Imunositokimia Streptavidin Biotin: Deteksi Dini Viral Nervous Necrosis Virus pada Lendir Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus) Immunocytochemistry Streptavidin Biotin: Early Detection of Viral Nervous Necrosis Virus in the mucous of the Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus) Putu Eka Sudaryatma, Artanti Tri Lestari, Ni Luh Sunarsih, Ketut Sri Widiarti, Sulis Nur Hidayah, Didik Srinoto Laboratorium Uji Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan kelas I Denpasar Email: [email protected]Abstract Kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) is one of the kerapu fishes that has been successfully bred by the farmers. The survival rate of the fish reaches up to the 40% at the fish hatchery of the home industry of in Bali. The disease in which may cause significant mortality in kerapu fish, especially for the larvae and juveniles is viral nervous necrosis (VNN). We therefore developed and applied the immunological diagnostic approach of immunocytochemistry technique of streptavidin biotin (SB) for early detection of VNN. Mucous samples of VNN infected- kerapu fish in vivo were firstly detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT- PCR) for the presence of DNA VNN. If it is RT-PCR-positive VNN, the mucous samples were then tested by SB. Results of the present study indicated that the VNN virus could be detected with SB technique within only 24 hours post infection. It was concluded that rapid and accurate SB technique is suitable and appropriate to be applied for routine control and prevention national program in the Fish Quarantine for Indonesia because no need of fish sacrification, and scientific, law and international accepted, and even no hazardous environmental contamination. Keywords: kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus),VNN, mucous, SB, early detection Abstrak Kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) merupakan salah satu diantara ikan kerapu yang berhasil dibudidayakan oleh petani petambak dan tingkat keberhasilan mencapai 40% pada penetasan kerapu industri skala rumah tangga di Bali. Virus viral nervous necrosis (VNN) merupakan penyebab kematian massal ikan kerapu, terutama larva dan juvenil. Pada penelitian ini, dikembangkan dan diaplikasikan uji imunositokimia streptavidin biotin (SB) untuk diagnosis dini VNN. Sampel (lendir) ikan kerapu yang diinfeksi virus VNN in vivo, diuji reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Lendir yang positif DNA VNN dengan RT-PCR, selanjutnya diuji SB. Hasil penelitian ini membuktikan, bahwa virus VNN dapat dideteksi pada lendir ikan kerapu macan tersebut yang terinfeksi virus VNN 24 jam sebelumnya. Disimpulkan, bahwa uji SB yang cepat dan akurat adalah tepat dan cocok untuk diaplikasikan dalam rangka program rutin kontrol dan pencegahan VNN di Karantina Ikan Indonesia karena dapat dilakukan tanpa mematikan ikan, diterima secara ilmiah, hukum dan internasional, dan bahkan tidak mencemari lingkungan hidup. Kata kunci: kerapu macan ((Epinephelus fuscoguttatus),VNN, lendir, SB, diagnosis dini JURNAL SAIN VETERINER ISSN : 0126 - 0421 JS 30 (1), Juli 2012 V 99
14
Embed
JURNAL · mikro, spuit ukuran 1-5 ml, gelas benda, gelas penutup, analitical balance, hot plate, vorteks, thermal blok, patsel, rak tabung mikro, deep freezer, freezer, thermalcycler,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Imunositokimia Streptavidin Biotin: Deteksi Dini Viral Nervous Necrosis Virus pada Lendir Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus)
Immunocytochemistry Streptavidin Biotin: Early Detection of Viral Nervous Necrosis Virus in the mucous of the Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus)
Putu Eka Sudaryatma, Artanti Tri Lestari, Ni Luh Sunarsih, Ketut Sri Widiarti, Sulis Nur Hidayah, Didik Srinoto
Laboratorium UjiBalai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan kelas I Denpasar
Kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) is one of the kerapu fishes that has been successfully bred by the farmers. The survival rate of the fish reaches up to the 40% at the fish hatchery of the home industry of in Bali. The disease in which may cause significant mortality in kerapu fish, especially for the larvae and juveniles is viral nervous necrosis (VNN). We therefore developed and applied the immunological diagnostic approach of immunocytochemistry technique of streptavidin biotin (SB) for early detection of VNN. Mucous samples of VNN infected- kerapu fish in vivo were firstly detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the presence of DNA VNN. If it is RT-PCR-positive VNN, the mucous samples were then tested by SB. Results of the present study indicated that the VNN virus could be detected with SB technique within only 24 hours post infection. It was concluded that rapid and accurate SB technique is suitable and appropriate to be applied for routine control and prevention national program in the Fish Quarantine for Indonesia because no need of fish sacrification, and scientific, law and international accepted, and even no hazardous environmental contamination.
