ISOLASI SENYAWA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI …

ISOLASI SENYAWA DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL ASETAT BIJI KOPI ROBUSTA (Coffea canephora) DENGAN METODE

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)

S K R I P S I

INTAN MAGHFIRA ARIJAL

F1C117001

PROGRAM STUDI KIMA

JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS JAMBI 2021

i

SURAT PERNYATAAN

ii

RINGKASAN

Antioksidan berperan menyingkirkan radikal bebas melalui reaksi dan

menghambat terjadinya reaksi oksidasi lain. Antioksidan yang banyak

digunakan adalah antioksidan sintetik, ditambah dengan pemanfaatan bahan

alami sebagai antioksidan. Salah satu bahan alami sebagai antioksidan yaitu

berasal dari kopi. Pada penelitian ini biji kopi robusta (Caffea canephora)

dilakukan roasting menggunakan suhu 200ºC dan digrinder. Kemudian

dilakukan maserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama 48 jam.

Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dan dipatkan crude metanol. Kemudian

dilakukan partisi cair-cair menggunakan tiga pelarut yaitu n-heksan, etil asetat

dan metanol. Selanjutnya masing-masing fraksi diuji skrining fitokimia dan uji

aktivitas antioksidan dengan penampak bercak DPPH. Sehingga diperoleh fraksi

teraktif untuk selanjutnya dilakukan proses pemisahan dan pemurnian

senyawa. Isolate yang didapatkan kemudian dikarakterisasi menggunakan

spektrofotometer UV-Vis dan FT-IR. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan

dengan penangkapan radikal DPPH dan kontrol positif digunakan vitamin C

(asam askorbat). Golongan senyawa yang terdapat pada fraksi etil asetat yaitu

flavonoid, tannin,dan alkaloid. Sedangkan pada isolat murni F2.2 mengandung

senyawa golongan alkaloid. Ekstrak n-heksan memiliki nilai IC50 sebesar 152,55

ppm. Ekstrak etil asetat memiliki nilai IC50 82,12 ppm dan ekstrak metanol

memiliki nilai IC50 84,64 ppm. Senyawa yang berhasil diisolasi dari fraksi etil

asetat biji kopi robusta pada F2.2 memiliki nilai IC50 sebesar 21,63 ppm.

Sedangkan pada control positif vitamin C (asam askorbat) mmiliki nilai IC50

sebesar 32,301 ppm sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa dari golongan

alkaloid tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat.

iii

SUMMARY

Antioxidants may act to inhibit free radicals through reactions and the

occurrence other oxidation reactions. Antioxidants widely used synthetic

antioxidants, coupled with the use of natural ingredients as antioxidants. One of

the natural ingredients as antioxidants comes from coffee. In this study, robusta

coffee beans (Caffea canephora) were roasted using temperature of 200ºC and

grinded. Then maceration was carried out using methanol for 48 hours. The

extract obtained was concentrated and crude methanol was extracted. Then the

liquid-liiquid partition was carried out using three solvents, namely n-hexane,

ethyl acetate and methanol. Furthermore, each fraction was tested for

phytochemical screening and antioxidant activity test with DPPH spots. The

most active fraction is obtained for further separation and purification of the

compound. The obtained isolates were then characterized using UV-Vis and FT-

IR spectrophotometers. Antioxidant activity testing was carried out by

scavenging DPPH radicals and positive control using vitamin C (ascorbic acid).

Group compounds contained in the ethyl acetate fraction are flavonoids,

tannins, and alkaloids. While the pure isolate F2.2 contains compounds of the

alkaloid group. The n-hexane extract has an IC50 value of 152.55 ppm. The ethyl

acetate extract had an IC50 value of 82.12 ppm and the methanol extract had a

IC50 value of 84.64 ppm. The compound that was isolated from the ethyl acetate

fraction of robusta coffee beans at F2.2 had an IC50 value of 21.63 ppm. While

the positive control vitamin C (ascorbic acid) has an IC50 value of 32,301 ppm so

it can be said that the compounds from the alkaloid group have very strong

antioxidant activity.

iv

HALAMAN JUDUL ISOLASI SENYAWA DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL ASETAT BIJI KOPI ROBUSTA (Coffea canephora) DENGAN METODE

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)

S K R I P S I

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana pada

Program Studi Kimia

INTAN MAGHFIRA ARIJAL F1C117001

PROGRAM STUDI KIMIA JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS JAMBI 2021

v

HALAMAN PENGESAHAN

vi

RIWAYAT HIDUP

Intan Maghfira Arijal, dilahirkan di Batusangkar pada

tanggal 26 Februari 1999 dari Ayah yang bernama Arijal dan

Ibu Zafni Zainal sebagai putri pertama dari dua bersaudara.

Pendidikan yang telah ditempuh oleh penulis yaitu SD

Negeri 01 Pangian dan lulus pada tahun 2011. Kemudian

melanjutkan pendidikan di SMP Negeri 2 Lintau Buo dan

lulus pada tahun 2014. Selanjutnya penulis melanjutkan

sekolah menengah atas di SMA Negeri 2 Lintau Buo dan lulus pada tahun 2017.

Pada tahun 2017 penulis melanjutkan pendidikan di perguruan tinggi negeri

yaitu di Universitas Jambi, Fakultas Sains dan Teknologi, Jurusan Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Program studi Strata-1 Kimia melalui jalur

SBMPTN. Penulis aktif mengikuti kegiatan seminar-seminar baik ditingkat

jurusan, regional maupun Universitas. Penulis juga dipercaya menjadi asisten

laboratorium kimia dasar dan kimia organik I. Selama masa studi di perguruan

tinggi, penulis aktif di organisasi HIMKI (Himpunan Mahasiswa Kimia) periode

2017-2018 dan 2018-2019. Penulis mengikuti Kegiatan Magang di UPTD

Laboratorium Lingkungan Dinas Lingkungan Hidup Kabupaten Batang Hari

selama kurang lebih 2 bulan. Kemudian penulis melakukan penelitian dengan

judul “ISOLASI SENYAWA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI

ETIL ASETAT BIJI KOPI ROBUSTA (Coffea canephora) DENGAN METODE DPPH

(2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)”.

vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena berkat

limpahan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulisan skripsi dengan judul

“ISOLASI SENYAWA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL

ASETAT BIJI KOPI ROBUSTA (Coffea canephora) DENGAN METODE DPPH

(2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)” dapat terselesaikan sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana pada Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan

Teknologi, Universitas Jambi.

Penyusunan skripsi ini tentu saja tidak terlepas dari peran serta berbagai pihak

yang telah memberikan banyak bantuan baik secara materil dan spiritual serta

secara langsung maupun tidak langsung. Untuk itu penulis mengucapkan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Tuhan Yang Maha Esa, karena Rahmat-Nya penulis bisa menyelesaikan

Tugas Akhir hingga selesai.

2. Prof. Damris, M, M.Sc., Ph.D selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Jambi yang telah memberikan fasilitas dalam menyelesaikan

tugas akhir.

3. Dr. Tedjo Sukmono., S.Si., M.Si selaku Wakil Dekan bidang Akademik,

Kerjasama dan Sistem Informasi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas

Jambi yang telah memberikan izin dalam melakukan penelitian tugas akhir.

4. Heriyanti, S.T., M.Sc., M.Eng. Ketua Program Studi Kimia Fakultas Sains

dan Teknologi Universitas Jambi, telah memberikan izin dalam melakukan

penelitian tugas akhir.

5. Prof. Drs. H. Sutrisno, M.Sc., Ph.D. selaku pembimbing utama dan Ibu

Ratih Dyah Puspitasari, S.Si., M.Si. selaku dosen pembimbing pendamping

yang telah meluangkan banyak waktu maupun tenaga serta memberikan

arahan, nasihat, saran, bantuan dan kerelaan hati dalam membimbing

penulis selama melakukan penelitian sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini.

6. Tim penguji skripsi Prof. Dr. rer. nat. Muhaimin, S.Pd., M.Si. Bapak Drs.

Nelson, M.Si. dan ibu Rahmi, S.Pd., M.Si. yang telah memberikan masukan

dan kritikan kepada penulis untuk kemajuan dan perbaikan penulis

sendiri.

7. Bapak dan Ibu dosen di Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Jambi

yang telah memberikan ilmunya kepada penulis selama perkuliahan.

8. Yang tercinta dan tersayang kedua orang tua serta Nilam selaku adik yang

sepenuhnya memberikan dukungan, doa, serta semangat kepada penulis.

viii

9. Kyuhyun, Yesung, Ten, Taeyong, Jaehyun, Luffy, Sanji, dan Zoro yang telah

menjadi motivasi penulis selama bersekolah hingga menyelesaikan kuliah.

10. Mutual dari fandom ELF dan NCTzen yang telah memberikan dorongan,

semangat, dan doa kepada penulis.

11. Tim Kopi Riris, Novi, Laras, Shara, dan Jihan. Terimakasih telah menjadi

partner selama menyelesaikan penelitian di Laboratorium Tugas Akhir.

12. Ulfa, Gita, Kiki, Devi, Ida, Wawan, dan Ardi yang telah menemani penulis

dari awal masuk ke prodi Kimia hingga sekarang.

13. Teman Seperjuangan Kimia 2017 dan Keluarga Besar Kimia Fakultas Sains

dan Teknologi Universitas Jambi.

Semoga Allah SWT membalas budi baik yang tulus dan ikhlas kepada

semua pihak yang bersangkutan.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak

kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran

yang membangun untuk melengkapi kekurangan yang ada pada skripsi ini.

Semoga skripsi ini dapat bermanfaat untuk kita semua.

Jambi, September 2021

Penulis

ix

DAFTAR ISI

SURAT PERNYATAAN ........................................................................................... i

RINGKASAN ......................................................................................................... ii

SUMMARY .......................................................................................................... iii

HALAMAN JUDUL .............................................................................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................... v

RIWAYAT HIDUP ................................................................................................. vi

PRAKATA ........................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL .................................................................................................. xi

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... xiii

I. PENDAHULUAN ................................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1

1.2 Identifikasi dan Perumusan Masalah ......................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian ....................................................................................... 3

1.4 Manfaat Penelitian ..................................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................................... 5

2.1 Kopi Robusta (Coffea canephora) ................................................................ 5

2.2 Kandungan Senyawa Kimia Biji kopi Robusta ........................................... 5

2.3 Antioksidan dan Radikal Bebas ................................................................. 7

2.4 Ekstraksi dan Isolasi Senyawa Organik ..................................................... 9

2.5 Identifikasi Senyawa Organik ................................................................... 11

III. METODELOGI PENELITIAN ......................................................................... 13

3.1 Waktu dan Tempat ................................................................................... 13

3.2 Bahan dan Peralatan Penelitian ............................................................... 13

3.3 Prosedur Kerja ......................................................................................... 13

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 19

4.1 Preparasi dan Ekstraksi Sampel Penelitian .............................................. 19

4.2 Penapisan Fitokimia (Screening Fitokimia) ............................................... 21

4.3 Isolasi senyawa Fraksi Etil Asetat Biji Kopi Robusta (Caffea canephora) . 26

4.4 Isolasi dan Pemurnian ............................................................................. 28

4.5 Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi ......................................................... 31

V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 37

5.1 Kesimpulan .............................................................................................. 37

5.2 Saran ....................................................................................................... 37

x

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 38

LAMPIRAN ......................................................................................................... 43

xi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Banyaknya Ekstrak dan %rendemen Hasil Maserasi .................................... 21

2. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak metanol biji kopi robusta (Coffea canephora)

............................................................................................................. 21

3. Hasil rendemen fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi metanol .......... 22

4. Hasil Skrining Fitokimia Fraksi n-heksan, Etil Asetat dan Fraksi Metanol ... 23

5. Pengelompokkan Fraksi Hasil KVC Fraksi Etil Asetat Biji Kopi Robusta

(Caffea canephora) ............................................................................... 27

6. Pengelompokkan Fraksi Hasil KKG (F2) Etil Asetat Biji Kopi Robusta (Caffea

canephora)............................................................................................ 29

7. Hasil Skrining Fitokimia Isolat F2.2 .............................................................. 30

8. Data pembanding serapan FTIR senyawa F2.2 .............................................. 34

9. Hasil Uji Aktivitas antioksidan ekstrak, fraksi, dan isolat Biji Kopi Robusta

(Coffea canephora) menggunakan metode DPPH .................................. 34

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur Kafein (Spiller dalam Wachamo, 2017). ............................................ 6

2. Struktur asam klorogenat (Sukohar et al., 2011) ............................................ 7

3. Mekanisme Penghambatan DPPH (Molyneux, 2004)........................................ 8

4. Reaksi Uji Dragendorff (Marliana et al., 2005) ............................................... 23

5. Mekanisme reaksi flavonoid (Varghese et al., 2010)....................................... 24

6. Reaksi saponin .............................................................................................. 24

7. Reaksi tannin dengan FeCl3 .......................................................................... 25

8. Uji antioksidan menggunakan penampak noda DPPH .................................. 26

9. Pemurnian sampel dengan kromatografi vakum cair .................................... 27

10. Pola noda hasil KLT dari KVC faksi etil asetat ............................................. 27

11. Hasil uji kualitatif fraksi etil asetat (F3,F2,F1) menggunakan penampak

bercak DPPH ............................................................................................... 28

12. kromatografi kolom gravitasi (KKG) ............................................................ 28

13. Pola noda KLT subfraksi gabungan KKG ..................................................... 29

14. Uji aktivitas antioksidan F2.2 menggunakan DPPH .................................... 30

15. Hasil uji kemurnian KLT dengan 3 eluen berbeda (a) n-heksan:etil (1:9), (b)

dcm:etil (2:8), dan (c) aseton:etil (1:9) ......................................................... 31

16. Spektrum UV-Vis F2.2 ................................................................................. 31

17. Spektrum UV Vis (Bhawani et al., 2015)...................................................... 32

18. Spektrum IR F2.2 ........................................................................................ 33

19. Spektrum FTIR kafein (Kwasniewska et al., 2021) ....................................... 33

20. Isolat murni F2.2 ......................................................................................... 36

21. Struktur kafein (Spiller dalam Wachamo, 2017) .......................................... 36

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema Penelitian ........................................................................................... 43

2. Roasting dan Grinding ................................................................................... 44

3. Ekstraksi dan Isolasi ..................................................................................... 45

4. Uji aktivitas antioksidan ................................................................................ 49

5. Analisa Data dan Perhitungan ....................................................................... 50

6. Dokumentasi ................................................................................................. 54

1

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Provinsi Jambi merupakan salah satu daerah penghasil kopi terbesar di

Indonesia. Total luas areal kebun kopi di Provinsi Jambi pada tahun 2018

tercatat yaitu sebesar 27.274 Ha sedangkan pada tahun 2019 bertambah

menjadi 28.096 Ha, dengan jumlah produksi 16.588 Ton (BPS Provinsi Jambi,

2020). Produktivitas dalam menghasilkan Kopi/Ha Provinsi Jambi mencapai

997 Kg/Ha termasuk tertinggi ke 4 (empat) di Indonesia dengan produksi kopi

yang stabil dari tahun ke tahun (Dinas Perkebunan Provinsi Jambi, 2019).

