una cswoUn mokcular que permite la difusin de solutos. La poliaaikida qua sa wen utc caw tiene tamaño de poro en el mimoorden quc la mayor park de las proteínas, cOnoiky.ad0 a dsr un afsaa Q tuaizsrk, mkcuiar. AdrnJI ba pies da F ) o 1 í l c n l d son polimeros sWtkoa da u11 aatpincro &renleiida quo es prqmmdo doniotiwa CM una &dc puma alta de tal I- que tma v w pui kcm$icM coir wmdaPiUdiq hay rqmdwbiiidrd m los mm. Adem& tienen h v& da ser hertes, &abies en un rango de PH atqplio. tnnpcraium y fuem kIE0. Son tramsparram y d o p - i l i de la conca~& sc p e i c tener gdca GO^ difemntes mgos de iamaiio de poro. -

r Se determinó la viscosidad de suspensiones acidulantes de harina en agua. Lüer y Schneider (1921) comparando varios métodos para la determinación de la capacidad de hidratación de coloides, enconmón Estas a lo largo son conocidas por sus diferencias entre las diferentes harinas y los diferentes t ips de trigo, son reflejo de una habilidad de las proteinas del gluten para la absorción de agua. La realción entre el un buen acuerdo con el método de Hofmeister. el cual involuvra la absorción de coloides, el método de Fisher para determinar el cambio de volumen, y el método de viscosidad.

Numerosas investigaciones se realimón en anos recientes sobre la viscosidad de suspensión de harina-agua y la medida de la viscosidad resulta útil en medición de harina de trigo suave. Finney y Yamazaki (1946). en aplicación de la medida de la viscosidad para harina de trigo hierte, encontraron para variedades una relacion esencialmente lineal entre la viscosidad y el contenido de proteina. pero esta relación no fue la misma para variedades diferentes, por lo que estas variedades diferentes no pudieron ser evaluadas por la medida de la viscosidad. Finney y Yamazaki (1946), en otras investigaciones por el desarrollo de un método para probar que la relación de la capacidad de retención de agua en harina de trigo fuerte es medido por determinación de peso de material separado de suspensiones acidulantes de harina-agua por medio de una centrifuga bajo condiciones prescritas. Los valores obtenidos correlacionados con pan de harina suave y al parecer para evaluar las variedades de higo duro rojo de invierno propiamente en terminos de su calidad del gluten. Metodo.

En un esfuerzo para adaptar una medida de la absorción de agua por un procedimiento, encontraría requerimientos previamente mencionados de una practica de inspeccidn de prueba de grano. Se noto que la proporci6n en que la fase sólida de una suspensión de agua-kid0 de harina de higo entero, se estableci6 Se estableció que hay una asociaci6n con el alto contenido de proteina y buena calidad en el gluten. La fase sólida de este tipo de suspensión aparece con una masa consistente de particulas del gluten en los cuales son incrustados otros constituyentes del trigo. El nivel para el cual la fase sólida se estableció bajo un para el contenido de varios de diferentes muestras de higo. Establecimiento dpido ,de tal suspensibn fue encontrado para ser asociado con un bajo contenido de proteina y con trigos variantes tienen una Abre calidad de gluten.esfuerzo de gravedad en un interYalo de tiempo depende de la cantidad de gluten presente y del grado de inflamiento.

,

El siguiente proccdmiento fue aplicado a todas las muestras de harina. Colocar una cantidad de harina equivalente a 4.0 g en I 00 ml de agua en un cilindro graduado teniendo una distancia de 180 a 185 mm emire el mro y 100 mi de marca. Adicionar 50 ml de agua destilada en el cilindro, batir la mezcla hasta 30 ragundoq y permiti que permanezca por cinco minutos. Adicionar 25 ml de ácido acético diluido, entonces el contenido de la mezcla en el cilindro se inviette, se tapa y se regresa a su posición veriif.1 10 minutos. úuncdiDpmen te despudr de mezclado K toma el tiempo con un cronometro. Después del intervalo de ex.ctlmentc cinco minutos y lec el volumen de la fase s6lida en el material graduado. Este volumen en mililitros ei el valor de sedimentación de la harina.

Mdterlo de BmliQsd.

Es un método basado en el uso de azúl brillante de Coornassie G-250, ya que existe en dos fornu de color , rojo y anil. La fwma roja es covemda en su forma azúl, al conbinarse con los enlaces de la proteína El complejo proteína-teñida tiene un alta coeficiente de extinción, adern&, de una gran sensibilidad. Metodología. Preparaci6n de la proteína. Se emplea albumina de suero de bovino. La solucibn fue preparada en O. 15 M de cloruro de sodio. Las concentraciones fueron determinadas por espectrofotometria. Preparación de los reactivos para proteína.

El ani1 brillante de Coomassie G-250 fue disuelto IOOmg de este en 50 rnl de eatanol al 95 %, estos a su vez mezclados con ácido fosforico al 8S% . La solución hie diluida a un volumen de I litro. La concentraci6n fmal en el reactivo fue de 0.01 % (wh) de azúl brillante de Coomasie, 4.7 %(w/v) de estanol, y 8.5 % (w/v) de ácido fosfonco.

v

Método standar.

La proteína contiene en soluci6n I O por 100 microgramos de proteína en Lolumen de 0.1 ml fue pipeteado en tubos de lZxl00 mm . El volumen en los aibor de pnicba fie ajustado a 0.1 ml con buffer apropiado. Cinco mililitros de proteína fueron di ionadrs para cada tubo y fueron mezcaldos los tubos. La absorvancia a 595 nm fue medida después de dos minutos. Se prcpar6 el blanco de O. I mi de los buffers apropiados y Sml de reactivo de proteha Usando la prueba standar para muestras desconocidas. Preparacih de las muestras desconocidas.

Se pesa exactamente O. I g de harina de trigo, sc le agrega Sml de solución de cloruro de sodio al 2% , se toman 100 microlitros de esta solución en tubos de ensaye y a estos se les adicionan loo0 microlitros del reactivo de Bradford, se espns 2 minutos a que se forme el complejo enlace de proteina -ail de Coomassie. Se lee a una longiiud de onda dc 595 nm .

M.en C. Lilt Vózquez Chóvn. Area de Alimentos Dspirímatento de Bioteeuobgh

Bibliografía.

Salvador Badui Dergal. Química de los Alimentos. Editorial Alhambra Mexicana. pp 162.198. Dominic W. S. Wong (1995) Qulmica de los Alimentos mecanismos y teoria. Editorial ACWBIA.

Zaragoza Espaila. . J.G.Brenan (1980). Las operaciones De la ingenieria de los Alimentos. Segunda edición, Editorial

ACRIBIA Zaragoza Espana. Técnicas de Electroforesis. M.en C. Gabnela Sepulveda Jimenez . Mario Bradford. Analytical Biochemistry 72 248-254 (1976). A rapid and Method for the Quantitation

of Microgam Quanties of Protein Utilizing the Principle of Protein-Bindmg. Effect of treatment on Portcin Solubility and Viscoelastic Porperites of Wheat Gluten. Vol. 5 I.No. 5,

1980 Cereal Chemistry. Lawrence Zcleny A simple Sedimentation test For Estimating the Bread-Baking and Gluten Qualites

of wheat Flour. Dale Every. A Simple, Four-minutr, Protein-solubility Test for Heat Damage in Wheat. Journal of

Cereal Science 6 (1987) 225-236.

hsbsrtadtanpa

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México D.F. a 11 de Abril de 1999

M. en C. José Arredondo Figueroa. Director de la división de C.B.S.

Presente.

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Por medio de la presente me dirijo a usted para informarle que la alumna Irene Cruz Leyva con número de matricula 91 333379, de la licenciatura en Ingeniería de los alimentos concluyó satisfactoriamente el trabajo realizado en el proyecto denominado "Determinación del efecto del tratamiento térmico del trigo sobre las propiedades del gluten ", mismo que se realizó como trabajo de servicio social en esta instinicion y se contemplo llevar a cabo del I3 de octubre de 1988 al 13 de abril de 1999.

Sin más por el momento quedo de usted

M.en C. Lilia Vázquez Chávez. Profem Asociado "C" de liempo compiero

Area de Alimenlos

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoachn Y la Purísima. Col. Vicentina. 09340 MCxico, D.F. Tel.: 724-4600 TELEFAX: (5) 612 O88

Cruz Leyva Irene 91333329. Ingenieria en los Alimentos. “DETERMINACION DEL EFECTO DEL TRATAMIENTO TERMICO DEL TRIGO SOBRE LAS PROPIEDADES DEL GLUTEN” Clave de registro del Servicio Social: IA.061.98 Fecha de Entrega: 13 de Abril de 1999. Asesor: M.en C. Lilia Vázquez Chávez, profesor Asociado “C” de tiempo completo, Area de los Alimentos.

RESUMEN.

Para determinar el efecto del tratamiento thnico del trigo sobre las propiedades del gluten, se procedió a realizar tres pruebas de análisis: Prueba de Bradford, Sedimentación y electroforesis, mismas que nos ayudaron a determinar como se habia dañado la proteina del gluten en la harina tras haber sido sometido el grano de trigo ( Tritucum asestivum de la variedad fuerte de la variedad (“Oasis”) a un secado artificial por lecho fluidificado a diferentes tiempos (360,300,270,240,210,150, 120, 90, 45, 30, 20 minutos) y diferentes temperaturas (40,60,70,80 y IOO°C). Este tratamiento térmico se realizó con el fin de poder encontrar las condiciones más óptimas de secado del grano de trigo para as¡ poder ser almacenado, sin que se presenten consecuencias posteriores en la calidad panadera debido al daño del gluten por el tratamiento térmico. Para la determinación del daño a la solubilidad de la proteina se utilizó la prueba de Bradford, Las muestras de harina fueron sometidas a una solubilización en soluciÓn3e cloruro de sodio al 2%.Utilizando como proteina patrón el BSA (Suero de Albúmina de Bovino ), el Espectronic Genesys 5 para relizar las lecturas con una longitud de onda de 595 nm. Se obtuvo como resultado que el daño a la solubilidad de las proteinas se registró con mayor intensidad en las muestras de grano que fueron tratadas a temperatura de 100 “C, tiempo de 20 minutos tanto en una humedad inicial de 18 como de 20 %, registrandose los más bajos valores. Prueba de Sedimentación . Se realizo de acuerdo a la técnica de Zeleny. Se utilizó 3.2 g de harina de las muestras a las cuales se les aplico el tratamiento térmico mencionado para el grano de trigo. La cual se mezclo con una solución de ácido láctico, esta prueba nos muestra el daño por desnaturalizaciEn que sufren las proteinas al ser secadas artificialmente, estos se observó por la determinackn del volumen de sedimentación de la harina, al cuanficar el grado de absorción de agua por las proteinas del gluten. La prueba de Zeleny también rnostro que el daño a la proteina del trigo es mayor cuando las temperaturas de secado del grano son más severas ( 100 “C por 20 minutos a 18% y IOOTpor 30 minutos a ?O % de humedad), obteniendo un volumen de sedimentación de 8.0, y para el testigo de 9.0 ml, sin embargo en este caso estudio no se puede aceptar como una medida de calidad panadera la prueba de sedimentación, ya que de acuerdo otros investigadores el volumen de sedimentación es al menos de 55 ml para variedad de harina de harina fuertefzeleny) como es el caso de la variedad “Oasis” que es considera una variedad fuerte. Se realizó un análisis estadístico para ambas pruebas , el cual resultó altamente significativo, tanto para la variable dependiente “concentración de proteina soluble, como para el volumen de sedimentación para las variables de respuesta : tiempo, temperatura y humedad. Prueba de Electroforesis. Las muestras de harina se solublilizaron en solución de NaCl al 2%. fueron tratadas con mercaptoetanol, se prepararon los geles de poliacrilamida se montaron las muestras en los carriles del gel y se aplico corriente en buffers controlados ,para las separación de las proteínas en bandas coloreadas con azul brillante de Comassie R-250. En esta prueba se pretende identificar las proteínas del gluten que fueron dañadas por el secado, se sabe que se ve afectada la solubilidad de las proteinas esta perdida se debe a intercambio de enlaces sulfudrilo-disulfuro en las reacciones de intercambio, con lo cual se afecta la fracción de glutenina, y con ello se ve afectada la calidad panadera (C.E. LUPANO and M.C. ARON). Para esta prueba de electroforesis solo se trata de estandarizar la técnica, así como su reproducibilidad y en una segunda etapa de esta investigación se identificaran las proteínas que fueron separadas en cada una de las bandas al determinar sus pesos moleculares y así establecer cual fue el daño a la proteína por eatamiento térmico.

