PSI 50 Jaa LAPORAN AKHIR ·peNGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1 DENGAN PENDEKATAN AGENT KETUA PELAKSANA : Dr. dr. Budiman Bela, SpMK Tahun 2012 PUSA T BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN BADAN LITBANG KESEHATAN DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSAT PENELITIAN DAN LA YANAN KESEHATAN VIROLOGI DAN KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2012
55
Embed
Jakarta LAPORAN AKHIR ·peNGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN …
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
PSI
50 Jakarta
LAPORAN AKHIR
·peNGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1
DENGAN PENDEKA TAN AGENT
KETUA PELAKSANA :
Dr. dr. Budiman Bela, SpMK
Tahun 2012
PUSA T BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHA TAN BADAN LITBANG KESEHATAN
DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSA T PENELITIAN DAN LA YANAN KESEHA TAN VIROLOGI DAN
KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
agensia penyebab pandemi influenza global sejak virus ini ditemukan melewati "batas lintas
spesies" dan ditemukan menginfeksi manusia pada tahun 1997 (1, 7,8).
lnfeksi influenza A H5Nl pada manusia ditemukan pertama kali pada tahun 2005 dan
sampai dengan 6 Mei 2010, jumlah kasus infeksi influenza A H5Nl terkonfinnasi mencapai
165 kasus dengan jumlah kematian sebanyak 136 orang (82,4%) (9,10). Sejak tahun 2007
sampai saat ini jumlah kasus infeksi influenza A H5N1 terlihat menurun (10), namun
kemungkinan munculnya virus influenza A H5Nl galur baru penyebab pandemi perlu untuk
diwaspadai. Peningkatan migrasi penduduk secara global, posisi geografis Indonesia yang
terletak pada jalur migrasi unggas liar, serta fakta bahwa unggas liar merupakan "reservoir"
virus influenza A menjadi alasan penting yang menjadi landasan untuk senantiasa
memperhitungkan influenza A, khususnya influenza A H5Nl sebagai potensi ancaman bagj
kehidupan masyarakat Indonesia.
Kewaspadaan terhadap munculnya virus influenza A H5N1 galur baru akibat
fenomena antigenic drift maupun antigenic shift yang berpotensi sebagai penyebab pandemi
perlu untuk dipertahankan mengingat berdasarkan peristiwa pandemi sebelumnya, virus
influenza A penyebab pandemi merupakan virus influenza A unggas dengan kemampuan
transmisi dari orang ke orang. Penting untuk diperhatikan pula bahwa vims influenza A
H5Nl yang semula · hanya ditemukan di unggas dan tidak menginfeksi manusia kemudian
menunjukkan kemampuan melintasi batas antara spesies sehingga ditemukan di manusia dan
kemudian bahkan ditemukan mampu melakukan infeksi dari orang ke orang walaupun masih
secara terbatas dalam kelompok tertentu yang mungkin hampir seluruhnya memiliki
hubungan kekeluargaan.
Salah satu upaya persiapan pandemi Influenza A yang direkomendasikan oleh WHO
pada tahun 2005 ialah pengembangan vaksin yang efektif, khususnya yang memiliki
spektrum proteksi yang luas (11). Vaksinasi merupakan strategi intervensi yang bersifat
.. cost-effective" karena respon irnun terhadap vaksin influenza A bersifat protektif sehingga
mampu mencegah terjadinya infeksi yang berpotensi menyerap pendanaan dalam jumlah
besar untuk biaya diagnosis, perawatan dan pengobatan. Strategi vaksinasi merupakan salah
satu strategi yang dapat diharapkan mencegah angka morbiditas dan mortalitas tinggi pada
saat munculnya galur virus influenza A baru dengan struktur antigen yang belum dikenali
oleh imunitas populasi manusia, namun terdapat permasalahan yang perlu untuk dipecahkan
agar strategi ini dapat diterapkan secara berhasil. Walaupun vaksinasi Influenza A
merupakan strategi pengendalian infeksi yang dapat dianggap murah dan efektit:
pengembangan vaksin Influenza A berdasarkan teknologi yang dipakai saat ini yaitu
menggunakan telur ayam berembrio memiliki kendala tersendiri. Kendala utama dalam
jpiDduksi vaksin Influenza A pada telur ayam berembrio ialah pada potensi teknologi ini
.=enghasilkan jumlah vaksin yang mencukupi dalam waktu yang relatif cepat, dimana hal ini
smgat penting agar pemberian vaksin dapat dilakukan sebelum terjadinya infeksi pada
.sebagian besar populasi penduduk suatu negara (12,13). Di sisi lain, vaksinasi seluruh
populasi negara bukanlah hal yang mudah untuk dilakukan, karena tidak hanya memerlukan
ketersediaan vaksin spesifik yang mampu memberikan perlindungan terhadap galur virus
baru, tetapi juga memiliki tantangan tersendiri dalam distribusi vaksin, khususnya di wilayah
lndonesia yang sulit untuk dijangkau dalam waktu cepat.
Vaksin DNA menarik untuk dikernbangkan dalam rangka persiapan menghadapi
pandemi influenza A. Waktu yang dibutuhkan untuk melakukan konstruksi "bibit vaksin"
serta memperoleh vaksin dalam skala besar yang mencukupi untuk vaksinasi seluruh populasi
penduduk suatu negara dengan jum lab populasi yang besar seperti Indonesia dapat dilakukan
dalam kurun waktu 11 minggu, sehingga vaksinasi seluruh populasi secara teoritis dapat
dilakukan dalam kurun waktu kurang dari 16 minggu sejak susunan nukleotida virus
penyebab pandemi diperoleh. Sifat DNA yang relatif jauh lebih-stabil dibandingkan protein
memungkinkan vaksin DNA untuk disebarluaskan ke seluruh pelosok negara, khususnya
negara kepulauan seperti Indonesia, dengan cara yang lebih mudah karena tidak tergantung
kepada sistem pendingin untuk mempertahankan stabilitas dan efektivitas vaksin.
Vaksin DNA telah terbukti dapat menimbulkan proteksi silang antar subtipe influenza A
yang berbeda, bila gen yang disisipkan pada vektor vaksin DNA merupakan gen
pengekspresi protein bersusunan asam amino terkonservasi pada berbagai subtipe virus
influenza A, misalnya gen pengekspresi protein matriks dan nukleoprotein. Ditinjau dar.i segi
keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon imun seluler, maka dapat diperkirakan
bahwa vaksin DNA pengekspresi protein H dan N dari subtipe tertentu berpotensi lebih besar
untuk menghasilkan proteksi silang terhadap varian-varian galur tersebut karena respon imun
seluler memiliki kemampuan pengenalan epitop yang lebih beragam dibandingkan respon
imun humoral (14). Selain itu, tidak tertutup kemungkinan bahwa vaksin DNA berdasarkan
suatu subtipe virus influenza A dapat memberikan proteksi terhadap infeksi oleh virus
influen:za A subtipe lainnya. Kemungkinan ini menjadi terbuka berdasarkan fakta yang
ditemukan bahwa infeksi sebelumnya oleh suatu subtipe influenza A dapat memberikan
proteksi terhadap infeksi oleh virus influenza A subtipe lain yang terjadi kemudian (15, 16).