Kopi (Coffea sp) merupakan salah satu minuman yang diproduksi dan

dikonsumsi terbesar kedua di dunia. Kopi memiliki citarasa dan aroma yang

khas dibandingkan dengan minuman lainnya (Farhaty dan Muchtaridi, 2012).

Kopi Robusta (Coffea canephora) mulai diperkenalkan di Indonesia Tahun 1900

sebagai pengganti kopi Arabika (Coffea arabica) yang hancur akibat serangan

karat daun. Keunggulan kopi Robusta terletak pada kemampuannya yang lebih

tahan terhadap organisme pengganggu tanaman sehingga dianggap sebagai

alternatif pengganti yang tepat (Rukmana, 2014).

Kopi mempunyai banyak kandungan yang berguna untuk tubuh, salah

satunya kafein yang berguna dalam penekanan pertumbuhan sel kanker. Kafein

juga berfungsi dalam menurunkan risiko diabetes melitus tipe 2 yaitu dengan

cara menjaga sensibilitas tubuh terhadap insulin, penyakit Parkinson, dan juga

Alzheimer (Olivia, 2014). Serbuk kopi robusta (Coffea canephora) memiliki efek

untuk mempercepat penyembuhan luka insisi (Artho et al, 2015). Selain itu

kandungan senyawa bioaktif pada biji kopi robusta (Coffea canephora)

digunakan sebagai bahan obat-obatan meliputi antioksidan, antivirus,

antijamur, antiinflamasi, dan antibakteri (Amiliyah et al., 2015).

Antioksidan sangat bermanfaat untuk kesehatan. Antioksidan

merupakan senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat

memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas tanpa mengganggu

fungsinya dan dapat memutuskan reaksi berantai dari radikal bebas. Setiap

radikal bebas mempunyai elektron yang tidak berpasangan di permukaan kulit

luarnya, sehingga radikal bebas berusaha menarik elektron dari jaringan-

jaringan yang ada di dalam tubuh yang disusun oleh sel-sel.

Di dalam kopi terdapat senyawa volatil dan non-volatil yang

mempengaruhi aroma dan mutu kopi. Di dalam kopi terkandung senyawa

kafein yang merupakan alkaloid dan asam klorogenat yang merupakan

golongan senyawa polifenol yang memiliki aktivitas antioksidan dan kandungan

2

polifenol kopi robusta lebih tinggi dibandingkan kopi arabika (Coffea arabica)

ataupun tanaman lain (Johnston et al., 2003). Kandungan polifenol pada kopi

berkisar 200-550 mg dalam bentuk asam klorogenat (Yusmarini, 2011).

Menurut penelitian sebelumnya, tumbuh-tumbuhan dengan kadar fenol

tinggi memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi pula, hal ini dikarenakan

sebagian besar senyawa-senyawa antioksidan merupakan senyawa turunan

fenol (Kristiningrum dan Cahyani, 2015). Penelitian yang dilakukan oleh

Ferrazzano et al (2009), menyatakan bahwa kopi mengandung turunan dari

asam hidroksinamis diantaranya kafein, klorogenik, kumarin, ferulin, asam

sinapik, flavonoid, dan polifenol. Selain itu dalam penelitian Sukohar et al

(2011), kafein dan asam klorogenat merupakan isolat kopi yang bersifat

sitotoksik dan mengandung antioksidan yang tinggi.

Menurut Iglesias et al (2016), Uji DPPH dianggap lebih sensitif untuk

penentuan aktivitas antioksidan senyawa yang bersifat kurang polar. Menurut

Karadag (2009) dalam Wulansari (2018), metode DPPH memiliki kelebihan yaitu

metode analisisnya yang sifatnya lebih sederhana, cepat, mudah diamati, dan

lebih sensitif terhadap sampel dengan konsentrasi yang relatif kecil sehingga

hasil yang diperoleh lebih akurat (Wahdaningsih et al., 2013).

Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Muzdalifa dan Jamal (2019),

diperoleh data yang menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki aktivitas

antioksidan yang lebih baik dari ekstrak fraksi n-heksan dan ekstrak fraksi air.

Aktivitas antioksidan berasal dari senyawa yang terdapat pada fraksi dari kulit

biji kopi robusta, diantaranya diketahui positif berdasarkan uji fitokimia adalah

flavonoid, fenolik, alkaloid, saponin, tannin dan terpenoid. Pada penelitian

Qurrotul (2016), dilakukan uji aktivitas antioksidan pada bagian daun kopi

robusta. Uji dilakukan pada fraksi etil asetat dan fraksi etanol ekstrak etanolik.

Didapatkan hasil bahwa pada fraksi etil asetat dan fraksi etanol ekstrak

etanolik memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC50 fraksi

etil asetat sebesar 1,53 ppm dan fraksi etanol ekstrak etanolik sebesar 1,92

ppm.

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan diperlukan isolasi

untuk memperoleh senyawa aktif sebagai antioksidan dari biji kopi robusta.

Oleh karena itu, pada penelitian ini penulis mengambil judul penelitian, “Isolasi

Senyawa dan Uji Aktivitas Antioksidan Dari Fraksi Etil Asetat Biji Kopi

Robusta (Coffea canephora) dengan Metode DPPH (2,2-difenil-1-

pikrilhidrazil)”. Isolasi dilakukan untuk memperoleh senyawa yang aktif

sebagai antioksidan dari biji kopi robusta (Coffea canephora) yang didasarkan

pada penelitian Sukohar et al (2011), dimana kafein dan asam klorogenat

3

merupakan isolat kopi yang mengandung antioksidan yang tinggi. Selain itu

pada penelitian ini akan digunakan biji kopi robusta (Coffea canephora) yang

telah diroasting yang membedakannya dari penelitian Muzdalifa dan Jamal

(2019), yang tidak diroasting untuk mengetahui bagaimana pengaruhnya

terhadap aktivitas antioksidan yang dihasilkan. Selain itu pemilihan fraksi etil

asetat dilakukan karena pada penelitian Muzdalifa dan Jamal (2019), fraksi etil

asetat memiliki kandungan antioksidan lebih kuat dibandingkan fraksi n-

heksana dan fraksi air.

1.2 Identifikasi dan Perumusan Masalah

Radikal bebas memiliki efek yang dapat menyebabkan terjadinya

kerusakan sel-sel dalam tubuh sehingga menimbulkan berbagai penyakit.

Sehingga dibutuhkan suatu senyawa yang dapat meredam radikal bebas

tersebut. Diketahui antioksidan memiliki kemampuan untuk meredam radikal

bebas (Muzdalifa dan Jamal, 2019). Antioksidan berperan menyingkirkan

radikal bebas melalui reaksi dan menghambat terjadinya reaksi oksidasi lain.

Antioksidan yang banyak digunakan adalah antioksidan sintetik, ditambah

dengan pemanfaatan bahan alami sebagai antioksidan. Salah satu bahan alami

sebagai antioksidan yaitu berasal dari kopi. Tumbuhan merupakan sumber

antioksidan alami yang tersebar pada bagian tumbuhan baik pada kayu, biji,

daun, buah, akar, bunga, maupun serbuk sari. Salah satu tumbuhan yang

berpotensi sebagai sumber antioksidan adalah biji kopi robusta (Caffea

canephora) yang telah mengalami proses roasting. Oleh karena itu, dari

identifikasi masalah di atas maka dirumuskan permasalahan yang menjadi

pokok penelitian ini antara lain:

1. Golongan senyawa apa yang terkandung dalam fraksi etil asetat biji kopi

robusta (Coffea canephora) yang diroasting?

2. Apakah fraksi etil asetat dan senyawa kimia yang berhasil diisolasi dari

biji kopi robusta (Coffea canephora) roasting memiliki kemampuan

sebagai antioksidan?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Menganalisis golongan senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat

biji kopi robusta (Coffea canephora) yang telah diroasting

2. Membandingkan aktivitas antioksidan dari senyawa kimia yang berhasil

diisolasi dari fraksi etil asetat biji kopi robusta (Coffea canephora)

roasting dengan vitamin C (asam askorbat).

4

1.4 Manfaat Penelitian

1. Mendapatkan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dari biji kopi

robusta (Coffea canephora) yang diroasting

2. Mengetahui tingkat aktivitas antioksidan dari biji kopi robusta (Coffea

canephora) yang diroasting

3. Memberikan informasi mengenai senyawa-senyawa metabolit sekunder

yang terkandung pada biji kopi robusta (Coffea canephora) yang

diroasting

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kopi Robusta (Coffea canephora)

Kopi Robusta merupakan salah satu dari dua varietas utama Coffea

canephora dari spesies itu sendiri. Nama dari kopi ini sering digunakan yang

merujuk pada spesies. Menurut Soesanto, L. (2020), kopi Robusta menyumbang

hampir 30% dari produksi kopi komersial. Umumnya kopi Robusta ditanam di

Asia Tenggara dan Afrika Barat. Kopi Robusta memiliki rasa yang sedikit lebih

pahit dari kopi Arabika. Tanaman kopi Robusta menghasilkan biji kopi yang

lebih banyak dari kopi Arabika.

Kopi robusta memiliki banyak manfaat bagi kesehatan tubuh manusia,

diantaranya yaitu dapat merangsang pernapasan, membantu pencernaan

makanan di dalam tubuh, menurunkan sirkulasi darah di otak, menenangkan

perasaan mental yang berkepanjangan dan badan yang letih, sebagai obat

penolong diare, serta pencegah muntah sesudah operasi (Suwanto dan

Oktavianty, 2010). Selain itu bubuk dari kopi robusta bermanfaat sebagai terapi

untuk mempercepat penyembuhan luka (Yuwono, 2014).

Menurut Rahardjo (2012), klasifikasi tanaman kopi robusta adalah

sebagai berikut:

Kigdom : Plantae

Subkigdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Asteridae

Ordo : Rubiales

Famili : Rubiaceae

Genus : Coffea

Spesies : Coffea canephora

2.2 Kandungan Senyawa Kimia Biji kopi Robusta

Seyawa-senyawa kimia pada biji kopi dapat dibedakan atas senyawa

volatil dan non volatil. Senyawa volatil merupakan senyawa metabolit sekunder

yang memiliki sifat mudah menguap. Beberapa kelompok senyawanya antara

lain derivatif asam lemak, terpenoid fenol dan sebagainya. Sedangkan senyawa

non volatil yang berpengaruh terhadap mutu kopi antara lain kafein, asam

klorogenat, hidrokarbon alifatik, asam, alkohol, tiol, furan, piro, piridin, quinon,

fenol (asam alifatik) dan amin aromatik (Ramanaviciene et al., 2003). Hasil

skrining fitokimia yang dilakukan oleh Pratita (2017), diketahui bahwa

6

simplisia kopi Robusta mengandung golongan senyawa flavonoid, saponin,

fenol, tanin, dan kuinon.

Hasil penelitian Spiller dalam Wachamo (2017), menyebutkan bahwa

kopi mengandung sedikit nutrisi, tetapi mengandung lebih dari ribuan bahan

kimia alami seperti karbohidrat, lipid, senyawa nitrogen, vitamin, mineral,

alkaloid dan senyawa fenolik. Beberapa di antaranya berpotensi menyehatkan

dan beberapa yang lain berpotensi bahaya. Salah satu senyawa alkaloid yang

berpotensi berbahaya untuk kesehatan adalah kafein.

N

NO

CH3

CH3

O

N

N

CH3

Gambar 1. Struktur Kafein (Spiller dalam Wachamo, 2017).

Komposisi kimia dari biji kopi dapat bergantung pada spesies dan

varietas dari kopi tersebut serta faktor-faktor lain yang berpengaruh

diantaranya yaitu lingkungan tempat tumbuh, tingkat kematangan, dan kondisi

penyimpanan. Proses pengolahan juga dapat mempengaruhi komposisi kimia

dari kopi. Seperti penyangraian yang dapat mengubah komponen labil pada

kopi sehingga membentuk komponen yang kompleks (Panggabean, 2011).

Kopi memiliki banyak kandungan senyawa kimia di dalamnya. Salah

satu kandungan senyawa kimia tersebut adalah asam klorogenat. Asam

klorogenat diketahui memiliki banyak manfaat untuk menghasilkan efek

farmakologi yang berkhasiat (Farhaty dan Muchtaridi, 2012). Asam yang

dominan pada biji kopi adalah asam klorogenat yaitu sekitar 8% atau 4,5%

pada kopi sangrai. Selama penyangraian sebagian besar asam klorogenat

menjadi asam kafeat dan asam kuinat (Yusianto, 2014).

Biji Kopi hijau Robusta paling banyak mengandung asam klorogenat

dibandingkan dengan biji kopi lainnya. Nilai kandungan asam klorogenat pada

biji kopi robusta mencapai 6.1-11.3 mg per gram biji kopi. Namun, perbedaan

kandungan asam klorogenat tidak hanya didasarkan pada jenis saja, adanya

beberapa faktor seperti pemanasan atau penyangraian biji kopi hijau atau

disebut juga roasted coffee. Selama proses pemanggangan atau penyangraian

kopi terjadi perubahan secara fisik ataupun kimia, begitupun dengan

kandungan didalam biji kopi (Farah, 2012).

7

OH

OH

O

O

OH

HO

HO

O

Gambar 2. Struktur asam klorogenat (Sukohar et al., 2011)

2.3 Antioksidan dan Radikal Bebas

Antioksidan merupakan zat yang mampu melindungi tubuh dari

serangan radikal bebas yang mampu merusak struktur membran sel.

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa ini

memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya

reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga

merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat

radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif, sehingga kerusakan sel akan

terhambat (Winarsi, 2007).

Antioksidan diklasifikasikan menjadi dua kategori, yaitu antioksidan

pencegah dan antioksidan pemutus rantai. Antioksidan pencegah bekerja

dengan menghambat pembentukan reactive oxygen species (ROS), seperti enzim

katalase, peroksidase, superoksida dismutase, dan transferin. Antioksidan

pemutus rantai merupakan senyawa yang menangkap radikal oksigen

kemudian memutus rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya vitamin C,

vitamin E, asam urat, bilirubin, polifenol, dan sebagainya (Putri et al., 2019).