Keywords: kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus),VNN, mucous, SB, early detection
Abstrak
Kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) merupakan salah satu diantara ikan kerapu yang berhasil dibudidayakan oleh petani petambak dan tingkat keberhasilan mencapai 40% pada penetasan kerapu industri skala rumah tangga di Bali. Virus viral nervous necrosis (VNN) merupakan penyebab kematian massal ikan kerapu, terutama larva dan juvenil. Pada penelitian ini, dikembangkan dan diaplikasikan uji imunositokimia streptavidin biotin (SB) untuk diagnosis dini VNN. Sampel (lendir) ikan kerapu yang diinfeksi virus VNN in vivo, diuji reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Lendir yang positif DNA VNN dengan RT-PCR, selanjutnya diuji SB. Hasil penelitian ini membuktikan, bahwa virus VNN dapat dideteksi pada lendir ikan kerapu macan tersebut yang terinfeksi virus VNN 24 jam sebelumnya. Disimpulkan, bahwa uji SB yang cepat dan akurat adalah tepat dan cocok untuk diaplikasikan dalam rangka program rutin kontrol dan pencegahan VNN di Karantina Ikan Indonesia karena dapat dilakukan tanpa mematikan ikan, diterima secara ilmiah, hukum dan internasional, dan bahkan tidak mencemari lingkungan hidup.
Kata kunci: kerapu macan ((Epinephelus fuscoguttatus),VNN, lendir, SB, diagnosis dini
JURNAL SAIN VETERINER
ISSN : 0126 - 0421
JS 30 (1), Juli 2012V
99
Pendahuluan
Pencanangan Indonesia sebagai penghasil
produk kelautan dan perikanan terbesar tahun 2015
oleh Kementerian Kelautan dan Perikanan memacu
seluruh kegiatan budidaya, terutama perairan laut
yang dapat dimanfaatkan untuk pengembangan
usaha budidaya ikan yang diperkirakan mencapai
tiga juta hektar (Sunaryanto et a.., 2001). Usaha
pengembangan potensi perairan selain untuk
memenuhi kebutuhan konsumsi masyarakat yang
dapat mensejahterakan, juga dapat menggali potensi
alam yang baru sehingga terjadi pelestarian
lingkungan yang berkesinambungan.
Salah satu potensi perairan laut yang sudah
dikembangkan dan mulai menunjukkan pasar
internasional adalah ikan kerapu. Ikan kerapu
tersebar luas di perairan yang berkarang di daerah
tropis maupun subtropis. Beberapa jenis ikan kerapu
yang sudah menjadi sasaran budidaya adalah kerapu
bebek (Cromileptes altivelis), kerapu macan
(Epinephelus fuscoguttatus), kerapu sunu
(Epinephelus leopardus) dan kerapu lumpur
(Epinephelus coioides). Jenis kerapu tersebut
memiliki nilai jual yang tinggi dan untuk proses
budidayanya hanya diperlukan dan digunakan
komponen-komponen lokal.
Kerapu macan termasuk salah satu diantara
kerapu yang berhasil dibudidayakan dengan survival
rate mencapai 40% (Anonim, 1998), pada hatchery
skala rumah tangga di Bali, ketersediaan benih ikan
kerapu selalu kontinyu karena tidak terpengaruh
musim. Dengan keunggulan yang maksimal maka
spesies tersebut sudah dapat menembus pasar
internasional yang banyak dilalulintaskan antar
daerah untuk mencukupi pasokan benih dan antar
negara untuk kebutuhan konsumsi.