�ieSpOU ilnun yang diinduksi oleh vaksin DNA meliputi respon imun sel T CD8, sel T
,.,..-_ re.spcm imun humoral dan juga respon imun nonspesifik (inate immunity) melalui
-.--. .... - Toll like receptor (TLR). Respon imun humoral berperan dalam netralisasi virus
� tidak dapat melakukan penempelan pada reseptor sel targetnya, disamping itu
c::�Nli yang berikatan dengan partikel virus juga mengakibatkan penempelan antibodi pada
se.I urinfeksi yang mengekspresikan partikel virus sehingga sel-sel NK (natural killer) tertarik
:-.. melepaskan substansi-substansi yang bersifat toksik terhadap sel terinfeksi tersebut.
� sel T CD8 berperan dalam penghancuran sel-sel terinfeksi yang mengekspresikan
virus di dalam molekul MHC kelas I akibat interaksi spesifik antara reseptor sel T
c..ecgan antigen virus. Perangsangan sel T CD4 (sel T helper) meningkatkan efektivitas
sisrem imun spesifik yang ditimbulkan oleh vaksin dalam rnelakukan eliminasi infeksi virus
i!:Jaik melalui jalur respon imun humoral maupun respon imun seluler.
Vaksin DNA jauh lebih stabil dibandingkan dengan vaksin berbentuk antigen protein
serta dapat dengan mudah disediakan dalam bentuk preparat kering tanpa mengurangi
stabilitas dan kemampuannya menginduksi respon lmun. Hal mi merupakan saJah satu
keunggulan yang mempermudah distribusi vaksin DNA ke seiuruh pelosok Indonesia tanpa
kendala ketergantungan pada "rantai dingin" yang memerlukan fasilitas pendingin khusus
untuk penyimpanan vaksin. Keunggulan vaksin DNA yang lain ialah pada teknik amplifikasi
"seed vaccine" yang relatif lebih murah dan berpotensi untuk dilakukan dengan
memanfaatkan bahan-bahan baku yang diproduksi sendiri di Indonesia.
Modifikasi vaksin DNA untuk meningkatkan imunogenitas vaksin telah dilaporkan dalam
beberapa penelitian. Penambahan gen Interleukin-2 (IL2) telah diketahui dapat meningkatkan
efikasi vaksin DNA (J 7 ). Modifikasi lain adalah modifikasi antigen sehingga menjadi
antigen yang dapat disekresikan (18). Dalam penelitian ini akan dilakukan modifikasi pada
vaksin DNA sehingga antigen virus yang djhasilkan akan membentuk viral like parlicle
(VLP). Selain itu akan dilakukan fusi antara gen penyandi antigen virus dengan susunan
nukleotida penyandi peptida atau protein yang diharapkan dapat meningkatkan respon
antibodi (sel B), respon sel T-CD4 dan respon sel T-CD8. Untuk meningkatkan respon
antibodi dilakukan fusi antigen virus dengan komplemen C3d yang diharapkan akan
meningkatkan stimulasi sel B yang dipicu oleh interaksi C3d-CD21 sedangkan fusi antigen
dengan CD40L dilakukan untuk aktivasi sinyal kedua melalui interaksi CD40-CD40L untuk
stjmulasi Janjut pada set B. Komponen lain yang juga menarik untuk disertakan ialah
komponen interaksi CD28-B7. Fusi antigen deogan komponen C3b diharapkan akan
C!D.ingkatkan fagositosis �ntigen oleh makrofag yang akan berubah menjadi "Antigen
P:?:senting Cells" untuk stimulasi sel T-CD4 spesifik. Stimulasi sel T-CD8 oleh vaksin DNA
c..ipat dikatakan merupakan sifat alamiah vaksin DNA, karena antigen yang dihasilkan oleh
:!ksin DNA diproduksi oleh sel resipien vaksin sehingga bersifat antigen endogen yang
.;enlapat dalam sitosol.
Vaksin jenis lainnya yang juga menarik untuk dikembangkan adalah vaksin subunit
rekombinan, khususnya yang diekspresikan pada sistem ekspresi prokariota, misalnya
Escherichia coli. Vaksin rekombinan yang diekspresikan pada E.coli memiliki keunggulan
dari segi biaya produksi karena medium yang digunakan relatif jauh lebih murah
dibanding.kan medium kultur sel, selain itu tingkat produksi antigen rekombinan juga relatif
cinggi. Sistem purifikasi antigen rekombinan juga telah dikembangkan sehingga
memungkinkan produksi dalam jumlah besar. Untuk mengatasi pennasalahan kesulitan
antigen eksogen menstimulasi respon sel T-CD8, akan dilakukan fusi antara protein
rekombinan dengan protein listeriolysin dan susunan asam amino yang mampu meni�gkatkan
ubikuitinasi. Protein· listeriolisin diharapkan- akan meningkatkan lokalisasi protein yang
difagositosis oleh makrofag ke dalam sitosol sedangkan susunan asam amino yang
meningkatkan ubikuitinasi diharapkan akan meningkatkan proteolisis antigen di proteasom
sebingga epitop antigen eksogen yang diinjeksikan pada resipien vaksin akan terekspresi
pada molekul MHC kelas I untuk stimulasi sel T-CD8 spesifik. Alternatif lain yang dapat
dilakukan ialah melakukan fusi dengan protein voyager virus herpes simpleks meningkatkan
meningkatkan penetrasi antigen ke dalam set non fagosit.
Telah diketahui bahwa stimulasi respon antibodi oleh antigen berstruktur repetitif lcbih
kuat dibandingkan stimulasi oleh antigen berepitop tunggal. lnteraksi epitop repetitif pada
antigen berstruktur repetitif dengan reseptor spesifik pada sel B (antibodi pada permukaan sel
B) akan mengakibatkan sambung silang (cross-linking) reseptor spesifik pada permukaan sel
B dan menimbulkan stimulasi kuat pada sel B. Partikel virus pada dasarnya merupakan
komponen repetitif yang terbeotuk oleh perakitan mandiri (selfassembly) komponen protein
pembentuk partikel virus, sehingga secara alamiah partikel virus merupakan stimulator kuat
respon sel B karena interaksi reseptor spesifik pada sel B dengao epitop repetitif pada
permukaan partikel virus memungkinkan terjadinya fenomena sambung silang pada
pennukaan sel B.
