VALIDASI METODE IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR TADALAFIL DALAM
SEDIAAN PERMEN KARET CINTASECARA KLT-DENSITOMETRI
Angela Diana Dhuy Nyaga1,*, Henry Kurnia Setiawan1, Senny Yesery
Esar11Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya*Correspondence :
085283535375., [email protected]
Abstrak
Sebuah metode kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri yang
sederhana dan sensitif telah dikembangkan untuk identifikasi dan
penetapan kadar tadalafil dalam sediaan permen karet cinta. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk memvalidasi metode yang akan
digunakan dalam penelitian terkait identifikasi dan penetapan kadar
tadalafil tersebut. Tadalafil dieluasi pada fase diam silika gel 60
GF254 dan fase gerak campuran kloroform : metanol : asam asetat
glasial (70:3:0,2 v/v) sehingga memperoleh harga Rf dan Rs (0,53
dan 5,71) pada panjang gelombang 286 nm. Hasil dari validasi metode
yang dilakukan adalah sebagai berikut, Uji linearitas menunjukkan
korelasi yang linear dimana r hitung (0,998) > r tabel (0,878).
Dari uji akurasi diperoleh nilai % recovery rata-rata secara
berurutan 99,86; 99,66; dan 99,53 (%) pada konsentrasi 25, 50 dan
75 (ppm). Terkait uji presisi nilai KV dari masing-masing
konsentrasi adalah 3,315; 2,779 dan 1,316 %, 5%. Untuk uji LOD dan
LOQ yang diperoleh masing-masingnya adalah 1,339 g/ml dan 4,464
g/ml. Kesimpulan metode ini dapat digunakan untuk identifikasi dan
penetapan kadar tadalafil dalam permen karet cinta karena memiliki
akurasi dan presisi yang baik sera sensitifitas yang baik.
Kata kunci : Validasi Metode, Tadalafil, Permen Karet Cinta,
KLT-Densitometri
TLC-DENSITOMETRY METHOD VALIDATION OF IDENTIFICATION AND ASSAY
OF TADALAFIL IN LOVE CHEWING GUM
Abstrack
A simple and sensitive thin layer chromatography (TLC)
densitometry method has been developed for identification and assay
of tadalafil in love chewing gum. The aim of this research is to
validate the method used in the identification and assay of the
tadalafil. Tadalafil was eluated on silica gel 60 GF254 and mobile
phase mixture of chloroform: methanol: glacial acetic acid
(70:3:0.2 v/v), to obtain Rf and Rs (0.53 and 5.71); at wavelength
of 286 nm. The results of the validation method showed a linear
correlation where r value (0.998)> r table (0.878), The test of
accuracy obtain the % recoveryaverage 99.86; 99.66; and 99.53 (%)
on the consentration 25, 50 and 75 (ppm). The precision test has a
variation each concentration of 3.315; 2.779 and 1.316%, 5%. For
the limit of detection and limit of quantification for Tadalafil
were found to be 1.339 g/ml and 4.464 g/ml, respectively. For the
conclusion TLC method can be used for the identification and assay
of tadalafil in love chewing gum because it has good accuracy and
precision.