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Formato de presentación del informe del Informe Final.

Naturaleza del proyecto.

Invesiigación.

Introducción.

El secado por lecho fluidizado, en el cual se utiliza aire caliente forzado a través de un lecho de sólidos de forma tal que los sólidos queden suspendidos en el aire. El aire caliente actúa tanto como medio fluidizante como desecación. El lecho fluidizado 'se aplica fácilmente a los cereales, dentro de un amplio margen de contenidos de humedad. (?) El trigo es un cereal que fundamentalmente se utiliza en la fabricación de los distintos derivados de la panificación, ya que presentan la particularidad de que durante su fermentación se produce un esponjamiento, esta capacidad se debe principalmente a las proteinas. La harina contiene de 10 a 12% de proteinas, son basicamente glutelinas y prolaminas del citoplasma de las célulasaél endospermo, en donde actúan como componentes esmicturaies y de reserva de nitrógeno para el crecimiento, en menor proporción existen también otros, como las albúminas y globulinas, que representan sólo aproximadamente un 15 % del total y cuyo peso molecular promedio es de 12. 000. La separación de cada una de las fracciones que integran las proteinas del trigo se puede efectuar con base en la solubilidad.

Las glutelinas del trigo reciben el nombre de gluteninas, mientras las prolaminas; el de gliadinas y ambas suman el 85 % de la fracción proteica ; estas junto con los lipidos y agua forman el llamado " gluten ". responsable de las propiedades de cohesividad y de viscoelasticidad de la. masa de panificación.

Las gliadinas solubles en etanol al 70 % representan el 50 % del total de las proteinas, son de una clase heterogénea de 40 a 60 polimeros que por medio de electroforesis se han dividido en cuatro grupos (alfa, beta, gamma y omega ). En una proporción de 15 , 30, 30, y 25 % respectivamente. Sus cadenas simples tiene estructuras primarias con diferentes composición de aminoácidos y su peso molecular varia de 15, O00 a 80,000 con un promedio de 36,000.

Su conformación se estabiliza por medio de enlaces disuifuro intramolecularmente; al hidratarse forman una masa viscosa extensible, fluida pero poco elsrjtica y son responsables de la expansión de las masas durante la

,elaboración del pan. Cuando existe un exceso de gliadinas en relación con las glutelinas el gluten se vuelve débil, permeable y no retiene el anhidro carbónico, entonces la masa en lugar de esponjarse se colapsa.

Se han identificado 15 glutelinas en forma monomérica que tienen pesos moleculares desde 12, O00 hasta 135, O00 y que se caracterizan por su elevado número de enlaces disulfuro que le confieren una gran estabilidad y permiten la asociación para formar polimeros de un peso molecular de varios millones. Son solubles en soluciones salinas neutras y en etanol al 70 % solubles o dispersas en ácidos y en bases débiles, al hidratane producen una masa muy tenaz, elastica y cohesiva. Para elaborar el pan, estas proteinas deben estar en proporción adecuada ya que un exceso; en el gluten presenta tanta cohesividad que inhibe la expansión de la masa y provoca una reducción del volumen fuial. El gluten en conjunto tiene una composición de aminoácidos aproximadamente de 6% ionimbles, 45 % polares y 49 % apolar, se caracterizan por su elevado contenido de prolina y glutamina 24 Y 37 % respectivamente. Del total de los aminoácidos, la alta proporción de este iminoácido hace que 10s PoliPePtidos

I .

carezcan de una conformación helicoidal, lo que a su vez causa que el grupo amida de la glutamina tenga facilidad de establecer puentes de hidrógeno intermoleculares e.intramoleculares. Su baja concentración de amonoácidos ionizables y el alto porcentaje de hidrofóbos hace que sea poco soluble a pH neutro. Contiene además un gran numero de residuos de sisteina que le permite producir enlaces disulfuro intra e intremoleculares aun cuando las proteinas del trigo no forman una estructura tridimensional con base a enlaces covalentes. Durante el amasado manual, las gluteninas y las giadinas se desnaturalizan y establecen uniones disulfuro. hidrófobas e hidrófilas que hacen que estos polimeros se orienten longitudinalmente, los esfuerzos mecánicos inducen un intercambio de grupos azufrados entre las multiples cisteinas. El resultado de este proceso es la formación de una red elástica y cohesiva necesaria para el esponjamiento ocasionado por la presión del anhídro de carbono. Dicha red se crea por una interacci6n de las gliadinas y las glutelinas y se estabiliza mas por medio de u n gran número de puentes de hidrógeno por parte de la glutenina y de las uniones hidrofóbas y enlaces disulfuro intra e intermoleculares. La tenacidad de las harinas se debe a la composición del gluten; las conocidas como fuertes producen masas cohesivas que requieren tiempos de mezclado largos, los llamados débiles; que desarrollan estructuras adeacuadas y colapsan al amasarse. Es practica común el empleo de agentes oxidantes y reductores para regular la cantidad de los 'enlaces disulfuro cruzados y son parcialmente responsables de las propiedades reológicas de la masa, los agentes oxidantes que más se emplean son los peróxidos, bromatos. persulfatos y entre los reductores destacan los sulfitos, la cisteina, el glutatión o cualquier compuesto que tenga grupos sulfidrilos libres.( I )

Durante el tratamiento térmico, se debilitan los enlaces entre los lipidos polares, especialmente los glicolípidos, y las proteinas del gluten debido a la desnaturalización proteica. A medida que aumenta la temperatura mayor a 50'32, el almidón, los lipidos se traslocan y sus moléculas pasan a formar complejos con el almidón. (2)

Antecedentes.

A traves del tiempo se han realizado una serie de pruebas para la determinación de proteína en los alimentos en particular en los granos de cereales, se han ido practicando estas pruebas y se ha conseguido mejorar la sensibilidad en la cuantificación de las proteins. En el caw en que los granos de trigo fueron sometidos a tratamiento térmico se han presentado caws de datio por calor, que ocurre cuando el grano se ha secado artificialmente a temperaturas criticas, por tratamiento térmico, especialmente la glutenina drasticamente reduce la calidad panadera y la capacidad de germinación del trigo.

La solubilidad de proteínas y sus propiedades viscoelasticas del gluten son marcadamente modificadas por calentamiento en agua a ebullici6n. El gluten presenta cambios en sus propiedades viscoelasticas las cuales se h

del trigo. que han sufrido dano por calentamiento. También se ha llegado a establecer que hay una relación lineal entre la calidad panadera y el daño por calentamiento en trigo. Entre los métodos que se emplea se encuentra : Electroforesis, Bradford ( thción de los enlaces de proteina ), y la prueba de sedimeatación de Zeleny.

observado que tienen una relación directa en un cambio de la solubilidad de ia proteina. ir uchas pruebas de cumtificación de proteínas utilizan el criterio de la pérdida de solubilidad de las proteinas

Objetivo general.

Determinar el grado de daño en las proteinas del gluten de trigo (variedad Oasis ), mediante la aplicación de técnicas para determinación de proteina.

Objetivos particulares.

Aplicar diversas técnicas para la determinación y cuantificación de las proteinas: Electroforesis, Bradford, sedimentación.

Comparar los resultados obtenidos de cada una de las tecnicas mencionadas . Establecer la relación que guarda el daño por tratamiento térmico que sufren las proteinas .

.

Diagrama de flujo de la Metodología en el proyecto de investigación "Determinación del efecto del tratamiento térmico del trigo sobre las propiedades del gluten".

Secado por lecho flnidifieado A diferentes tiempos (6 ,5,4.30,4, 3.30 2.30.2.0 1.30 1.0,0.45. 0.30,0.20 h.)

y temperaturas (~0,60,70,80 y io0 T).

I .:::- Molienda.

/ Prueba de Bradford.

1 ueba de Electrofere

METObOLOGIA.

Y ELECTROFORESIS.

PRUEBA DE SEDIMENTACION.

PRUEBA DE BRADFORD

> Curva patron.

‘r Tabla de resultados de concentracion de proteina soluble.

> Grofica de resultados de la concentracion de proteina soluble.

Metodologia.

Electroforesis

La electoforesis es una técnica universamente utilizada por los bioquimicos de péptidos y proteinas. EI fundamento de separación de esta técnica, se basa en el movimiento que tiene un componente proteico a través de un medio eléctricamente conductivo. en respuesta a una aplicación de voltaje. Por lo cual, la carga eléctrica efectiva ylo el radio molecular son las caracteristicas bioquimicas de las proteinas, que se han usado para el desarrollo de los procedimientos electroforeticos. Alternativamente, la hidrofobosidad, la quiralidad y la afinidad especifica, son otras propiedades fisicoquimicas consideradas en algunas modalidades de separación. Fundamento: Las proteinas y los péptidos .son anfolitos, es decir poseen gnipos ionizables tanto aniónicos como cationicos. Su carga neta y movilidad son una función del pH del medio que los rodea. Una proteina en solución, a un pH diferente a su punto isoelétrico puede tener tanto carga positiva como negativa. Esto ocasiona una movilidad a través de un campo eléctrico. Moléculas con carga positiva emigram hacia el catodo negativo, mientras que aquellas con una carga negativa lo hacen hacia el anódo positivo. Además del pH, la fuerza iónica y la conductividad del medio son otros factores importantes, que influyen en la movilidad de las moléculas durante el desarrollo del proceso elctroforético.

Materiales.

Sistemas de amortiguadores

El pH y la fuerza iónica son especificamente controlados con el uso de amortiguadores con una conductividad y fuerza iónica bajas. En general tales reguladores tienen componentes orghicos relativamente grandes, no cargadas y por lo tanto con una movilidad eletroforética baja lo produce la velocidad de separación alta y una resolución aceptable, El pH de elección es neutro o ligeramente alcalino, los reactivos más populares y comunmente usados son el TRIS ( hidroxymethyl ).