?embentukan partikel virus tanpa kandungan materi genetik dapat terjadi secara alamiah
a::.?::!pUll secara artifisial. Struktur partikel virus tanpa kandungan materi genetik disebut juga
�oai Viral Like Particle (VLP). Imunisasi binatang percobaan dengan VLP influenza A
tclah terbukti dapat menghasilkan respon imun protektif pada uji tantang binatang yang telah
&i:munisasi dengan partikel virus influenza A infeksius homologus (19). Pembentukan YLP
influenza A telah dicoba pada sistem ekspresi mamalia (sel mamalia) dan sistem ekspresi
baculovirus (sel serangga) (19,20).
Penelitian ini secara umum bertujuan untuk menghasilkan berbagai prototipe vaksin
\-aksi:n influenza A serta melakukan penilaian efektivitas vaksin maupun aspek ekonomi
Derbagai prototipe vaksin tersebut. Vaksin yang dikembangkan berupa vaksin DNA, vaksin
'LP dan vaksin protein subunit rekombinan. Setiap jenis prototipe vaksin influenza A yang
embangkan dalam penelitian ini akan diteliti potensinya sebagai kandidat vaksin persiapan
?Jldemi melalui uji respon imun humoral, uji respon irnun selular dan uji tantang terhadap
�rbagai jenis galur virus influenza A H5Nl yang berkembang di Indonesia, rnaupun
�adap virus influenza A subtipe lainnya.
Institusi pelaksana penelitian, telah berpengalaman dalam pengembangan prototipe
Vclksin DNA, maupun prototipe vaksin protein subunit rekombinan. Berbeda dengan
prototipe vaksin DNA influenza A H5Nl yang akan dikembangkan dalam penelitian ini,
pototipe vaksin influenza A H5N 1 yang dikembangkan sebelumnya di institusi pelaksana
�elitian tidak difusikan dengan susunan nukleotida yang bersifat ajuvan.
PERMASALAHAN
Galur virus influenza A H5N1 penyebab pandemi sulit untuk diprediksi karakteristik
�iknya karena informasi yang dimiliki mengenai pola replikasi virus serta faktor-faktor
c::clekular yang mendasari tahapan inteksi virus pada berbagai spesies belum mencukupi
1- dipakai dalam penentuan arah evolusi virus influenza A H5Nl yang berpotensi sebagai
� influenza A penyebab pandemi. Walaupun demikian, dapat diperkirakan bahwa
tlrur antigen yang dimiliki oleh virus influenza A H5Nl galur baru akan memiliki
pt:ESamaan epitop dengan virus influenza A yang beredar saat ini sehingga respon imun yang
Chduksi oleh antigen virus influenza A H5Nl berbasis susunan asam amino galur tahun ini
bapotensi memiliki daya proteksi silang dengan galur baru virus influenza A H5Nl yang
- bu] di kemudian hari sebagai penyebab pandemi. Potensi persamaan epitop ini khususnya
Lehih tinggi pada epitop yang dikenali oleh sel T, baik sel T CD4 maupun sel T CD8.
Untuk menghadapi kemungkinan timbulnya virus influenza A non H5Nl sebagai
j)eflyebab pandemi influenza A, perlu diteliti potensi protein virus influenza A dengan
susunan asam amino terkonservasi pada semua subtipe influenza A untuk dikembangkan
sebagai vaksin persiapan pandemi influenza A baru. Protein matriks dan nukleoprotein
berpotensi sebagai kandidat vaksin yang memenuhi persyaratan ini. Di sisi lain, perlu
dipikirkan penghambatan replikasi virus oleh respon antibodi netralisasi yang sebagian besar
bekerja berdasarkan interaksi dengan protein permukaan Hemaglutinin. Untuk ini dapat
dipertimbangkan perancangan susunan asam nukleat penyandi antigen Hemaglutinin
beberapa subtipe influenza A yang berpotensi penyebab pandemi, dengan susunan asam
amino konsensus pada setiap subtipe tersebut. Antigen permukaan yang mungkin dapat
dianggap mendesak untuk dikembangkan ialah antigen hemaglutinin HS, H9, dan H l (2009),
neuraminidasa NI dan N2.
Keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon sel T-CD8 spesifik secara
efisien pada pernberian vaksin untuk "priming" dapat berpotensi merugikan dalam pemakaian
vaksin DNA sebagai "booster". Respon sel T-CD8 yang dihasilkan melalui vaksinasi
sebelumnya dapat mengakibatkan destruksi sel yang mengekspresikan antigen vaksin DNA,
sehingga stimulasi respon imun oleh vaksinasi booster kurang efektif akibat penurunan
jumlah dan masa pemaparan antigen dengan sistem imun. Untuk mengatasi permasalahan ini
diperlukan vaksinasi menggunakan antigen eksogen yang tidak hanya mampu menginduksi
respon antibodi dan respon sel T-CD4 secara efisien, tetapi juga mampu menginduksi respon
sel T-CD8 yang diperlukan untuk eliminasi sel terinfeksi virus.
Antigen eksogen yang dipakai untuk imunisasi booster pasca imunisasi awal dengan
'":1'3.ksin DNA dapat berupa virus hidup dilemahkan, partikel vims terinaktivasi, Viral Like
Particle maupun protein subunit. Jenis antigen yang paling mudah dan relatif paling murah
JDtuk dikembangkan ialah vaksin protein subunit, khususnya yang diekspresikan pada sistem
ekspresi prokariota. Telah diketahui bahwa protein hemaglutinin virus influenza A dapal
diekspresikan secara efisien pada sistem ekspresi prokariota dengan melakukan optimasi pada
susunan kodon serta menggunakan galur sel Escherichia coli (E. coli) tertentu yang dapat
i:nengatasi permasalahan toksisitas protein rekombinan sel E. coli. Produksi protein
rekombinan menggunakan sistem ekspresi E. coli relatif jauh lebih murah dibandingkan
�·--.u· antigen virus menggunakan kultur sel mamalia ataupun menggunakan telur ayam
�rio. Antigen eksogen lainnya yang dapat dipakai untuk imunisasi booster ialah
� eksogen berbentuk VLP. Antigen jenis ini dapat menginduksi respon sel B yang kuat
tQCaJ3 mampu rnelakukan cross-linking reseptor sel B spesifik oleh epitop repetitif pada
ukaan VLP. Antigen VLP dapat diproduksi pada sistem ekspresi mamalia, sistem
c...spresi baculovirus, dan sistem ekspresi tumbuh-turnbuhan.
Proses produksi maupun antigen yang dihasilkan dari tumbuh-tumbuhan, sistem
-d:spresi prokariota tidak mengandung komponen binatang, seperti halnya antigen virus yang
Cproduksi menggunakan kultur sel MOCK (berasal dari anjing), sehingga permasalahan
��g terkait produk binatang seperti kandungan patogen hewani dan permasalahan halal
:::m.upun haram dapat terhindarkan. Vaksin protein subunit rekombinan berpotensi untuk
digunakan dalam vaksinasi "booster" pasca imunisasi dengan vaksin DNA. Pemberian
Tak.sin ini dengan jalur administrasi ataupun pencampuran dengan ajuvan yang sesuai juga
dapat diarahkan untuk merangsang respon lgA spesifik maupun respon sel T-CD8.
