Pesticidi organofosforici ed effetti neuroendocrini e comportamentali in modelli animali: rilevanza per la valutazione dei rischi per la salute neuropsicologica in età evolutiva. G. Calamandrei, A. Olivieri, A, Venerosi, L. Ricceri Dipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, Roma ISS, 15 ottobre 2008
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ISS, 15 ottobre 2008old.iss.it/binary/inte/cont/1Calamandrei et al. - Pesticidi... · Evidenze di interferenza con il sistema endocrino per molti insetticidi ( o,p´-DDT, endosulfan,
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Pesticidi organofosforici ed effetti neuroendocrini e comportamentali in modelli animali: rilevanza per la
valutazione dei rischi per la salute neuropsicologica in età evolutiva.
G. Calamandrei, A. Olivieri, A, Venerosi, L. RicceriDipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze,
Istituto Superiore di Sanità,Roma
ISS, 15 ottobre 2008
. Pesticidisostanze o i prodotti chimici capaci di controllare, limitare, respingere o
distruggere gli organismi viventi (microrganismi, animali o vegetali) considerati come nocivi, o di opporsi al loro sviluppo
Evidenze di interferenza con il sistema endocrino permolti insetticidi ( o,p´-DDT, endosulfan, dieldrin, methoxychlor, kepone,
dicofol and toxaphene);alcuni erbicidi (alachlor, atrazine and nitrofen);fungicidi (benomyl, mancozeb and tributyl tin);nematocidi (aldicarb e dibromochloropropane).
Neurotossicità potenzialedella maggioranza degli insetticidi:Effetti sul SN mediati da meccanismi neuroendocrini?
NOAEL (not osservable adverse effect level) livello di concentrazione di un principio attivo assumibile da un animale di laboratorio nel lungo
periodo senza mostrare effetti avversi.
ADI (acceptable daily intake)dose giornaliera di fitofarmaco accettabile per l’uomo
NOAEL/100
Questo modello non tiene in considerazione fattori molto importanti quali la compresenza di più principi attivi contemporaneamente(multiresiduo), spesso con analogo meccanismo d’azione,e, per quanto riguarda il valore del singolo residuo,gli effetti calcolati su organismi diversi da quello “tipico”(maschio adulto di circa 70 kg)
LIMITI DEI PARAMETRI STIMATI PER LA VALUTAZIONE DEI RISCHI
PER LA SALUTE UMANA
RICONSIDERAZIONE DEI PROCESSI DI VALUTAZIONE DEL RISCHIO
VIE DI ESPOSIZIONE A UN PESTICIDA:PECULIARITA’ DELL’ORGANISMO IN
SVILUPPO
• Periodo fetale: attraverso la placenta in seguito ad esposizione materna occupazionale/residenziale/attraverso la dieta
• Periodo neonatale: attraverso l’allattamento, il contatto cutaneo, l’espirazione
• Periodo infantile: direttamente dall’alimentazione, o esposizione a polveri in ambiente domestico, terreno contaminato, etc.
Il bambino non è un adulto in miniaturama ha specifiche caratteristiche
eto-ecologiche, che lo espongono a maggiori rischi
• Statura: più vicino al terreno, più esposto alle polveri
• Comportamento: portare gli oggetti e le mani alla bocca aumenta il rischio di esposizione ai tossici
• Dieta meno variata e più ricca di frutta• Sistemi enzimatici di detossificazione ancora
immaturi
Scenario reale: esposizione protratta e a basse dosi durante tutto il corso dello sviluppo pre e postnatale
RISCHIO PIU’ ELEVATO CHE PER L’ORGANISMOADULTO di perturbazione di molteplici processi
maturativi nel sistema nervoso, endocrino, immunitario
Fonte Eurostat 2007
INSETTICIDI ORGANOFOSFORICI
• Inibitori dell’enzima acetilcolinesterasi, azione neurotossicadeterminata dall’accumulo del neurotrasmettitore acetilcolina nello spazio sinaptico con conseguente sovrastimolazione della trasmissione colinergica
• Effetti acuti da esposizione occupazionale: convulsioni, paralisi, neuropatie legati ad inibizione AChE superiori al 60% dei valori di controllo
• Relativamente privi di effetti avversi sull’uomo (adulto) per esposizioni a basse dosi
Dalla seconda metà degli anni ‘90, dati sperimentalianimali indicano la possibilità di una maggiore suscettibilità dell’organismo in sviluppo agli effetti degli OP, e in particolare del CPF (EPA, 1996)
Gurunathan al, Environ Health Perspect, 1998: calcolando la molteplicità delle fonti di esposizione e le caratteristiche etologiche di bambini sotto i tre anni di età, si arriva a un’esposizione reale al clorpirifosalmeno 10 volte superiore all’ADI (0.03 mg/kg/day) stabilito per l’organismo adulto.