Keywords: Validation Methods, Tadalafil, Love Chewing Gum,
TLC-densitometry
PENDAHULUAN Berita mengenai bahaya dan keresahan dari masyarakat
terkait beredarnya permen karet cinta membuat beberapa laboratorium
mengadakan penelitian untuk mengidentifikasi senyawa apa yang
terkandung dalam permen peningkat libido. Salah satu laboratorium
dari universitas di Surabaya telah dilaporkan mengadakan penelitian
untuk identifikasi bahan aktif di dalam permen cinta menggunakan
metode kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri dan hasilnya
negatif dimana tidak menunjukan adanya kandungan bahan penyusun
Viagra yakni Sildenafil Sitrat, Tadalafil maupun Verdenafil HCl
(Surabaya Tribun.com, 9 Februari 2013). Selain laboratorium
tersebut sebuah Laboratorium swasta di Indonesia telah berhasil
mengidentifikasi dan menganalisis kandungan tadalafil di dalam
sediaan permen karet cinta tersebut dengan menggunakan metode LC-MS
sehingga memperoleh hasil yang menyatakan bahwa zat berkhasiat yang
terdapat dalam permen karet cinta tersebut adalah tadalafil 5,4 mg
dan Sildenafil sitrat 27,4 mg (Redaksi, Februari 2013). Terkait
penelitian sebelumnya yang memiliki hasil yang berbeda maka perlu
diadakan penelitian lebih lanjut untuk memastikan senyawa apakah
yang terkandung di dalam permen karet cinta tersebut. Beberapa
penelitian yang telah dilakukan yakni Patel and Natvarlal (2011)
melakukan analisis terhadap sediaan farmasetik tadalafil
menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi,
Setiawan, et al (2011) melakukan analisis terhadap tadalafil dalam
sediaan jamu kuat secara KLT-Densitometri. Setiawan, et al (2012)
melakukan analisis tadalafil dalam kopi greng dan minuman herbal
peningkat vitalitas dengan metode KLT. Tadalafil merupakan salah
satu bahan kimia obat berkhasiat untuk meningkatkan libido pada
pria. Dalam dunia medis dan pengobatan Tadalafil adalah suatu
senyawa yang selektif, dan merupakan inhibitor reversibel dari
Phospodiester tipe 5 yang digunakan sebagai terapi oral untuk
disfungsi ereksi (Giuliano,F and L,Varanese., 2002). Tadalafil
meningkatkan fungsi ereksi yakni dengan cara meningkatkan jumlah
cGMP (Thomas, 2000). Penggunaan tadalafil seharusnya di bawah
pengawasan dokter dan berdasarkan resep dokter. Dalam terapi
disfungsi ereksi dosis yang biasanya digunakan yakni tadalafil
diberikan secara oral dengan dosis 10-20 mg dan digunakan minimal
30 menit sebelum melakukan hubungan seksual (Martindale 36th ed,
2009). Tadalafil dibatasi karena banyak menimbulkan efek samping
yang merugikan seperti sakit kepala, muka memerah, pusing, gangguan
pencernaan, insomnia, vertigo, hidung berdarah, demam, anemia,
mual, nyeri perut, gangguan penglihatan, gangguan otot jantung,
nyeri dada, jantung berdebar dan kematian (Martindale 36thed,
2009).Untuk mengetahui Apakah metode KLT-densitometri dapat
digunakan secara tepat dan teliti untuk identifikasi dan penetapan
kadar Tadalafil dalam sediaan permen karet cinta merek A,B dan C
yang beredar di pasaran maka perlu dilakukan validasi metode
analisis KLT-Densitometri dalam mengidentifikasi dan menetapkan
kadar tadalafil dalam sediaan permen karet cinta merek A,B dan C
yang beredar di pasaran.
METODE PENELITIANAlatAlat yang digunakan dalam penelitian adalah
TLC scaner (Camag), chamber, pipa kapiler berbagai volume,
mikropipet Socorex berbagai volume, timbangan analitik Denver
Instrument M220, vortex, alat fotografi, labu takar berbagai
volume, kertas saring whatmann.Bahan Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini tablet Cialis (tadalafil 20mg), metanol p.a
(E,Merck), asam asetat glasial p.a (E,Merck), amoniak p.a
(E,Merck), kloroform p.a (E,Merck), pelat silika gel 60 GF254
(E,Merck).Tahapan PenelitianPenelitian ini dimulai pada bulan
September hingga Desember 2013 di Fakultas Farmasi Universitas
Katolik Widya Mandala Surabaya.a. penyiapan 1. Formula Matriks
Permen Karet Matriks dalam penelitian adalah permen karet rasa buah
yang beredar di pasaran. Ditimbang matriks sebanyak 1/10 bagian
permen karet (300 mg). Penggunaan matriks didasarkan pada
penelitian terdahulu yang dilakukan oleh laboratorium swasta di
Indonesia yang menyatakan bahwa kandungan tadalafil 5 mg/ permen.2.
Penyiapan Fase GerakPada penelitian ini digunakan tiga macam fase
gerak yaitu campuran (1) Kloroform : Metanol (9:1 v/v); (2)
Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2, v/v); (3)
Kloroform : Metanol : Amoniak pekat (75:2:5 v/v). Masing-masing
campuran tersebut diaduk kemudian dituangkan ke dalam chamber dan
didiamkan selama 30 menit hingga jenuh.3. Larutan Baku Induk
Tadalafil dalam Metanol Tablet cialis digerus halus kemudian
ditimbang dengan teliti setara dengan 5 mg tadalafil, dilarutkan
dalam 10,0 ml metanol (500 ppm). 4. Larutan Matriks dalam
MetanolDitimbang matriks sebanyak 1/10 bagian (300 mg). Kemudian
diekstraksi dengan 4 ml metanol dan divorteks selama 10 menit.