Beberapa pertanyaan yang perlu dijawab dafam pengembangan vaksin influenza A·
berbasis DNA, antigen rekombinan prokariota dan VLP ialah:
I. Bagaimana pengaruh fusi antigen vaksin influenza A dengan masing-masing komponen
C3d, CD40L, CD28, listeriolysin, Vif HIV-I dan protein voyager Herpes Simpleks
terhadap respon imun humeral dan selular?
2. Apakah vaksinasi dengan antigen NJ konsensus dapat menimbulkan respon. sel T
sitotoksik terhadap sel pengekspresi antigen neuraminidasa HlNl dan H5Nl?
3. Bagaimana respon antibodi netralisasi yang ditimbulkan oleh imunisasi antigen H5 dan
HI bersusunan asam amino konsensus terhadap infeksi beberapa galur H5 dan HJ?
-t Bagaimana kombinasi pemberian vaksin untuk "priming" dan "booster" yang dapat
secara efisien merangsang respon imun humoral, sel T CD4 dan sel T CD8?
5. Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A HINI dan H5Nl bervirulensi
tinggi dapat pasca "priming" menggunakan vaksin DNA influenza A?
6. Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A H1Nl dan H5N1 dapat
diperoleh dalam tempo kurang dari I minggu pasca vaksinasi menggunakan kombinasi
vaksin yang akan diteliti?
7. Apakah respon protektif masih dapat diinduksi oleh vaksinasi pada individu yang berada
pada fase dini infeksi influenza A?
:IL MANFAAT PENELlTIAi�
_ Infonnasi yang diperoleh dari penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh peneliti lain untuk
pengembangan vaksin influenza A berdaya proteksi tinggi maupun vaksin virus
berenvelop lainnya
Prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini berpotensi untuk dipatenkan
sebagai "seed vaccine" nasional yang merupakan hak milik bangsa Indonesia
"' .knis vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai model
notuk penelitian respon imun humeral, respon imun set T CD4 maupun sel T CD8
terhadap berbagai jenis antigen lainnya
-r... Berbagai jenis "platform'' prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini akan
memberikan alternatif yang lebih luas untuk mendapatkan prototipe vaksin influenza A
yang efektif, aman dan stabil, serta dapat diproduksi secara cepat dan mudah dengan
biaya produksi yang relatif lebih ekonornis.
5. Infonnasi yang diperoleh melalui eksperimen imunisasi dengan berbagai komposisi
vaksin pada vaksinasi "priming" dan "booster'' bermanfaat untuk menentukan komposisi
vaksin pada "priming" dan "booster" yang mampu merangsang respon imun secara lebih
dini dan eftsien
Pengalarnan yang diperoleh dari penelitian ini meningkatkan kemampuan peneliti untuk
merancang strategi pengembangan vaksin . .
7. Pengalaman yang diperoleh dalam melakukan pengembangan vaksin DNA dan vaksin
rekombinan yang diproduksi dalam berbagai sistem ekspresi dapat dibagikan kepada
kelompok penelitian Indonesia lainnya untuk meningkatkan kemandirian bangsa
Indonesia dalam teknologi pengembangan vaksin
8. Keterlibatan peneliti-peneliti muda dalam penelitian ini akan menghasilkan generasi peneliti
baru yang memiliki wawasan luas ser:ta keterampilan menyusun strategi penelitian dan
keterampilan teknis yang lebih tinggi dalam pengembangan dan penelitian vaksin
JC. TUJUAN PENELITIAN
T � uan Umum:
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan beberapa kandidat vaksin
influenza A H5Nl dalam bentuk vaksin DNA, antigen rekombinan prokariota dan
antigen VLP dalam bentuk protein fusi maupun non fusi dengan komponen C3d,
CD40L, CD28 dan listeriolisin Listeria monocytogenes serta mendapatkan informasi
mengenai respon imun humoral dan selular yang ditimbulkan oleh kombinasi vaksin
yang diberi.kan sebagai "priming" dan "booster" sebagai landasan untuk menetapkan
komposisi serta cara pemberian vaksin yang memberikan respon irnun protektif yang
lebih dini dan lebih efisien.
jaan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini ialah:
1. Mendapatkan konstruksi vektor vaksin DNA fusi dan non-fusi pengekspresi
antigen H5, NI, MA dan NP.
2. Mendapatkan kandidat vaksin VLP mengandung komponen HA+NA+MA
(dengan atau tanpa NP) untuk influenza A subtipe H5Nl
3. Mendapatkan kandidat vaksin influenza A H5, HI, MA dan NP berupa protein
rekombinan prokariota
4. Mendapatkan informasi mengenai pengaruh penambahan C3d, CD40L dan CD28
pada antigen prokariota terhadap respon sel T CD4 dan respon antibodi
5. Mendapatkan infonnasi mengenai pengaruh fusi antigen influenza A dengan
listeriolisin, Vif HIV-I dan protein Vp22 Herpes Simpleks terhadap pembentukan
respon sel T CD8 spesifik epitop antigen virus influenza
6. Mendapatkan informasi mengenai potensi vaksin DNA influenza A untuk
menimbulkan respon imun protektif pasca pemberian vaksin untuk "priming"
7. Mendapatkan komposisi vaksin "priming" dan "booster" yang dapat
menimbulkan respon protektif lebih dini secara lebih _efisien
8. Mendapatkan infonnasi m engenai . pemakaian vaksin influenza A untuk
mendapatkan efek kuratif pada individu (hewan coba) yang telah terinfeksi
9. Mendapatkan informasi mengenai jangka waktu timbulnya respon protektif pada
komposisi vaksin yang dinilai memiliki respon imun seluler dan humoral yang
terbaik serta memiliki potensi paling tinggi pada uji tantang hewan coba dengan
infeksi virus influenza A H5NI atau HIN I
" :\fETODE PENELITIAN
_ !Keraogka Konsep Penelitian
Komponen anngen
Subtipe Virus Influenza virus:
A - Hemaglutrnrn (HA)
I -H5N1 - Neuramin ldase (NA)
-HlN'I -Malrrks (MA1)
- H9N2 • Nukleoprotern (NP)
I I .i.
Efektivitas i
I -Vaksin sebagai
Daya Proteksi I � vaksin Pre-.S1lan1J � pandemidan ·� - Pandemi --- I Strmu lasi I I Dosis Vaksin I f -..