Menurut Winarsi (2007), antioksidan dapat dibedakan menjadi tiga

macam berdasarkan fungsinya, yaitu:

a. Antioksidan primer, berfungsi untuk menegah terbentuknya radikal bebas

baru. Sifatnya yang mudah untuk memutus reaksi berantai sehingga dapat

bereaksi dengan radikal-radikal lipid dan mengubahnya menjadi produk

yang lebih stabil.

b. Antioksidan sekunder, bekerja dengan cara mengkelat logam yang bertindak

sebagai pro-okisidan yang menangkap radikal dan mencegah terjadinya

reaksi berantai.

c. Antioksidan tersier, berfungsi untuk memperbaiki kerusakan biomolekul

yang disebabkan oleh radikal bebas.

Senyawa alkaloid memiliki kemampuan untuk menghentikan reaksi

radikal bebas diantaranya yaitu quinolone. Kafein dapat bertindak sebagai

8

peredam radikal hidroksil, sedangkan melatonin dapat menjaga sel dari

pengaruh radiasi (Yuhernita,2011).

Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan penangkapan radikal

(radical scavenging) terhadap radikal DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil).

Menurut Iglesias et al (2016), Uji DPPH dianggap lebih sensitif untuk penentuan

aktivitas antioksidan senyawa yang bersifat kurang polar. Metode penangkapan

radikal DPPH ini merupakan metode kuantitatif. Prinsip dari metode ini

didasarkan pada kemampuan suatu senyawa uji untuk menangkap radikal dan

mengurangi intensitas warna radikal DPPH yang berwarna ungu menjadi

berwarna kuning yang diukur oleh spektrofotometer pada panjang gelombang

515 nm. Radikal DPPH bersifat stabil dan memiliki panjang gelombang

maksimum antara 515-520 nm (Prior et al., 2005).

Konsentrasi ekstrak berbanding lurus dengan aktivitas penangkapan

radikal DPPH. Semakin besar konsentrasi senyawa antioksidan maka aktivitas

penangkapan radikal DPPH semakin besar. Senyawa antioksidan mampu

mereduksi radikal DPPH sehingga menyebabkan penurunan absorbansi DPPH

yang ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning. Persamaan

regresi linier antara hubungan konsentrasi senyawa antioksidan dan persen

penangkapan radikal DPPH dapat digunakan untuk menentukan nilai IC50

senyawa antioksidan (Isnindar et al., 2017).

Berikut merupakan mekanisme reaksi DPPH menurut Molyneux (2004)

dapat dilihat pada Gambar 3.

N

N

O2N NO2

NO2

+ RH

N

NH

O2N NO2

NO2

+ R

Gambar 3. Mekanisme Penghambatan DPPH (Molyneux, 2004).

9

2.4 Ekstraksi dan Isolasi Senyawa Organik

Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses penarikan atau pemisahan komponen atau

zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Proses

ekstraksi bertujuan untuk mendapatkan komponen-komponen bioaktif suatu

bahan (Harborne, 1987). Sedangkan ekstrak adalah hasil dari proses ekstraksi.

Ekstrak dapat berupa sediaan kering, kental atau cair dan dibuat dengan

menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang sesuai diluar

pengaruh cahaya matahari langsung (Tiwari et al., 2011).

Ada bermacam-macam jenis metode ekstraksi yaitu: konvensional dan

metode ekstraksi modern. Metode ekstraksi konvensional meliputi maserasi,

detoks, soxhlet, refluks, perkolasi, dan infusi. Metode ekstraksi modern meliputi

ekstraksi gelombang mikro, ekstraksi tekanan tinggi, superkritis ekstraksi

cairan, ekstraksi sonikasi, ekstraksi enzimatis dan ekstraksi hidrotropi (Hanani,

2015). Menurut Handa et al (2008), terdapat beberapa metode ektraksi yaitu

sebagai berikut.

a. Maserasi

Merupakan teknik perendaman dimana zat yang sudah diperhalus (di dalam

partikel yang lebih kecil) direndam menggunakan pelarut seperti methanol

dengan beberapa kali diaduk atau dikocok pada suhu ruangan namun

terdapat kekurangan pada metode ini yaitu tidak semua senyawa bahan aktif

dapat terekstraksi

b. Perkolasi

Merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk mengekstrak

senyawa yang berupa cairan. Pada metode ini digunakan larutan untuk

merendam seluruh bahan hingga bahan aktif tertarik. Ciri khas dari metode

perkolasi yaitu menggunakan pelarut yang selalu baru dan dilakukan pada

suhu kamar

c. Infusi

Metode ini dilakuan dengan cara merendam sampel dengan air dingin atau

air panas dalam waku singkat

d. Digesti

Merupakan bentuk dari maserasi dengan cara dipanaskan selama proses

ekstraksi

e. Dekoktasi

Metode ini menggunakan cara perebusan material menggunakan air pada

volume tertentu dan waktu yang telah ditetapkan dan selanjutnya

didinginkan dan disaring

10

Pada prakteknya terdapat beberapa jenis kromatografi yang disebut real

kromatografi. Menurut Leba (2017), jenis kromatograf tersebut sebagai berikut.

1. Kromatografi kertas (Paper chromatography)

2. Kromatografi lapis tipis (Thin layer chromatography)

3. Kromatografi kolom (Colomn chromatography)

4. Kromatografi gas (Gass chromatography)

5. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode analisa kualitatif

dari suatu sampel dengan memisahkan komponen senyawa pada sampel

berdasarkan perbedaan kepolarannya. Semakin dekat kepolaran antara sampel

dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fasa gerak tesebut. Uji

kromatografi lapis tipis dilakukan dengan proses elusidasi dan menghitung nilai

Rf (retention factory). Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan cara

diuapkan di atas penangas air sampai diperoleh ekstrak kental, ekstrak

ditimbang untuk mengetahui banyaknya ekstrak yang didapat, selanjutnya

dihitung nilai rendemen dari masing-masing ekstrak. Pemilihan pelarut akan

mempengaruhi hasil kandungan senyawa yang terekstraksi. Pemilihan pelarut

untuk ekstraksi dilakukan berdasarkan kepolaran zat, dimana zat yang non

polar akan larut dalam pelarut non polar sedangkan zat yang polar akan larut

dalam pelarut polar (Fatoni, 2015).

Kromatografi kolom konvensional merupakan metode kromatografi klasik

yang masih digunakan hingga saat ini untuk pemisahan dan pemurnian.

Pemisahan dengan metode ini didasarkan pada mekanisme adsorpsi dan partisi,

dimana melibatan ikatan hidrogen, gaya van der waal, gaya dipol-dipol,

interaksi ionik dan filtrasi antara senyawa dalam campuran dengan fasa

diamnya. Umumnya senyawa yang dapat berinteraksi dengan fasa diam akan

teretensi sedangkan senyawa yang tidak dapat berinteraksi dengan fasa diam

akan bergerak mengikuti pelarut dan terelusi lebih dulu. Hasil pemisahan

kemudian disebut sebagai fraksi. Penggunaan metode ini dengan cara

memasukan campuran pada bagian ujung atas kolom sehingga fasa gerak dapat

mengalir melalui fasa diam. Peristiwa ini hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi

(Leba, 2017).

Menurut Leba (2017), terdapat dua jenis metode dari kromatografi kolom

yaitu metode kering dan metode basah

1. Metode kering

Pada metode ini dilakukan dengan cara melapisi ujung bawah kolom dengan

kapas setelahnya masukkan serbuk silika gel secara perlahan ke dalam

11

kolom dengan ditekan hingga padat. Kemudian lapisi bagian atas selika

dengan kertas saring. Kolom siap digunakan

2. Metode basah

Pada metode ini dilakuan dengan cara silika gel dijenuhkan menggunakan

fasa gerak. Selanjutnya suspensi dialirkan melalui dinding kolom secara

perlahan. Pelarut pengelusi dialirkan hingga silika gel padat. Pelarut

kemudian dibiarkan mengalir hingga batas adsorben. Kolom siap untuk

digunakan. Pada metode ini kedua ujung kolom harus dilapisi dengan kapas

sebelum dan setelah pengemasan kolom.

Partisi merupakan suatu peristiwa yang melibatkan kesetimbangan

distribusi senyawa dalam fasa yang berbeda sehingga diperoleh suatu koefisien

yang spesifik yang berkaitan dengan proses distribusi tersebut. Partisi

bergantung pada daya larut solute terhadap pelarut yang dipengaruhi oleh berat

molekul. Umumnya kedua fasa sukar diatur polaritasnya secara konstan

karena baik fasa diam maupun fasa geraknya merupakan zat cair. Selain itu

pemisahan ini digunakan untuk memisahkan senyawa polar atau larut dalam

pelarut polar. Pemisahan menggunakan partisi umumnya bersifat kualitatif

(Rubiyanto, 2017).

2.5 Identifikasi Senyawa Organik

Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis

yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara

kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan

cahaya. Prinsip kerja Spektrofotometer UV-Vis yaitu apabila cahaya

monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut

diserap, sebagian dipantulkan , dan sebagian lagi dipancarkan. Keuntungan

pemilihan metode ini karena memberikan metode sangat sederhana untuk

menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil (Yanlinastuti, 2016).

Spektrofotometer Infra Merah (IR)

Fourier Transform Infra Red Spectroscopy (FTIR) merupakan suatu

metode analisis yang didasarkan pada vibrasi atom-atom dalam suatu molekul

atau atom. Molekul akan mengarbsorpsi gelombang radiasi infra merah jika

molekul tersebut memiliki momen dipol listrik yang akan berubah selama

bervibrasi. Semakin besarnya momen dipol listrik yang dihasilan maka semakin

tajam pita absorpsi yang terbentuk. Molekul akan mengabsorpsi jika gelombang

radiasi inframerah memiliki frekuensi yang sama dengan vibrasi dari molekul.

12

Terdapat dua jenis instrument spektrofotometer IR, yaitu

spektrofotometer dispersif menggunakan monokromator berupa prisma dan

spektrofotometer fourier transform yang menggunakan interferogram. Saat ini

spektrofotometer yang paling banyak digunakan yaitu spektrofotometer FTIR.

Kelebihan dari spektrofotometer FTIR ini terletak pada sensitifitasnya yang

tinggi, waktu analisis yang cepat, akurat, dan reprodusibilitas frekuensi yang

baik, sehingga menghasilkan data yang dapat diterima, serta dilengkapi dengan

perangkat lunak kemometrika yang memungkinkan sebagai alat canggih untuk

analisis kualitatif dan kuantitatif (Sudjadi dan Rohman, 2018).

Cara kerja dari spektroskopi infra merah yaitu dengan memindai sampel

menggunakan sinar inframerah, yang kemudian menembus sampel dan

ditangap oleh detektor. Hasil pemindaian kemudian diolah dengan komputer

sehingga menyajikan spektrum sampel. FTIR menggunakan radiasi IR dari

sumber cahaya benda hitam yang meliputi seluruh spektrum IR. Spesifikasi

kimia dari FTIR berasal dari interaksi absorbsi dari sinar IR dengan mode

vibrasi dari molekul yang dideteksi. Informasi yang lengkap dari spektra IR

memungkinkan banyak terdeteksinya spesi kimia dalam sekali pengukuran.

FTIR dapat digunakan dalam tiga konfigurasi seperti transmisi, pantulan, dan

total pantulan lemah (Wibisono, 2017).

13

III. METODELOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Instumentasi dan Tugas Akhir

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Jambi. Penelitian ini dilakukan pada

bulan Desember 2020 sampai Mei 2021.

3.2 Bahan dan Peralatan Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan untuk

proses ekstraksi yaitu botol maserasi, labu alas bulat, vaccum rotary evaporator

IKA RV 10. Kemudian peralatan untuk proses pemisahan senyawa organik yaitu

kolom kromatografi gravitasi (KKG), pelat Kromatografi Lapis Tipis (KLT),

chamber kromatografi, lampu UV, pinset, botol vial, lumpung alu. Peralatan

untuk uji fitokimia seperti pipet tetes dan plat tetes. Peralatan analitik seperti

neraca analitik, spektofotometer UV-Vis Hitachi UH-5300, dan spektrofotometer

FT-IR (Shimadzu 8400). Peralatan gelas (Iwaki pyrex) seperti gelas ukur, labu

ukur, gelas piala, erlenmeyer, batang pengaduk, serta peralatan lainnya seperti

alumunium foil, mistar, pensil, gunting, buku catatan dan kamera gawai.

Sampel penelitian yang digunakan adalah biji kopi Robusta (Coffea

canephora) yang diperoleh dari Kabupaten Merangin, Provinsi Jambi. Bahan

kimia yang digunakan yaitu pelarut organik metanol, etil asetat, n-heksana,

H2SO4 2 N, pereaksi Dragendorff (merck KGaA), pereaksi Meyer, serbuk Mg

(sigma Aldrich), HCl 2 N, HCl pekat 37% (sigma aldrich), kloroform (CHCl3),

FeCl3 pereaksi Lieberman Burchad (asam asetat anhidrat dan asam sulfat

pekat), silika gel G60 (0,063-0,200 mm dan 0,040-0,063 mm). Serta sebagai

bahan untuk pengujian antioksidan yang digunakan adalah 2,2-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (sigma aldrich), akuades, metanol p.a., dan asam askorbat

(vitamin C) sebagai senyawa antioksidan pembanding.

3.3 Prosedur Kerja

Pengambilan dan preparasi sampel penelitian

Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel yaitu biji kopi Robusta

di kawasan Kabupaten Merangin, Provinsi Jambi.

Proses Roasting

Biji kopi diroasting pada suhu 200ºC. Proses roasting dilakukan di

Sekolah Tinggi Teknologi Nasional (Stiteknas) Jambi. Proses roasting

merupakan proses perpindahan panas yang kompleks, dimana biji kopi

mengalami penurunan berat secara konstan, peningkatan volume dan densitas,

warna, pH, flavor, dan aroma (Edzuan et al., 2015).

14

Pasang regulator gas ke tabung gas LPG dan pastikan mesin roasting

dan cooling bin terhubung ke sumber listrik. Nyalakan saklar sehingga drum

dapat berputar. Atur penunjuk pada katup gas pada posisi 7.5. nyalakan katup

api dan biarkan hingga suhu 200ºC. Jika telah mencapai suhu 200ºC

masukkan 1000 gram biji kopi melalui corong pada alat. Biji kopi yang masuk

akan diaduk dan dipanaskan secara bersamaan dalam tabung pengaduk. Saat

proses roasting berlangsung, biji kopi dapat dipantau melalui sendok yang

terdapat pada mesin. Selama proses roasting dicatat perubahan suhu dari menit

pertama hingga terakhir.