Filtrat diambil dan dimasukkan labu ukur 10,0 ml. Ekstraksi
dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama. Larutan ekstraksi
ditambahkan metanol sampai 10,0 ml.5. Larutan Campuran Bahan Aktif
dan Matriks Ditimbang secara teliti sebanyak 1/10 matriks, kemudian
diekstraksi dengan 4 ml metanol dan divorteks selama 10 menit.
Filtrat diambil dan dimasukkan labu ukur 10,0 ml. ekstraksi
dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama tambahkan 1 ml larutan
baku tadalafil (500 ppm), kemudian ditambah metanol hingga 10,0
ml.
b. Validasi Metode Penetapan Kadar secara KLT-Densitometri1.
Selektivitas Larutan baku induk tadalafil (500 ppm) diencerkan
sebanyak 10 kali untuk memperoleh hasil 50 ppm, larutan matriks
permen karet serta simulasi permen karet cinta yang dibuat dengan
cara mencampurkan matriks dengan bahan aktif tadalafil yang
memiliki konsentrasi 50 ppm. Masing-masing larutan ditotolkan pada
pelat KLT menggunakan pipa kapiler 10 l kemudian dieluasi dengan
menggunakan ketiga fase gerak hingga batas eluasi. Pelat KLT yang
telah dieluasi dikeringkan lalu diamati pada TLC scanner untuk
menentukan panjang gelombang terpilih dan fase gerak yang akan
digunakan.2. Linearitas Dari baku induk (500 ppm) dibuat lima macam
konsentrasi dengan rentang 25-200% dalam metanol. Dipipet 0,125;
0,250; 0,500; 0,750 dan 1 ml kemudian ditambahkan metanol hingga
5,0 ml sehingga diperoleh 5 macam konsentrasi yakni 12,5; 25,0;
50,0; 75,0; dan 100,0 g/ml (ppm). Ditotolkan pada pelat KLT
sebanyak 10 l kemudian dieluasi dengan menggunakan fase gerak
terpilih sampai batas eluasi dengan menggunakan fase gerak
terpilih. Area yang diperoleh didibuat persamaan regresi hubungan
antara konsentrasi dengan area. 3. Ketepatan (Akurasi) dan
Ketelitian (Presisi) matriks dengan bahan aktif dicampurkan pada
konsentrasi 50, 100 dan 150 %. Uji ketepatan dilakukan dengan
menimbang matriks sebanyak 1/10 bagian permen karet (300 mg).
Kemudian diekstraksi dengan menggunakan 4 ml metanol dan divorteks
selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan ke labu takar 10,0
ml. ekstraksi dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama lalu
ditambahkan dan ditambahkan dengan 0,5 ml (50%); 1ml (100%) dan 1,5
ml (150%) baku induk tadalafil. Larutan di tambahkan metanol hingga
10,0 ml. Larutan ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler
10 l, dieluasi dengan fase gerak terpilih sampai batas eluasi. Pada
pelat KLT yang telah dieluasi dikeringkan lalu diamati menggunakan
TLC scanner. Luas area dan profil spektra noda diukur dengan
menggunakan densitometer pada panjang gelombang terpilih.
Pengerjaan dilakukan replikasi 3 kali dengan 3 macam konsentrasi.
Ketepatan dihitung dari persen perolehan kembali (% recovery).
Ketelitian dapat diukur sebagai simpangan baku (SD) atau koefisien
variasi (KV).4. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)Untuk
uji LOD dan LOQ dibuat suatu kurva baku pada rentang 5 macam
konsentrasi. Dari baku induk (500 ppm) dengan rentang 12-20% dalam
metanol. Dipipet 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 dan 0,10 ml kemudian
ditambahkan metanol hingga 5,0 ml sehingga diperoleh 5 macam
konsentrasi yakni 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; dan 10,0 g/ml (ppm). Larutan
ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 10 l kemudian dieluasi dengan
menggunakan fase gerak terpilih sampai batas eluasi. Pelat KLT yang
telah dieluasi dikeringkan lalu diamati pada TLC scanner pada
panjang gelombang terpilih. Hasilnya dihitung LOD dan LOQnya.