Budidaya kerapu macan tidak lepas dari faktor
penyakit yang dapat menyerang dan menggagalkan
hasil budidaya. Salah satu penyakit yang telah
dilaporkan oleh para peneliti adalah viral nervous
necrosis (VNN) yang dapat menyebabkan kematian
massal pada ikan kerapu, terutama pada stadia larva
dan juvenil. Di Indonesia kejadian penyakit VNN
ditemukan pertama kali di daerah Banyuwangi pada
budidaya kakap putih dan ikan kakap tersebut
tampak lesu, berenang berputar dengan perut di
permukaan dan sering muncul ke permukaan dengan
berenang secara vertikal (Koesharyani et al., 1999).
Gejala kilinis yang tampak pada ikan kakap tersebut
kemudian ditetesi bahan perekat larut air, ditutup
dengan gelas penutup dan diamati di bawah
mikroskop cahaya. Hasil positif apabila dalam
sediaan yang telah dilakukan pewarnaan
streptavidin-biotin akan terlihat warna coklat
keemasan.
3.2. RT-PCR menggunakan IQ-2000
a. Purifikasi RNA VNN (kit high pure viral ®nucleic acid) ( Roche )
Lendir tubuh ikan kerapu macan diambil
sebanyak 200 μl, dimasukkan ke dalam tabung
mikro 1,5 ml dan dikerjakan sesuai dengan intruksi ®)kit high pure viral nucleic acid (Roche sampai
selesai. Elusi asam nukleus disimpan pada suhu -80 oC (sediaan). Untuk pemeriksaan RT-PCR
digunakan 6 μl sediaan.
b. Pemeriksaan VNN menggunakan RT-PCR (kit
IQ-2000)
Sampel yang digunakan untuk pengujian
menggunakan kit IQ-2000 berbeda antara sampel
yang berupa organ dan sampel yang berupa lendir.
Untuk sampel yang berupa organ yang digunakan
sebanyak 20 mg dan dilakukan ekstraksi sampai
dengan rangkaian proses kit IQ-2000 selesai,
sedangkan untuk sampel yang berupa lendir yang
sudah melalui proses purifikasi RNA hanya
digunakan 6 µg dan tidak dilakukan ekstraksi,
langsung diamplifikasi sampai dengan rangkaian
proses kit IQ-2000 selesai dan dibaca menggunakan
lampu UV trans illuminator.
4. Analisa data
Analisa hasil dilakukan secara deskriptif
dengan membandingkan hasil pengamatan gejala
klinis, hasil uji imunositokimia lendir yang
dikonfirmasi dengan uji RT-PCR.
Hasil dan Pembahasan
Pada penelitian ini, kerapu macan yang telah
diinfeksi virus penyebab VNN pada uji utama
menunjukkan gejala klinis berupa gerakan renang
Putu Eka Sudaryatma et al.
102
abnormal, disorientasi lingkungan dan perubahan
warna tubuh. Perubahan gerakan renang ikan kerapu
macan yang sangat mudah dikenali sebagai akibat
infeksi virus penyebab VNN adalah berenang
berputar-putar dan vertikal, kehilangan disorientasi
lingkungan, antara lain: menabrak-nabrakkan diri ke
dinding dan dasar aquarium dan warna tubuh yang
lebih gelap. Dalam waktu tiga hari ikan berenang
terbalik, kemudiaan akan berada di dasar aquarium
yang disusul dengan kematian. Kejadian tersebut
dapat dilihat pada ikan kerapu yang diinfeksi virus
VNN (Tabel 1) dan yang dikohabitasi (Tabel 2).