Condiciones disocianies.

El empleo de un sistema disefiado para disociar a todas las proteínas es útil para estudiar la complejidad y el peso molecular de los polipkptidos que constituyen una muestra. El reactivo disociante empleado es el dodecil sulfato de sodio (SDS). Oms agentes reductores, como el 2-mercaptoetanol se puede usar en combinaci6n para romper los enlaces disulhiro. En presencia del SDS, se rompe la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria de la proteína. La cadena polipetidica se desenrolla y se rodea por las moléculas de SDS y se forma una micela. Las numerosas cargas negativas que proveen las moléculas de SDS hacen que las cargas que llevan las proteinas se vuelvan insignifíantes. Por lo tanto, la cadena polipCptidica se transforma en una micela elongada, cuya longiiud y c a r p san pFoBorcicnitcs al peso molecular de la cadena. La mezcla de proteínas es d e s n n b i r a l i por caiei%tmmi6riio a 100 O C en presencia de SDS y el agente reduntor bajo dichas condiciones, los compljos SDS cargados negativamente, con densidades de carga idénticas pueden emigrar en un gel y su sepanción es realizada unicamente de acuerdo al tamaño del polipéptido. Ademas se agrega glienol, para aunMnar la densided de la muestra. Requisito importante cuando se aplica en el gel, ya que evita que sc mezeic con la wluci6n reguladora dispuesta en los reservorios

de la cámara de electroforesis. El colorante como es el azÚl de bromofenol también es includo para dar seguimiento de la distancia recorrida por la muestra de proteinas. Los geles como un medio de soporte. El uso de geles como un medio anticonvectivo ha permitido controlar los efectos de calentamiento y de difusión pos electroforética generados durante la electroforesis en solución debido a que es posible fijar las proteinas en su posición de migración inmediatamente después de que finaliza la electroforesis. Un gel es una matriz sólida compuesta de un polímero hidrofilico, poroso con una estructura molecular que permite la difusión de solutos. La poliacrilamida que se usa en este caso tiene tamalio de poro en el mismo orden que la mayor parte de las proteínas, contribuyendo a dar un efecto de tamizado molecular. Además los geles de poliacrilamida son polimeros sintéticos de un monomero de acrilamida que es preparado de reactivos con una grado de pureza alta de tal forma que una vez que las condiciones son estandarizadas, hay reprodusibilidad en los resultados. Además tienen la ventaja de ser inertes, estables en un rango de PH amplio, temperatura y fuerza iónica. Son

'transparentes y dependiendo de la concentración se puede tener geles con diferentes rangos de tamaño de poro.

El gel de poliacrilamida se forma por una reacción de radicales libres. La polimerización es iniciada por la adición de uno u otro persulfato de amonio o riboflavina, el N,N,N,N" tetrametiletilendiamina ( TEME). Cataliza la formación de radicales libres de oxigeno del persulfato, iniciando la polimerización. Es por tanto recomendable desairear la mezcla de reactivos antes de agregar el catalizador, ya que el oxígeno inhibe la reacción al aumentar la concentración tanto de TEME como de persulfato se aumenta la velocidad de polimerización.

Equipo.

Para llevar a cabo una electroforesis se requiere una cámara y una fuente de poder. Para la identificación y cuantificación se requiere un equipo de fotografía que permita tener un registro permanente de las proteínas sepafadas en el gel. La conservación de un gel también puede ser realizada con el uso de secadores de geles comerciales.

Deierminación del peso molecular.

La electroforesis en geles de poliacrilamida bajo condiciones disociantes es ampliamente utilizada para conocer el numero de subunidades y el peso molecular de cada una de sus cadenas polipeptidicas.

Análisis post electrofore'iico: Visualización y cuaniificación.

Una vez que las proteinas o polipeptidos han sido separados es necesario realizar un tratamiento especifico, que permita fijar y detectar las bandas de proteína. Las proteínas son fijadas con ácido acético-metanol. Las bandas de proteína se detectan por tinci6n con colorantes como la plata en este caso. En la práctica se debe considerar el tiempo de tinción y este dependerá del grosor y la concentraci6n del gel.

,

Preparación de los Reactivos.

Solución 9.

Mezclar 14.6g de acrilamida con 0.4g de N,N’ -metileno-bis acrilamida; aforados a 50mI con agua destilada.Se almacena a temperatura de 4°C.

Buffer 11 (Buffer de separación.) . Se pesaron 9.075g de TRZMA BASE [tris (Hidroximetil) aminometano] y aforados a 50ml de agua destilada, ajustando el pH a 8.8 con HCI

Buffer de tanque.

Se pesan 3% de TRIZMA BASE, con 14.4 g de glicina y I O ml de SDS al 10% .Aforados a I litro con agua destilada.

Solución 15 (Buffer de empaquetamiento).

Se pesan 3g de TRIZMA BASE aforando a 50 ml , ajustando el pH a 6.0 con HCI.

Solución I3 (SDSal 10%)

Se pesaron 5 g de lauril sulfato (SDS, Sodiom Dodecylsulfate), y se afora a 50 ml de agua destilada

Solución decolorante.

Se miden 75 ml de ácido acético glacial, mas 50 ml de alcohol etilico absoluto y se afora con agua destilada hasta un volumen de I litro.

Solución teaidora.

Se mezclaron 1.25 mg de ani1 de Coomassie R-250. Con 92 ml de ácido acético glacial y se aforaron con solución de etanol ai 50 %; hasta un volumen fmal de I litro.

Persulfato de Amonio.

Se pesaron 0.lg de persulfato de amonio y se agregaron Iml de agua destilada (preparar ai momento de realizar la determinación).

Solución 14 (Tratamiento de desnpturalheión)

Se mezclsron 2.5 ml de sdwión 15, can 4 ml de la solución 13 y se apagaran 2 ml de glicerol y 1 mi del reactive 2-m0pc-l y firw*aade 10 Ls 0.25 mi de &I de bromof&nol ai 1 5 y IO ml de mua destileda.

Preparación de bo muestras.

Extraccion de la proteína con solución de C ~ O N ~ O de sodio al 2 %

Se pesa O. I g de harina previamente identificada la temperatura a la cual fue secada, se adicionaron 5 ml de la solución de, NaCl al 2% .Se agito el tubo de ensaye que los contenia por un minuto, se deja reposar durante una semana final del tiempo se extrae el sobrenadante, se almacena a temperatura de congelación. Se descongela antes de realizar la prueba de elctroforesis.

a temperatura ambiente . AI

Preparación de los geles.

Gel de separación. Se adicionan 2.34 ml de la solución 9 (acrilamida), 1.75 ml de buffer de separación, 70 microlitros de la solución de SDS al I O %, 2.82 ml de agua, 30 microlitros de persulfato de amonio, 30 microlitros de TEMED.

Gel de empaquetamiento. Se agregan 790 microlitros de acrilamida, 1.5 ml de buffer de empaquetamiento, 70 microlitros de solución SDS al I O %, 3.62 ml de agua, 30 microlitros de persulfato de amonio, 30 microlitros de TEMED.

Indicador de Pesos Moleculares(DALT0N MARK VI).

Se debe mantener una relación 3:1, entre dicho marcador y la solucón 14.Esto se realizó para que se hicieran visibles las franjas de los indicadores de peso molecular, obteniendo de esta manera una concentración de I .68 microgramoslmicrolitro.

A continuación se muestran los calculos para obtener la concentración:

13.5 mg-----------2ml(agua destilada)

13,500 microlitros----2000 microlitros.

X=6750 microlitros----- 1 O00 microlitros.

X=202.5 microlitros------30 microlitros.

202.5 microlitros--------- 120 microlitros.

25.3 I microgramos------I 5 microlitros.

X=l .68 microgramod microlitro.

Albúmina BSA.

Se adicionarón 350 microlitros de la solución de albumina. previamente preparada, se adicionaron 150 microlitros de la solución 14 .Obteniendo una concenl~ación fuial de 0.175 microgramosl microlitro.

25 mg de albumina----------------lOOml de agua destilada.

2500 micrograBos----------------- I O0 O00 microlitros

87.5 microgramos------------------j50 microlitros.

87.5 microgramos------------------jOO microlitros.

2.625 microgramos----------------- I5 microlitros.

O. 175 microgramos Irnicrolitro.

Montaje de las muestras en el gel.

Se colocaron 400 microlitros del sobrenadante que se obtuvo al haberse solubilizado las proteinas en la solución de cloruro de sodio al 2 % , se adicionaron 100 microlitros de la solución 14 (tratamiento de desnaturalización).Se colocan los tubos de ensaye en agua ebulliendo por 5 minutos aproximadamenteSe dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente.Finaimente se agregaron 15 microlitros en cada uno de los canales que tiene el gel. Dando el mismo tratamiento a la albúmina y el reactivo de DALTON identificando cada una de las posiciones tomadas por cada una de las diferentes muestras analizadas. La concentración final de la muestra problema de harina resultó ser de 1.6 x I O ” microgramos/microlitro.

0.1 g de harina.---------S.O ml de la solución de NaCl al 2 %

O. I g-----------j O00 microlitros

I O0 mg-------500microlitros

00.1 mg------ 500 microlitros

X=0.008 microgramos--- 400 microlitros

X=O.O08 microgramos---500 microlitros.

~=2.4~10-‘ _ _ _ _ _ _ _ _ ~ _ _ _ _ _ _ _ _ I j microlitros

X= 1 . 6 ~ 10.‘ microgramos/microlito

Tinci6n de los geles.

Una que ha transcurrido el tiempo de corrimienio de las proteínas en el gel, mediante el uso del apamto para elecnoforesis.Se colocan los geles en un nistaliudor que contenga suticiente solucibn teflidora (ani1 de Cooi8ssie R-2%). por han, -qiwi& 9c &qji¡$ el exoaK) dc colorpsts y se colocen en otro reciepiente coluniisndo soluci6n el mi, esa u h a opsnob se wlizá cambiando 3 o 4 veces se acid ru f i c i cn tem~ el gel. Fmbie se adicionaba agua destilada al gel y se dejaba en este por espacio de 24 horn. AI temino de este tiempo se colocarón los geles para poder ser leldos en el densitomcno.

Rñ

U n a prueba de sedimentación simple, para estimar, la calidad panadera y la calidad del gluten en la harina de trigo.