Setelah mendapatan warna biji kopi yang diinginan kemudian nyalakan

cooling bin dan tarik tuas pembuka mesin sehingga biji kopi masuk dalam

penampung dan proses pendinginan biji kopi dapat berlangsung. Jika proses

pendinginan selesai angkat pelat penutup cooling bin dan tampung biji kopi

menggunakan wadah. Matikan cooling bin dan tutup kembali pelat penutupnya.

Biji kopi kemudian ditimbang. Biarkan suhu mesin turun hingga suhu 50ºC

kemudian matikan mesin dengan menekan saklar listrik.

Proses Grinding Kopi

Biji kopi Robusta yang telah ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam

mesin grinding yang telah terpasang dengan listrik. Gunakan wadah

penampung pada bagian bawah alat. Atur alat hingga mencapai tingkat

kehalusan 1. Nyalakan alat dan tampung bubuk kopi yang diperoleh. Matikan

alat jika telah selesai. Selanjutnya sampel dibawa ke Laboratorium Instrumen

dan Tugas Akhir Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Jambi untuk

dilakukan proses selanjutnya.

Ekstraksi senyawa organik

Sampel biji kopi Robusta diekstraksi menggunakan metode maserasi

menggunakan pelarut metanol. Maserat yang diperoleh kemudian dipisahkan

pelarutnya menggunakan alat destilasi rotary evaporator vaccum untuk

memperoleh ekstrak kental dari pelarut yang digunakan. Ekstrak kental yang

diperoleh kemudian ditimbang untuk dihitung rendemennya sehingga dapat

diketahui perkiraan bobot senyawa yang berhasil diekstrak per bobot sampel

yang digunakan untuk setiap pelarut yang digunakan.

15

Uji Skrining Fitokimia

Menurut Setyowati et al (2014), Skrining Fitokimia dapat dilakukan

dengan beberapa uji yaitu sebagai berikut:

Uji alkaloid. Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam larutan HCl encer kemudian

disaring dan filtrat dibagi menjadi tiga tabung reaksi.

-Tes Mayer

Filtrat A ditambahkan reagen Mayer (larutan Kalium Merkuri iodida).

Terjadinya endapan berwarna putih mengindikasikan adanya senyawa

alkaloid. Untuk senyawa alkaloid pada pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen

pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari Kalium

tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks Kalium-alkaloid yang

mengendap.

-Tes Dragendorff

Filtrat B ditambahkan reagen Dragendorff (larutan Kalium Bismut iodida).

Terjadinya endapan berwarna merah bata mengindikasikan adanya senyawa

alkaloid. Pada reaksi menggunakan reagen Dragendorf, dinyatakan bahwa

ion logam K+ membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan alkaloid sehingga

membentuk kompleks Kalium-alkaloid yang mengendap.

Uji flavonoid. Sejumlah Ekstrak dilarutkan dalam 5 mL air panas, didihkan

selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan serbuk Mg secukupnya, 1

mL asam klorida pekat dan 2 mL etanol. Dikocok kuat dan dibiarkan

terpisah. Terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan etanol

menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

Uji tanin/fenolik. Sejumlah ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan

FeCl3 1 %. Terbentuknya warna kehitaman mengindikasikan adanya

senyawa fenolik. Warna yang terbentuk diduga berupa besi(III) heksa-fenolat

sehingga uji ini memberikan indikasi gugus -OH aromatik.

Uji steroid dan terpenoid (Tes Lieberman-Buchard). Sejumlah ekstrak

dilarutkan dalam kloroform dan disaring, filtrat ditambahkan beberapa tetes

asam asetat anhidrat, kemudian dipanaskan dan didinginkan. Selanjutnya

larutan ditambahkan beberapa tetes asam sulfat. Terbentuknya cincin coklat

mengindikasikan adanya senyawa steroid.

Uji saponin. Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam 20 mL aquades, kemudian

larutan dikocok dalam labu ukur selama 15 menit. Terbentuknya lapisan

busa setinggi 1 cm mengindikasikan adanya senyawa saponin.

16

Uji aktivitas antioksidan Metode DPPH

Pembuatan Larutan

Metode yang digunakan pada penelitian Latief et al (2015), digunakan

untuk pengujian aktivitas antioksidan menggunakan DPPH. Dalam uji aktivitas

antioksidan ini, yang dilakukan adalah membuat larutan DPPH 50 µM dengan

cara melarutkan 1,97 mg serbuk DPPH ke dalam 100 mL methanol p.a,

terbentuk larutan berwarna ungu tua.

Pembuatan Larutan Uji

Setelah membuat larutan DPPH 50 µM, langkah selanjutnya adalah

pembuatan larutan uji, sampel ditimbang sebanyak 10 mg, dilarutkan dalam 10

ml metanol p.a dalam labu ukur 100 ml sebagai larutan induk, sehingga

didapatkan konsentrasi 1000 ppm dan dari larutan induk dibuat larutan seri

konsentrasi sebesar 100, 300, dan 500 ppm. Untuk penentuan aktivitas

antioksidan, setiap konsentrasi larutan uji dipipet sebanyak 0,2 ml dengan

menggunakan pipet mikro dan dimasukkan ke dalam botol vial, kemudian

ditambahkan dengan larutan DPPH 50 μM sebanyak 3,8 ml. Campuran larutan

dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap. Campuran

larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometri UV Visible pada panjang

gelombang 517 nm. Sebagai kontrol positif digunakan asam askorbat dengan

perlakuan yang sama seperti larutan uji dengan konsentrasi 10, 30, dan 50

ppm. Kemudian dihitung nilai persen inhibisinya yang menunjukkan aktivitas

peredaman DPPH dan nilai IC50 yaitu konsentrasi yang menghasilkan 50%

inhibisi.

Masing-masing ekstrak biji kopi robusta dianalisis kadar rendemen,

skrining fitokimia dan aktivitas antioksidan. Fraksi teraktif kemudian dilakukan

fraksinasi menggunakan kromatografi kolom vakum menggunakan fasa diam

silika gel dengan perbandingan 1:20. Sampel yang digunakan disiapkan secara

preabsorsi dan dielusi menggunakan eluen dengan kepolaran meningkat. Hasil

elusi berupa fraksi elusi ditampung dalam botol dan dikelompokkan ke dalam

fraksi-fraksi kolom berdasarkan kesamaan pola noda pada plat KLT. Masing-

masing fraksi kolom dipekatkan menggunakan rotary evaporator dan diuji

aktivitas antioksidannya menggunakan penyemprot radikal DPPH. Noda yang

aktif pada pengujian menggunakan plat KLT dari fraksi aktif selanjutnya

dipisahkan dan dimurnikan dengan teknik kromatografi dan rekristalisasi

hingga diperoleh senyawa murni aktif.

17

Karakterisasi Senyawa Murni Spektrofotometri UV-Visible

Kristal fraksi yang diperoleh dilarutkan dengan menggunakan pelarut

metanol p.a. Pada alat spektrofotometer UV-Vis, terlebih dahulu ditentukan

panjang gelombang yang digunakan yaitu 200-400 nm. Kemudian dilakukan

baseline pada alat dengan blanko berupa metanol. Sampel dianalisis dan dilihat

panjang gelombang yang dihasilkan.

Spektrofotometri FT-IR

Kristal dari fraksi yang diperoleh, digunakan sebanyak 0,5 mg kemudian

dicampur dengan KBr sebanyak 50 mg dan digerus homogen. Pada alat

Spektrofotometer FT-IR terlebih dahulu dilakukan baseline dengan blanko

berupa udara. Sampel diletakkan ke dalam sel KBr dan dimasukkan ke dalam

alat dengan lubang mengarah ke sumber radiasi kemudian dilakukan analisis

mulai dari panjang gelombang 2,5 mikron (υ 4000 cm-1) hingga 25 mikron (υ

400 cm-1).

Analisis Data Penentuan persentase rendemen ekstrak

Untuk menentukan persentase rendemen ekstrak dari masing-masing

pelarut yang digunakan terhadap sampel yang digunakan, dapat diperoleh

menggunakan persamaan berikut:

% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 =𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑘𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 (𝑔𝑟)

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑎𝑤𝑎𝑙 (𝑔𝑟) 100%

Penentuan analisis fitokimia

Untuk analisis fitokimia dilakukan dengan cara melihat adanya reaksi

antara reagen dengan sampel yang digunakan. Reaksi dapat berupa timbulnya

perubahan warna, timbunya endapan, atau terbentuknya lapisan.

Nilai % inhibisi

Penentuan nilai % inhibisi dilakukan dengan menggunakan persamaan

berikut:

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 =𝑎𝑏𝑠𝑜𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥 100%

Keterangan:

Kontrol = larutan kosong (tanpa tambahan sampel)

Nilai IC50

Untuk menghitung nilai IC50 dapat diperoleh dengan memplotkan grafik

hubungan konsentrasi sampel dengan % inhibisi. sumbu x adalah konsentrasi

sampel sedangkan sumbu y adalah % inhibisi. Kemudian dihitung persamaan

regresinya y = a + bx dimana untuk menghitung nilai IC50 dapat diketahui dari

18

mengganti nilai y pada persamaan regresi dengan nilai 50. Dari hasil IC50 yang

dihasilkan, selanjutnya ditentukan tingkat kekuatan antioksidan yang

dihasilkan. Tingkat kekuatan antioksidan. Intensitas antioksidan Nilai IC50

(ppm) sangat kuat 500 (Praditasari, 2017).

Penentuan Stuktur Senyawa Organik

Karakterisasi senyawa menggunakan spektrotometer UV-Vis

Analisis ini dilakukan dengan melihat pada panjang gelombang puncak

gelombang yang terbentuk. Kemudian dari hasil panjang gelmbang tersebut

dapat diperkirakan transisi elektron yang terjadi yang relatif sesuai dengan

gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa yang dianalisis. Karakterisasi

senyawa menggunakan spektrofotometer FT-IR. Analisis ini dilakukan dengan

melihat daerah spektrum yang berkaitan dengan spektrum senyawa organik,

yaitu pada bilangan gelombang 4000-400 cm-1. Kemudian dengan melihat pola

vibrasi gelombang yang dihasilkan dan dengan membandingkannya dengan

database, maka dapat diperkirakan ikatan-ikatan atom dan gugus-gugus fungsi

yang ada dalam senyawa yang dianalisis.

19

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Preparasi dan Ekstraksi Sampel Penelitian

Preparasi sampel penelitian merupakan tahap awal dalam sebuah

penelitian. Proses ini diawali dari determinasi sampel tumbuhan. Tujuan dari

proses determinasi yaitu untuk meyakinkan bahwa sampel tumbuhan yang

digunakan merupakan tumbuhan yang benar. Berdasarkan hasil determinasi di

laboratorium Instrumentasi dan Tugas Akhir Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Jambi diketahui bahwa sampel yang digunakan pada penelitian ini

merupakan biji tumbuhan yang berasal dari Famili Rubiaceae, Genus Coffea,

dan Spesies Coffea canephora. Proses selanjutnya pengeringan sampel biji kopi

Robusta (Coffea canephora).

Pada penelitian ini, biji kopi dikeringkan di udara terbuka dengan tujuan

untuk mengurangi kadar air yang terkandung di dalamnya serta menghindari

terjadinya reaksi enzimatik sehingga dapat meminimalisir terjadinya kerusakan

sampel saat penyimpanan dan proses ekstraksi. Selanjutnya dilakukan proses

roasting. Proses roasting merupakan proses perpindahan panas yang kompleks

dalam kondisi tertutup (panas termal), di mana biji kopi akan mengalami

penurunan berat, peningkatan volume, dan penurunan densitas selama

penyangraian. Sudah terkenal bahwa proses penyangraian menyebabkan sifat

kimia dan fisikokimia biji kopi hijau. Sehingga biji kopi akan mengalami

perubahan seperti warna, tingkat pH, rasa dan aroma (Perdana et al., 2018).

Pemilihan suhu 200°C dilakukan karena pada keperluan industri

makanan diperlukan suhu tinggi untuk mengeluarkan senyawa yang terdapat

pada biji kopi robusta (Coffea canephora) disaat pemanasan berlangsung

sehingga menghasilkan aroma. Selain itu roasting dilakukan untuk

menghilangkan air yang masih terdapat di dalam biji kopi.

Selanjutnya dilakukan penggilingan (grinder) biji kopi robusta untuk

memaksimalkan proses ekstraksi hal ini dapat terjadi karena semakin luasnya

permukaan sampel yang berkontak dengan pelarut yang digunakan. Berat biji

kopi sebelum diroasting yaitu 5,04 kg. Pada proses roasting dilakukan pada

suhu 200˚C.

Ekstraksi bertujuan untuk menarik senyawa yang terdapat sampel

menggunakan pelarut yang dapat melarutkan senyawa yang diinginkan dari

komponen serta dapat menghilangkan senyawa yang tidak diinginkan. Menurut

Sudarmaji et al (2007), terdapat dua jenis ekstraksi yaitu ekstraksi tunggal dan

ekstraksi bertingkat. Ekstraksi tunggal merupakan ekstraksi yang

menggunakan satu jenis pelarut. Kelebihan dari metode ini yaitu lebih

20

sederhana dan tidak memerlukan waktu yang lebih lama. Adapun ekstraksi

bertingkat merupakan ekstraksi yang menggunakan pelarut lebih dari satu.

Kelebihan dari ekstraksi bertingkat yaitu dapat menghasilkan rendemen dalam

jumlah yang lebih banyak dengan senyawa yang berbeda tingkat kepolarannya.

Pemilihan pelarut dalam ektraksi merupakan dasar yang penting karena

pelarut yang digunakan akan mempengaruhi senyawa yang terkandung dalam

sampel. Terdapat beberapa sifat pelarut antara lain polar, semi polar dan non

polar. Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa yang bersifat

polar diataranya, senyawa alkaloid kuarterner, fenolik, karatenoid, tanin, gula,

asam amino dan glikosida. Pelarut semi polar dapat mengekstrak senyawa yang

besifat sedikit polar dan sedikit non polar diantaranya senyawa fenol, terpenoid,

alkaloid, aglikon, dan glikosida. Sedangkan pelarut non polar dapat

mengekstrak senyawa non polar diataranya, lilin, lipid dan minyak yang bersifat

volatil atau mudah menguap (Harborne, 1987).

Dari penelitian yang telah dilakukan, dipilih ekstraksi tunggal karena

lebih efisien dan sederhana. Selain itu ekstraksi tunggal tidak banyak

menggunakan pelarut serta metode ini dapat menghindari kerusakan senyawa

yang bersifat termolabil pada bahan. Pelarut yang digunakan adalah metanol.