c. Aplikasi Metode Identifikasi dan Penetapan Kadar Tadalafil
dalam Sediaan Permen Karet Cinta Merek A,B dan C yang Beredar di
Pasaran
Permen karet cinta A,B dan C di timbang masing-masing 1/10
bagian permen karet (300 mg) dan diekstraksi dengan 4 ml metanol
kemudian divorteks selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan
ke dalam labu takar 10,0 ml. ekstraksi dilakukan dua kali dengan
metanol 4 ml dengan tahapan yang sama. Larutan ekstraksi
ditambahkan dengan metanol hingga 10,0 ml. Kemudian di totolkan
pada pelat KLT sebanyak 10 l dan dieluasi menggunakan fase gerak
terpilih sampai batas eluasi. Pelat KLT yang telah dieluasi
dikeringkan kemudian diamati dibawah sinar UV. Luas area dan profil
spektra dari noda yang diukur dengan densitometer pada panjang
gelombang terpilih. Hasilnya dihitung persen perolehan kembali (%
recovery).
HASIL DAN PEMBAHASANHasil uji selektivitas menetapkan campuran
Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v) sebagai
fase gerak terpilih pada panjang gelombang 286 nm. Hasil
keterpisahan dan gambar spektrum serapan tadalafil dapat dilihat
pada gambar 1 dan 2. Dasar dari pemilihan fase gerak tersebut
adalah harga Rf, Rs, K dan As yang memenuhi syarat. Hal ini
dikarenakan fase gerak ini bersifat semi polar, dengan indeks
polaritas (4,128) sehingga analit lebih sukar untuk terdistibusi ke
dalam fase gerak dan tertahan pada fase diam, disamping itu
penambahan asam asetat glasial menyebabkan analit yang bersifat
basa lebih sukar terdistribusi dan mengikuti fase gerak, ini
ditunjukkan dengan harga Rf (0,571) dan harga K (0,8867) yang lebih
besar, sehingga pada fase gerak ini antara tadalafil dan matriks
dapat terpisah dengan lebih baik (Rs=5,71), ionisasi sulit terjadi
karena asam yang ditambahkan merupakan asam lemah sehingga noda
yang dihasilkan bagus (tidak tailing) dan harga As yang diperoleh =
1 yang menunjukkan peak berbentuk lonceng.Hasil uji linearitas
menunjukkan metode ini memilki signifikansi yang baik karena
memiliki harga rhitung < rtabel (tabel 1) dan grafik linearitas
dapat dilihat pada gambar 3. Berdasarkan uji ANAVA F hitung 0,7266
< F tabel (4,26). Hal tersebut menunjukan tidak adanya perbedaan
yang bermakna dari masing-masing linearitas yang dilakukan pada
tiga hari yang berbeda. Sehingga untuk perhitungan selanjutnya
dapat digunakan linearitas dari ketiga hari tersebut.Pada uji
akurasi yang tertera pada tabel 2 menunjukan akurasi dari ketiga
macam konsentrasi tersebut memenuhi syarat dimana %recovery
rata-rata berada pada rentang 95-105%. Disamping itu dari uji nilai
t menggunakan metode one sample t test dimana harga t hitung < t
tabel menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna dari ketiga
konsentrasi tersebut sehingga dapat disimpulkan akurasi/ketepatan
yang dimiliki metode ini baik. Hasil uji presisi (tabel 2)
menunjukkan harga KV yang memenuhi syarat 5% (Skoog and West,
1980). Hasil tersebut menunjukan metode ini memiliki variasi yang
kecil sehingga dapat dikatakan metode tersebut memiliki
presisi/ketelitian yang baik. Harga LOD/LOQ yang diperoleh
masing-masingnya adalah 1,339 g/ml dan 4,464 g/ml.. Maka dari itu
apabila sampel memiliki konsentrasi demikian masih bisa terditeksi.
Grafik LOD/LOQ dapat dilihat pada gambar 4.Hasil dari pengujian
terhadap sampel menunjukkan dari ketiga sampel merek A,B dan C
tersebut yang menunjukkan adanya noda adalah sampel A(gambar 4)
sedangkan sampel B dan C tidak menunjukkan adanya noda pada
densitogram. Berdasarkan bentuk spektrum dan panjang gelombang yang
dihasilkan pada scan terhadap noda (gambar 5), dapat disimpulkan
bahwa zat yang diperoleh bukan merupakan tadalafil.