Ostrea et al., Neurotoxicology, 2002: nel meconio riscontrate concentrazioni di CPF di circa 5 mg/kg
Nel 2001, sulla base della revisione dei dati, l’impiego residenziale
del CPF viene vietato negli Stati Uniti, così come l’uso dello stesso insetticida nei parchi e nei luoghi pubblici
frequentati dai bambini
Dati clinici ed epidemiologici (2000-2006): gli organofosfati interferiscono negativamente
con il neurosviluppo nell’uomo• High maternal levels of CPF in association with low
maternal levels of PON associated with significantreduction in head circumference at birth (Berkowitzet al., EHP, 2004)
• Impaired short-term memory and attention in children exposed to methyl-parathion (Ruckartz et al., EHP, 2004)
• Abnormal reflexes as assessed in the Brazeltonscale in neonates exposed in utero toorganophosphorous pesticides: higher levels of OP metabolites in the mother’s urine are associatedwith hyporeflexia after 3 days from birth (Young et al., Neurotoxicology, 2005).
• High chlorpyrifos levels in umbilical cord plasma are predictive of lower neuropsychological scoresat 3 years of age: deficit in attention, hyperactivity, low psychomotor and mentaldevelopment indexes (Rauh et al., Pediatrics, 2006)
Studi su modelli animali:effetti avversi del CPF sul neurosviluppo
Anche in assenza di significativa inibizione AcHE, esposizione perinatale al CPF• altera trascrizione genica e sinaptogenesi• colpisce sistemi di neurotrasmettitori diversi dal
colinergico(noradrenergico, serotonergico)• neuroni bersaglio preferenziale nella fase prenatale,
cellule gliali in quella postnatale
Protocollo sperimentale di esposizione neonatale al CPFa dosi prive di tossicità sistemica e comparabili
all’esposizione umana
Infancy
1 4 5 8 10 11
CPFULTRA
SOUNDS
25 45 60Postnatal day
Treatment
Behavioral testingLOCOMOTOR
ACTIVITY
Weaning Adolescence AdulthoodDevelopmental stage
11 14
CPF 25 45 60
SOCIAL INTERACTIONS
PASSIVE AVOIDANCE
Postnatal day
HOMING
Trattamento giorni 1-4: % inibizione AChE= 20%Trattamento giorni 11-14: nessuna inibizione
20
40
60
80
Vehicle CPF 1 mg CPF 3 mg
Locomotor activity(pnd 25)CPF 1-4
Dis
tanc
etra
velle
d(m
)
CPF 11-14*
Weaning
Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol
Allo svezzamento (giorno 23)gli animali esposti al CPF nel
periodo neonatale avanzato (11-14) mostravano una più elevata attività motoria ed esplorativa,
un effetto dose dipendente.
Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol
All’adolescenza (giorno 45), gli animali esposti al CPF, sia ai gg 1-4 che ai gg 11-14, erano più attivi nell’esplorazione di un nuovo ambiente (test di novelty seeking)
emostravano una prevalenza di interazioni
aggressive con un conspecifico non familiare, ad un’età alla quale di solito
prevalgono i comportamenti di tipo affiliativo
Adolescence
CPF 1-4
0
5
10
15 Vehicle-mCPF 1 mg-mCPF 3 mg-m
0
5
10
15
1
CPF 11-14
5-min-blocks
Total aggressive responses(pnd 45)
2 3 4
1 2 3 4
Num
bero
f res
pons
espe
r min
* *
* *
* *
AGONISTIC BEHAVIOUR
PND11 PND14
CPF
4 - 5 months
LOCOMOTOR ACTIVITY
SOCIAL RECOGNITION
MATERNAL BEHAVIOUR
2 monthsGD15 GD18
CPF
Birth
Esposizione prenatale + neonatale al CPFDisegno sperimentale
PLUS MAZE
Prenatal Postnatal
Le dosi di clorpirifos utilizzate sono dosi al di sotto della soglia di tossicità (inibizione dell’acetilcolina esterasi < del 50% nel siero, assenza di inibizione significativa nel cervello)e paragonabili alla massima esposizione umana attraverso dosi subtossiche
3 6
0
20
40
60
80
100
**
Prenatal treatment CPF (mg/kg)3 6
0
50
100
150
200Serum Brain
Attività cerebrale e sierica della Ache
PND 15
PND 0
% o
f cha
nge
from
Con
trol
% o
f cha
nge
from
Con
trol
% o
f cha
nge
from
cont
rol
0
20
40
60
80
100
120
Postnatal CPF (mg/kg)
*
*
*
31veh
% o
f cha
nge
from
cont
rol
0
20
40
60
80
100
120
140
31veh
#* * *
6 mg/kg3 mg/kgveh
Prenatal CPFmg/kg
Brain Serum
Freq
uenc
yof
Cro
ssin
g
veh 1 3
Postnatal CPF (mg/kg)
0
150
200
250
300
350
40063veh
Prenatal CPFmg/kg
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
*
**
*
*
**
##
Open field, valutazione dell’attività spontanea in un ambiente nuovo
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase prenatale e/o postnatale
determina un aumento dell’attività locomotoria nei maschi adulti
Dur
atio
n (s
)
Prenatal CPF (mg/kg)
0
1
2
3
4
veh 3 6
Submissive uprightposture
Attack response
Postnatal CPF (mg/kg)
0
2
4
6
8
Dur
atio
n (s
)
veh 1 3
Freq
uenc
y
0
1
2
3
4
5
veh 1 3
* *
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase prenatale induce un comportamento pro-aggressivo durante un incontro sociale
tra maschi adulti
Comportamento Agonistico
Freq
uenc
y
01234567
veh 1 3
Postnatal CPF (mg/kg)
Defensive uprightposture
Offensive uprightposture
Prenatal CPF (mg/kg)
01234567
Freq
uenc
y
*
veh 3 6
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale induce un comportamento pro-aggressivo durante un incontro
sociale tra maschi adulti
Comportamento Agonistico
Postnatal CPF (mg/kg)
Licking
Freq
uenc
y
Dur
atio
n (s
)
02468101214
veh 1 3
*
020406080100120
veh 1 3
* *
Sniffing
Freq
uenc
y
Postnatal CPF (mg/kg)
9
01357
veh 1 3
* *
Freq
uenc
y
Crouching response
Dur
atio
n (s
)
veh 1 3 0
1
2
3 * *
veh 1 301020304050 * *
Postnatal CPF (mg/kg)
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale aumenta i
comportamenti “materni” durante un test di induzione materna in femmine
vergini
Induzione del comportamento materno
R
ResidentR P1
R P1
ResidentR P2
45 min
45 min
Riconoscimento sociale
T= Training (3 min)
= Retest Same (3 min)
= Retest Different (3 min)
4
8
12
16
SOCIAL INVESTIGATION
******
Num
bero
f epi
sode
s/m
in
CPF3Veh
Prenatal Treatment
CPF6
Veh CPF1 CPF3Postnatal Treatment
Num
bero
f cal
l/min
40
80*
**
*
** **
a
a
a
ULTRASOUND VOCALIZATIONS
T RS T RS T RS
T RS RD T RS RDT RS RD
Veh CPF1 CPF3Postnatal Treatment
Social Isolation (4 days)
USVs+
Social investig
(Anogenital, nose and
body sniffing)
USVs
R = resident P = partner
Plus Maze
Postnatal treatment (mg/kg)
0
10
20
30
40
50
60
70
% Time spent in the open arms
MaleFemaleveh 1 3 veh 1 3
**
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale induce
un comportamento meno ‘ansioso’ nelle femmine
DARK-LIGHT TEST
Veh CPF0
100
200
*
Late
ncy
(s)
Head dipping
frequ
ency
MaleFemaleveh 3 6 veh 3 6