Metanol merupakan pelarut yang bersifat polar dan disebut sebagai magic

solvent karena kemampuannya yang dapat mengekstraksi senyawa aktif yang

larut dalam cairan ekstraseluler dan intraseluler sehingga dapat menyari

hampir seluruh senyawa dalam tumbuhan (Harborne, 1987). Proses maserasi

menggunakan metanol dilakukan selama 2x24 jam. Dalam proses ekstraksi,

semakin lama waktu ekstraksi, kuantitas bahan yang terekstrak juga akan

semakin meningkat dikarenakan semakin banyak kontak antara bahan dengan

pelarut (Winata et al., 2015). Sedangkan waktu maserasi yang melewati waktu

optimum akan menyebabkan komponen yang terekstrak menurun. Waktu

maserasi yang melewati waktu optimum akan merusak zat terlarut yang ada di

dalam bahan dan berpotensi meningkatkan proses hilangnya senyawa-senyawa

di dalam larutan yang terekstrak karena adanya penguapan (Cikita et al., 2016).

Rendemen Ekstrak

Rendemen merupakan nilai dari perbandingan berat akhir yaitu berat

ekstrak yang dihasilkan dengan berat awal dan dikalikan dengan seratus persen

(100%) (Sani et al., 2014). Nilai rendemen dapat mengetahui besar kecilnya

efisiensi proses ektraksi. Hal ini dapat dilihat dari pemilihan metode ekstraksi

dan bagian tumbuhan yang diekstrak sehingga nilai rendemen dipengaruhi oleh

dua faktor tersebut. (Tiwari et al., 2011). Dari hasil proses ektraksi biji kopi

robusta (Coffea canephora) yang telah diroasting diperoleh ekstrak pekat

21

berwarna hitam yang selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotary evaporator

untuk mendapatkan ekstrak kental (crude) dari biji kopi robusta. Banyaknya

ekstrak dan % rendemen dari hasil penguapan ektrak dalam gram disajikan

pada Tabel 1.

Tabel 1. Banyaknya Ekstrak dan %rendemen Hasil Maserasi

Maserasi Berat Sampel

(gr)

Volume MeOH (mL)

Volume Ekstrak

(mL)

Ekstrak Kental

(Evaporasi) (gr)

% Rendemen

I

4.220

7.600 2.927 100

5% II 4.600 4.336 80

III 3.965 3.542 31,37

Berdasarkan Tabel 1 di atas dapat terlihat bahwa rendemen ekstrak biji

kopi robusta (Caffea canephora) yang didapatkan yaitu sebesar 5%. Hasil

rendemen ini dipengaruhi oleh lamanya waktu ekstraksi. Maserasi yang telah

dilakukan yaitu selama 2 hari merupakan waktu yang optimal untuk

mendapatkan rendemen ekstrak. Selain itu dilakukan pengulangan maserasi

untuk memperoleh senyawa yang lebih banyak. Data dari rendemen pada Tabel

1 memiliki hubungan dengan senyawa aktif di dalam sampel. Sehingga apabila

jumlah randemen yang dihasilkan banyak maka jumlah senyawa senyawa aktif

yang terkandung dalam sampel juga semakin banyak (Hasnaeni et al., 2019).

4.2 Penapisan Fitokimia (Screening Fitokimia)

Penapisan fitokimia dilakukan pada simplisia berupa ekstrak biji kopi

robusta (Caffea canephora) yang bertujuan untuk mengetahui golongan

senyawa yang terdapat pada sampel (Kabera et al., 2014). Hasil skrining

fitokimia ekstrak metanol biji kopi robusta (Coffea canephora) dapat dilihat pada

Tabel 2.

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak metanol biji kopi robusta (Coffea canephora)

Skrining Fitokimia Hasil Keterangan (+)

Alkaloid -Pereaksi Dragendorff -Pereaksi Meyer Flavonoid Saponin Tanin Fenol Steroid Triterpenoid

+ - + - + + - +

Endapan merah hingga jingga Endapan putih kekuningan Terbentuk buih berwarna jingga Busa stabil Warna hitam kehijauan Warna hijau sampai biru kehitaman Warna biru atau hijau Warna ungu atau jingga

*keterangan

(+) terdapat seenyawa metabolit sekunder

22

(-) tidak terdapat senyawa metabolit sekunder

Berdasarkan Tabel 2 hasil penapisan fitokimia dari simplisia ekstrak biji

kopi robusta (Coffea canephora) dapat dilihat bahwa ekstrak mengandung

senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, fenol, dan triterpenoid sehingga

memungkinkan untuk dilakukan proses isolasi seyawa pada biji kopi robusta.

Ekstraksi Cair-Cair (Partisi)

Proses ekstraksi biji kopi robusta selajutnya yaitu dilakukan dengan

cara partisi (ekstraksi cair-cair) menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat.

Pada tahap ini ekstrak kental metanol dilarutkan dengan pelarut metanol dan

akuades kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah dan dicampurkan

dengan n-heksan selanjutnya digojlog dan didiamkan sehingga terbentuk dua

lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan n-heksan (organik). Setelah terkumpul

lapisan n-heksan dipekatkan dengan alat rotary evaporator sehingga didapatkan

fraksi n-heksan. Selanjutnya lapisan air ditambahkan dengan larutan etil asetat

kemudian dilakukan hal yang sama seperti pada proses sebelumnya (Saputra et

al., 2018). Sehingga didapatkan fraksi etil asetat. Hasil rendemen fraksi n-

heksan dan fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Hasil rendemen fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi metanol

Berdasarkan Tabel 3 didapatkan hasil bahwa rendemen terbanyak

yaitu pada fraksi metanol yaitu sebesar 32,1808 %. Pelarut metanol mampu

mengekstrak senyawa lebih baik, karena perolehan senyawa didasari oleh

kesamaan sifat kepolaran terhadap pelarut (Verdiana et al., 2018). Penggunaan

jenis pelarut dengan perbedaan polaritas dapat memberikan pengaruh terhadap

rendemen. Pelarut organik berdasarkan konstanta dielektriknya dibedakan

menjadi dua, yaitu polar dan non polar. Konstanta dielektrik menyatakan gaya

tolak menolak antara dua partikel bermuatan listrik dalam satu molekul.

Selanjutnya dilakukan uji skrining fitokimia yang bertujuan untuk mengetahui

golongan senyawa yang terdapat dalam tiap fraksi yang diperoleh.

Hasil dari skrining fitokimia dari tiap fraksi dapat dilihat pada Tabel 4.

Berdasarkan Tabel 4 hasil skrining fitokimia dari faksi n-heksan diketahui

bahwa fraksi n-heksan positif mengandung senyawa flavonoid. Pada fraksi etil

asetat diketahui bahwa fraksi etil asetat positif mengandung senyawa alkaloid,

flavonoid, dan tanin. Sedangkan pada fraksi metanol diketahui positif

mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, dan triterpenoid.

Fraksi %Rendemen

n-heksan 13,0528

Etil asetat 26,6885

Metanol 32,1808

23

Tabel 4. Hasil Skrining Fitokimia Fraksi n-heksan, Etil Asetat dan Fraksi Metanol

Skrining Fitokimia Hasil Keterangan (+)

Fraksi n-Heksan

Alkaloid -Pereaksi Dragendorff -Pereaksi Meyer

Flavonoid

Saponin

Tanin

Fenol

Steroid

Triterpenoid Fraksi Etil Asetat

Alkaloid -Pereaksi Dragendorff -Pereaksi Meyer

Flavonoid

Saponin

Tanin

Fenol

Steroid

Triterpenoid Fraksi Metanol

Alkaloid -Pereaksi Dragendorff -Pereaksi Meyer

Flavonoid

Saponin

Tanin

Fenol

Steroid

Triterpenoid

- - + - - - - - + - + - + - - - + - + - + - - +

Endapan merah hingga jingga Endapan putih kekuningan Terbentuk buih berwarna jingga Busa stabil Warna hitam kehijauan Warna hijau sampai biru kehitaman Warna biru atau hijau Warna ungu atau jingga Endapan merah hingga jingga Endapan putih kekuningan Terbentuk buih berwarna jingga Busa stabil Warna hitam kehijauan Warna hijau sampai biru kehitaman Warna biru atau hijau Warna ungu atau jingga Endapan merah hingga jingga Endapan putih kekuningan Terbentuk buih berwarna jingga Busa stabil Warna hitam kehijauan Warna hijau sampai biru kehitaman Warna biru atau hijau Warna ungu atau jingga

*Keterangan

(+) terdapat seenyawa metabolit sekunder

(-) tidak terdapat senyawa metabolit sekunder

Analisis alkaloid

Bi(NO3)3 + 3KI BiI3 + 3KNO3

Coklat

BiI3 + KI K [BiI4]

Kalium tetraiodobismutat

N NK

+ K + BiI4BiI4

Endapan Kalium-Alkaloid

Gambar 4. Reaksi Uji Dragendorff (Marliana et al., 2005)

24

Nitrogen dari alkaloid akan bereaksi dengan kalium tetraiodobismutat

yang membentuk endapan kalium alkaloid yang berwarna merah.

Analisis flavonoid

Analisis flavonoid dilakukan dengan menggunakan HCl pekat dan

serbuk Mg atau disebut dengan uji Wilstataer. Uji positif ditandai dengan

terbentuknya warna jingga. Logam Mg dan HCl pekat berfungsi untuk

mereduksi inti benzopiron yang terdapat pada struktur flavonoid (Varghese et

al., 2010). Reaksi yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Mekanisme reaksi flavonoid (Varghese et al., 2010)

Analisis saponin

Pengujian saponin dilakukan dengan mengocok sampel yang telah

dilarutkan dengan air hangat hingga muncul busa yang stabil dan apabila

ditetesi dengan larutan HCl, busa tidak akan menghilang. Reaksi yang terjadi

dapat dilihat pada Gambar 6.

CO

OH2O

CO2H+

OOH

OH

OH

CH2OH

OOH

OH

OH

CH2OH

l-arabinopiriosil-3-β-asetil oleanolat aglikon glukosa

Gambar 6. Reaksi saponin

O

O

OH

HCl

O

OH

OH

+ Cl

O

O

OH

HO

O

OH

+Cl

25

Analisis tannin

Uji positif pada tannin adalah menghasilkan warna hitam kehijauan.

Reaksi yang terjadi antara eksrak dengan FeCl3 dapat dilihat pada gambar 7.

O

OH

OH

HO

OH

3 + Fecl3

O

O

O

OH

OH

O

O

OHO

HO

O

O

O

OHHO

Fe

+

3H +3Cl

Gambar 7. Reaksi tannin dengan FeCl3

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Sebelum difraksinasi, terlebih dahulu dilakukan uji KLT untuk melihat

pola pemisahan komponen-komponen senyawa yang terdapat dalam ekstrak

kasar. Uji KLT juga dilakukan terhadap fraksi-fraksi yang akan difraksinasi dan

juga fraksi-fraksi yang didapat setelah perlakuan fraksinasi. Uji KLT dapat

dilakukan dengan sistem campuran eluen menggunakan beberapa pelarut

seperti n-heksana, etilasetat, aseton, diklorometana, dan metanol. Hasil

kromatogram diamati di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm

agar dapat dilihat pola pemisahan komponen-komponen senyawanya. Hasil

kromatogram tersebut kemudian disemprot menggunakan larutan DPPH untuk

menampakkan bercak/noda dari komponen senyawa tersebut. Setiap fraksi

yang menghasilkan pola pemisahan dengan nilai Rf (Retention factor) yang sama

digabung dan dipekatkan sehingga diperoleh beberapa fraksi gabungan yang

akan difraksinasi lebih lanjut.

Dari penelitian ini tiap fraksi kemudian diuji aktivitas antioksidannya

menggunakan penampak bercak/noda DPPH dengan cara disemprotkan.

Berikut merupakan gambar hasil fraksi methanol, etil asetat dan n-heksan

setelah disemprotkan dengan radikal DPPH.

Dari gambar 8 terlihat bahwa pada plat fraksi etil asetat terdapat noda

disepanjang plat sehingga pada fraksi etil asetat diduga mengandung senyawa

antioksidan. Selanjutnya digunakan fraksi etil asetat untuk diisolasi senyawa

yang terkandung di dalamnya.

26

Gambar 8. Uji antioksidan menggunakan penampak noda DPPH

4.3 Isolasi senyawa Fraksi Etil Asetat Biji Kopi Robusta (Caffea canephora)

Proses isolasi senyawa dilakukan dengan beberapa tahapan antara lain

pemisahan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan

bantuan pompa vakum untuk mempercepat proses pemisahan pada metode

selanjutnya. Ekstrak yang dipilih yaitu etil asetat difraksinasi menggunakan

KCV. Pada tahapan ini digunakan dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase

diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan

melarutkan zat komponen cairan (Sri, 2014). Fase gerak menggunakan

kepolaran gradien yang dimulai dari non polar, semi polar dan polar yaitu

pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol. Penggantian gradien fase gerak

dilakukan saat fase gerak pada gradien sebelumnya telah habis ketika melewati

kolom.

Pada penelitian ini sampel dielusi menggunakan pelarut dengan

perbandingan pelarut n-heksan dan etil asetat yang digunakan yaitu (9:1, 8:2,

7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9) pelarut etil asetat 100% dan perbandingan etil

asetat dengan metanol (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9), serta pelarut

metanol 100%. Hasil elusi menggunakan KCV diperoleh sebanyak 22 vial yang

selanjutnya diuapkan. Hasil fraksinasi kemudian dipantau kembali dengan KLT

menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (1:9) fase diam yang digunakan

adalah silika gel untuk menentukan senyawa mana yang akan dilanjutkan

untuk proses isolasi senyawa. Kemiripan bercak noda yang timbul pada plat

KLT diamati dibawah sinar UV 254 nm. Fraksi dengan kemiripan pola noda

yang sama kemudian digabungkan menjadi satu vial. Hasil pemisahan senyawa

dengan kromatografi kolom cair dapat dilihat pada Gambar 9.

27

Gambar 9. Pemurnian sampel dengan kromatografi vakum cair

Hasil pengelompokkan fraksi hasil KVC dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Pengelompokkan Fraksi Hasil KVC Fraksi Etil Asetat Biji Kopi Robusta (Caffea canephora)

Fraksi Urutan botol vial % rendemen

F1 F2 F3

1-13 14-15 16-22

2,34

Dari hasil KVC diperoleh 22 vial yang selanjutnya dianalisa

menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mengelompokkan tiap fraksi.

Berdasarkan hasil KLT dari di atas diperoleh tiga fraksi gabungan yaitu fraksi 1

(vial 1-13), fraksi 2 (vial 14-15), dan fraksi 3 (vial 16-22). Rendemen yang

didapatkan yaitu sebesar 2,34 %.

