IV° CONGRESSO LATTIERO – CASEARIO AI.T.e.L. Latte e Derivati : ricerca , innovazione e valorizzazione G. Bolzoni Centro Referenza Nazionale Qualità Latte Bovino Legnaro (PD) 12/09/2014 Determinazione quantitativa di Cl. tyrobutyricum nel latte con tecniche biomolecolari : risultati preliminari e prospettive D. Bassi , P.S. Cocconcelli – Università Cattolica sede di PC e CR G. Delle Donne, E. Pavoni, G. Bolzoni - IZSLER Brescia
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IV° CONGRESSO LATTIERO – CASEARIO AI.T.e.L. lattiero/6_Bolzoni et... · Preparazione Campioni : 100 mL di latte bianco sono stati contaminati con 100 µL di ... estrazione DNA
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IV° CONGRESSO LATTIERO – CASEARIO AI.T.e.L.
Latte e Derivati : ricerca , innovazione e valorizzazione
G. Bolzoni Centro Referenza Nazionale Qualità Latte Bovino
Legnaro (PD) 12/09/2014
Determinazione quantitativa di Cl. tyrobutyricum nel latte con tecniche biomolecolari : risultati preliminari e prospettive
D. Bassi , P.S. Cocconcelli – Università Cattolica sede di PC e CR
G. Delle Donne, E. Pavoni, G. Bolzoni - IZSLER Brescia
CLOSTRIDI SPORIGENI ANAEROBI
Nel secolo della globalizzazione (anche lattiero-casearia) un vecchio (e complicato) problema per pochi eletti
Industrializzazione della caseificazione, riduzione delle stagionature, incremento igiene del latte e standardizzazione delle flore microbiche ambientali, metodi analitici poco efficaci, influenza ridotta sulla sicurezza alimentare, limitate novità, poche possibilità di interventi correttivi e preventivi
La notevole variabilità in Frequenza ed Entità rende difficile quantificare il danno produttivo
(differenze PR e GP, utilizzo forme alterate, tempi di comparsa)
Soprattutto differenze tra caseifici e tra periodi ( 1-4 % delle forme con ± 1000 % !!)
difficile anche definire con precisione causa-effetto • Quali e quante spore determinano un danno quantificabile ? • In quali condizioni ? • Senza Lisozima (GP) ??
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Malgrado decenni di ricerche e sperimentazione la relazione tra quantità e tipo di spore nel latte e tipo ed entità del danno nel
formaggio è tutt’altro che «robusta»
Tra i tanti motivi :
• ridotta accuratezza analitica del metodo di Screening (MPN) • la germinazione delle spore nella cagliata è variabile
• l’azione fermentante delle forme vegetative è variabile e condizionata dalle condizioni microambientali • l’azione di altri microrganismi ( sporigeni e non ) e di altri fattori tecnologici interagiscono con comparsa ed entità del gonfiore o La formalina prima, il lisozima poi ed il divieto di insilati condizionano le possibilità di indagine, tenendo sotto controllo relativo l’incidenza del problema
o VANTAGGI : Applicabile su grandi numeri di campioni a costi contenuti (strumentazione limitata,
competenze ridotte) ; Risultati aspecifici ma ormai consolidati in termini di significatività ; Migliorabile marginalmente con appesantimenti procedura ;
o SVANTAGGI : Ridotta accuratezza , limitata ripetibilità, scarsa riproducibilità, tempi lunghi; Conteggio «Spore» aspecifico; Correlazione con danni caseari poco costante; Distribuzione dati «non normale» per elaborazioni statistiche, e valutazioni ; Variabilità procedura applicativa, soggettività esito; NOTA BENE : se utilizzato per una classificazione sul medio periodo del latte di un allevamento
«problema» rimane idonea all’uso; se utilizzata per valutare una tantum il latte ed i prodotti derivati non è sufficientemente efficace
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ALTRE METODICHE POSSIBILI
