ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha SKRIPSI Oleh : RIZKI NUR FAUZIAH NIM. 135080300111064 PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2017
62
Embed
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L ...repository.ub.ac.id/4478/1/Rizki Nur Fauziah.pdf · Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa laporan skripsi
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM
L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha
SKRIPSI
Oleh :
RIZKI NUR FAUZIAH NIM. 135080300111064
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2017
Judul : ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L- ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha
Nama Mahasiswa : RIZKI NUR FAUZIAH
NIM : 135080300111064
Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan
PENGUJI PEMBIMBING:
Pembimbing 1 : Dr. Sc. ASEP AWALUDIN PRIHANTO, S.Pi, MP
Pembimbing 2 : Dr. Ir. HAPPY NURSYAM, MS
PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:
Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. ANIES CHAMIDAH, MS
Dosen Penguji 2 : Dr.Ir. HARDOKO, MS
Tanggal Ujian : 28 AGUSTUS 2017
PERNYATAAN ORISINALITAS
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang saya tulis ini
dengan judul Isolasi dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-
Asparaginase dari Akar, Batang dan Daun Mangrove Exoecaria agalloca benar-
benar merupakan hasil karya saya sendiri, dan sepanjang pengetahuan saya
juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh
orang lain kecuali yang tertulis dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar
pustaka.
Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa laporan
skripsi ini hasil penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia untuk menerima
sanksi atas perbuatan tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.
Malang, Agustus 2017
Mahasiswa,
Rizki Nur Fauziah NIM. 135080300111064
UCAPAN TERIMAKASIH
Penyusunan penulisan laporan penelitian ini selesai karena adanya
bantuan dari berbagai pihak,maka dari itu penulis menyampaikan ucapan
terimakasih kepada:
1. Orang tua tercinta Moch. Djamil,S.ST, MT dan Dra. Nur Nadhiroh, M.Pd,
yang telah memberikan motivasi, dukungan,do’a, restu, dan ridho, sehingga
penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini dengan baik.
2. Dr.Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Dr. Ir. Happy Nursyam, MS
selaku dosen pembimbing dalam penulisan laporan skripsi yang senantiasa
selalu memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis.
3. Dr. Ir. Anies Chamidah dan Dr. Ir. Hardoko selaku dosen penguji pada
sidang skripsi yang telah memberikan masukan dan arahan pada penulisan
laporan skripsi.
4. Kakak dan adik tersayang Huril ‘In Afqiha Taubatin dan Muhammad Mukhlis
yang telah memberikan semangat, dukungan, dan nasehat selama penulisan
skripsi.
5. Teman-teman nan jauh Fauziah Hidayati, Nurma Azuhra, dan Immamatul
Khoiriah yang selalu memberikan motivasi,dukungan, dan semangat hingga
Nana, Mbk Rine, dan Rina yang selalu menghibur disaat penulis jenuh, sedih
maupun senang dan senantiasa memberikan semangat hingga dapat
menyelesaikan skripsi.
8. Endyk Alvianto yang telah memberikan semangat, motivasi, nasehat, dan
yang selalu menerima keluh kesah penulis hingga skripsi ini dapat
terselesaikan dengan baik.
9. Teman-teman sebimbingan yang telah memberikan dukungan, dan
semangat yang dapat menjadikan motivasi penulis untuk dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sampaikan semua, yang telah
memberikan bantuan kepada penulis selama proses hingga skripsi ini dapat
terselesaikan.