Gambar 10. Pola noda hasil KLT dari KVC fraksi etil asetat

Berdasarkan pengelompokan noda tersebut kemudian dilakukan uji

kualitatif terhadap aktivitas antioksidan pada fraksi-fraksi yang didapat dengan

cara menotolkan kembali tiap fraksi pada plat KLT selanjutnya dielusi

menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (1:9). Berikut hasil uji aktivitas

antioksidan secara kualitatif menggunakan DPPH disajikan pada Gambar 11.

28

Gambar 11. Hasil uji kualitatif fraksi etil asetat (F3,F2,F1) menggunakan penampak bercak DPPH

Setelah ketiga fraksi diuji aktivitas antioksidannya secara kualitatif

maka didapatkan hasil pemantauan dimana pada fraksi 2 (F2) setelah

disemprot dengan radikal DPPH menunjukan hasil yang positif dengan

terbentuknya bercak berwarna kuning paling banyak. Maka fraksi 2 (F2) dipilih

untuk kemudian dilakukan isolasi selanjutnya.

4.4 Isolasi dan Pemurnian

Proses selanjutnya dilakukan proses pemisahan dan pemurnian senyawa

yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Pada

tahap ini digunakan untuk memisahkan senyawa yang lebih spesifik karena

lamanya kontak antara eluen dan senyawa di dalam kolom yang hanya

dipengaruhi oleh gravitasi bumi. Sebanyak 2 gram ekstrak fraksi F2 etil asetat

diimpregnasi menggunakan silika gel. Sebelum dielusi dilakukan uji KLT untuk

mencari eluen dengan pemisahan terbaik yang kemudian digunakan sebagai

eluen untuk KKG. Hasil dari KLT menunjukkan bahwa pada perbandingan

eluen n-heksan dan etil asetat belum memberikan pemisahan terbaik. Eluen

yang digunakan merupakan campuran antara n-heksan dan etil asetat dengan

perbandingan (2:8) dan (1:9) serta pelarut etil asetat 100% kemudian campuran

antara etil asetat dan metanol dengan perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6,

3:7). Proses pemisahan menggunakan KKG dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)

F2

29

Berdasarkan Gambar 12 dari hasil KKG diperoleh 69 vial yang kemudian

diuapkan dan dilanjutkan pemantauan dengan menggunakan KLT untuk

menggabungkan fraksi dari hasil KKG. Digunakan perbandingan eluen n-

heksan dan etil asetat (1:8). Berdasarkan hasil KLT, vial dengan pola noda yang

sama kemudian digabungkan menjadi empat subfraksi yaitu fraksi 2.1 (vial 1-

10), fraksi 2.2 (vial 11-26), fraksi 2.3 (27-45) dan fraksi 2.4 (vial 46-69). Pola

noda KLT tiap subfraksi dapat dilihat pada Gambar 13 berikut:

Vial 1-10

Vial 11-21

Vial 22-32

Vial 33-42

Vial 43-52

Gambar 13. Pola noda KLT subfraksi gabungan KKG

Pengelompokkan fraksi hasil KKG (F2) dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Pengelompokkan Fraksi Hasil KKG (F2) Etil Asetat Biji Kopi Robusta (Caffea canephora)

Fraksi Urutan botol vial Berat fraksi % Rendemen

F2.1 F2.2 F2.3 F2.4

1-10 11-26 27-45 46-69

0,1 gr 0,67 gr 0,95 gr 6,85 gr

2,0161 13,5080 19,1532 138,10

Pada F2.2 terbentuk kristal yang kemudian dilarutkan menggunakan n-

heksan untuk memisahkan senyawa nonpolar yang bersifat sebagai pengotor.

Isolat pada F2.2 tidak larut dalam n-heksan kemudian isolat diskrining

fitokimia untuk menentukan golongan senyawanya dan diuji kemurniannya

dengan uji KLT. Hasil skrining fitokimia pada F2.2 dapat dilihat pada tabel 7.

30

Tabel 7. Hasil Skrining Fitokimia Isolat F2.2

Skrining Fitokimia Hasil Keterangan (+)

Alkaloid -Pereaksi Dragendorff -Pereaksi Meyer Flavonoid Saponin Tanin Fenolik Steroid Triterpenoid

+ - - - - - - -

Endapan merah hingga jingga Endapan putih kekuningan Terbentuk buih berwarna jingga Busa stabil Warna hitam kehijauan Warna hijau sampai biru kehitaman Warna biru atau hijau Warna ungu atau jingga

*Keterangan

(+) : Terdapat senyawa metabolit sekunder

(-) : Tidak terdapat senyawa metabolit sekunder

Berdasarkan hasil skrining fitokimia dari F2.2 diketahui bahwa isolat

mengandung senyawa alkaloid. Kemudian dilakukan uji aktivitas

antioksidannya menggunakan penampak bercak yaitu DPPH dengan

menotolkan pada plat KLT kemudian disemprotkan dengan DPPH. Berikut hasil

uji aktivitas antioksidan secara kualitatif menggunakan DPPH dapat dilihat

pada Gambar 14.

Gambar 14. Uji aktivitas antioksidan F2.2 menggunakan DPPH

Selanjutnya dilakukan uji kemurnian dengan menggunakan tiga jenis

pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Jika noda yang terbentuk

menampakkan satu noda tunggal maka dapat dikatakan bahwa sampel sudah

merupakan senyawa murni. Hasil uji kemurnian KLT sistem tiga eluen yaitu

dapat dilihat pada Gambar 15.

Hasil uji KLT dengan menggunakan tiga eluen yang berbeda berdasarkan

Gambar 15 yaitu n-heksan : etil asetat (9:1), aseton : etil asetat (1:9), dan DCM :

etil asetat (2:8) yang menunjukkan bahwa isolat mempunyai noda tunggal dan

merupakan isolat yang telah murni. Kemudian dihitung nilai Rf dari tiap eluen

sehingga didapatkan nilai Rf pada tiap eluen sebagai berikut.

F2.2

31

a. n-heksan : etil asetat (9:1) = 0,49

b. aseton : etil asetat (1:9) = 0,6

c. DCM : etil asetat (2:8) = 0,47

Gambar 15. Hasil uji kemurnian KLT dengan 3 eluen berbeda (a) n-heksan:etil asetat (1:9), (b) DCM : etil asetat (2:8), dan (c) aseton : etil asetat(1:9)

4.5 Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi

Spektrofotometer UV-Vis

Berikut merupakan spektrum UV-Vis dari isolat F2.2 fraksi Etil asetat

biji kopi robusta (Caffea canephora)

Gambar 16. Spektrum UV-Vis F2.2

Berdasarkan spektrum pada senyawa F2.2 pada Gambar 16 terdapat

satu pita yang dihasilkan oleh isolat murni dalam pelarut metanol. Pita ini

memiliki panjang gelombang 286 nm. Serapan pada panjang gelombang 286 nm

ini diduga adanya transisi elektron yang tidak berikatan ke orbital anti ikatan

(n→π*) oleh gugus karbonil (C=O) dan (N-H). Serapan ini terjadi pada panjang

gelombang dengan panjang intensitasnya rendah (Sastrohamidjojo, 2001).

286 nm

a c b

Panjang gelombang (nm)

Absorb

an

si

32

Gambar 17. Spektrum UV Vis (Bhawani et al., 2015)

Hal ini diperkuat dengan panjang gelombang 276-280 nm pada Gambar

17 yang merefleksikan kandungan kafein pada sampel yang diukur (Souto et al.,

2015). Selain itu pada panjang gelombang 270 hingga 300 masih terkait erat

dengan panjang gelombang dalam biji kopi sangrai seperti kafein (Suhandy dan

Yulia, 2017). Pada penelitian Bhawani et al (2015), data spektrum yang

diperoleh memiki kemiripan dengan isolat F2.2. Diketahui bahwa serapan yang

didapat yaitu pada 274 nm merupakan golongan senyawa alkaloid yaitu kafein.

Spektrofotometer FTIR

Karaketrisasi menggunakan spektrofotometri FTIR dengan

memanfaatkan spektroskopi sinar merah digunakan untuk mengidentifikasi

material dan keberadaan gugus fungsi yang terdapat dalam sampel. Energi yang

dipancarkan akan menyebabkan getaran atau vibrasi antar molekul (Maimuna

et al., 2020). Analisa FTIR pada isolat F2.2 digunakan untuk mengetahui gugus

fungsional yang terdapat dalam isolat. Hasil dari spektrofotometri FTIR senyawa

F2.2 dapat dilihat pada Gambar 18.

Karakteristik menggunakan FTIR pada Gambar 18 dilakukan pada

rentang bilangan gelombang 600-4000 cm-1. Bilangan gelombang 971,06 cm-1

merupakan indikasi keberadaan gugus C-N dari ikatan amina alifatik.

Gelombang bilangan 1457,77 cm-1 menunjukkan vibrasi tekuk C-H dari gugus

fungsi alkana. Pita serapan pada bilangan gelombang 1546,08 cm-1 merupakan

karakteristik dari vibrasi ulur C=C dari cincin aromatik, sedangkan 1643,56

cm-1 menunjukkan vibrasi ulur C=O pada keton. Vibrasi ulur H-C=O, C-H pada

gugus fungsi berada pada bilangan gelombang 2953,28 cm-1. Vibrasi ulur C-H

alkana berada pada bilangan gelombang 3108,17 cm-1.

Absorb

an

si

Panjang gelombang (nm)

33

Gambar 18. Spektrum IR F2.2

Gambar 19. Spektrum FTIR kafein (Kwasniewska et al., 2021)

Berdasarkan data yang telah didapatkan diketahui bahwa hasil

spektrum FTIR memiliki kesamaan dengan senyawa yang diduga mirip dengan

alkaloid hasil dari penelitian (Kwasniewska et al., 2021) yaitu senyawa golongan

alkaloid berupa senyawa kafein. Berikut perbandingan interpretasi data analisa

FTIR terhadap isolat F2.2 pada Tabel 8.

Bilangan gelombang (cm-1)

% T

ran

sm

itan

si

% T

ran

sm

itan

si

Bilangan gelombang (cm-1)

34

Tabel 8. Data pembanding serapan FTIR senyawa F2.2

Isolat fraksi F2.2

(nm)

alkaloid (Kwasniewska et al., 2021) (nm)

Jenis Ikatan Gugus Fungsi

971,06 1457,77 1546,08 1643,56 2953,28 3108,17

970 1456,02 15555 1660 2950 3110

C-N C-H

C=C pada cincin aromatik C=O keton H-C=O,C-H

C-H

Amina alifatik Alkana

Aromatik Keton

Aldehida Alkena

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat isolat F2.2

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan

metode DPPH. Metode ini digunakan karena prosesnya lebih sederhana dan

DPPH lebih sensitif sehingga hasil yang didapat lebih akurat (Maesaroh et

al.,2018). Metode pengujian antioksidan menggunakan DPPH dapat dilakukan

dengan dua cara yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif.

Metode Kuantitatif

Hasil uji aktivitas antioksidan dari ektrak, fraksi, dan isolat biji kopi

robusta (Coffea canephora) dengan metode DPPH dapat dilihat pada Tabel 9.

Berdasarkan hasil dari % inhibisi dari uji aktivitas antioksidan pada Tabel 9

dapat diketahui bahwa ekstrak etil asetat memiliki nilai IC50 yaitu 82,12 ppm

lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak n-heksan dan ekstrak metanol yaitu

152,55 ppm dan 84,64 ppm. Sehingga ekstrak etil asetat memiliki aktivitas

antioksidan yang paling tinggi dibandingkan dengan dua ekstrak lainnya. Hal

Ini dikarenakan terdapat lebih dari satu senyawa aktif yang berperan sebagai

antioksidan sehingga meningkatkan nilai aktivitasnya.

Identifikasi isolat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV

sinar tampak. Sampel dilarutkan dalam metanol kemudian diukur panjang

gelombang maksimal sampel. Hasil spektrum menunjukan bahwa panjang

gelombang optimum larutan DPPH untuk penentuan aktivitas antioksidan yaitu

517 nm. Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat

jika nilai IC50 kurang dari 50 ppm, kelompok kuat 50-100 ppm, kelompok

sedang 101-150 ppm, dan lemah 151-200 ppm (Molyneux, 2004).

Dari Tabel 9 dapat dilihat nilai IC50 isolat fraksi etil asetat F2.2 sebesar

21,63 ppm. Pada penelitian Sukohar et al, (2011), yang menguji aktivitas

antioksidan kopi robusta tanpa diroasting memiliki nilai IC50 sebesar 21,41 ppm.

Nilai yang diperoleh tidak terlalu jauh dikarenakan isolat F2.2 merupakan

senyawa murni yang aktivitas antioksidannya dipengaruhi oleh gugus fungsi

yang aktif sebagai antioksidan. Proses roasting dapat mempengaruhi jumlah

senyawa yang aktif sebagai antioksidan. Karena pada suhu yang tinggi senyawa

35

akan mengalami degradasi. Hasil Uji Aktivitas antioksidan ekstrak, fraksi, dan

isolat Biji Kopi Robusta (Coffea canephora) menggunakan metode DPPH dapat

dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9. Hasil Uji Aktivitas antioksidan ekstrak, fraksi, dan isolat Biji Kopi Robusta (Coffea canephora) menggunakan metode DPPH

Sampel Konsentrasi (ppm)

Absorbansi

% Inhibisi

Persamaan linear IC50

(ppm) Blanko (kontrol negatif)

Sampel

Fraksi n-heksana

100

0,418

0,116 72,248 y=0,1577x+25,942 R² = 0,6846 152,55 300 0,096 77,033

500 0,015 96,411

Fraksi etil

asetat

100 0,027 93,540 y=0,1413x+37,831 R² =0,4554 82,12 300 0,035 91,626

500 0,028 93,301

Fraksi metanol

100 0,042 89,952 y=0,1533x+36,258 R² = 0,5172 84,64 300 0,016 96,172

500 0,013 96,889

Asam askorbat (kontrol positif)

10 0,327 21,77 y= 1,7026x-4,9957

R² = 0,7482

32,301 30 0,359 14,114

50 0,011 97,368

Isolat F2.2 Etil Asetat

10 0,163 61 y=1,1044x+26,104R2= 0,5009

21,63

30 0,097 76,79

50 0,142 66,02

Nilai IC50 pada vitamin C sebagai kontrol positif yaitu 32,301 ppm. Pada

penelitian Widyasanti et al, (2016) nilai IC50 dari vitamin C sebagai kontrol

positif yaitu 6,285 ppm. Diketahui bahwa vitamin C merupakan salah satu

senyawa yang mudah rusak. Karena vitamin C mudah teroksidasi pada suhu

tinggi dipercepat oleh panas, sinar, alkali, enzim, oksidator, serta oleh katalis

tembaga dan besi. Oksidasi akan terhambat apabila vitamin C dibiarkan dalam

keadaan asam, atau pada suhu rendah (Yuda et al, 2016). Selain itu dapat

disebabkan oleh jumlah antioksidan yang terkandung didalam ekstrak

(Tristantini et al., 2016).