Una prueba para estimación potencial de la calidad panadera, que es más simple, rápida, y practica que la prueba de Kjeldahl para proteínas, o otras pruebas ahora usadas para evaluar el trigo en terminos de su calidad panadera. podría ser extremadamente valioso para uso en el grado de calidad del trigo. Se sabe que hay difrencias entre harinas de diferentes tipos de trigo, se reflejo por la hanilidad de las proteínas de gluten para absorver agua. La relación entre el invremento coloidal de gluten y la calidad panadera de la harina fue probablemente reportada primero por Upson y Calvin (1916). Gortner y Doherty (1918). en estudio de la proporción y extensión de incremento de los discos de gluten en soluciones diluidas de varios ácidos, encontro que glutenes de harinas fuertes tienen mucho más alta proporción de hidratación y mucho más alta capacidad de hidratación que los glutenes de harinas débiles. Lüers y Ostwal, (1920) y Gortner y Sharp (1923) demostraron la relación entre la fuerza de cocción y la capacidad de hidratación como medida por la viscosidad de la suspension de harina en agua, en suspensiones de ácido diluidas. Lüers y Scheider ( 1921). en comparación de varios métodos para determinar la capacidad de hidratación de los coloides, encontró un buen acuerdo entre Hofmeister’s , en un método que consistía en pesar antes y después de la absorción de agua por los coloides, el método de Fisher , para determinar el cambio en volumen, y el método de viscosidad. Numerosas investigaciones han sido hechas en años recientes sobre la viscosidad de supensiones de harina-agua en medio ácido, y la viscosidad medida ha sido encontrada úti l en evaluaciones de harina de trigo suave. Finney y Yamazaki (1946). en aplicación de la medida de la viscosidad para harinas de trigo fuerte. Asi mismo estos dos Últimos investigadores en otros estudios desarrollaron un método de prueba para evaluar la capacidad de retención de agua de la harina de trigo fuerte. Los datos obtenidos por estos muestra una buena correlaicón entre el volumen del pan y la capacidad de absorción de agua acidulada de la harina, sirven para evaluar las variedades de trigo en términos de su calidad panadera. (Lawrence Zeleny)

I

Método.

En un esfuerzo para adaptar una medida de la absorción de agua par un procedimiento, encontraria requerimientos previamente mencionados de una practica de inspección de pNeba de grano. Se nato que la proporción en que la fase sólida de una suspensión de agua-ácido de harina de trigo entero, se estableció Se estableció que hay una asociación con el alto contenido de proteina y buena calidad en el gluten. La fase sólida de este tipo de suspensión aparece con una masa consistente de particulas del gluten en los cuales san incrustados otros constituyentes del trigo. El nivel para el cual la fase sólida se estableció bajo un para el contenido de varios de diferentes muestras de trigo. Establecimiento rápido de tal suspensión fue encontrado para ser asociado con un bajo contenido de proteina y can trigos variantes tienen una pobre calidad de gluten.esfuerzo de gravedad en un intervalo de tiempo depende de la cantidad de gluten presente y del grado de inflamiento

.

Preparación de los reactivos

Agua de hidratación. (solución de azúl de bromofenol).

Se afladieron a mg de azúl de bromofenol y se aforaran can agua destilada a un litro final de volumen.

Solución madre (ácido I4ctico)

Se diluyeron 250 ml de ácido láctico en un litro de agua destilada, se mantiene en reflujo la solución durante 6 hrs sin perdida de valumen.

Reactivo de prueba de Sedimentación.

Se mezclaron 180 ml de la solución madre de ácido láctico con 200 ml de alcohol isopropilico aforando hasta un volumen final de 1 litro; se deja reposar el reactivo durante 48 horas, para posteriormente estandarizar a 0.05 +/- utilizando hidr6xido de sodio O. I N.

Tratamiento de las muestras problema.

Se pesaron 3.2 g de harina en una probeta graduada esmerilada, se añadieron 50 ml de agua de hidratación con a d de bromofenol, empezando a medir el tiempo al momento de haber añadido dicha agua. Se mezclan ambos sujetando la probeta en posición horizontal agitando de derecha a izquierda doce veces en cada dirección. Posterioemente se coloco la probeta en el agitador (vortex), y se agitó por cinco minutos.

' Pasando los cinco minutos, se añadieron 25 ml de reactivo de prueba de sedimentación agitando nuevamente hasta transcurir 10 minutos.finalmente se se coloca el cilindro en posición vertical sobre una superficie plana por cinco minutos y se le posteriormente el volumen de sedimentación en la probeta graduada.

Método de Bradford.

Este método para determinar proteina el cual involucra elenlazamiento de Coomassie, azúl brillante G- 250 para proteina. El enlace da el color para proteína, el cual puede leerse a una absorción máxima de 465-595 m. Estos ensayos son muy reproducibles y rápidos con el proceso de enlace teñido. Virtualmente completo en aproximadamente 2 minutos, y una estabilidad en el color desarrollado por no más de una hora. Hay cationes que interfieren en la prueba tales como el sodio o potasio. Sin embargo algunos detergentes como el dodecil de sodio, triton X-100 y otros detergentes para cristalería interfieren en la prueba, para puede utilizarse controles adecuados. Es un método basado en el uso de azul brillante de Coomassie G-250, ya que existe en dos formas de color , rojo y azul. La forma roja es convertida en su forma azul, al combinarse con los enlaces de la proteína. El complejo proteina-teñida tiene un alta coeficiente de extinción, además de una gran sensibilidad.

Metodologia

Preparación de la proteina.

Se emplea albúmina de suero de bovino. La solución fue preparada en 0.15 M de cloruro de sodio. Las concentraciones fueron determinadas por espectrofotometria. Se pesaron 25 mg de BSA se aforan a un volumen final.

Preparación de los reactivos para proteina.

El azul brillante de Coomassie G-250 fue disuelto IOOmg de este en 50 mi de etanol al 95 %, estos a su vez mezclados con ácido fosfórico al 85% . La solución fue diluida a un volumen de I litro. La concentración final en el reactivo fue de 0.01 Só ( d v ) de azhl brillante de Coomasie, 4.7 %(w/v) de etanol, y S.5 % (wiv) de ácido fosfórico.

Metodo standar.

La proteína contiene en solución 10 por 100 microgramos de proteína en volumen de O. I mi fue pipeteado en tubos de l2xlOO mm , El volumen en los tubos de prueba fue ajustado a 0.1 mi con buffer apropiado. Cinco mililitros de proteina fueron adicionados para cada tubo y fueron mezcaldos los tubos. La absorvancia a 595 nm fue medida después de dos minutos. Se preparó el blanco de 0.1 ml de los buffers apropiados y 5ml de reactivo de proteina. Usando la prueba standar para mueshas desconocidas.

Preparación de las muestras desconocidas.

Se pesa exactamente 0.1 g de harina de trigo, se le agrega 5ml de solución de cloruro de sodio al 2Yo , se t o m a 100 microlitros de esta solución en tubos de ensaye y a estos se les adicionan 1000 microlitros del reactivo de Bradford, se espera 2 minutos a que se forme el complejo enlace de proteína - d l de Coomassie. Se lee a una longitud de onda de 595 nm en el especirofotomeiro Specnonic Genesys 5.

I

Elaboración de la curva patrón para la determinación de la concentración de proteína por el método de Bradford utilizando Suero de' Albúmina de Bovino.

Absorvancia

0.1185 0.1895 0.28 I 0.325 0.488 0.5 195 0.5825 0.668

Conceniración de proteina (pgl loop1 )

2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 17.5 20.0 25.0

trafica de la curva patrón, elaborada con Suero de Albúmina de Bovino, utilizando la prueba de Bradford.

0.7 0.6

0.4

.- E 0.5 .

2 0.3 . 2 0.2 -

0.1 - O .

Curva patrón de BSA Por el metódo de Bradford

_-e. ,-- ~ ..-

./- ,/

-cfc /-.'.

.

Tabla de resultados para la dstwdnación de proteína soluble por la prueba de Bradford en las muestras de harina, las cuales se extrajeron de trigo de la variedad “Oasis”.

Tiempo (minutos) TemperaNra (“C) Concentración de proteína (pghg) Humedad inicial.

Gráfica en la cual se muestra la concentración de proteína en las muestras de harina de la variedad "Oasis" las cuales fueron tratadas a diferentes tiempos y temperaturas de secado.

0.6 0.55

0.5 0.45

0.4 0.35 0.3

I

* * ** - e + . *. -

-

Concentración de proteína en harina de la variedad "Oasis" por el metódo de Bardford.

0.7 , I 0.65 t

ANAUSIS DE RESULTADOS.

+ Prueba de Bardford.

*:e Tabla de resultados y grafica de los resultados obtenidos en la cuantificacion de la proteina soluble, a diferentes tiempos de secado y una misma temperciturci, humedad inicial de 18 %.

,

*:* Temperatura de 40 "C.

0 Temperatura de 60 "C.

Q Tcnrpwatura de 70 "C.

0:. Temperatura de 80 "C.

O Temperatura de 100 "C

o Tabla de resultados y graficas de la cuantificacion de la proteinasoluble a diferentes tiempos y una misma temperatura de secado, humedad inicial de 20 X.

o Temperatura de 40 "C.

o Tempetaua de 60 "C.

o Tcnrgarahira. de 100 "C.

Análisis'de Resultados.

Prueba de bradford.

. Tabla 1 . Resultados de Bradford determinacion de pr( tiempos de secados diferentes y humedad inicial de 18%.

I s( en &mg a temperatura 4 Y

Gráfica 1 . Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado y temperatura de secado de 40 "c.

Concentración de proteína a dikmntes üempos de secado y tempemturn de 40 "C

.

400

350

300 ui

a 250

E 200

150 g

O

E

I

._ C W

5 1 O0 F

50

O . ~ _ _ _ _

mtiernpo 360 270 240 O ... .~

mconcentracion de proteina. 9.461 8.538 9.543 lz.195 . ~ .

Tabla 2. Concentración de proteína a temperatura de 60°C y tiempos de secado diferentes a una humedad relativa de 18 %.

.

Gráfica 2. En la cual se muestra la concentración de la proteína soluble a diferentes tiempos de secado y una temperatura de secado de 60 OC, humedad inicial de 18 %.

Gráfica 2. Concentración de proteínas diferentes tiempos de secado y temperatura de 61) "C.

160 ;

140

120

ui 1 O0 B 80 'E 60 o

i= o 40

20

O

= C

C

O P

- oConcentracion de 1 10.296 8.095 j 10.516 10.195

i \ - ' prot. Soluble. ; -

Tiempo. ~ 150 j 120 ¡ 90 ~ 0 .

Tabla 3. Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado a temperatura de 70 OC y humedad inicial de 18%.

Tiempo (minutos) Temperabra ("C) Concentraci6n de proteína (pgímg) 60 70 10.025 45 70 9.38 30 70 9.29 O 20 10.195 .

Gráfica 3. Concentracion de proteína mediante la prueba de bradford a diferentes tiempos de secado y una temperatura de 70 OC. '

Concentración da proteak# SoSuMb a dtkrentes Uonrpos de secado y temperatura de 70 "C.

70

m concentración de I 10.025 9.38 9.29 , 10.195 ,

1

proteína m Tiempo 60 45 30 I O

En la tabla 4. S e tiene el valor de la concentración de proteina soluble a una temperatura de 80 oc y una humedad inicial de 18 % en un tiempo de secado de 30 minutos.

Tiempo (minutos) Temperatura (“C) Concentración de proteina (pg/mg) 30 80 I 9.37

O (testigo) 20 I10.195 1 Gráfica 4. Concentración de proteina soluble en p g h g de muestra, a 80 “C por treinta minutos y una humedad inicial del 18 %.

