izolovanje biljnih pigmenata.doc

Izolacija biljnih pigmenata

Filip Kovai, Vesna Cmreki, Antun Kuak1, Branka Pevalek-Kozlina2

1Rudarska i kemijska kola, Hallerova aleja 3, 42000 Varadin 2 Botaniki zavod, Prirodoslovno-matematiki fakultet, Zagreb

1. Uvod - 2. Materijali - 3. Postupak - 4. Identifikacija izoliranih spojeva - 5. Rezultati -

HYPERLINK "http://www.biol.pmf.hr/e-skola/radovi/karoten/Karoten.htm" \l "Rasprava#Rasprava" 6. Rasprava i zakljuak - 7. Literatura - Povratak

1. UvodBiljne stanice se od ivotinjskih stanica meu ostalim razlikuju i po tome to imaju plastide. Plastidi su lipidima bogati reakcijski prostori, odijeljeni od osnovne citoplazme dvostrukom ovojnicom. Ti prostori esto su upadljivo obojeni bojama topivim u mastima (lipokromima), te slue kao organeli u anabolizmu fotosintetske asimilacije ugljika i/ili kondenzaciji kroba. Plastidi imaju vlastitu DNA, RNA i ribosome, a razmnoavaju se diobom na dva dijela. DNA plastida razlikuje se od stanine po odnosu baza i po gustoi.

U biljnim stanicama prisutna su tri osnovna tipa potpuno diferenciranih plastida: 1. fotosintetski aktivni kromatofori (zeleni kloroplasti, smei feoplasti, crveni rodoplasti), 2. fotosintetski neaktivni kromatofori (crveni i uti kromoplasti) 3. Fotosintetski neaktivni bezbojni leukoplasti

Klorofil (Shema 1), najvaniji biljni pigment koji je aktivan za vrijeme fotosinteze, nalazi se u kloroplastima uklopljen u tilakoidnim membranama. On moe u odreenim uvjetima biti prekriven drukije obojenim popratnim pigmentima pa kromatofori nisu vie zeleni, ve smei ili crveni. U vodi netopljivi, djelomino lipofilni klorofil pojavljuje se u veine biljaka u dva kemijski srodna oblika: kao modrozeleni klorofil a i kao utozeleni klorofil b. Njihov je kvantitativni odnos otprilike 3:1. Klorofili sadre porfirinsku jezgru od etiri pirolska prstena u ijem se sreditu nalazi atom magnezija na koji je vezan fitolni rep. Porfirinska jezgra je hidrofilna, a fitolni rep bogat -CH3 skupinama je hidrofoban i lipofilan. Stvaranje monomolekularnog sloja klorofila na graninim slojevima bjelanevina i lipida rezultat je hidrofobnih i hidrofilnih svojstava klorofila. U tilakoidnim membranama kloroplasta uz zelene klorofile pojavljuju se u manjoj koliini naranastocrveni karotenoidi i uti ksantofili.

Shema 1:Klorofil

Crvene, naranaste i ute boje voa, povra i cvjetova potjeu od djelomino fotosintetski neaktivnih kromoplasta u kojima se nalaze pigmenti poznati pod nazivom karotenoidi. Ukupan udio klorofila i karotenoida u biljkama je 0.5-1 % suhe tvari. Oni mogu biti prisutni u razliitim strukturama: plastoglobulima (lipidne kapljice) ili nakupinama tubula, koncentrino rasporeenim membranama. Prilikom nagomilavanja karotenoida u kromoplastima moe doi i do njihove kristalizacije i luenja u citoplazmu u takvom obliku. U spreminom tkivu mrkve uvijek nalazimo takve kristale.

Karotenoidi, kojih je do danas otkriveno vie stotina, po kemijskom su sastavu tetraterpenoidi ope formule C40H50, a po fizikim svojstvima lipidi pa su topljivi u mastima i drugim organskim otapalima (lipokromi). Sredinji dio molekule karotenoida graen je od dugog, konjugiranog niza, najee osam izopropenskih jedinica vezanih tako da dvije -CH3 grupe najblie sredini zauzimaju poloaj 1,6, a ostale su u poloaju 1,5. Krajevi lanca su ili otvoreni ili su na njih vezana dva prstena ili je jedan kraj lanca otvoren, a na drugom kraju je prsten. Posljedica ovakve strukture je velika reaktivnost, podlonost autooksidaciji, intenzivna boja i karakteristini apsorpcijski spektri. Kod karotenoida postoji mogunost pojave velikog broja cis-trans izomera, ali karotenoidi se u biljci veinom nalaze kao "E" izomeri tj. sa svim dvostrukim vezama u trans poloaju. U otopinama, te pod utjecajem svjetlosti karotenoidi prelaze u "Z" izomere.

Oksidacijski produkti karotenoida, ksantofili, topljivi su u alkoholu i luinama. Karotenoidi vezani za bjelanevine i ugljikohidrate topljivi su u vodi. Najei karotenoid, koji je meuprodukt u sintezi vitamina A (retinola), je -karoten (Shema 2), a moe se izolirati iz mrkve. Uz -karoten u malim koliinama uvijek se nalaze L-karoten,G-karoten i D-karoten.