Berdasarkan gambar 20 dapat dilihat bahwa hasil isolat memiliki ciri

berwarna putih dan berbentuk kristal. Isolat yang diperoleh merupakan kafein

dari golongan alkaloid. Alkaloid bersifat basa karena memiliki paling sedikit

satu buah atom Nitrogen dan merupakan bagian dari cincin heterosiklik

(Hammado dan Illing, 2013).

36

Gambar 20. Isolat murni F2.2

Berikut merupakan struktur dari kafein (Spiller dalam Wachamo, 2017).

N

NO

CH3

CH3

O

N

N

CH3

Gambar 21. Struktur kafein (Spiller dalam Wachamo, 2017)

Pada penelitian ini dilakukan pengujian titik leleh. Titik leleh merupakan

sifat fisik yang diperlukan untuk karakterisasi suatu senyawa. Titik leleh yaitu

temperatur yang merujuk tepat pada saat proses perubahan dari fasa padat ke

fasa cair (Wade, 1999). Isolat dikatakan murni apabila memiliki rentang nilai

sebesar 1° dari titik leleh pustakanya. Dari hasil uji titik leleh isolat F2.2

didapatkan hasil sebesar 219,8 °C. Menurut Pradeep et al. (2015), titik leleh

kristal kafein yaitu sebesar 238 °C. Dari hasil uji menunjukkan senyawa kurang

murni. Terjadinya rentang nilai yang jauh ini dapat diakibatkan oleh beberapa

faktor yaitu ukuran kristal, banyaknya isolat, pengemasan dalam pipa kapiler,

dan senyawa lain yang mempengaruhi range titik leleh.

37

V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan sebagai

berikut:

1. Senyawa yang berhasil diisolasi dari fraksi etil asetat biji kopi robusta

(Coffea canephora) yang telah diroasting mengandung senyawa

golongan alkaloid yaitu kafein.

2. Ekstrak n-heksan memiliki nilai IC50 sebesar 152,55 ppm. Ekstrak etil

asetat memiliki nilai IC50 82,12 ppm dan ekstrak metanol memiliki

nilai IC50 84,64 ppm. Senyawa yang berhasil diisolasi dari fraksi etil

asetat biji kopi robusta pada F2.2 memiliki nilai IC50 sebesar 21,63

ppm. Sedangkan pada control positif vitamin C (asam askorbat)

memiliki nilai IC50 sebesar 32,301 ppm sehingga dapat disimpulkan

bahwa senyawa dari golongan alkaloid tersebut memiliki aktivitas

antioksidan yang sangat kuat.

5.2 Saran

Perlu dilakukan analisis dan karakterisasi lebih lanjut menggunakan

NMR dan GC-MS sehingga dapat diketahui struktur senyawa yang berhasil

diisolasi serta uji aktivitas lain untuk melihat kemampuan bioaktivitas dari

senyawa yang berhasil diisolasi.

38

DAFTAR PUSTAKA

Amiliyah, R., A. Sumono dan L. Hidayati. 2015. “Deformasi Plastis Nilon Termoplastik Setelah Direndam Dalam Ekstrak Biji Kopi Robusta”. Jurnal Pustaka Kesehatan. Vol 3(1) : 117-121.

Artho, L.N., J. Wuisan dan J. A. Najoan. 2015. “Efek Serbuk Kopi Robusta

(Coffea canephora) Terhadap Penyembuhan Luka Insisi Pada Kelinci

(Oryctolagus cuniculus)”. Jurnal e-Biomedik (eBm). Vol. 3(3): 743-748.

Bhawani, S.A., S.S. Fong, dan M.N.M. Ibrahim. 2015. Spectrophotometric

Analysis of Caffeine. Hidawi. 1-7.

BPS Provinsi Jambi. 2020. Provinsi Jambi Dalam Angka Tahun 2020.

Cikita, I., I. H. Hasibuan dan R. Hasibuan. 2016. Pemanfaatan Flavonoid

Ekstrak Daun Katuk Sauropus androgynous (L) Merr) Sebagai

Antioksidan pada Minyak Kelapa. Jurnal Teknik Kimia USU. Jurnal

Teknik Kimia USU: 1-7.

Dinas Perkebunan Provinsi Jambi. 2019. Pembangunan Perkebunan Provinsi

Jambi Tahun 2019.

Edzuan F.A.M., N.A.M. Aliah dan H.L. Bong. 2015. “Physical and Chemical

Property Changes of Coffee Beans during Roasting”. American Journal of

Chemistry. Vol. 5(3): 56-60.

Farah, Adriana. 2012. Coffee :Emerging Health Effects and Disease Prevention,

First Edition. John Willey & Sons, Inc and Institute of Food Technologists.

USA: Wiley Blackwell Publising Ltd.

Farhaty, N dan Muchtaridi. 2012. “Tinjauan Kimia Dan Aspek Farmakologi

Senyawa Asam Klorogenat Pada Biji Kopi”. Suplemen. Volume 14(1): 214.

Fatoni, A., 2015. “Analisa Secara Kualitatif dan Kuantitatif Kadar Kafein Dalam

Kopi Bubuk Lokal Yang Beredar Di Kota Palembang Menggunakan

Spektrofotometer UV-Vis”. Laporan Penelitian Mandiri, Lembaga

Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Sekolah Tinggi Ilmu

Farmasi Bhakti Pertiwi: Palembang.

Ferrazzano G.T., A. Ivan, L. Anielo, D.A. Natale, dan A. Polio. 2009. “Anti-

Cariogenic Effects of Polyphenols From Plant Stimulant Beverages

(Cocoa, Coffee, Tea)”. Fitoterapia. 80:255–262.

Iglesias, G.C. E. Salas, N. Barouh, B. Baréa, A. Panya, F.M. Espinoza. 2016.

“Antioxidant Activity of Protocatechuates Evaluated by DPPH, ORAC, and

CAT Methods”. Food Chem. Vol 194: 749–757.

Isnindar, S. Wahyuono dan S. Widyarini. 2017. “Aktivitas Antioksidan Buah

Kopi Hijau Merapi The Antioxidant Activity of Green Coffee Cherries at

39

Merapi”. Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research. Vol.02:

130-136.

Hammado, N dan I. Illing. 2013. Identifikasi senyawa Bahan Aktif Alkaloid pada

Tanaman Lahuna (Eupatorium odoratum). Jurnal Dinamika. Vol. 4(2): 1-

18.

Hanani, E. 2015. Analisis Fitokimia. Jakarta: EGC.

Handa, S.S., S.P.S. Khanuja, G. Longo dan D.D. Rakesh. 2008. “Extraction

Technologies for Medicinal and Aromatic Plants”. International Centre for

science and High Technology. Vol.1.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Modern Menganalisis.

Bandung: ITB.

Hasnaeni, Wisdawati dan S. Usman. 2019. Pengaruh Metode Ekstraksi

Terhadap rendemen dan Kadar Fenolik Ekstrak Tanaman Kayu Beta-

Beta (Lunasia amara Blanco. Jurnal Farmasi Galenika. Vol.5(2):175-182.

Johnston, K.L., M.N Clifford dan L.M. Morgan. 2003. “Coffee Acutely Modifies

Gastrointestinal Hormon Secretion And Glucose Tolerance In Human.

Dalam: Glycemic Effect Of Chlorogenic Acid And Caffeine”. Am J Clin

Nutr. Vol. 78(4):728-33.

Kristiningrum, N dan Y.N. Cahyani. 2015. “Perbandingan Kadar Fenol Total dan

Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Daun Kopi Robusta dan Arabika”.

Jurnal e-Pustaka Kesehatan. Vol. 40.

Kwa´sniewska S.P., M. Wo´zniak, W. Jankowski, I. Ratajczak dan G. Cofta. 2021.

“Chemical Changes of Wood Treated with Caffeine”. Material. Vol (14):

497.

Latief, M., Nazarudin dan Nelson. 2015. “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun

dan Buah Prepat (Sonneratia alba) Asal Tanjung Jabung Timur Provinsi

Jambi. Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat”.

Universitas Tanjungpura. Pontianak: 112-117.

Leba, M.A.U. 2017. Ekstraksi dan Real Kromatografi. Yogyakarta: Deepublish.

Maimuna, F. Monado dan I. Royani. 2020. Studi awal pengaruh kloroform

sebagai pelarut pada proses ekstraksi molecularly imprinted polymer

(MIP) nano kafein. Jurnal Fisika. Vol 10 (1): 1-7.

Molyneux, P. 2004. “The Use Of The Stable Free Radical Diphenylpicril-Hydrazil

(DPPH) For Estimating Antioxidant Activity”. Songklanakarin J. Sci.

Technol. Vol 1: 211- 219.

Muzdalifa, D dan S. Jamal. 2019. “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fraksi Kulit

Biji Kopi Robusta (Coffea canephora Pierre ex A.Froehner) Terhadap

Pereaksi DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil) Antioxidant Activity Of The

40

Skin Extract Fraction Robusta Coffee Bean (Coffea canephora Pierre ex

A.Froehner) with DPPH Method”. Іndоnеѕіа Nаturаl Rеѕеаrсh

Рhаrmасеutісаl Jоurnаl. Vol 4(2): 41-50.

Olivia, F. 2014. Khasiat Bombastis Kopi. Jakarta: Elex Media Komputindo.

Panggabean, E. 2011. Buku Pintar Kopi. Jakarta: AgroMedia Pustaka.

Perdana, B.M., R. Manihuruk, R. Ashyar, Heriyanti dan Sutrisno. 2018.

Evaluation of the effect of roasting process on the energy transition and

the crystalline structures of Arabica, Robusta, and Liberica coffee from

Jambi Indonesia. Materials Science and Engineering. Vol. 345: 1-12.

Prior, R.L., Wu, X., dan Schaich, K., 2005. “Standardized Methods for the

Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and

Dietary Supplements”. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53:

4290–4302.

Praditasari, A. 2017. “Review: Uji Aktivitas Antioksidan Seara In Vitro Pada

Ekstrak tanaman”. Jurnal Universitas Padjajaran.

Pratita, A.T.K. 2017. “Skrining Fitokimia Dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Senyawa Alkaloid Dari Berbagai Ekstrak Kopi Robusta (Coffea

canephora)”. Jurnal Kesehatan Bakti Tunas Husada. Vol. 17(2).

Pradeep, S., G.N. Rameshaiah, H. Ashoka dan M. Chandraprasad. 2015.

“Caffeine Extraction And Characterization”. International Journal of

Current Research and Review. Vol 7(9): 16-19.

Putri, F.A., A. Arumsari dan Rusnadi. 2019. “Pembandingan Aktivitas

Antioksidan Kopi Robusta (Coffea canephora Pierre Ex A. Froehner) dan

Kopi Luwak Robusta (Coffea canephora Pierre Ex A. Froehner) dengan

Metode DPPH (1,1-Difenil- 2-Pikrilhidrazil)”. Prosiding Farmasi. Vol. 5(2):

270.

Qurrotul, A. 2016. “Uji aktivitas Antioksidan Antara Fraksi Etil Asetat dan

Etanol dari Ekstrak Etanolik Daun Kopi Robusta (Coffea canephora

Pierre ex Froehner)”. Skripsi. Semarang: Universitas Sultan Agung.

Ramanaviciene, Almira, Mostovojus, Voktoras, Bachmatova, Iriana dan

Ramanavicius. 2003. “Anti-bacterial Effect on Caffeine on Eschericia coli

and Pseudomonas florescens”. Journal Acta Medica Lituania. Vol.10(4):

185-188.

Rahardjo, P. 2012. Panduan Budidaya dan Pengolahan Kopi Arabika dan

Robusta. Jakarta: Penebar Swadaya.

Rukmana, H.R. 2014. Untung Selangit dari Agribisnis Kopi. Jakarta: Lily

Publisher.

41

Rubiyanto, D. 2017. Metode Kromatografi Prinsip Dasar, Praktikum dan

Pendekatan Pembelajaran Kromatografi. Yogyakarta: Deepublish.

Sani, R.N., F.C. Nisa, R.D. Adriani dan J.M. Maligan. 2014. Analisis Rendemen

dan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Mikroalga Laut Tetraselmis chuii.

Saputra, T.R., A. Ngatin dan Y. T. Sarungu. 2018. “Penggunaan metode

ekstraksi maserasi dan Partisi pada Tumbuhan Cocor Bebek (Kalanchoe

pinnata) dengan kepolaran berbeda”. Fullene Journal of Chemistry.

Vol.3(1): 5-8.

Sastrohamidjojo, H. 2001. Spetroskopi Infra Merah. Yogyakarta: Liberty

Yogyakarta.

Setyowati, W.A.E., S.R.D. Ariani, M.B. Ashadi dan C.P. Rahmawati. 2014.

“Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Metanol

Kulit Durian (Durio zibethinus Murr.) Varietas Petruk”. Jurnal Fakultas

Keguruan dan Ilmu Pendidikan. Vol. 1.

Soesanto, L. 2020. Kompendium Penyakit-penyakit Kopi. Yogyakarta: Lily

Publisher.

Souto, U.T.C.P. 2015. “Identification of adulration in Ground Roasted Coffees

using UV Vis Spectroscopy and SPA-LDA”. Journal Food, Science and

Technology. Vol.30(1-5).

Sri, A. 2014. Pengembangan Potensi Potensi Bahan Alam disampaikan dalam

Seminar Nasional Kimia Tanggal 24 September 2014.

Sudjadi dan A. Rohman. 2018. Analisis Derivat Babi. Yogyakarta: Gadjah Mada

University Press.

Suhandy, D dan M. Yulia. 2017. “Peaberry Coffe Discrimination Using UV

Visible Spectroscopy Combined with SIMCA and PLS-DA”. International

Journal of Food Properties. Vol.20(1):331-339.

Sukohar, A., F.F. Setiawan, Wirakusumah dan S.S. Herry. 2011. “Isolasi Dan

Karakterisasi Senyawa Sitotoksik Kafein Dan Asam Klorogenat Dari Biji

Kopi Robusta Lampung”. Jurnal Medika Planta. Vol. 1(4).

Suwanto dan Y. Oktavianty. 2010. Budi Daya 12 Tanaman Perkebunan Unggulan. Penebar Swadaya. Jakarta.