I Pen rn gkatan Peningkatan P-en in gkaran II titer anhbodi JUmlahSelT JU'mlah SelT spesifik CD8 spesrfik CD4spesrftk
1 I �;E::�1 I I :r;:�is I V'l•ulUtd'!:>I SelTCD4
Stimulas1 I � ..... 01'> •':1 L - ,,,. TLR / - -� .. -·""'
I I y hayau pada
Peptida aJ Lrvan
·
Komposls1 d1m cara Ben1ukvaksrr1 proses produ",;'
-C3d pemberian vaksin ••'"'IC:1i'\ - DNA -CD40L • Komblnasi]enis - protein rekombrnan E. l\ecepatan
I - CD28 vaksin -coli - produksiveksm
- Listenolysm - Cara pemberian . VLP (baculovirus) ' Peptida VP22 vaksrn Stabrhtas vaksrn I
-
Variabel yang berada di Juar kotak tidak tennasuk dalam variabel yang ak:an diteliti dalam penelitian yang diusulkan
··i Tempat Penelitian
- Laboratorium dengan fasiJitas Biologi Molekular, Rekayasa DNA dan Rekayasa Protein
- Laboratorium dengan fasilitas BSL-2 dan BSL-3 - laboratorium dengan fasilitas BSL-3 hewan
1 Waktu Penelitian
Lama Penelitian: 3 tahun 2012 - 2014
A. Jenis Penelitian
Penelitian intervensi
..5.. Disain Penelitian
Disain penelitian ini ialah eksperimen
Populasi dan Sampel
ft>pulasi penelitian ialah hewan coba berupa mencit (Mus musculus) galur Balb/c atau .:!rlY. Akan dilakukan beberapa eksperimen menggunakan hewan coba untuk meniJaj -;:engaruh fusi peptida ajuvan, dosis dan kombinasi pemakaian prototipe vaksin dalam ZKSinasi "priming" dan "booster", maupun pengaruh pencampuran prototipe vaksin
C:tlam satu sediaan terhadap respon imun spesifik (antibodi, sel T CD4, sel T CD8), daya teksi silang, proteksi dini dan efek kuratif vaksinasi.
Perhitungan sampel dilakukan berdasarkan rumus Federer: t-1) (n-1) 2:_ 15, dimana
= jum lah kelompok perlakuan - = jumlah individu dalam setiap kelompok perlakuan
- Variabel
1
�.:i:c:I;ksi" Struktur Sekunder dan Tersier Protein Fusi
_ :::!>el independen:
Smunan Asam Amino H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell pene�ating peptide CPP) · Listeriolysin dan VP22, situs insersi peptida ajuvan pada susunan asam amino protein virus, posisi relatif dan susunan peptida protein virus (pada Scrambled Antigen 'accine)
?:rt::bel terkendali: Piranti lunak untuk prediksi struktur sekunder serta piranti lunak untuk prediksi struktur :essier protein
::r.iabel dependen: f.ksposisi peptida ajuvan pada ·perm ukaan molekul protein virus, prediksi struktur sekunder peptida ajuvan, prediksi struktur tersier peptlda ajuvan
truksi dan ekspresi Vaksin DNA i::!Jel independen:
Su:sunan nukleotida H5, Nl, MA 1, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide CPP) Listeriolysin dan VP22
-;,:be/ terkendali: ·ektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli
E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, ::xtoda sekuensing, kondisi kultur sel mamalia, metoda transfeksi, metoda deteksi ckspresi antigen
_ ::3el dependen: Smtman nukleotida vaksin DNA, ekspresi antigen virus pada sel mamalia
Kr;:ms:tnitl!� i vektor dan ekspresi antigen rekombinan virus pada sistem ekspresi
_......,, . ..... Ota
Susunan nukleotida H5, Nl, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22
'c:riahe/ terkenda/i.·
Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli (E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, galur Escherichia coli (E. coli) untuk ekspresi protein rekom binan, kondisi kultur E. coli, metoda deteksi ekspresi antigen
't.iabel dependen:
Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada kultur sel SF9
� -mtruksi vektor dan ekspresi VLP pada sistem ekspresi bacu lovi rus
.::nabel independen:
Susunan nukleotida H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22
".::riabel terkenda/i.·
Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli
(E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, Jenis sel serangga (SF9) kondisi kultur set SF9, metoda transfeksi, metoda deteksi ekspresi antigen
'ariabel dependen: Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada ku.ltur sel SF9
.o..u.A.U.3. is respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CDS mencit diimunisasi Vaksin DNA t::riabel independen:
Vaksinasi dengan vaksin DNA mengandung gen H5, Nl, MA 1 dan NP, dengan dan ranpa fusi C3d, CD40L, CD28; cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22, \'ak.sinasi dengan antigen non fusi
"'cTiohel terkenda/i_· dosis vaksin, volume injeksi vaksin, species dan galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba (betina), usia hewan coba (6-8 minggu), tenggang \'aktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah dan splenosit)
::rtobel dependen: Titer antibodi hemaglutinin; titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; titer IL� titer interferon gamma, jumlah sel T-CD4 produsen sitokin per I 06 splenosit pasca papa.ran dengan antigen dalam kondisi kultur sel; jum lah sel T-CD8 produsen sitokin per Cl° splenosit pasca paparan dengan sel pengekspresi
I 2
.,.........._.. ..... · respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CD8 mencit diimunisasi Vaksin VLP dan
:;::xm·:u. reko m bin an
..::J!"J::l:i:ll�· independen: Dosi.s vaksinasi dengan antigen VLP baculovirus (H5Nl, HlNl, H9N2); vaksinasi oc::.gan antigen rekombinan prokariota H5, Hl , H9, Nl dan Nl dengan dan tanpa fusi
dengan C3d, CD40L, CD28, Listeriolysin dan VP22; komposisi vaksin "priming" dan
G:!mbar 5. Hasil pensejajaran asam amino gen Nucleoprotein yang akan digunakan dalam litian ini dengan asam amino konsensus NP H5Nl dan asam amino konsensus NP H l N l
::.!D. Perbedaan asam amino antara NP HSNI dan NP HINI pdm antara lain N26D, V39T, '-00, E59D, R83K,Rl061, Vl I IM, 1 1 25V,Ll421, M J 95T, V 1 96A, 1223V, Y295H, R31 IK, """:i9V, I322M, T356K, R357K, V359l, Q360K, M377V A379T, R406K, 1431V, T436S, --39N, 1450V, R458K, V462L, N488S, N504S, dan R505Q
DNA penyandi asam amino konsensus NP dibuat dengan menggunakan program DNA2.0.
Sikuen asam amino konsensus neuraminidase dan DNA penyandi asam amino neuraminidase
r.-onsensus berpotensi untuk paten. Berikut ini sik:uen DNA NP k:onsensus.