Shema 2: - karoten2. Materijali

2.1. pribor

Mrkva, blitva, tarionik s tukom, Erlenmeyerova tikvica, magnetska mjealica (Rotamix, Tehtnica 550 MMh), povratno vodeno hladilo, lijevak za odjeljivanje, tikvica s okruglim dnom, lijevak, filtar papir, Bchnerov lijevak, odsisna boca, semimikro-epruveta, porculanska posudica, pipeta, vodena kupelj, kromatografska kolona (zrano hladilo), kromatografska kada, ploice za tankoslojnu kromatografiju, ae, Petrijeve posudice, hladnjak, gumeni ep, vata.

2.2. kemikalije

Metanol (CH3OH) , petroleter, natrijev sulfat ( Na2SO4 bezvodni), kloroform (CHCl3), aluminijev oksid (Al2O3), aceton (CH3COCH3), diklormetan (CH2Cl2), natrijev klorid (NaCl), suhi dietileter ((CH3CH2)2O), apsolutni etanol ( C2H5OH, 100%).

3. Postupak

3.1. izolacija klorofila iz blitve

U tarioniku se najprije izgnjei 6 g zamrznutog lia blitve s 50 ml metanola kako bi se razorila stanina stijenka i time olakala ekstrakcija klorofila iz kloroplasta (Slika 1). Metanolni sloj u kojem se ekstrahiraju polarne organske tvari koje bi smetale pri kristalizaciji i identifikaciji odfiltrira se preko obinog filtar papira. Izgnjeena blitva mijea se sa smjesom od 25 ml metanola i 35 ml petroletera u Erlenmeyerovoj tikvici na magnetskoj mjealici pet minuta pri 300 ok/min, pri emu dolazi do ekstrakcije biljnih pigmenata u petroleter (Slika 2). Ekstrakt se profiltrira u lijevak za odjeljivanje. Mijeanje se ponovi sa zaostalim talogom blitve, 25 ml metanola i 75 ml petroletera. Oba ekstrakta se spoje i lagano izmukuju u lijevku za odijeljivanje pri emu dolazi do raslojavanja metanolnog od petroleterskog sloja (Slika 3) . Donji metanolni sloj ispusti se, a gornji, zeleni petroleterski sloj sui se u Erlenmeyerovoj tikvici bezvodnim natrij sulfatom da bi se uklonio ostatak vode. Ekstrakt se profiltrira preko naboranog filtar-papira u tikvicu s okruglim dnom. Na vodenoj kupelji uz stalno mijeanje pri temperaturi od 70 C, otapalo se uparuje dok ne preostane 2-2,5 ml otopine biljnih pigmenata koja se koristi za kromatografiju u koloni.

3.2. IZOLACIJA -KAROTENA IZ MRKVE

Ekstrakcija karotenoida oteana je jer su to vrlo nestabilne tvari koje su pod utjecajem svjetlosti, kisika i topline podlone izomerizaciji i autooksidaciji prilikom ega se razgrauju. Nariba se 10 g mrkve, potom se refluksira sa 25 ml metanola i 50 ml diklormetana pod povratnim vodenim hladilom u tikvici s okruglim dnom preko vodene kupelji pri temperaturi od 50-55 C pet minuta uz povremeno mukanje (Slika 4). U metanol se ekstrahiraju polarne organske tvari, a u diklormetan nepolarni karotenoidi. Ohlaena smjesa filtrira se preko Bchnerova lijevka na vakuum sisaljci te se isti postupak ponovi s preostalim uzorkom mrkve i 50 ml diklormetana kao to je ve opisano. Oba filtrata spoje se i tri puta lagano izmukuju u lijevku za odjeljivanje s 50 ml vode da se uklone preostale polarne tvari iz diklormetana (Slika 5, 6). Stvori li se emulzija pri izmukivanju, dodaje se malo natrijeva klorida da se slojevi lake odijele. Donji, naranasti sloj diklormetana u kojem se nalaze otopljeni karotenoidi, ispusti se u Erlenmeyerovu tikvicu i sui bezvodnim natrijevim sulfatom. Gornji vodeni sloj, koji sadri polarne tvari, se odbaci. Otopina karotenoida filtrira se preko naboranog filtar-papira u tikvicu s okruglim dnom te se otapalo upari na vodenoj kupelji pri temperaturi od 85 C na oko 2 ml. Otopini ekstrakta u porculanskoj posudici dodaje se 2 ml etera te se toploj otopini dokapava apsolutni etanol do zamuenja. Topljivost karotenoida u etanolu je slaba zbog njihove nepolarne grae, pa dodatkom etanola dolazi do njihovog taloenja. Potpunije taloenje postie se hlaenjem u hladnjaku pri temperaturi priblino oko 5 C.