Tabel 1. Pengamatan gejala klinis dan lesi patologis ikan kerapu yang diinfeksi virus penyebab VNN
Waktu Gejala klinis Lesi patologis anatomis
(pasca injeksi)
24 jam Ikan mulai berenang miring di permukaan, Sirip ekor geripis, insang pucat, hati pucat,
tetapi masih gesit dan warna tubuh memucat limpa bengkak
48 jam Ikan berenang dipermukaan, berenang vertikal Lesi di bawah mulut, sirip ekor geripis, insang
dan menabrakkan diri ke dinding aquarium, pucat, limpa bengkak dan hemoragis, hati
warna tubuh menggelap bengkak dan pucat
72 jam Ikan berenang dengan tubuh terbalik, tidak ada Sirip ekor geripis, lesi pada mulut, insang refleks, banyak ikan yang sekarat dan sudah ada
ikan yang mati
pucat, limpa bengkak kehitaman , ginjal
bengkak, hati pucat dan rapuh, usus dilatasi
Tabel 2. Pengamatan gejala klinis dan lesi patologis anatomis ikan kerapu yang dikohabitasi
Waktu Gejala klinis Lesi patologis anatomis
(pasca kohabitasi)
24 jam Ikan berenang normal, gesit dan menggerombol Warna tubuh terang, tidak ada lesi patologis
di dasar aquarium anatomis organ internal
48 jam Ikan mulai berenang miring di permukaan , Sirip ekor geripis, insang pucat, limpa tetapi masih gesit dan warna tubuh memucat bengkak, hati bengkak
72 jam Ikan berenang berputar-putar refleks sangat lambat, Sirip ekor geripis, lesi di mulut, insang pucat,
ikan mulai sekarat dan sudah ada yang gelembung renang dilatasi, limpa bengkak,
berenang terbalik dengan bagian abdomen di atas ginjal bengkak, hati pucat dan rapuh, dan usus dilatasi
Imunositokimia Streptavidin Biotin: Deteksi Dini
103
Yoshikoshi dan Inoue (1990) melaporkan,
bahwa ikan yang terinfeksi virus penyebab VNN
akan mengalami perubahan gerakan berenang dan
warna tubuh yang menggelap dan berenang berputar
di permukaan. Perubahan gerakan renang tampak
sangat jelas dengan adanya luka di bagian bawah
mulut, keadaan tersebut menandakan bahwa ikan
mulai kehilangan keseimbangan dalam berenang
sehingga seringkali menabrakkan diri ke dinding
dan/atau dasar aquarium. Benih ikan yang terserang
VNN dapat berbeda menurut umurnya. Pada ikan
kerapu yang berumur 45 hari sampai 4 bulan, ikan
kerapu akan terlihat berdiam di dasar bak, berenang
terbalik, gerakan lemah dan nafsu makan menurun
dratis, serta warna kulit menjadi gelap.
Pada umumnya, 3 -5 hari setelah adanya gejala
klinis ikan kerapu akan mati (Roza et al., 2003).
Infeksi virus penyebab VNN pada ikan yang
dilakukan melalui injeksi intra muskular sangat
cepat menyebar dan menginfeksi inang melalui saraf
perifer yang ada di otot, masuk ke dalam sistem saraf
pusat dan mata dan mengakibatkan ikan kehilangan
orientasi berenang dan disfungsi visual. Larva dan
juvenil kerapu peka terserang VNN pada suhu 24,5°
C – 26° C yang merupakan suhu optimal dalam
proses infeksi VNN dan dapat menyebabkan
kematian pada umur 7-45 hari karena sistem saraf
yang masih sederhana.
Pada penelitian ini, nekropsi yang dilakukan
pada ikan kerapu menunjukkan lesi patologis
dengan perubahan insang pucat, limpa bengkak dan
hemoragis, warna hati pucat dan konsistensinya
rapuh, ginjal bengkak, gelembung renang dilatasi
dan usus dilatasi (Gambar 1)
Gambat 1. Lesi patologis anatomis ikan kerapu macan 48 jam pasca infeksi VNN. Insang pucat dan berlendir, hati pucat, limpa membengkak dan usus kembung.
Putu Eka Sudaryatma et al.
104
Lesi patologis anatomis yang sama dilaporkan
oleh Gilda dan Leobert (2011). Ikan yang terinfeksi
virus penyebab VNN menunjukkan usus yang
kosong dan berisi udara dan dilatasi gelembung
renang. Perubahan pada organ internal, terutama hati
dan limpa akan terjadi jika infeksi virus VNN
melanjut akibat adanya viremia pada ikan yang
terinfeksi virus penyebab VNN. Dilatasi usus ikan
kerapu diakibatkan oleh adanya hasil fermentasi
bakteri normal usus dan diikuti oleh adanya
akumulasi cairan yang berwarna coklat kehijauan.
Kejadian tersebut akibat gerakan peristaltik usus
yang tidak teratur akibat dari kerusakan sistem saraf
perifer oleh infeksi VNN. VNN bersifat neurotropik
dan dapat ber-replikasi dalam saraf dan dapat secara
cepat menyerang organ lain yang dilalui oleh sistem
saraf perife (Korsnes, 2008).