Gambar 8. Ha5il verifikasi PCR dari pcDNA3 . l HA�TM
Aprosa0,8%; l.10 V; 30 menit
Keten.npn: 12-20 : pla=>id ieb>mbinan pcDNA 3.1.-HA (174lbp) M : Matb DNA wt : plasmid wild-type (271 bp)
b
Salah satu klon, yaitu ·pcDNA3 1 (+)J:-IA�1M(13) diverifikasi sekuensing dan
menunjukkan kesesuaian DNA sisipan dengan template gen HA H5N1 . Hasil sekuensing
menunjuk.kan bahwa gen HA telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+) (Gambar
9). Plasmid kemudian diperbanyak dan disimpan dalam bentuk stok kultur.
10 lC . I . I ·
lO . I .
50 I · · · · I · I . .
60 I .
HAH5 A T G G A G A A A A T A G T G C T T C T T C T T G C A A T A G T C A G T C T T G T T A A A A G T G A T C A G A T T T G C A T
M E K V L L l A V S l V K S D 0 C
pc0N"31HATM AT QQA Q A A A A T A Q T C C T T CT T C T T Q C A A T A Q T C A G T C T T GT T A A A A G T G A T C AG A TT T G C A T
M E K L A V S L V K S D 0 C
100 I . . I ·
::o I . . · I · i .
·zo 130 . . . I . ' .
HAHO A T G C A A A C A A T T C A A C A Q A G C A G G T T Q A C A C A A T C A T G G A A A A G A A C G T T A C T G T T A C A C A T
H A N N S T E Q V D T M E K N V T V T H pcDNA31HATM AT G C A A A C A A T T CAA CA G A G C A GG T T G A C A C A A T C A T G G A A A A GA A C G T T A c T G T TA CACA T
H A N N S T E Q V D T M E K N " T V T H
150 . I .
>to . I ·
170 I .
180 . I
190 I . . · I
200
HAH5 C A T A C T G G A A A A G A C A C A C A A C G G G A A G C T C T G C Q A T C T A G A T G G A G T G A A G C C T C T A A T T T
L E K T H N G K L C D L 0 G V K P L
p.cDNA31HATM CAT A c T G G A A AA G A C A C A C A A C G G G A A G C T c TGCGA T C T A G A T G G A G I GA A GCCTCT A A T T T
L E K T H N G K L C D D G V K P L
Z20 I · · · I . . · · I ·
230 I . . · · I ·
2<.0 . I ·
250 . I .
260 · I . . · I · · · I ·
270 I .
HAH5 T G T A G T G T A G C T G G A T G G C T C C T C G Q Q A A C C C A A T G T G T G A C G A A T T C A T C A A T G T A C C G G A
c s v A G w L l G N p M c 0 e F N v p e pc:ONA31HATM TOT A G T GT A QCT QQA T G G C TC C T CQGGAACCCAA T G T G I g A C G A A T T C A T C A A T GT A CCGGA
C S V � G W L G � P M C D E F N V P E .
I . I . . I 300
I . I . . . . . . I ))0
. I . I . . I HAH5 A C A T A G T G G A G A A G G C C A A T C C A A C C A A T G A C C T C T G l l A C C C A G G G A G T T T C A A C G A C T A T
Y V E K A N P T N 0 L C Y P G S N O Y
pc0NA31HATM A CAT A G t GGA G A A G G C C A A T C C A A C C A A T G.ACCTCT G T T A C C C A G G G A G T T T CAA CGACT A I
Y V E K A N P T N D L C Y P G S F N 0 Y
l60 370 I . I .
HAH5 G A A A C A C C T A T T Q A G C A G A A T A A A C C A
K' H L S f\ N
pc:ONA31HATM GAA A CAT C t AT T G A G C C G A A T A A A C C A
K H S R N
Garn bar 9. Hasil alignment pcDNA3.1 (+)HAll.TM
V.8. Pengklonaan adjuvan gen Cd40L ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1(+)
Sintesis DNA sisipan CD40L yang menyandi protein CD40L dilakukan melalui proses
amplifikasi polymerase chain reactor reverse transcriptase (RT-PCR) menggunakan RNA
yang diekstraksi dari sel PMBC mencit sebagai materi genetik pola cetaknya. Amplifikasi
DNA penyandi protein CD40L menggunakan reagen One Step RT-PCR Superscript 111/Taq
Platinum dan pasangan primer MSCD40L_F l dan CD40L F2. Gambar IO menunjukkan
hasil PCR dari DNA sisipan Cd401.
10000
l'et�: M :MMUOHA......,....
: ha<ll PCR CD40t. (782 bpi · : pob DHA CD40l (78l bp)
Garn bar I 0. Hasil PCR CD40L
DNA adjuvan Cd401 akan diklona ke dalam plasmid ekspresi mamalia pcDNA3. l
dengan situs restriksi HindIII dan EcoRI. Gambar 1 1 menunjukkan skema pengklonaan
DNA adjuvan Cd401 ke daI11:m vektor pcDNA3.1 .
Gambar 1 1 . Skema pengklonaan DNA adjuvan CD40L dalam vektor pcDNAJ. l
Plasmid pcDNA3. l (+) pertama-tama direstriksi dengan enzim restriksi Hindlll selama
16 jam. Hasil yang diharapkan adalah plasmid terlinearisasi, kemudian dipurifikasi
menggunakan QIAEXII gel extraction kit dengan metode desalting. Gambar 12
menunjukkan plasmid pcDNA3. l yang telah direstriksi dengan Hindlll dan dipurifikasi
C G � A G � G G 4 A G T � A , C C T T C A T0 A A G � l. T l 1 G T � T 1 C A T � c o ; � G ! G G 4 ; G f A A • C C T T C 4 T Q A j � � T T T t G , ;. r T C A T ;.
,t_, ··r . I I I ;. .:. ;. ;. � G C T • • � G � 0 4 T O C A • C · · � G G .& G � .& GG A T C T T T • T - ! � A A G C l A .;. l Q A O • T G C > .& C ll 4 • G G � G � • GG A � C T T 1 • 1
' : I �IC�_811GR c c ; •Ge l G .... � c fGTG,,.GG ... o Ii TG .. c:. :.GGC - ... i'. T J G . o. G ;. Cl).t:OLof'I C C T T GC t G ;. :. c r G J G , G G .& 0 4 T O A 0 ,;. ,t. G G C :. - � T T G • ,;. G -' Ornul Con'"'""''
�1C0.&.01.._IWGR CDoO<.on Oir\ut ConHn�1n
td)+WtCO-*OL._8'.HGR a:MCl\.on Ont.a1Conu11n1t
..oN.UtCD&.Ol_BHGR awo<.on OM:uf COl'l••n'l.1o1t.
... f r • I
C C T • G 1 c ;. ;. Q G � l � T ;. � C O T T � � � c - � � G � - G � G ;. � - � , ;. C C T T G T C ! ;. G G - T ! T ! � e o r r � � � c - � -=- G .t � G � G ;. ;. � � � �
. : · I I ' I � .