Microbiologia classica con varianti (terreni, condizioni, prove biochimiche di tipizzazione ) Conducibilità Metodiche Molecolari o Vantaggi : notevoli in termini di specificità, accuratezza , ripetibilità
o Svantaggi : applicabilità su ampi numeri, quasi sempre, limitata ; differenziazione spore e forme vegetative non sempre efficace/possibile NOTA BENE : per ricerche , approfondimenti, verifiche sono tutte idonee ; attualmente non ancora applicabili in termini routinari
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Polymerase Chain Reaction (PCR) e Real Time PCR
La Real Time PCR misura l'amplificazione del DNA in tempo reale (qrt-PCR) durante la fase esponenziale della reazione permettendo di «tenere sotto controllo» le reazioni aspecifiche (falso positivo) e, con l’ausilio di standard di calibrazione, può esprimere risultati quantitativi della presenza iniziale dei microrganismi target
proge.o di fa3bilità
applicazione rou<naria e sviluppo di metodiche biotecnologiche per la determinazione quan<ta<va di sporigeni anaerobi nel la.e
Base di Partenza : Numerose Esperienze e Proge3 di Ricerca Università Ca.olica S.C. di PC/CR; PRC 2007 IZSLER -‐ PCR qualita<va e semiquan<ta<va per Cl. sporogenes – Cl. butyricum – Cl. tyrobutyricum ; varie altre esperienze nazionali ed internazionali : - Quan@ta@ve Detec@on of Clostridium tyrobutyricum in Milk by Real-‐Time PCR L. Lopez-‐Enriquez, D. Rodriguez-‐Lazaro, M. Hernandez; ( 2007) – Appl. Environ. Microbiol. , vol. 73 no. 11 3747-‐3751 -‐ Iden@fica@on of Clostridium tyrobutyricum as the causa@ve agent of late blowing in cheese by species-‐specific PCR amplifica@on.) N Klijn, F F Nieuwenhof, et. al. ( 1995 ). Appl. Environ. Microbiol., vol. 61 no. 8 2919-‐2924 -‐ A direct PCR detec@on method for Clostridium tyrobutyricum spores in up to 100 milliliters of raw milk. L.M. Herman, J.H. De Block, G.M. Waes (1995) Appl. Environ. Microbiol., vol. 61 no. 12 4141-‐4146
RISULTATI PRELIMINARI- FASE 2 Prove di estrazione e RTQ-PCR in matrice latte
Allestimento Latte «bianco» per diluizioni : UHT microfiltrato centrifugato, risospeso in S.F. ; verificato con colorazione di Shaeffer & Fulton
Preparazione Campioni : 100 mL di latte bianco sono stati contaminati con 100 µL di sospensione di spore di Cl. tyrobutyricum ottenendo una concentrazione in sospensione di 2 x 104 spore/ 100 mL à ovvero 200 spore/mL (à 200.000 spore/litro : «Latte +104»)
seguito da diluizioni seriali analizzate in doppio.
Processazione Campioni : centrifugazione, sospensione pellet, estrazione DNA con Lysis Tubes L + QIAamp Cador Mini Kit
Da valutare effetti di interferenza con altri Clostridi
??? % Germi Sporigeni Anaerobi Gasogeni
( Gen. Clostridium, Gen. Bacillus)
Tempo analisi 24/48 ore 7 giorni
Carico di lavoro 180 cp / giorno 400 cp / giorno
Costo complessivo E’ Stimabile un costo complessivo qrt-PCR da 2 a 4 volte quello MPN (esclusa strumentazione)
NOTA BENE : la sensibilità diagnos@ca NON E’ CONFRONTABILE (target diverso e differenza procedura di calcolo)
PROSPETTIVE
• Ulteriori studi applica<vi e di validazione sono indispensabili
• In par<colare sono da valutare le possibilità di
assemblare in un’unica procedura anali<ca gli altri Clostridi target ( Mul<plex)
• Più che sperimentazione di confronto/ correlazione con i risulta@ della metodica tradizionale (MPN), sarebbe par@colarmente necessario sperimentare la correlazione tra esi@ PCR e cara1eris@che qualita@ve delle forme e comparsa di gonfiore nel formaggio
T.H.M. CAMBIAMENTO
Tanto per cambiare
(le conseguenze sono spesso peggiora<ve)
Perché tu1o rimanga uguale
( Ga.opardo)
Per migliorare
Nel caso degli Sporigeni Anaerobi sembra possibile con
sperimentazioni tecnico-scientifiche e modifica del «punto di vista» pratico