Tiwari, P., B. Kumar, M. Kaur, G. Kaur dan H. Kaur. 2011. “Phytochemical

Screening and Extraction: A Review”. Internationale Pharmaceutica

Sciencia. Vol. 1(1).

Tristantini, D., A. Ismawati, B. T. Pradana dan J. G. Jonathan. 2016. “Pengujian

Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH PADA Daun Tanjung

(Mimusops elengi L). Prosiding Teknik Kimia Kejuangan. Vol 1: 1-7.

42

Verdiana, M., W.R.I. Widarta, dan I.D.G.M. Permana. 2018. Pengaruh Jenis

Pelarut Pada Ekstraksi Menggunakan Gelombang Ultrasonik Terhadap

Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Lemon Citrus limon (Linn.)

Burm F.). Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan. Vol. 7(4): 213-222.

Wachamo, H. L. (2017). “Review on Health Benefit and Risk of Caffeine

Consumption”. Medical and Aromatic Plants Journal, 11:416.

Wade, L. G. 1999. Organic Chemistry. New York: Prentice Hall International.

Wahdaningsih, S., S. Wahyuono dan E.P. Setyowati. 2013. “Isolasi Dan

Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Batang Pakis (alsophila glauca

J.SM) dengan Metode DPPH (2,2-difenil-1 pikrilhidrazil)”. Traditional

Medicine Journal. Vol. 18(1): 38-45.

Wibisono, Y. 2017. Biomaterial dan Bioproduk. Malang: UB Press.

Widyasanti, A., D. Rohdiana dan N. Ekatama. 2016. “Aktivitas Antioksidan

Ekstrak Teh Putih (Camellia sinensis) Dengan Metode DPPH (2,2-difenil-

1-Pikrilhidrazil)”. Vol 1(1): 1-9.

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius.

Winata, E. W dan Yunianta. 2015. Ekstraksi Antosianin Buah Murbei (Morus

alba L.) Metode Ultrasonic Batch (Kajian Waktu dan Rasio Bahan :

Pelarut). Jurnal Pangan dan Agroindustri. Vol 3 (2) 773-783.

Wulansari, A.N. 2018. “Alternatif Cantigen Ungu (Vaccinium varingiaefolium)

Sebagai Antioksidan Alami: Review”. Farmaka. Vol. 6(2): 419-429.

Yuda, P. E. S. K dan N. M. D. S. Suena. 2016. “Pengaruh Suhu

PenyimpananTerhadap Kadar Tablet Vitamin C yang Diukur

Menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis”. Jurnal Ilmiah

Medicamento. Vol.2(1): 23-27.

Yanlinastuti, F.S. 2016. “Pengaruh konsentrasi pelarut untuk menentukan

kadar zirkonium dalam paduan U-Zr dengan mengguakan metode

Spektrofotometri UV-Vis”. PIN Pengelolaan Instal Nukl. Vol.1(17): 22– 33.

Yuhernita and Juniarti. 2011. “Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dari

Ekstrak Metanol Daun Surian yang Berpotensi sebagai Antioksidan”.

Makara Sains. Vol. 15(1): 48-52.

Yusianto, D.N. 2014. “Mutu Fisik dan Citarasa Kopi Arabika yang Disimpan

Buahnya Sebelum di- Pulping”. Pelita Perkebunan. Vol. 30(20) : 137-158.

Yusmarini. 2011. “Mini Review Senyawa Polifenol pada Kopi: Pengaruh

Pengolahan, Metabolisme dan Hubungannya dengan Kesehatan”.

Sagu.Vol. 10(2): 22-30.

Yuwono, H.S. 2014. “The New Paradigm of Wound Management Using Coffee Powder. Journal of Surgery. Vol. 2(2) : 25-29.

43

LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Penelitian

Sampel Biji Kopi Robusta

(Coffea canephora)

Maserasi menggunakan Metanol

Partisi Cair-Cair

Lapisan bawah Fraksi n-heksana

Fraksi Metanol Fraksi Etil Asetat

Skrining

Fitokimia

Isolasi

Senyawa

Uji Aktivitas

Antioksidan

Isolat Murni

Skrining

Fitokimia

Karakterisasi

Senyawa

Uji Aktivitas

Antioksidan

Roasting

Penghalusan (grinding)

44

Lampiran 2. Roasting dan Grinding

a. Roasting

Katup api pada alat roasting dinyalakan hingga

mencapai suhu 200ºC

Dimasukkan 1.000 gr biji kopi Liberika

Dipanaskan selama 21 menit

Dicatat perubahan suhu yang terjadi setiap menit

selama proses roasting berlangsung

b. Penghalusan Grinding

Dimasukkan sampel ke dalam mesin grinder

Dinyalakan alat

Dilakukan proses grinding

1.000 gr Biji kopi Robusta

Hasil

Biji Kopi Robusta

Hasil

45

Sampel bubuk

biji Kopi Robusta

Residu Filtrat

Lampiran 3. Ekstraksi dan Isolasi

a. Ekstraksi (Maserasi)

Ditimbang dan dimasukkan ke dalam botol

Ditambahkan pelarut metanol hingga semua

sampel terendam

Diaduk

Didiamkan selama 2 x 24 jam

Disaring

Diuapkan dengan alat rotary

evaporator hingga diperoleh

ekstrak kental

Diuji skrining fitokimia dan

aktivitas antioksidan dengan

penampak noda DPPH

Hasil

46

Ekstrak metanol (crude) biji Kopi

Robusta

Fraksi n-heksana Lapisan atas

Fraksi

etil asetat

Fraksi

metanol

Lapisan atas

b. Fraksinasi Cair-Cair

Ditimbang sejumlah ekstrak

Dilarutkan dengan metanol

Ditambahkan sejumlah n-heksana

Digojlok selama beberapa menit

Didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan

Ditampung lapisan bawah yang terpisah

Dilanjutkan hingga diperoleh warna larutan yang sama

Dihitung volume dan dipekatkan

Diulangi partisi dengan pelarut etil asetat dengan prosedur yang sama

Dihitung volume, dipekatkan

Diuji skrining fitokimia dan aktivitas antioksidan tiap fraksi dengan penampak bercak DPPH

47

c. Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Dirangkai alat kromatografi kolom vakum cair

Ditimbang ekstrak dan fasa diam berupa silika gel

Dipanaskan silika gel dalam oven pada suhu 110

ºC selama 15 menit

Dilarutkan silika gel yang telah dioven dengan n-

heksana dan dimasukkan ke dalam kolom

Dimasukkan kertas saring

Ekstrak diimpregnasi dengan silika gel yang tidak

dipanaskan dalam oven dan dimasukkan ke dalam

kolom

Dimasukkan kertas saring kembali

Dialirkan eluen secara bergradient dengan bantuan

tekanan dari alat pompa vakum

Vial-vial yang diperoleh dikelompokkan

berdasarkan noda dari hasil KLT

Hasil

Fraksi Etil Asetat

48

d. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)

Dirangkai alat kromatografi kolom gravitasi

Ditimbang ekstrak dan fasa diam berupa silika gel

Dimasukkan kapas ke dasar kolom

Dilarutkan silika gel yang telah dipanaskan dalam

oven dengan n-heksana dan dimasukkan ke dalam

kolom

Dimasukkan kertas saring

Ekstrak diimpregnasi dengan silika gel yang tidak

dipanaskan dalam oven dan dimasukkan ke dalam

kolom

Dimasukkan kertas saring kembali

Dialirkan eluen secara bergradient dengan bantuan

tekanan dari alat pompa vakum

Dikelompokkan vial-vial yang diperoleh

berdasarkan noda dari hasil KLT

Diji skrining fitokimia dan uji aktivitas antioksidan

dengan penampak bercak DPPH

Hasil

Fraksi etil asetat

49

Lampiran 4. Uji aktivitas antioksidan

a. Pembuatan Larutan Stok

Dilarutkan masing-masing dalam labu ukur 10 mL dengan

metanol p.a.

Dibuat serangkaian larutan dengan variasi konsentrasi 500

ppm, 300 ppm, dan 100 ppm

b. Pembuatan larutan DPPH

Dilarutkan dengan 100 mL metanol sehingga diperoleh

larutan dengan konsentrasi 50 µM

Dijaga kondisinya pada suhu dingin dan tidak terpapar

cahaya

c. Penentuan aktivitas antioksidan

Dipipet dengan menggunakan mikropipet ke dalam vial

Ditambahkan 3,8 mL larutan DPPH 50 µM

Dihomogenkan larutan

Dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap di suhu ruang

Diukur absorbansi menggunakan spektrofotofemeter UV

Vis pada panjang gelombang 517 nM

Digunakan asam askorbat sebagai kontrol positif

Sejumlah

sampel

Hasil

1,97 mg

serbuk DPPH

Hasil

Hasil

0,2 mL Larutan

Sampel

50

Lampiran 5. Analisa Data dan Perhitungan

A. Perhitungan Rendemen Ekstrak

% Rendemen = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝐸𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝐷𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝐷𝑖𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑥 100% =

211,37 𝑔𝑟

4.220 𝑔𝑟 𝑥 100% = 5%

B. Pembuatan larutan DPPH (50 µM)

50 µM = 0,05 mM

Mr DPPH = 394,33 g/mol

Banyak DPPH yang ditimbang

M = gram

Mr x

1000

V (mL)

0,05 mM = X (mg)

394,33 g/mol x

1000

100 mL

X = 0,05 mM x 394,33 g/mol x 100 mL

1000

X = 1,97165 mg

Jadi, untuk membuat larutan DPPH 50 µM dibutuhkan massa DPPH

sebanyak 1,97165 mg dalam 100 mL metanol p.a

C. Pembuatan larutan asam askorbat (vitamin C)

1000 ppm = 1 g

1000 mL=

0,01 g

10 mL

Jadi, untuk membuat larutan asam askorbat 1000 ppm dibutuhkan massa

asam askorbat sebanyak 0,01 g dalam 10 mL metanol p.a

D. Pembuatan larutan asam askorbat berbagai konsentrasi

- 50 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

V1 = 50 ppm x 10 mL

1000 ppm

= 0,5 mL

Jadi, untuk membuat larutan asam askorbat 50 ppm diambil sebanyak 0,5

mL larutan asam askorbat 1000 ppm, dilarutkan dalam labu ukur 10 mL.

- 30 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

V1 = 30 ppm x 10 mL

1000 ppm

= 0,3 mL

Jadi, untuk membuat larutan asam askorbat 30 ppm diambil sebanyak 0,3

mL larutan asam askorbat 1000 ppm, dilarutkan dalam labu ukur 10 mL.

- 10 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

51

V1 = 10 ppm x 10 mL

1000 ppm

= 0,1 mL

Jadi, untuk membuat larutan asam askorbat 10 ppm diambil sebanyak 0,1

mL larutan asam askorbat 1000 ppm, dilarutkan dalam labu ukur 10 mL.

E. Pembuatan larutan uji berbagai konsentrasi

- Pembuatan larutan uji 10.000 ppm

10 g

1000 ml=

0,1 g

10 ml=10.000 ppm

- Pembuatan larutan uji 500 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

V1 = 500 ppm x 10 mL

10000 ppm

= 0,5 mL

Jadi, untuk membuat 10 mL larutan uji 500 ppm diperlukan larutan stok

10.000 ppm sebanyak 0,5 mL.

- Pembuatan larutan uji 300 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

V1 = 300 ppm x 10 mL

10000 ppm

= 0,3 mL

Jadi, untuk membuat 10 mL larutan uji 300 ppm diperlukan larutan stok

10.000 ppm sebanyak 0,3 mL.

- Pembuatan larutan uji 100 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

V1 = 100 ppm x 10 mL

10000 ppm

= 0,1 mL

Jadi, untuk membuat 10 mL larutan uji 100 ppm diperlukan larutan stok

10.000 ppm sebanyak 0,1 mL.

F. Perhitungan %Inhibisi dan IC50 dalam antioksidan

Ekstrak n-heksan Konsentrasi (ppm) 0 100 300 500 Absorbansi 0,418 0,116 0,096 0,015 %Inhibisi 0 72,248 77,033 96,411 Regresi Linear y= 0,1577x + 25,942

R2= 0,6846

52

IC50 152,55 ppm

%inhibisi

- 100 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,116

0,418x 100 % = 72,248%

- 300 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,096

0,418x 100 % = 77,033%

- 500 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,015

0,418x 100 % = 96,411%

IC50

y = bx + a

50 = 0,1577x+25,942

x = 50 − 25,942

0,1577 = 152,55 ppm

Ekstrak etil asetat Konsentrasi (ppm) 0 100 300 500 Absorbansi 0,418 0,027 0,035 0,028 %Inhibisi 0 93,540 91,626 93,301 Regresi Linear y= 0,1413x + 37,831

R2= 0,4554 IC50 82,12 ppm

%inhibisi

- 100 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,027

0,418x 100 % = 93,54%

- 300 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,035

0,418x 100 % = 91,626%

- 500 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,028

0,418x 100 % = 93,301%

IC50

y = bx + a

50 = 0,1413x + 37,831

x = 50 – 37,831

0,1413 = 82,12 ppm

Ekstrak metanol Konsentrasi (ppm) 0 100 300 500 Absorbansi 0,418 0,042 0,016 0,013 %Inhibisi 0 89,952 96,172 96,889 Regresi Linear y= 0,1533x + 36,258

R2= 0,5172 IC50 84,64 ppm

53

%inhibisi

- 100 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,042

0,418x 100 % = 89,952%

- 300 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,016

0,418x 100 % = 96,172%

- 500 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,013

0,418x 100 % = 96,889%

IC50

y = bx + a

50 = 0,1533x + 36,258

x = 50 – 36,258

0,1533 = 84,64 ppm

Isolat f2.2 dari Fraksi Etil Asetat Konsentrasi (ppm) 0 10 30 50 Absorbansi 0,418 0,163 0,097 0,142 %Inhibisi 0 61 76,79 66,02 Regresi Linear y= 1,1044x + 26,104

R2= 0,5009 IC50 21,63 ppm

%inhibisi

- 10 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,163

0,418x 100 % = 61%

- 30 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,097

0,418x 100 % = 76,79%

- 50 ppm

%inhibisi = absorbansi kontrol−absorbansi sampel

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100%

=0,418−0,142

0,418x 100 % = 66,02%

IC50

y = bx + a

50 = 1,1044x + 26,104

x = 50 – 26,104

1,1044 = 21,63 ppm

54

Lampiran 6. Dokumentasi

Biji kopi robusta

(Caffea canephora)

Proses roasting

Proses grinder

Bubuk biji kopi

robusta

Proses KVC

Impregnasi

dengan silika

Proses KKG

Fraksi hasil KKG