Gráfica 4. Concentración de proteína adiferentes tiempos de secado y temperatura de 80 “C

40 1

ui 30 O a C

C al O

‘E 20

e 10 F

O ____ FJ concentración de 30 O

Droteína .-

=tiempo 9.37 10.195

.

Tabla 5.Detenninación de proteína soluble en Iig/mg de muestra a una humedad inicial de 18%. temperatura de 100 "C, la muestra testigo.

Tiempo (minutos) 20 O

Temperatura ("C) 100 I 6.82

20 I 10.195

Concentración de proteína (pg/mg)

En la gráfica 5, Se observa como a temperatura de 100 OC el daño por tratamiento térmico si es notable al registrarse un valor de concentración de la proteína soluble en pg/mg notablemente menor comparado con el registrado para las condiciones anteriores.

I

Grifica 5. Concentración de proteina a 80 'C por 30 mlnutosde sacado.

35

30

25

20

15

10

5

O Concnetrackin de proteha 9.37 10 195

i tienpo 30 O

Tabla 6. Muestra concentración de proteína soluble a temperatura de 40 O C , humedad inicial de 20 % y tiempos diferentes de secado.

r

.

Gráfica 6. Concentración de proteína soluble cuantificada por el metódo de Bradford a diferentes tiempos de secado y una temperatura de secado de 40 "C, humedad inicial de 18 %.

Gráfica 6. Concentración de proteína soluble a diferentes tiempos, humedad de io%

350 I 1

300

250

200

150

1 O0

50

O 1 2 3

Concentración de proteína 9.422 9.83 10.195 ( u g h )

.Tiempo 300 120 O

Tabla 7. Concentración de proteina soluble a temperatura de 60 "C a diferentes tiempos de secado y una humedad inicial de 20 %.

I 1

II Timw (minutos) IllTemDeratura ("C) IlConcentracidn de Drotelna í u d m d I

Gráfica 7. Concentración de proteina soluble a diferentes tiempos de secado, huemdad inicial de 20 % y una temperatura de secado de 60 "C.

I Gráfica 7. Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, humedad de 20 %

160

140

120

1 O0 - o .$ 80 C

60 ! .P 40 r

20

O

xoncentraci6n di proteína (uglmg'

tiempo

9.45 9.762 10.0195

150 120 O

\

. .

Para la tabla 8 . Concentración de proteína soluble a temperatura de 100°C y tiempo de tratamiento temico de 20 minutos, humedad inicial de 20 %.

Gráfica 8. Comparando la concentración de proteína soluble con tratamiento thnico a 100 "C v sin tratamiento,

Gráfica 8. Concentración de proteína soluble tratada a 100 "C

20

15

10

5

O

(gConcentraci6n de , 7.41 10.195 Droteina lualmai ' . - -.

.Tiempo. 20 O

.

+ SEWWNTACION.

Tabla de Resultados y grafica da mimen de sedimentacion a diferentes tiempo y temperaturas y humad- aC 18 y 20 %.

Sedimentación.

Tabla de resultados correspondiente a los resultados obtenidos de la prueba de Sedimentacion según Zeleny, de las muestras de harina tratadas a diferentes tiempos y temperaturas de secado por lecho fluidificado, a diferentes humedades.

120 I120 19.0 I20 120 I120 18.0 I20

Gráfica. Volumen de Sedimentación según el método de Zeleny, en muestras de harina extraídas de granos de trigo sometidos a tratamiento térmico, para el secado de los mismos por lecho fluidificado a diferentes tiempos, temperaturas y humedad.

Gráfica .Volumen de sedimentación en muestrasde harina de la variedad "Oasis

.VOLSED 9 195

nnENFo ,3801270

.W : 4 0 / 4 0 #. Mimedad j 18 ~ 18 i 18 18 1 8 , I 8 ~ 18 18 ' 18 ' 18 ! 18 ! 18 ' 18 20 ~ 20 20 ~ 2 0 2 0 ~ - i 8 ,

. ,

9 . 5 . 9 9 ' 8 9 9 9 ! 8 1 8 . 5 8 . 5 : 9 : 9 8.5 9 8 9

:210'210'150 120 90 ! 60 30 ~ 45 I30 20 ~300~120:150¡120 120 O

~ 4 0 ~ 4 0 i W . W ~ 6 0 ~ 7 0 ~ 7 0 ~ 7 0 ~ 8 0 1 0 0 1 4 0 . 4 0 mi60 100 2 0 '

ANAUSI ESTADISRCO.

> Prueba de Bardford (nedias de la concentracion de proteina soluble ).

Ii Tabla de datos y grafica a temperaturas y humedad de 18 %. 3 Tabla de datos y grafica a temperaturas y tiempos diferentes,

humedad inicial de 18%. 3 Tabla de datos y grafica a temperaturas diferentes y humedad de 20

Y!. > Tabla de datos y grafica a tiempos y temperaturas diferentes y

humedad de 20 96.

.

Análisis estadistico.

4 I

80 b.37

I O0 6.82 20 10.195 (testigo) -

Prueba de Bradford.

De acuerdo a los resultados obtenidos, el grado de solubilidad de la proteína disminuye a utilizar temperaturas de secado más severas, no asi en el caso que se utilizó temperaturas moderadas por tiempos prolongados. Se realizo un análisis de varianza para el estudio de las variables de respuesta: temperatura, tiempo, humedad , siendo altamente significativo este modelo en el estudio de la concentración de proteína, con un valor de F=35.29 y un a =O.OOl y un valor de R’ =0.9970. Así mismo se realizo la prueba de Tukey obteniendose el valor de las medias para las diferentes variables de estudio así como la combinación de estas variables de respuesta y establecer el comportamiento de la variable dependientes (prueba de bradford para determinar la cantidad de proteína soluble de la harina y la prueba de sedimentación que nos proporciona el grado de hidratación de las proteinas del gluten).

,

En la tabla 9.0 se muestra el valor de las medias a diferentes temperaturas a una humedad inicial de I S %.

Temperatura (“C) 7 Media (prueba de Bradford, conceniración de proteína pg/mg)

40 79.49 c

Temperatura (“C) Media (prueba de Bradford, conceniración de proteína pg/mg)

I 4 0

I1 70 1119.56 II

Gráfica 9.0. Se muestra el valor de las medias de la concentración de proteina soluble a diferentes temperaturas de secado.

Gráfica 9.0 media de la concentración de proteína a diferentes temperaturas.

6

5-

4-

3-

2 p-

1-

O 50 1 O0 150

- 1 2 3 4 1 5 6 ~ ~~ __ allmperatura 40 , 60 70 80 I 100 ~ io O Media de concentración de 9.49 9.63 9.56 9.37 ~ 6.82 ' 10.195

,

En io tabla 10. Se muestra los valores medios de la concentración de proteína a diferentes tiempos y temperatura de secado a una humedad inicial de I 8 %.

I Tiempo (minutos) I Temperatura (“C) I Media (concentracion de proteína I

En la g r á f i c a 10. Se muestra el valor medio de la concentraci6n de la proteína soluble en muestras de harina a diferentes, tiempos y temperaturas de secado, humedad inicial de 18 %.

. Gráfica IO. Media de la concentración de proteína soluble.

13 - 7

4

I C

r~

L

L _ _

O 1 O0 200 300 400 - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

mtienpo 20 30 30 40 60 90 120 150 210 240 270 364 O .tern 100 70 80 70 70 60 60 60 40 40 40 40 20 ,Gdr-6&-9T9?7 938 I002 1051 809 1029 995 954 853 946 1002

- - ~ - _ _

.-

En la tabla 11. Se tienen los valores de las medias de la concentracion de la proteina a diferentes temperaturas de secado y una humedad inicial de 20 %.

I

/ n ~ e d i a 1 9.61 9.61 I. Temp 1 40 60

Temperatura (“C) An 19hl

1 Media( concentraci6n de proteina pgimg)

I

7.41 I 10.195 I O0 20

1 -

60 19.61 i no 17.41

La grÓfica 11. Media de la concentración de proteina soluble a diferentes temperaturas de secado , humedad inicial de 20 %.

Gráfica 11. Media de la concentración a diferentes temperaturas.

,

Tierno en mnubs.

80

60

40

20

O

La tabla 12. Muestra los valores medios de la concentracidn de proteina de las muestras de harina que fueron tratadas a tiempos y temperaturas diferentes de secado por lecho fludificado.

Tiempo (minutos)

20 120 120 150 300 20 (testigo)

. Temperatura (“C)

100 7.41 40 9.79 60 9.76 60 9.45 40 9.42 20 10.195

Media (concentración de proteina Pdmg)

En la grófica 12. Se muestra el valor medio de la concentración de proteina soluble a tiempos y temperaturas de secado diferentes.

Gráfica 12. Media de concentración de proteína soluble a diferentes tiempos y temperaturas.

350

300 3 250

E 5 150

100

C 50

O

+

.E 200

al

1 2 3 4 5 6

7.41 9.79 9.76 9.45 9.42 10.195

SEDIMENTACiON.

4 Tabla de datos y graficas de volumen de scdimentacion en mi. Para tiempos diferentes de secado, temperatura de 40 "C a una huemedad de 18 Yo.

'

*:+ Tabla de datos y graficas de volumen de sedimentacion en ml. Para tiempos de secado diferentes y temperatura de 70 "C, humedad inicial de 18 70.

O Tabla de datos y gFBffigq de Y n de wdimtntacion a diferentes tiempos de secado y de 80 "C, humedad inicial de 18 70.

e:* Tabla de datos y grafica de volumen de sedimentacion a diferentes tiempos de secado y temperatura de 100 "C, humedad inicial de 18 YO.

*:e Tabla de resuit y grafica a diferentes tiempos de secado, tempwatum$e 40 "C ,humedn$ inicial Qr 20 YO.

*:* Tabla de datos y grafica a difenntcs tiempos de UC&, temperatura de 60 "C, humedad inicial de 20 X.

0 Tabla de datos y gpafka B de 100 "C, hwrutdad de 20 X.

Sedimentación.

En la determinación de daño de a las proteinas para hidratarse por tratamiento térmico se tienen registrados los valores de sedimentación obtenidos al realizar la prueba de sedimentación según Zeleny. En la cual se puede observar que los valores obtenidos de volumen de sedimentación fluchian entre S.0 y 9.0 mI 10s cuales al ser comparados por los datos reportados por Zeleny son muy bajos, ya que los registrados por Zeleny fluctuan entre 29.2 y 44.4 ml .A pesar que el grano del cual se extrajo la harina es de “Oasis” que se considera una variedad fuerte y por lo tanto se esperarían valores de volumen de sedimentación por arriba de lo resultados que se obtuvieron. Por lo tanto los datos que se obtuvieron en este proyecto de investigación no se pueden interpretar como resultados apropiados para dar un veredicto sobre como le afecta a la proteína las variables como son: temperatura y tiempo de secado por lecho fluidificado, con esto la prueba de Zeleny no nos proporcionó la información suficiente para decir que tanto se pudo dañar la proteína del gluten de la variedad “Oasis” frente a un tratamiento térmico.

CuadrolJ. Resultados del volumen de sedimentación (mi) a temperatura de 40 “C, 18 % de humedad y diferentes temperaturas.