Virus penyebab VNN dapat menginfeksi ikan
melalui tiga cara yaitu: 1. Melalui sel-sel epitelia
saluran pencernaan, 2. Melalui axon yang ada di
permukaan sel dan 3. Melalui peredaran darah
(Korsnes, 2008). Ikan yang diinfeksi virus penyebab
VNN melalui injeksi intra muskular menginfeksi
ikan dengan cara mereplikasikan diri di dalam
sitoplasma atau nukleus serabut otot skelet
kemudian menyebar dan ber-replikasi di sistem saraf
perifer dan selanjutnya virus akan langsung masuk
ke dalam sistem saraf pusat. Ikan yang dikohabitasi
dapat terinfeksi VNN akibat masuknya virus yang
ada di air melalui kontak dengan permukaan tubuh
(lendir, sirip dan otot), termasuk via oral sehingga
akan dapat menginfeksi sel-sel epitelia epitelia
sistem saluran pencernaan. Kejadian ini yang
disebut ”water borne disease”. Virus yang masuk
melalui permukaan tubuh dapat langsung
bereplikasi di epitel permukaan saluran pencernaan
dan masuk ke dalam sistem saraf pusat melalui
sistem saraf perifer (nervus Vagus) (Korsnes, 2008).
Hasil pengamatan imunositokimia pada apus
lendir kerapu macan yg diinjeksi inokulum virus
penyebab VNN dan kerapu macan yang tertular
VNN dengan kohabitasi dapat dilihat pada Gambar
2.
a b c
Gambar 2. Imunositokimia lendir Kerapu Macan 24 jam pasca infeksi VNN. a. Kontrol negatif, b. Kontrol positif dan c.
Ikan kohabitasi (SB, 1000x.).
Imunositokimia Streptavidin Biotin: Deteksi Dini
105
Uji imunositokimia pada apus lendir kerapu
macan menunjukkan hasil imunositokimia positif
pada 24 jam pengamatan. Reaksi positif pada ikan
yang dikohabitasi dan ikan yang diinfeksi virus
penyebab VNN menghasilkan reaksi spesifik
antibodi-antigen yang terwarnai oleh kromogen,
menunjukkan warna coklat-keemasan. Sedangkan,
kontrol negatif tidak menunjukkan adanya warna
coklat keemasan akibat tidak adanya reaksi antibodi-
antigen yang dikehendaki. Hasil positif berarti,
bahwa virus yang diinfeksikan pada ikan sudah
berada di air pemeliharaan dalam selang waktu 24
jam dan dapat langsung menularkan pada ikan sehat.
Keluarnya virus dari ikan yang diinfeksi dapat
melalui feses, lendir dan insang. Feses merupakan
hasil ekskresi dari pencernaan yang merupakan salah
satu media pembawa virus yang berada di dalam
saluran pencernaan. Virus dapat menginfeksi
melalui saluran pencernaan dan selanjutnya
menginfeksi sistem saraf perifer dan akhirnya virus
VNN dapat menginfeksi serabut otot jantung
(niokardium) dan makrofag (Grotomol et al., 1997).
seperti algae, parasit dan debris nekrotik sel-sel
epitelia. Selain itu, protein sisa pakan pada budidaya
ikan dapat digunakan oleh virus sebagai tempat ber-
replikasi. Korsnes (2008) melaporkan adanya
betanodavirus pada mikroorganisme perairan laut
dan ikan yang tidak merupakan inang spesifik dari
VNN. Hal tersebut dapat disebabkan oleh keadaan
VNN yang stabil di lingkungan dan dapat bertahan
hidup pada suhu ekstrem dan pemberian desinfektan
(Arimoto et al., 1996).
Pengujian VNN yang sudah dilakukan dengan
imunositokimia dilanjutkan verifikasi dengan
menggunakan tehnik reverse transcriptase-
polymerase chain reaction (RT-PCR) yang bertujuan
untuk konfirmasi hasil uji imunositokimia. Hasil uji
RT-PCR kerapu macan dapat dilihat pada Gambar 4.