G � � � � C ! G C l T T G � � A l O C A A � O A O O i G J I G ! Q G A T C C T C G ; ;. � a C r G C T T l O � t � 1 G C A � ' 0 4 0 G i G � T O r G O � t C C 1 C
:• 1 • ' . ' I ! � � l ! GC ; G C A C � CO T l 0 l 1 r O CG - � o c c , � c � u 1 r ... 1 a c ! � � 1 1 o c ; G C .O C A C G T T G l � � o c c � - o cc , • c � G 7 � ! T GC
A G C � l C C G l f C T • C A G T 0 0 0 C C A � C � .l. � G G £ T a ? T A � � c c ' G C � T C C G l l C T n C � O T G G O C C A & 0 � £ A G G � T � T T � T A C C
1�.1 i I I I I ' I 4 T a lo. ' }'. .... G c ,I. . .;,,, c l t G G r " � f 0 c f r 0 It. A ,\ J. r GG G 4 .. ... c AG c 4 T G A � � � a c � � C � T G G l � A t f C f T Q A � A A T GG G A A A C A O C
�- � .:.� ' ' ' C C � 1 T C .t T C G T C G G C C T C T O O c · o - .1. o c c c 6 G C • G l G G .o.. T C C � 1 T C 6 T C G � c G G C C T C l G Q c f o ... � o c c c ..;.. G C ; G T G G .o. 1
poc0UAJtC�L.,.6HCA C TO ... G :. G .:. ;. T C T "I ;. C 1 C. .:. .:.oOC.CCC. - - T .o.. CCC .:... C .11. G l '! C CO�o" c j Q .lt. G .\ G .t - r e T T .;. c I c :. ..;.. Q O C O O C .a. .I. A 1 .- . e c. c ... cs.GT "J C C::IU•ulC9ft•·•"" .. '
pcOHAl1CO-.,..&HCR c · c c c -c;e'! T t G C C - G C - c c .. G : c · e r 1 c ;. .: ' t T G G G C G G • CQ.IOt..on c · c c c .o.GC"! 1 1 C. C G - tl C -oc .. c re t G . "' C ;. c J l G G G C G G Cl1.1•UICO"', .... ,�
••ONAl 1CC..OL_8HOA 0 � G f �TC ... ;:.. T T ;. c ... .. G c 1 OG T 0 c r i e - 0 T 0 � T t G T c ... - C G CO.liOl..•rl G , G T T T G .::. � T J ,. � .. ;. G c 1 G G , G c f • c T G T Ci ; T r G T c - M C; G Cl1.1•u•C-••"'•1.1•
I ·� . T G � C T G � � G C & • G C C A 4 G l 0 A l CC � C � 0 A C 1 T O G � T T C T C: r G .i:. c 1 c .:.. .; G C .1. • G C C ..., ... G r o .0 1 c c .. c .... o A C r 1 � G c r r c r c
EcoRI
Gambar 16. Hasil alignment DNA sisipan dengan gen CD40L mus musculus
Plasmid pcDNA3. J -Cd401 yang telah terverifik.asi dengan sekuensing kemudian akan
diisolasi skala besar dan dibuat stok kultur untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.
C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A G G A C A A G A A C C
A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A G G A C A A G A A C C
50 60 70 80 I I I I I I I I
G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A C G T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A CG T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C CG G C A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C
90 Barn HI m i20 I I I I I I I I
C A G C T A C G C A T A A G G A T C C G G T T G G A G G G A G C A A G T T C C T C A G C T A CG C A T A A G G A T C C G G T TG G A G GG A G C A ; G T T C C T C A G C T A C G C A T A A G G A T C C
1m MO 1� NO I I I I I I I I
G A C C A C CG C C A AG G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C CG G C G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C C G G C
170 180 190 200 I I I I I I I I
A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C C A G C T A C G C A T A A G G A T A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C C A N C T A C G C A T A A G G A T
210 220 230 2• I I I I I I I I
C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C TG A C C A C C G C C A A G G A C A A C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A GG A C A A
2-5.0 260 270 280 I I I I I I I I
pc0NA31P28(13)_BHGR G A CGG TGGG A GG A C C C C G G C A AG C TG T A C A A CG T G G A G G C p�DNA31P28(13)_CMVF G A CGG T G G G A G G A C C C C G G C A A G C TG T A C A A C G T G G A G G C p2B Clustal Cons•nsus
290 300 310 320 I I I I I I I I
pc0NA31P28(131_BHGR C A C C AG C T A C G C A T A AG GA T C C A C T AG T C C A G T G T G G T G G pcDNA31P28(131_CMVF C A C C AG C T A C G C A T A AG G A T C C A C T AG T C C A G T G i G G T G G p28 Clusul Consensu.s
pc0NA31P28(131_BHGR pcDNAl1P28(13)_CMVF p28 Clusul Con .. nsu•
JN l•O I I I I I
A A T T C T G C A G A T A T C C A G C � C A G T G G C G A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G
Gambar 19. Hasil sekuensing plasmid pcDNA-P28(13)
Sisa ligasi kemudian ditransfonnasi ulang, kemudian dilakukan seleksi koloni
terhadap plasmid rekombinan yang dihasilkan. Verifikasi sekuensing tehadap plasmid
pcDNA3. J -P28(5) menunjukkan bahwa fragmen P28 telah berhasil diklona ke dalam plasmid
pcDNA3 . 1 ( +) (Garn bar 20).
� w m � � I · · · · I · · I · • · I · · · · I · · I · I · · I · · I
00 70
P,1(5),_CMVF A A OCT TA AOT 1 CCT QACCACCOCCAAGOACA AOAACCQOTGQOAGOACCCCCCCAACCT ('1" A CAA CGTGG
K L K F L 1 T A K D K N A W ! D P 0 K l V U V
pU · · · · · · AAOTTCCTOACCACCQCCAA00ACAA0AACC001000A00ACCCCGOCAAGCTQTACAACGTOG
� f l T T A K 0 K N R W E D P G K L Y N V
· · · · I · · · I - - - - I - - - - I - - I -!>29(�)..CMV,- ACOCCACCAOCT A COCA T AAGGA TCC
! A T S V A • G S -· AOOCCACCAQCTACOCATAAGQATCC
! A T S V A • 4 S
Garn bar 20. Hasil alignment pcDNA3. l P28(5)
V.10. Pengklonaan adjuvan gen VP22 ke dalam vektor plasmid pcDNA3.l(+)
DNA sisipan VP22 diamplifikasi dengan template gen sintetik VP22, DNA sisipan
kemudian direstriksi dengan enzim restriksi Hindlll dan BamHI (Garn bar 21)
bp
3000-
1000· soo-100·
•
bp
10000-
3()00-
1000-
500-
1.llO -
b
Ketennpn: M :MaibDNA 1 : -f'Cll VP'22 (1.17 bp) z : VP22 llunHl-Hindlll (117 bp)
Gambar 2 1 . DNA insert VP22 dan vektor pcDNA3.1 (+)
Hasil ligasi dari DNA vektor dan sisipan VP22 kemudian diseleksi dengan PCR ko]oni
menggunakan primer yang mengamplifikasi daerah Mutiple Cloning Sites (MCS) dari vektor
plasmid pcDNA3. l(+). Berdasarkan hasil seleksi PCR (Gambar 22), beberapa kJona yang
diperkirakan positif mengandung DNA sisipan Yn2 kemudian diverifikasi sekuensing
(Gambar 23).