4. Identifikacija izoliranih spojeva

Kao pouzdana i jednostavna metoda za identifikaciju i razdvajanje izoliranih spojeva odabrana je kromatografija. Tankoslojna kromatografija preteno se koristi za identifikaciju spojeva u smjesi, a kromatografija u stupcu za njihovo razdvajanje. Za uspjenost kromatografije vrlo je vaan pravilan izbor mobilne i stacionarne faze.

4.1. kromatografija u koloni

Na dno kromatografske kolone stavi se svitak vate i zaepi gumenim epom, 1/3 volumena kromatografske kolone napuni se petroleterom te ispuni s oko 10 g silicijeva dioksida, a na vrh se nanese otopina ekstrakta pigmenata. Stijenka se ispere s malo petroletera pri emu se ekstrakt potpuno upije na adsorbens. Eluira se smjesom aceton:petroleter (10:90). Eluat se hvata u Erlenmeyerovu tikvicu (Slika 7, 8) . Pri pojavi prve obojene kapi, tikvica se promijeni, aeluiranje se nastavlja. Klorofilna frakcija eluira se acetonom. Pigmenti se uvaju u mraku, pod vakuumom i na hladnome kako bi se sprijeilo njihovo raspadanje.

4.2. tankoslojna kromatografija

Svaki izolirani materijal vrlo je vano tono identificirati iako se izolacija obavlja po ve dokazanome protokolu. Kromatografija, tankoslojna ili na papiru, pouzdana je metoda koja se esto koristi za identifikaciju i odvajanje komponenata. Mi emo takoer na uzorak ispitati kromatografskom metodom.

Izolirane kristale biljnih pigmenata najprije otopimo u to manjem volumenu etera. Mala koliina uzorka nanese se na startnu liniju kromatografske ploice te se prieka da otapalo ishlapi. Za eluiranje se koristi vie sustava otapala:

1. petroleter : metanol = 22 : 3 2. petroleter : etanol = 22 : 3 3. dietileter : etanol = 22 : 3

Eluiranje uzorka vri se u aama poklopljenim Petrijevim posudicama. Nakon to je otapalo doseglo frontnu liniju kromatogram se izvadi iz ae, zabiljei se frontna linija i ostavi na zraku da se osui. Kako bi se dobivene mrlje pojaale, osueni kromatogrami ostave se nekoliko minuta u zatvorenoj posudi s par kristalia joda. Vezanjem joda na konjugirane veze karotenoida mrlje potamne, te takve ploice moemo uvati due vrijeme. Izmjerene su udaljenosti mrlja od startne linije te su izraunate Rf vrijednosti (Tablica 1). Kombiniranjem otapala dolo se do zakljuka da je najpogodniji sustav otapala za eluiranje biljnih pigmenata petroleterom, jer su u tim sluajevima dobivene dvije mrlje razdvojenih pigmenata.

5. Rezultati

Ekstrakcijom klorofila iz lia blitve, pomou metanola i petroletera, dobivena je smjesa biljnih pigmenata. Kromatografijom u koloni dobivene su tri frakcije: utonaranasta, svijetlo i tamnozelena (Slika 9) . Na temelju boja zakljueno je da su to karotenoidi, svjetliji klorofil b i tamnije zeleni klorofil a koji je dobiven u veoj koliini od klorofila b.

Ekstrakcijom mrkve pomou metanola i diklormetana dvostrukim refluksiranjem, dobivena je smjesa karotenoida to je zakljueno prema naranastoj boji. Tankoslojnom kromatografijom odreene su Rf vrijednosti (Tablica 1) razdvojenih mrlja za koje pretpostavljamo da su dva razliita karotena.

1.2.3.

prva mrlja0,750,770,68

druga mrlja0,560,59-

Mobilne faze:

1. petroeter : metanol = 22 : 3 2. petroleter : etanol = 22 : 3 3. dietileter : etanol = 22 : 3

6. Rasprava i zakljuak

Izolacija biljnih pigmenata provedena je uspjeno prema postojeim protokolima uz prilagodbe srednjokolskom laboratoriju vezane uz nedostatak tehnikih sredstava.

Na temelju rezultata dobivenih kromatografijom u koloni, zakljueno je da je klorofil ipak neto "polarniji" od karotenoida jer se klorofilna frakcija eluira uspjenije acetonom, nego petroleterom.

Rezultati tankoslojne kromatografije nisu u potpunosti zadovoljavajui zbog nedostatka standardnog uzorka s kojim bi bilo mogue usporediti izolirani materijal i zbog nedostatka literaturnih podataka o slinim analizama.

Snimanjem apsorbancije na 642,5 i 660 nm mogu se tono identificirati klorofili, dok se - karoten moe identificirati snimanjem apsorbancije pri 452 nm.

7. Literatura

[1] V. Rapi; Postupci priprave i izolacije organskih spojeva; kolska knjiga, Zagreb 1994.

[2] D. von Denffer, H. Ziegler; Botanika, morfologija i fiziologija; kolska knjiga, Zagreb 1988.

[3] P. Karlson; Biokemija; kolska knjiga; Zagreb; 1988.

[4] http://dcb-carot.unibe.ch/nomen.htm