Keterangan :1. Marker (333, 630, 843 bp)2. Kontrol (-)3. Kontrol (+) (289, 479, 1176 bp)4. Lendir kohabitasi aquarium 1 (+)5. Lendir kontrol + aquarium 1 (+)6. Lendir kohabitasi aquarium 2 (+)7. Lendir kontrol + aquarium 2 (+)8. Lendir kohabitasi aquarium 3 (+)9. Lendir kontrol + aquarium (+)
630 bp
333 bp
Gambar 4. Hasil pemeriksaan RT-PCR lendir ikan kerapu macan jam ke-24, 48 dan 72 pasca infeksi VNN
Imunositokimia Streptavidin Biotin: Deteksi Dini
107
843 bp
Hasil uji RT-PCR menunjukkan, bahwa lendir
ikan kerapu macan pada jam ke-24 sampai jam ke-72
pasca infeksi VNN semuanya positif VNN. Hal
tersebut membuktikan, bahwa dapat dilakukan
deteksi VNN pada 24 jam pasca infeksi VNN.
Berdasarkan hasil Uji imunositokimia dan
pemeriksaan RT-PCR yang menunjukkan hasil
positif, maka untuk diagnosa dini VNN dapat
d igunakan u j i imunos i tok imia . Tekn ik
imunositokimia streptavidin biotin dapat
diaplikasikan untuk deteksi dini virus VNN secara
cepat, tepat dan akurat sesuai dengan petunjuk dari
OIE dan juga memiliki kelebihan karena dapat
diaplikasikan pada sampel (spesimen) ikan tanpa
melukai atau bahkan tanpa mematikan ikan kerapu
macan bersangkutan, sehingga dapat mengkontrol
dan mencegah penyebaran penyakit VNN lebih
awal, atau bahkan eradikasi VNN, serta sekali gus
mampu mencegah kemungkinan terjadinya
pencemaran lingkungan.
Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Prof.
drh. Hastari Wuryastuti, M.Sc., Ph.D. dan Prof. drh.
R. Wasito, M.Sc., Ph.D., Fakultas Kedokteran
Hewan, Universitas Gadjah Mada yang telah
membimbing dalam penelitian dan juga penulisan
naskah.
Daftar Pustaka
(2001) Pembudidayaan Dan Manajemen Kesehatan Kerapu. Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center (SEAFDEC). Iloilo, Philippines.
(2006) Manual IQ 2000. Farming Intelligene Tech. Corp. http://www.iq2000kit.com. Diakses pada tanggal 26 Maret 2012.
Al Qodri, A. H., Sudjiharno & Anidiastuti, 2004. Pemilihan Lokasi Pembenihan Kerapu. Balai Budidaya Laut Lampung. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Departemen Kelautan dan Perikanan, Lampung. Hal. 15 dan 19.
Anonimus. (2008) The Circulatory System In Fish. http://www.earthlife.com. Diakses pada tanggal 10 Maret 2012.
Antoro, S., Sarwono, H. A. and Sudjiharno. (2004) Biologi Kerapu Pembenihan Kerapu. Balai Budidaya Laut Lampung. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Departemen Kelautan dan Perikana, Lampung.
Arimoto, M, Sato, J., Maruyama, K., Mimura G. and Furusawa, I. (1996) Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Aqua. J. 143:15-22.
Artanti, T. (2010) Nilai Diagnostik Imunositokimia Viral Nervous Necrosis (VNN) pada Kerapu Macan. Laporan Uji Coba Balai Karantina Ikan Ngurah Rai. Jakarta.
Brown, C.C., Olander H.J. and Senne D.A. (1992) A Pathogenesis Study Of Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (H n ) In Chickens, Using 5 2
Immunohistochemistry. J. Comp. Path. 107 : 341-348.
Chi, S.C., Lo, B.J. and Lin, S.S., 2001. Characterization Of Grouper Nervous. J. Fish Dis. 24: 3-13.
Firiasari, A. (2009) Pengamatan Ekspresi Protein Dengan Metode Imunositokimia. CCRC Farmasi UGM. Yogyakarta.
Fujaya, Y. (2004) Fisiologi ikan. Rineka Cipta. Jakarta.
Gilda, D, Lio-Po and Leobert D P. (2011) Viral Disease Chapter I. http://rfdp.seafdec.org.ph. Diakses pada tanggal 25 Maret 2011.