Gambar 1. Pemisahan Tadalafil dengan Matriks menggunakan fase
gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v)
Gambar 2. Hasil scanning pemilihan panjang gelombang tadalafil
menggunakan fase gerak terpilih Kloroform : Metanol : Asam asetat
glasial (70:3:0,2 v/v)
Gambar 3. Grafik Kurva Linearitas Tadalafil pada Tiga Hari yang
Berbeda
Gambar 4. Densitogram Sampel Permen Karet Cinta Merek A
Menggunakan Fase Gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (
70 : 3 : 0,2 v/v )
Keterangan :Noda dari sampelNoda tadalafil
2
1
Gambar 5. Hasil Scanning Spektrum Noda Sampel Merek A Ditumpuk
dengan Spektrum Tadalafil Murni menggunakan fase Gerak Terpilih
Kloroform : Metanol : Asam Asetat Glasial ( 70 : 3 : 0,2 v/v )
Tabel 1. Ringkasan Hasil Perhitungan Regresi Linear Kurva
Linearitas Tadalafil
HariKoefisien Korelasi (r)Persamaan Regresi (y= b.x
+a)IIIIII0,99890,99710,9954Y = 76,547 x + 82,1743Y = 68,789 x +
310,207Y = 73,083 x + 227,566
Tabel 2. Hasil Uji Akurasi dan Presisi
ReplikasiKonsentrasi teoritis (ppm)Luas Area nodaKonsentrasi
sebenarnya (ppm)% recovery% recovey rata-rata SDKVT
hitungIIIIII24,3424,5026,131925,101997,202163,2023,4724,5226,9396,45100,09103,0699,86
% 3,313,31
%0,07IIIIII52,9052,7250,704050,703842,303743,8054,3751,3449,91102,7097,3898,2999,66
% 2,772,78
%0,33IIIIII79,278,6576,055808,705690,305453,8079,9378,2174,75100,9099,4098,2999,53
% 1,311,32 %0,62
KESIMPULAN Berdasarkan hasil analisis data dan interpretasi
penemuan, maka dapat disimpulkan bahwa metode kromatografi lapis
tipis yang digunakan dalam kondisi fase diam silika gel GF254
dengan fase gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial ( 70 :
3 : 0,2 v/v ) dapat digunakan untuk menetapkan kadar tadalafil
dalam sediaan permen karet cinta karena memiliki ketepatan dan
ketelitian yang baik. Setelah dilakukan aplikasi sampel dari ketiga
merek permen karet cinta yang beredar di pasaran dapat disimpulkan
bahwa permen karet cinta merek A,B dan C yang beredar di pasaran
tidak mengandung tadalafil.DAFTAR PUSTAKAGiuliano, F., dan L,
Varanese, 2002, Tadalafil:a novel treatment for erectile
dysfunction, Eur Heart J Supplements, 4, 24-31
Martindale, 2009, The Complete Drug reference, 36nd ed,
Pharmaceutical Press, London, 2196-2197
Patel, S. A., and P. J. Natvanal, 2011, High Performance Thin
Layer Chromatographic Method For Determination Of Tadalafil In
Tablet Dosage Form, American Journal of Pharmtech Recearch, 1(3),
138-146
Redaksi, 2013, Laporan Khas Redaksi: Kandungan Permen Cinta Sama
Dengan Vigra, Trans 7, Jakarta, 14 Februari 2013.
Setiawan, H., S. Esar, E. Sukarti, 2007, Analisis Sildenafil
Sitrat dan Tadalafil Dalam Sediaan Jamu Kuat Pria Secara
KLT-Densitometri, Universitas Widya Mandala, Surabaya.
Setiawan, H., S. Esar, E. Sukarti, 2012, Analisis Sildenafil
Sitrat Dalam Sediaan Jamu Kuat Pria Secara KLT-Densitometri,
Universitas Widya Mandala, Surabaya.
Skoog, D.A., and D. M. West, 1980, Principles of Instrumental
Analysis, Thomson Higher Education, London, 848-851.
Thomas, G., 2000, Medicinal Chemistry, Jhon Wiley & sons,
new York, 456-457
1
5