.

brófica 13. La gr;ifica muestra la relación entre el volumen de sedimentación de las muestras de harina tratadas a diferentes tiempos y una temperatura de secado de 40 "C. humedad inicial de I8 %.

,!'.. '.., ,

Tabla 14. Volumen de sedimentación a temperatura de 60°C y una humedad de 18% a tiempos de secado diferentes.

I I 1 J

Tiempo (minutos) I(ITemperatura(0C) lllVolumen de sedimentación(ml) . I to 1110 n I

Gráfica 14.Volumen de sedimentación a temperatura de secado del trigo de 60 "C y humedad inicial de 18 % a diferentes tiempos de secado.

Gráfica 14. Volumen de sedimentación a temperatura de 60 "C y diferentes üempoa

160 /'

I

Gráfica 15. Valumen de sedimentación a una temperatura de 70 "C y humedad inicial de 18 %, a tiempos de secado diferentes.

Tiempo (minutas) I Temperatura ("C) I Valumen de sedimentación (mi) 60 I70 19.0 A5 I 70 18.0 .. .~ .- e i n I 7n I q n _I" ." O (testigo) I20 19.0

En la g~ ifica 15. Se muestra el valumen de sedimentación a una temperatura de 70 O C y tiempos diferentes de secada

u) O 3 L

'E e

E O O

80

70

60

50

40

30

20

10

O

Gráfica 15. Volumen de sedimentación a temperatura de 70 'C y tiempos diferentes

n n n

9 - 9 8 9

70 70 70 20 I

60 45 30 O

Tiempo (minutos) Temperatura("C) 30 80 O (testigo) 20

bráfica 16. Correspondiente a volumen de sedimentacion a temperatura critica por tiempo reducido al secado.

Volumen de sedimentaci6n(T) 8.5 9.0

Gdfica 17. Volumen de Sedimentación, humedad de 20 % y tepentura de 100 ' C en el secado

Tiempo en minutos.

/

/'-

80 -I'

70 1'

/ All/ -- I

I I

O 20 I Sene2 1 9 j I

Tabb 17. Se muestra el volumen de sedimentación a 100°C y un tiempo se secado de 20 minutos a una humedad inicial de I8 Yo.

Tiempo (minutos) I Temperatura (“C) [ Volumen de sedimentación (ml) ->n I100 18.5 ~~ ... -- O (testigo) 120 110.195 1

Tabla 18. Se muestra el volumen de sedimentación a una humedad inicial de 20 % y una temperatura de 40°C a tiempos de secado diferentes.

Tiempo (minutos) I Temperatura ("C) 1 Volumen de sedimentación(ml) $00 I40 19.0

.

._.__ , a l l e m p o 300 ~ 120

;.Temp 40 40

9 j 9

__- I

I ~ vol. De sed ¡

En la gráfica 18. Se muestra como a una humedad de 18% y tiempo de secado de 40 "C el volumen de sedimentación a tiempos de secado diferentes.

i I .

O 20

9 , , 1 :

Gráfica 18. Volumen de Sedimentación adiferentes tiempos

de secado, humedad 20%

.2

, ,

O 1 O0 200 300 400 ~

..". 1 2 I 3

7

Tabla 19.- En la cual se muestra el volumen de sedimentación a una humedad inicial de 20 % y una temperatura de secado de 60 O C a diferentes tiempos de secado.

Tiempo (minutos) I Temperatura ("C) I Volumen de sedimentacibn (ml) I Fn I hn 1 x 5

Gráfica 19. - Volumen de sedimentación a temperatura de 60 "C, humedad inicial de 20 %. A diferentes tiempos de secado.

En la tabla 20. Se muestra el valor de sedimentación a una temperatura de secado de 100 O C y un tiempo de secado de 20 minutos a una humedad inicial de 20 %.

Tiempo (minutos) 20 O (testigo)

Temperatura Vol. De Sedimentación. 1 O0 8.0 20 9.0

.

Gráfica 20. Volumen de Sedimentación a temperatura de 1 O0

"C, 20 %de humedad

1 O0

80 -

60 -

40 -

20 -

0-

0 Vol de Sed a 9

.temp 1 O0 20

OTiempo 20 O

& y grafica de volumen medio de sediemtacian a -da -mturas de secada y humedad inicial de 18 %.

-aw de y vafica de volumen medio de sedimcntacion a de secado y huemdad inicial de 18 %. fir&-

* -ab@ -hda y gra&s & vcdumen medio de sedimcntacion a *=rdes ríhs\pos de secada y incial d 20 Y'.

. Tabla de m h d o s y gafica de wtumen medio de dmentacion a dife* tes tíQeirphr y t&tnpscoturas, huntcdad inicial da x) %.

!.

Análisis de Estadktico.

Se realizo un análisis de varianza el cual nos mostró que para la variable dependiente “Sedimentación” el modelo de elección es altamente significativo. Registrando un valor de F=24.2 I , y un a=O.OOO I , con un R’= 0.91 I O . Asi mismo para las variables independientes como fueron: Tiempo, temperatura resulto ser altamente significativo dicho análisis para dichas variables de respuesta. Con un valor de F = 21.95 para el tiempo y un a= 0.0001, para la temperatura un valor de F= 46.12 y un a= 0.0001, En seguida se tiene el análisis de las medias para cada una de las diferentes temperaturas utilizadas para el el tratamiento termico en le secado del grano de trigo.

Tabla 21. En Ius contiene los resultados de las medias de-sedimentación a diferentes temperaturas a una humedad inicial de 18 %.

.

6rifica 21. En la se muestra el valor de la medias de sedimentacion a diferentes temperaturas de secado, con una humedad inicial del grano de trigo de 18 Oh.

. Gráfica 21. de Volumen de SedimntwAbn a Faturas

diferentes.

. nMedia (sed) 9.07 8.67 8.67 8 8 9 I - . ___~-__-- I TernDeratura. 40 60 70 80 1 O0 20

Tabla a . 0 En esta tabla se muestra el valor de las medias a tiempos de secado diferentes.

Tiempo (minutos) IIlMedia de sedimentación.

En la gráfica 22.Volumen de Sedimentación medio a tiempos de secado diferentes y una humedad inicial de 18 YO.

Gráfica 22. Media de Volumen de Sedimentación a tiempos diferentes de

secado.

300 $.

Tierrpo en ninutos.

I I I 1 I I I I I I /mMBdiadeSed.! 8 18.5 I 8 I 9 19 1 8 19.21 9 I 9 1 9 19 ! , I I I !

I 2 0 130 40 160 I90 1f20l2f0124012701360~ O I , I /E Tiempo

-

,

I I I

Tabla 23. Esta tabla muestra los valores medios de la sedimentación a temperaturas diferentes, humedad inicial de 20 %.

Temperatura ("C) 40 60 1 O0 20

Media de sedimentación. 9 8.75 8.0 9.0

.

Grdfica 23. Volumen medio de Sedimentación a temperaturas diferentes de secado, una humedad inicial de 20%

Gráfica 23. de Volumen de Sedimentwióin a diferentes

temperaturas

100-

Temp ("C)

Tabla 24 . Esta tabla incluye los valores medios del volumen de sedimentación a tiempos de secado diferentes y humedad inicial de 20 %.

~~

120 9 I50 8.5 300 9 O 9.0

Tiempo (minutos) 20 I8

I Media de sedimentación.

.

:.Tiempo ~ 0 Media de MI. De Sed.

Gráfica 24. Medias de valor de Sedimentación a tiempos de secado diferentes y una humedad inicial de 70 %

l ! 1 2 1 3 4

20 120 150 300 O / ! I

! !

8 9 8.5 9 9

Gráfica 24. Media de Volumen de Sedimentación a diferentes tiempos de Secado.

i

O 200 loo Temp en (‘C) 300 I

Tabla 25. La tabla muestra los tiempos y temperaturas a las cuales fueron sometidas las muestras de trigo, asi como el respectivo valor de la media de sedimentación a una humedad de 20 %.

IZO 40 9 120 60 9 .I 50 60 8.5 300 40 9 O 70 9

Tiempo (minutos) 20 I100 18

1 Temperatura ("C ) I Media de vol. De sedimentación.

e

20%.

Grráfica 25. Madies de volumen de Sedimentación a tiempos y tempemWm difPrentes.

120

1 O0

80

60

40

20

O

350

300

250

200

150

1 O0

50

O

rs B a

'5 C

C o O n

F

... -MadhdeVol. Dew. 1 8 : 9 9 i 8 . 5 1 9 ' 9 :

-+-- ~ 2 0 ' t 1 0 , 1 2 0 / 1 M ' 3 W i o j mTcrrp. ra iura , 1 0 0 : 4 0 ' 60 I 6 0 1 40 20 _- .

. . ' I

ELECTROFORESIS.

.

Q FiGURAS DE 1 HASTA LA 8. LAS CUALES MUESTRAN LOS GELES DE POLIACRIALMIDA LAS BANDAS DE SEPARACION DE LAS PROTEINAS QUE FUERON SEPARADAS EN EL GEL, POR ELECTROFORESIS. EN LAS MUESTRAS DE HARINA QUE FUERON OBTENIDAS DE LA MOLIENDA DE GARNOS DE TRIGO DE LA VARIEDAD OASIS SECADOS ARTIFICIALMENTE POR LECHO FLUIOIFICADO A DIFERENTES TIEMPOS Y TEMPERATURAS Y HUEMEDAD INICIAL DE 18 Y 20 %.

Electrof oresis.

En csta etapa del proyecto de investigacion se obtuvieron los geles de poliacrilamida. de cada una de las corridas de las diferentes muestras de proteina soluble en cloruro de sodio al 1 ?'o previaniente obteiiida de las iiiuestrns de liarina .que Lie extra.jo de los granos de trigo secados a temperaturas tales como: 40 'C. GO'C.70 ' C. SO" C Y IO0 ;C. a tiempos de secado diferentes como fueron : ?O. jO, 45. GO. 170. 150, 240. 270. 300. 300 iiiinutos. Los rejultados obtsiiidos en esti1 primera etapa de sstudio correspondio a tener la rrprodiicibi1id;id de los resultados. asi tai i ibi in Ilegr a establecer una estandarizaciún de la t6cnicn de electroforcsis. cn iina seg?iiida ?tapa de anilisis se podri identificar las proteiiias que fueron sepradas por eiectroforcsis 211 c.~d.~ 11110 de los &s. por imrdio 'lei uso de 1111 densitometro. para estimar los pesos nioleculilres de las dif?rei~tes bandas iiiustradiis :II cada uno de los carriles que iiitegaii cada gel como se inuestra en Ins siguientes iigiirlis.

Figura I .O: Gel-poliacrilamida en muestras de harina de trigo. La proteina fue solubilizada en Cloruro de sodio al 1%. utilizando mercaptoetanol como medio desnaturaliwnte durante la técnica La distribuciún del montaje de las muestras es como se menciona a continuación.