0
5
10
15
20
25
30
35
Prenatal treatment (mg/kg)
*
Plus Maze
L’esposizione alla dose intermedia di CPF in fase
prenatale induce un comportamento meno esplorativo nei maschi
Aggressivita’ Materna: difesa del nido in presenza di un maschio adulto intruso, femmine adulte esposte al CPF pnd 11-14
Investigative behaviour(Mutual Circling, Social Sniffing and Follow )
Dur
atio
n(s
)
0
100
200*
Digging
Dur
atio
n(s
)
*
0
5
10
15
20
Defensive PosturesD
urat
ion
(s)
0
10
20
30
40
50
*
Attacks
0
10
20
30
Freq
uenc
y
CPF 3 mg/kg
Veh
Esiste un’ampia finestra di vulnerabilità del sistema nervoso centrale all’esposizione al CPF
Le alterazioni del profilo comportamentale osservato non appaiono riconducibili alla inibizione dell’acetilcolina esterasi. Ciò suggerisce che tale parametro è insufficiente nella valutazione del rischio da esposizione a clorpirifos
In particolare il quadro di alterazione comportamentale ottenutoin questo studio suggerisce una selettiva suscettibilità dei comportamenti di tipo sociale/parentale ed emozionale
Quali i target neurali dell’azione del CPF? E’ possibile ipotizzare un’interferenza con la maturazione di meccanismi neuroendocriniche sono tra i regolatori più importanti delle funzioni sociali e riproduttive?
L’esposizione perinatale al CPF aumenta la densità dei recettori 5HT1 e 5HT2 e del trasportatore presinaptico per la serotonina nel cervello di ratto (Aldridge et al. 2005; Slotkin2007). La serotonina è significativamente implicata negli stati affettivi/emozionali e nella regolazione dei comportamenti agonistici nei mammiferi.
I neuropeptidi ipotalamici ossitocina e vasopressina, oltre controllare importanti funzioni fisiologiche legate alla riproduzione, hanno anche un ruolo centrale nella
modulazione dei comportamenti sociali e degli stati emozionali. Dati recenti indicano che la sintesi di
ossitocina nell’ipotalamo è sotto controllo serotoninergico (Ho et al. 2007; De Magalhaes Nunes et
al. 2007). oxyavp
Aree limbiche (5HT)
Ipotesi: il CPF interferisce con questo meccanismo neuroendocrino
di regolazione del comportamento?
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF
OT
leve
l[A4
50 n
m]
0 mg/kg3 mg/kg6 mg/kg
Prenatal CPFmain prenatal effect p=0.01
Males
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg
OT
leve
l[A4
50 n
m]
Postnatal CPF
Females
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF
Livelli ipotalamici di ossitocina in topi adulti CD1 esposti a CPF in fase prenatale e neonatale
Incremento dose-dipendente e più marcato nei maschi
a)
b)
main prenatal effect p<0.01
0 mg/kg3 mg/kg6 mg/kg
Prenatal CPF
0
10
20
30
40
50
60
AVP
leve
l[O
D*m
m2]
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF
Females
AVP
leve
l[O
D*m
m2]
* *
0
10
20
30
40
50
60Males
**
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg
Postnatal CPF
0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg
Postnatal CPF
0
10
20
30
40
50
60
Livelli ipotalamici di vasopressina in topi adulti CD1 esposti a CPF in fase prenatale e neonatale
Decremento dose-dipendente e più marcato nei maschi
Iperattività e aumentata risposta agli stimoli ambientali e sociali negli animali esposti al CPF:
effetti sul funzionamento della tiroide?
Conception 12wks Birth 2yrs
Fetal/neonatal TH
Maternal TH
Cerebral neurogenesis, migration
Cerebral neurogenesis
Neuronal differentiation, synaptogenesis
gliogenesis
myelinogenesis
FIG. 1: Distribution of serum T4 levels detected in pregnant dams at GD 18 (Panel A) and follicular cell height (expressed as follicular external area/ follicular internal area: FEA/FIA) measured in dams at PND 23 (Panel B). Lines indicate mean values.
Panel A Panel B
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4
T4
(ng/
ml)
M0 M6M3 M0 M6M3
P=0.04
P=0.02 P=0.02
FIG. 2: Mean ± SD of serum T3 levels in F1 males (panel A) and females (panel B) at PND150