bp
1000 500
100 -
Keteranpn:
bp
1-14 : plasmid reloombinan pcDNA 3.l-VP22 {388bp) M : Mam DNA Wt : plasmid wild-type (271 bp)
Garn bar 22. Has ii PCR sekuensing klona plasmid pcDNA3. l -VP22
pc0NA31VP22( 4 J_BHO R pe.ONAl1VP22(4)_CMVF VPMR ' Clusul Cons•n•u•
.10 &O I J I l I I I G A G C T C T C T G G C T A O C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G O C T G A G C T C � C T O G C T A A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C � G O C l
:J ?.a :-o I I I I I I
T • T C G A A A T T A A T A C O A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A � O C T T A T C G A A A T T A a T A C O A C T C A C T a T A G G G A G A C C C A N G C T
Hindll oo 100 110 1.:v
I I I I I I I I G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C T TG A C G C T G C T A C A G C T A C G G C T O G C G T T T A a A C T T A A G C T TG • C G C T G C T A C A G C T A C
G � C O C T G C T A C A G C T A C '------' 1.H1 1.sO '::V 1H>·
l J I j $ ! 1 I A C G � G G T C G T T C T G C T � C T T C T A A O C C • A C T G A A C G 1 C C A • C G T G G T C G T T C T G C T G C T T C T A A A C C � A C T G A A C G , C C A A C G T O G T C G T T C T G C T G C T l C T A A A C C � A C T G A • C G T C C A
HUI :g..,. ;<.)1 I I I I r l J
C G T G C T C C � G C T C G T T c i o c T T C T C G T C C � C G T C G T C C � G C G � G C T C C � G C T C G T T C T G C T T C T C G T C C � C G T C G T C C A C C O T G C T C C A G C l C G T T C T G C T T C T C G T C C � C G T C G T C C � G
Bamff
T T G ;.. l T A A b � ... ,;:. T C �1 l C T � G T T G � � T � A b G A T C C A C T A N T T G . .1. A
Garn bar 23. Hasil sekuensing pcDNA3. l -VP22( 4)
5.7.Pengklonaan gen HA-HSNJ tanpa daerah traosmembran dan cytotoxic tail ke
daJam vektor plasmid pcDNA3-1(+)VP22 dan pcDNA3.1(+)Cd401
Tahap selanjutnya setelah semua gen berhasil dik.Jona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+)
adalah pembuatan vektor untuk fusi gen hemaglutinin dan adjuvan gen. Gen HA�TM dik.Jona
ke dalam vektor yang telah mengandung adjuvan gen, yaitu adjuvan gen CD40L, VP22, dan
P28.
DNA insert HALffM diamplifikasi menggunakan enzim TaqHifi polymerase, kemudian
diklona ke dalam pcDNA 3.l (+)CD40L. Fragmen HAf1TM basil PCR dipurifikasi,
kemudian direstriksi menggunakan enzim Nhel dan Hind/JI secara sekuensial. pcDNA3.1 (+)
yang telah mengandung fragmen CD40L digunakan sebagai vektor juga direstriksi dengan
enzim yang sama. Gambar 24 merupakan visualisasi hasil restriksi fragmen HA11TM dan
pcDNA3 . 1 CD40L
bp
6000 5000 3000
1000
-soo
bp
3000 1500 1200 1000
500
--
Agarosa 0,8 %, 100 V, 30 menit
Keterangan: M : marker
1 : pcDNA3.1(+) Cd401 uncur 2 : pcDNA3.1(+} Cd401- Nhel Hindi II
(6.210 bp}
Keterangan:
M : Marker
1 : HAllTM - Nhel Hindlll (1470 bp)
Gambar 24. Restriksi DNA insert HAf1TM dan vektor pcDNA3. I CD40_L dengan enzim Nhe 1 dan HindlII
Hasil digesti fragmen HALffM dan pcDNA. l CD40L dipurifikasi dengan low melting
agarose, selanjutnya diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase. Campuran reaksi ligasi
diinkubasi 16°C selama 1 6 jam. Kontrol ligasi yang digunakan yaitu campuran ligasi yang
hanya berisi vektor terlinearisasi, tanpa diberi DNA insert. Hasil ligasi selanjutnya
ditransformasi ke dalam set kompeten Escherichia coli TOP 10 dengan metode heat shock
Hasil koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR koloni dan dibuat replika koloni. Garn bar
25 merupakan visualisasi hasil PCR koloni pada agarosa 0,8%. Berdasarkan hasil PCR
koloni, terdapat 4 koloni dari total 8 koloni yang diverifikasi, mengindikasikan membawa
fragmen HAt1TM yaitu koloni no. 2,3,6, dan 7.
-
Agarosa 0,8%, lOOV, 30 men it
Ket er ,rng.rn: 1-8 : rekombinan pcDNA3.l(+)Cd401-HAbTM (2523 bp)
Wt : pcDNA3.l(+)Cd401 (1053 bp) M : marker
bp
3000
2500
1000
500
Gambar 25. PCR koloni plasmid rekombinan pcDNA3. l CD40L HA�TM
Koloni yang menunjukkan hasil positif pada PCR koloni kemudian diverifikasi
kembali dengan teknik digesti. Plasmid rekombinan dilinearisasi menggunakan enzim
HindIII untuk memastikan ukuran plasmid rekombfoan. Gambar 1 8 menunjukkan hasil
visualisasi verifikasi digesti plasmid · rekombinan pada gel agarosa 0,8%. Hasil linearisasi
plasmid rekombinan pcDNAJ.l(+)Cd401 HALffM koloni 2,3,6, dan· 7 menunjukkan pola
migras.i antara marka DNA 6.000 dan 7.000 bp. Sesuai dengan yang diharapkan yaitu
berukuran 7.680 bp, gabungan antara pcDNA3 . 1 CD40L (6.2 10 bp) dan .HA�TM (1 .470 bp).
bp
8000 6000 5000
3000
1000
soo
Ket er angan:
Agarosa 0,8%, lOOV, 30 m;.>nit
M : marker
Wt : pcDNA3. l(+)Cd401-HA6TM uncut
1-8 : linearisasi pcDNA3.l(+)Cd401-HA6TM dengan Hindlll (7.680 bp)
Garn bar 26. Linearisasi rekombinan pc DNA 3. l CD40L HA6 TM dengan