A= Temperatura de secado 40 "C. por 5 horns y humedad inicial de ?O %. B= Teinprratiira de secado 40 'C. por 4 horas y humedad inicial de 20 %. C= Temperatura de secado 40 "C. por 330 horas y humedad inicinl de 20 %. D= Temperatura de secado (nulo). Sin tratamiento. E= Albúmina(O.l75 mc/ml). F= Marcador de Dalton de pesos moltculares (1.68 mgmi ). G= Temperatura de secado 40 OC. por 4. 30 horas, humedad inicial 18 %. H= Temperatura de secado 40 T. por 3.30 horas, humedad inicial 18%.

Y O

A ' B ' C ' D ' E ' F ' G "

Figura 2.0. Gel-poliacrilamida. En muestras de harina secadas a diferentes tiempos y temperaturas. L a proteina de dichas muestras se extrajo por solubilimción de estas en medio salino (NaCI al 2%). Las muestras de proteina soluble fueron calentandas con mercaptoetanol. La distribución de las muestras en cada uno de los carriles del gel se muestran a continuación.

A' = Temperatura de secado 40 "C. por 5 horas y humedad inicial de 20 %. B' = Temperatura de secado 40 "C. por 4 horas y humedad inicial de 20 %. C' = Temperatura de secado 40 "C. por 3.30 hons y humedad inicial de 20 % D' =Temperatura de secado (nulo), Sin tratamiento. E = Albúmina(0.172 mg/ml). F' = Marcador de Dalton de pesos moleculares (I 6 8 mg/ml ). G' =Temperatura de secado 40 OC, por 4. 30 horas, humedad inicial 18 %. H' = Temperatura de secado 40 O C , por 3.30 horas, humedad inicial 18%.

m * * - - .I**-?-

Figura 3 O Gel-poliacrialmidq en muestras de harina secadas a diferentes tiempos y temperaturas. LJ proteina fue extraida por solubilirnción de esta en medio salina y la proteina soluble fue tratada con mercaptoetanol. La distribución de las muestras en e l pl se muestra a continuación.

A= Temperatura de secado GO "C. por 2.30 horas. humedad inicial de 18 %. E= Temperatura de secado 60 "C, por 2.30 horas, hwn«bd inicial de 20 %. C= Temperatura de sewdo 60 "C. por 2.00 horas. humddd inicial de 20 %. D= Sin tratamiento muestra control. E= Albúmina(0.175 inghl). F= Marcador de Dalton de pesos moleculares (1.68 mgíml). G= Temperatura de secado 60 'C. por I .30 horas, humcaad inicial de I 8 %. H= Temperatun de secado 60 "C, por I .O how , humdad inicial de 18 %.

I i

.

# e C D E F G H

Figura 4.0. Gel-poliacrilamida. En muestras de proteina soluble en cloruro de sodio y tratadas con inercaptoetanol. La distribución de las muestras montadas en el gel se muestran a continuación.

A'= Temperatura de secado GO "C. por 2.30 horas, humedad inicial de 18 %. B'= Teniperatura de secado GO "C. por 2.30 horas, humedad inicial de 20 %. C'= Temperatura de secado GO "C. por 2.00 horas. humedad inicial de 20 %. D'= Sin tratamiento muestra control. E'= Albúmina (0.173 mg/ml). F'= Marcador de Dalton de pesos moleculares (1.68 mc/ml). G'= Temperatura de secado GO "C. por 1.30 horn, humedad inicial de 18 Oh. H'= Temperatura de secado GO O C . por 1.0 horas, humedad inicial de 18 %.

Figura 5 O Gel-Poliacrialmida. De muestras de proteina soluble en cloruro de sodio de harina extraida de trigo que fue harudo a diferenres tiempos y rempentum . Las muestras de proteina fueron tratadas con mercaptoetanol. La distribución de las muestras en cada uno de los canales se muestra a continuación

A= Temperatura de secado 70 "C. por 30 minutos, humedad inicial 18 Yo. B= Temperatun de secado 80 "C. por 30 minutos. humedad inicial 18%. C= Sin tratamiento (muestra control). D= Albúmina 0.175 mgh l . E= Marcador de Dalton para pesos mol6wkc.s 1.68 mg/ml. F= Tempentun de secado de Io0 OC, por 20 mkfttw, humtdhd de I 8 %. G= Temperatura de secado 100 OC. por 20 minutos, humedsd de 20 Oh. H= Temperatura de secado I O0 "C, por 30 minutos. humedad inicial I8 'h.

.

A ' B ' C ' D ' E ' F ' G H

Figura 6.0. Gel- poliacrilamida. en muestras de harina obtenidas de trigo sometiadas a un secado artificial a diferentes tiempos y temperaturas, La proteina se extrajo por solubilidad de estas en cloruro de sodio al 2% y esta protejna soluble fueron tratadas con mercaptoetanol. La distribución de las muestras se niuestra a continuación.

A'= Temperatura de secado 70 "C. por 30 minutos. humedad inicial 18 %. B'= Temperatura de secado 80 'C. por 30 minutos. humedad inicial 18%. C'= Sin tratamiento (muestra control), D'= Albiiinina 0.175 mg/ml. E'= Marcador de Dalton para pesos moleculares I .68 mg/ml. F'= Temperatura de secado de 100 "C. por 20 minutos. humedad de 18 %. G'= Temperatura de secado 100 "C. por 70 minutos, humedad de 20 %. H'= Temperatura de secado 100 T. por 30 minutos, humedad inicial I S %

.

Figura 7 Gel-Poliacrilamida, en muestras de harina obtenidas de trigo sometidas a un secado artificial a diferentes tiempos y temperaturas. La proteina se extrajo por solubilizacion de estas e11 solucioii de cloruro de sodio al 2% y una ves extraida dicha proteiiia fue tratada con iiiercaptoetanol. La distribucion de las muestras se muestra a continuacioii.

\ = Temperatura de secado de 40 "C, por 360 minutos, humedad inicial 18 % B = Temperatura de secado de 40 OC, por 12Qminutor. humedad inicial I8 % C = Sin tratamiento (Control) D= Albuinina0.175 mg/ml. E= Marcador de pesos moleculares 1.68 mg/mi. F= Temperatura de secado 60° C, por I Z O r n i ~ , humedad inicial 18%. C = Temperatura de secado de 70 O C. por 45 mimrtas, httrncdsd ¡fliC¡d 18 %.

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A' E C D' E' F ' 6'.

Figura 8. Gel-Poliacrilamida. en muestras de liarina obtenidas de trigo sometidas a un secado artificial a diferentes tiempos y temperaturas. La proteina se extrajo por solubilizacion de estas eii solucioii de cloruro de sodio al 2% y una ves extraida dicha proteina fue tratada con inercaptoetanol. La distribucion de las muestras se muestra a contiiiuacion.

A' = Temperatura de secado de 40 "C. por 360 minutos, humedad inicial 18 % B' = Temperatura de secado de 40 T, por 120 minutos, humedad inicial 18 % C' = Sin tratamiento (Control). D'= Albumiiia 0.175 mghni. E'= Marcador de pesos inoleculares I .68 mg/ml. F'= Temperatura de secado 60 o C. por 120 minutos, humedad inicial 18%. G' = Temperatura de secado de 70 o C, por 45 minutos, humedad inicial I8 %.

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Objetivos y metas alcanzados.

Se detemino el daño del gluten del trigo de la variedad OASIS, mediante la aplicacion de las tecnicas de Bradford y Sedimentacion, al ser aplicadas a las muestras de analisis, y tener su reproducibilidad en los datos, as¡ tambien se logro comparar estas dos pruebas y efectivamente dichas pruebas coinciden en sus resultados, al mosirarnos que al utilizar temperaturas de secado en el grano de trigo de 100 O C , por tiempos reducidos de 20 y 30 minutos . a una humedad inicial de 18 y 20 % respectivamente, nos arrojaron los menores valores para la concentracion de la proteina soluble en el caso de la prueba de Bradford y un menor volumen de sediemnatcion para la prueba de sedimenatcion segun Zelenyt, sin embargo ambas pruebas no se pueden considerar 100 % Jusgadas como pruebas para medir el grado de daño de la proteina en la harina de trigo, ya que es necesario realiar una mayor participacion de muestras de analisis, as¡ mismo la prueba de Sedimentacion se considera aun menoz eficaz en este caso de nuestro estudio por mostrar valores de sedimentacion muy bajos con respecto a los reportados por Zeleny, y se jusgaria la variedad Oasis como de calidad inferior por su cantidad de proteina, lo cual no es justificable, ya que dicha variedad es fuerte y por lo tanto se esperaria que tuviera una mayor proporcion de proteina y por consiguiente y un valor de sediemantacion mas aceptable. Sin embargo con los datos que se trenen se puede decir que se recomienda que se utilicen temperaturas de secado inefriores de 80 "C por tiempos moderados, para evitar el daño al gluten y con ello dismnuir la calidad panadera. En la prueba de elctroforesis, se logro establecer la tecnica, aplicarla y reproducir la obtencion de los geles de poliacrilamida, en dicha tecnica no se identificaron las bandas de separacion correspondientes a las proteinas separadas en dichos gel, por lo tanto no se logro identificar el daño de la proteina por el tratamiento termico por el secado artifial de lecho flidificado. Mediante electroforesis , al no identificar los pesos moleculres de las bandas encontradas en los diferentes geles. Este ultimo analisis se realizara en una segunda etapa de estudio mediante el uso de un densitometro, para ayudar aidentificar los pesos moleculares de las proteinas, en el cual se podra dar un resultado confiable acerca del daño que sufren las proteínas al ser tratadas termicamente durante un secado artificail, as¡ establecer las mejores condicones de esta operacion, que permita guardar el grano una ves secado artifialmente en el alamacen, evitando que el gluten de la harina de trigo sufra daños indeceables.

Objetivos y metas alcanzadas.

. Se determino el daño del gluten del trigo de la variedad OASIS, mediante la aplicación de las técnicas de Bradford y Sedimentación, al ser aplicadas a las muestras de análisis, y tener su reproducibilidad en los datos, así también se logro comparar estas dos pruebas y efectivamente dichas pruebas coinciden en sus resultados, al mostramos que al utilizar temperaturas de secado en el grano de trigo de 100 "C , por tiempos reducidos de 20 y 30 minutos, a una humedad inicial de 18 y 20 YO respectivamente, nos arrojaron los menores valores para la concentración de la proteina soluble en el caso de la prueba de Bradford y un menor volumen de sedimentación para la prueba de sedimentación según Zelenyt, sin embargo ambas pruebas no se pueden considerar 100 % jusgadas como pruebas para medir el grado de daño de la proteína en la harina de trigo, ya que es necesario realizar una mayor participación de muestras de análisis, as¡ mismo la prueba de Sedimentación se considera aun menos eficaz en este caso de nuestro estudio por mostrar valores de sedimentación muy bajos con respecto a los reportados por Zeleny, y se jusgaria la variedad Oasis como de calidad inferior por su cantidad de proteína, lo cual no es justificable, ya que dicha variedad es fuerte y por lo tanto se esperaría que tuviera una mayor proporción de proteína y por consiguiente y un valor de sedimentación mas aceptable. Sin embargo con los datos que se tienen se puede decir que se recomienda que se utilicen temperaturas de secado inferiores de 80 "C por tiempos moderados, para evitar el daño al gluten y con ello disminuir la calidad panadera. En la prueba de elctroforesis, se logro establecer la técnica, aplicarla y reproducir la obtención de los geles de poliacrilamida, en dicha técnica no se identificaron las bandas de separación correspondientes a las proteínas separadas en dichos gel, por lo tanto no se logro identificar el daño de la proteína por el tratamiento térmico por el secado artificial de lecho fluidificado. Mediante electroforesis , al no identificar los pesos moleculares de las bandas encontradas en los diferentes geles. Este ultimo análisis se realizara en una segunda etapa de estudio mediante el uso de un densitometro, para ayudar a identificar los pesos moleculares de las proteinas, en el cual se podrá dar un resultado confiable acerca del daño que sufren las proteínas al ser tratadas termicamente durante un secado artificial, así establecer las mejores condiciones de esta operación, que permita guardar el grano una ves secado artificialmente en el almacen, evitando que el gluten de la harina de trigo sufra daiios indeseables.