Grotmol, S., Bergh O. & Totland, G.K. (1999) Transmission Of Viral Encephalopathy And Retinopathy (Ver) To Yolk-Sac Larvae Of The Atlantic Halibut Hippoglossus Hippoglossus: Occurrence Of Nodavirus In Various Organs And A Possible Route Of Infection. Dis. Aqua. Org. 36: 95-106.
Putu Eka Sudaryatma et al.
108
Grotmol S., Totland, G.K., Thorud, K. and Hjeltnes, B.K. (1997) Vacuolating Encephalopathy And Retinopathy Associated With A Nodavirus-Like Agent: A Probable Cause Of Mass Mortality Of Cultured Larval And Juvenile Atlantic Halibut Hippoglossus Hippoglossus. Dis. Aqua. Org. 29: 85-97.
Katayama, M. (1960) Fauna Javonica Serranidae (Piscea) Biogeograpical Society Of Japan. Tokyo New Service. Ltd. Ginza Nishi. Japan.
Kjetil, K. (2008) Nervous Necrosis virus (VNN) in farmed Norwegian fish species. Thesis of Philosopiae Doctor (PhD) University of Bergen. Norway: Bergen.
Koesharyani I., Zafran and Yuasa, I. (1999) Deteksi Viral Nervous Necrosis (Vnn) Menggunakan Polymerase Chain Reaction (Pcr) Pada Ikan Kerapu Bebek. Pros.Sem.Nas.Pen. Dis. Tek. Budidaya Laut dan Pantai : 237-240.
Kokawa, Y., I. Takami, T. Nishizawa and M. Yoshimizu. (2008) Amixed Infection In S e v e n b a n d G r o u p e r E p i n e p h e l u s Septemfasciatus Affected With Viral Nervous Necrosis (Vnn). Aquaculture 284; 41-45.
Mori, K., Sugaya, E., Nishioka, T., Gomez, D.K., Fujinamy, Y., Arimoto, M., Okinaka, Y. and Nakai, T. (2005) Detection of betanodaviruses from feed fish used in marine aquaculture. In: EAFP 12th International Conference Diseases of Fish and Shellfish, 11-16 September 2005, Copenhagen, Denmark.
Nguyen, H.D., Nakai, T. and Muroga, K. (1996) Progression of Striped Jack Nervous Necrosis Virus (NNV) infection in naturally and experimentally infected str iped jack Pseudocaranx dentex larvae. Dis. Aqua. Org. 24: 99-105.
OIE (2006) Manual of diagnostic for aquatic animals. France.
Rantam, F.A. (2003) Metode Imunologi. Airlangga University Press. Surabaya.
Roza, D., Johnny and Yuasa K. (2003) Viral diseases of grouper in Indonesia. Makalah pada Training on Grouper Hatchery Seed Production. Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut Gondol – NACA Bangkok. Gondol 1 – 21 Mei 2003.
Sunaryanto, Sulistyo, Chaidir, I. and Sudjiharno (2001) Pengembangan Teknologi Budidaya Kerapu : Permasalahan Dan Kebijaksanaan. Prosiding lokakarya nasional. Pengembangan agribisnis kerapu : Peningkatan daya saing agribisnis kerapu yang berkelanjutan melalui penerapan IPTEK. Jakarta.
Wasito (1995) Penerapan Uji Imunologi Untuk Mendiagnosa HPIK Pada Kegiatan Lalu Lintas Ikan. Seminar Nasional Hama dan Penyakit Ikan Karantina dan Daerah penyebarannya. Jakarta.
Weeks, B.A. and Warinner, J.E. (1986) Functional Evaluation Of Macrophages In Fish From A P o l l u t e d E s t u a r y. Ve t . I m m u n o l . . Immunopathol. 12: 313-320.
Yoshikoshi, K. and Inoue, K. (1990). Viral Nervous Necrosis in hatchery larvae and juvenils of Japanese parrotfish, Oplegnathus fasciatus (Temminck & Schelgel). J. Fish Dis. 13: 69-77.
Yuasa, K., Koesharyani I., Roza D., Mahardika K., Johnny F. and Zafran. (2001) Manual For PCR Procedure : Rapid Diagnosis on Viral Nervous Necrosis (VNN) in Grouper. Lolitkanta – JICA Booklet 13: 35 – 37.