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Sedimentación.

En las tablas 13-20. asi como en sus respectivas gráficas se puede observar el comportamiento que tienen las proteínas del gluten de absorber agua en un medio ácido (Solución de ticido láctico) en un tiempo determinado, tras haber previamente sometido a un tratamiento térmico, al secar el trigo fuerte de la variedad "oasis", artificialmente por lecho fluidificado a diferentes tiempos y temperaturas. En dichas tablas se registran los volumenes de sedimentación de las muestras agrupadas en tiempos de secado diferentes y una misma temperatura en cada grupo, la separación se realizó en temperatura de 40, 60, 70, 80, y 100 "C. Se observa en dichos gráficos ,para una misma temperatura, variando los tiempos de secado no hay un cambio significativo en el valor del volumen de sedimentación en (mi), para estos p p o s de estudio.. Es importante mencionar que para temperatura de 80 y 100 "C , para 30 y 20 minutos respectivamente se obtuvieron los valores más bajos de sedimentación comparando con el resto de las muestra y el testigo. Para este proyecto de estudio, no podemos considerar, la prueba de sedimentación según Zeleny, como una medida, para estimar la calidad panadera de la harina, ya que datos proporcionados por investigadores sobre la prueba registran un volumen de sedimentación en (mi) de 20 para las harinas de trigos débiles , y más de 55 8ml) para harinas de trigo fuerte (Zeleny). Para nuestro caso de estudio se trabajo con la variedad "oasis", considerada como fuerte, para la cual obtuvimos valores de volumen d sedimentación en (mi) de 8.0 y 9.0. Por lo no podemos juzgar la pnteba de sedimentación en nuestro estudio, como un índice para estimar la cantidad de proteina y por lo tanto la calidad de la harina. En el análisis estadístico, resulto ser altamente significativo para la variable dependiente: volumen de sedimentación con respecto a sus variables de respuesta : tiempo, temperatura y humedad al aplicar un análisis de varinaza. Asi mismo se aplicó la prueba de Tukey para obtener el valor medio de los volumenes de sedimentación, dichos datos se muestran en las tablas 21-25, así como en sus respectivas gráficas. En la tabla 21 y 23 se nota claramente, como a medida que se incrementa la temperatura de secado, el valor medio del volumen de sedimentación es menor al compararlo con temperaturas inferiores de 40 y la muestra'testigo.

En la gráfica 22 y 24, se observa como al evaluar solamente las medias de sedimentación con el tiempo de secado , la condición puede ser engañosa, se tiene que a menor tiempo el daño a la proteina es mayor, lo cual no resultaría muy lógico, por lo que en este caso para establecer un juicio se necesitada tener más variables de comparación. En la tabla 25, en la cual se muestra tiempos y temperaturas de secado, se puede establecer que a menor tiempo de secado y mayor temperatura el daño a la proteina por desnaturalización es mayor, Comparando con el valor medio de sedimentación obtenido para el testigo, que registró el mismo valor que para las muestras tratadas a 40 y 60 "C. Por lo que a estas dos ultimas condiciones no puede tener la certeza que las proteínas no pierden la habilidad de absorción de agua.

Prueba de Eiectroforesis.

En esta etapa del proyecto se obtuvieron los geles de cada una de las corridas de las diferentes muestras de harina, extraídas de los granos de trigo que fueron sometidos a un tratamiento térmico al aplicarle el secado por lecho fludifaado a tiempos y temperaiuras diferentes, como se mencionó anteriormente en las pruebas anteriores. Los resultados obtenidos en esta primera etapa de investigación, para la prueba de lectroforesis, fue el de obtener una reproducibilidad de los resuludm (corridas de las muestras , separación de las bandas en los geles de poliacrialmida), así mismo Ikgw a establecer una estandarización de la t6cnica. para en una segunda etapa poder identificar cada una de las bandas Kparadap, que corresponde a protebas, sometidas a desnaturalización en una primera erapa cuando ncibiron el üaiamisnto térmico los granos de trigo, y posteriormente en la aplicación de la t6cnica se le adicion6 mercaptoatanol que es un agente reductor desnaturalizante, además de aplicar calor a las muestras por 5 minutos para aseguras la desnaturalización de

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las proteinas solubles en cloruro de sodio. Para la identificaci6n de las proteinas separadas en los geles , se colocó proteina patrón como fue la albúmina , además del marcador de pesos moleculares “indicador de Dalton”. El cual contiene las siguientes proteínas: L463 ILysozyme, Egg White 14,300, L47756 B- Lactoglobulin Bovine Milk, 18, 400, T901 I Trypsinogen, Bovine Pancreas, PMS Treated 24,00, PI 143Pepsim. Porcine Stomach Mucosa 34.700, A7642 Albumin, Egg (Ovalbum) 45,000, A7517 Albumin. Bovine Plasma 66,000. Ademb del uso de un desnsitometro que es un aparato que garantiza obtener datos mis acertados. Las pruebas al igual que en el restos de las pruebas de estudio se aplicaron por duplicado, en las figuras de I - 6, con respectivas repeticiones se pueden observar las condicones a las cuales fueron tratadas las diferentes muestras a las que se les aplico la técnica de electroforesis. Se sabe la solublilidad de las proteinas decrece conforme aumenta el tiempo de secado, la pérdida de la solubilidad se debe a las reacciones de intercambio entre los enlaces sulfidrilo y disulfuro. En las muestras tratadas con mercaptoetanol se observó en decremento en la fracci6n de gluten principalmente como concsecuencia del secado. Por lo que se pierde calidad panadera ante las proteínas afectadas del gluten (C.E. LUPANO). Se espera determinar resultados parecidos cuando se identifiquen las proteinas que se llegaron a dañar por el secado artificial de lecho fluidficacdoen el grano de trigo (Triticum aestivum ) de la variedad fuerte “Oasis”.

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Conclusión.

De acuerdo a los diferentes resultados obtenidos en las pruebas de análisis como son: Prueba de Bradford, prueba de sedimentación de Zeleny y la prueba de electroforesis, las cuales se realizaron en el proyecto de investigación “EFECTO DEL TRATAMIENTO TERMICO DEL TRIGO SOBRE LAS PROPIEDADES DEL GLUTEN “_ En el caso de la prueba de Bradford se concluye que la perdida de la solubilidad de las proteinas en el trigo dafiado por tratamiento thnico, fue más notable utilizando temperatura de 100 “C y un tiempo de 20 minutos, con una humedad inicial de 18 %, obteniendose una concentración de proteina soluble de 6.82 ug/mg de muestra, y para las mismas condiciones de tratamiento y una humedad de 20 % se tuvo una concentración de proteína soluble de 7.41 p g h g de muestra, de acuerdo al análisis de resultados que se realizó estos valores de la concentración de proteina soluble fueron los más bajos , comparados con los datos registrados para otras condiciones de tiempo y temperatura de secado del grano de trigo, en el resto de las muestra se tienen val0re.s que fluctúan entre 9.29 y 10.29 pg/mg de muestra, por tal motivo no es recomendable utilizar temperaturas de secado críticas, ya que esto provoca daño a la proteína al ir perdiendo la propiedad de solubilidad de las proteinas del gluten y con ello se reduce la calidad panadera(Da1e Every). La prueba de Sedimentación de Zeleny , para este análisis efectuado nos proporcionó datos de volumen de sedimentación bajos entre 8.0 y 10.0 mi. comparados con los obtenidos por Zeleny registrando valores promedio entre 39.12 y 52.2 ml, estos datos están reportados para harinas fuertes, a sí mismo (a variedad “oasis” que se utilizó para nuestro estudio también es considerada una variedad fuerte, por lo tanto con mayor cantidad de proteina y por lo tanto se esperarian valores de volumen de sedimentación mayores. Por tal motivo estos resultados obtenidos no nos proporcionan suficiente evidencia sobre la pérdida de la habilidad de las proteinas del gluten de absorber agua y de esta forma dar valores de volumen de sedimentación de acuerdo a determinadas condiciones de tratamiento térmico y asi juzgar el daiio que pudiera provocar dicho tratamiento. Sin embargo al analizar los resultados se tienen menores volumenes de sedimentación cuando el tratamiento termico fue de 80 OC , por 30 minutos y temperatura de 100 ‘C por 20 minutos , registrando volumen de sedimentación medio de 8.0 ml y para el resto de los tratamientos el valor medio de sedimentación fue de 9.0 ml, por ello podemos decir que si se vio afectada la propiedad de las proteinas de hidratación, aunque dichos resultados no se puedan comparar coo los proporcionados por otros investigadores. En la prueba de electroforesis como se menciono anteriormente es una etapa primaria de estudio, para la obtención de los geles-poliacnlamida de las diferentes muestras obtenidas de los tratamientos térmicos a diferentes tiempos como fueron: 20, 30,45,60,90.120,150,210,240,270 , 300 y 360. A diferentes temperaturas como fueron: 40, 60, 70, 80 y IO0 “C, en la variedad de trigo “Oasis”. En esta etapa no se determino el peso molecular de las diferentes proteinas separadas mediante la electroforesis, ya que dicha determinación se realizará en una segunda etapa de estudio. Se sabe que la proteína soluble en cloruro de sodio decrece cuando el tiempo de calentamiento aumenta a una temperatura crítica, por lo que se esperaria obtener menor número de bandas en las muestras que fueron sometidas a un tiempo moderado y una temperatura critica (M. F. Jeanjean R.). AI utiliuv el mercaptoetanol que es un agente reductor el cual cambia la estructura tridimensional de la proteina, lo cual nos permitirá una mejor desnaturalización de las proteinas y así poder tener una mejor separación de las sub unidades de las proteinas, se tienen menor números de bandas en los gel-poliacnlamida que fueron obtenidos de muestras tratadas a temperatura de 100” C y tiempo reducido. La tecnica de electroforesis es simple, rápida y altamente sensible, sin embargo se debe manejar con precaución ya que la mayoria de los reactivos utilizados son altamente tóxicos. Así también se debe tener un lugar especial para guardar los geles mientras estos no se utilicen, ya que se deshidratan y se vuelven quebradizos. Una parte importante de la electroforesis es contar con un densitometro que nos permita realizar lecturas mas certeras,

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