Malang, Agustus 2017
Rizki Nur Fauziah
NIM. 135080300111064
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria
agallocha
Rizki Nur Fauziah1), Asep Awaludin Prihanto2), Happy Nursyam3)
ABSTRAK
Enzim L-Asparaginase (L-Asparagin amidohydrolase) merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-Asparagine menjadi l-aspartat dan ammonia. L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan, bakteri, dan dalam serum tikus tertentu. L-Asparaginase tidak ditemukan pada manusia. Salah satu jenis tumbuhan yang memiliki potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove Excoecaria agalloca. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh bakteri endofit dari akar, batang, dan daun mangrove Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-Asparaginase dan mengetahui identitas bakteri berdasarkan uji Microbact system. Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif. Pada penelitian ini menggunakan sampel akar, batang, dan daun dari mangrove Excoecaria agalloca, yang diambil dari pantai Bajul Mati Malang. Sampel yang telah diambil kemudian dilakukan penanaman untuk mendapatkan isolat bakteri dengan cara dilakukan pengnceran dari 10-1 sampai 10-6 . Setelah didapatkan isolate bakteri maka akan dilakukan skrining dengan menggunakan media selektif L-asparaginase dan didapatkan hasil bakteri penghasil L-asparaginase. Bakteri yang memiliki aktifitas hidrolisis paling besar akan dilakukan uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Dari hasil isolasi bakteri endofit didapatkan 12 isolat bakteri yaitu daun 4 isolat, batang 4 isolat, dan akar 4 isolat. Dari 12 isolat tersebut terdapat 5 isolat yang positif menghasilkan enzim L-asparaginase yaitu dari D10-4 dan D10-5, serta dari B10-3, B10-4 dan B10-5. Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas penghasil L-asparaginase tertinggi adalah pada B10-3. B10-3
adalah bakteri gram positif yang memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil, berdiameter koloni 3,11 mm, dan menurut uji microbact system yang dilakukan bakteri tersebut adalah Bacillus subtilis. Kata Kunci : endofit, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis
ISOLATION AND SCREENING OF ENDOPHYTES BACTERIA WHICH PRODUCE L-ASPARAGINASE ENZYME FROM ROOT, STEM AND LEAF MANGROVES
Excoecaria agalloca
ABSTRACT
L-asparaginase enzyme (L-Asparagine amidohydrolase) is an enzyme that catalyzes and hydrolyses L-asparagine to L-aspartat and ammonia. L-asparaginase can be found in tissues of animals, plants, bacteria, and in rat serum. L-asparaginase can not be found in humans. One type of plant that has the potential source for producing l-asparaginase enzyme is the endophytes of mangrove Excoecaria agalloca. The purpose of this research was obtain bacteria endophytes from root, stem, and leaves of mangrove Excoecaria agalloca which capable of producing L-asparaginase enzyme and to identify the bacteria based on Microbact system test. The research method was descriptive. In this research used sampel roots, stems, and leaves from mangrove Excoecaria agalloca, taken from the beach of Bajul Mati Malang. Samples were taken and then plated to obtain
1) Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang 2) dan 3) Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang
isolates of bacteria by dilution from 10-1 to 10-6. Obtained the bacterial isolates will be screened using selective media L-asparaginase and showed bacteria producing L-asparaginase. Bacteria that have the most substantial hydrolysis activity will be conducted gram stain test and microbact system test. From the result of endophytic bacteria isolation, there were 12 isolates of 4 isolate leaves, 4 isolates stems, and 4 isolate roots. There were 5 isolates among 12 isolates which produced L-asparaginase enzyme is D10-4 and D10-5, and from B10-3, B10-4 and B10-5. Of the 5 isolates that have the highest L-asparaginase-producing activity are in B10-3. B10-3 is a gram-positive bacteria that has a basil cell shape with non motile motility, 3.11 mm colony diameter, and according to microbact system test the bacteria was Bacillus subtilis. Keywords : Endophytes, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis
KATA PENGANTAR
Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT, atas limpahan
rahmat dan hidayah-Mu penulis dapat menyajikan Laporan Skripsi yang berjudul
Isolasi Dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-Asparaginase Dari Akar,
Batang, dan Daun Mangrove Excoecaria agallocha. Di dalam tulisan ini, disajikan
pokok-pokok bahasan yang meliputi cara mengisolasi bakteri hingga
menscreening bakteri yang dapat menghasilkan enzim L-Asparaginase dan
melakukan mutagenesis untuk mengetahui perubahan aktivitas enzim yang
didapatkan.
Sangat disadari bahwa dengan kekurangan dan keterbatasan yang
dimiliki penulis, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti,
tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis
mengharapkan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi yang
membutuhkan.
Malang, Agustus 2017
Rizki Nur Fauziah
NIM. 135080300111064
DAFTAR ISI
Halaman RINGKASAN ..................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii DAFTAR ISI ....................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiii 1. PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang .......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 2 1.3 Tujuan Penelitian....................................................................................... 3 1.4 Kegunaan Penelitian ................................................................................. 3 1.5 Waktu dan Tempat .................................................................................... 3
2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................... Error! Bookmark not defined.4
2.9.1 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram ...... 13 2.9.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact…………….15
3. METODE PENELITIAN ................................................................................. 17
3.1 Materi Penelitian...................................................................................... 17 3.1.1 Alat Penelitian ...................................................................................... 17 3.1.2 Bahan Penelitian .................................................................................. 17 3.2 Metode Penelitian .................................................................................... 17 3.3 Prosedur Penelitian ................................................................................. 18 3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Excoecaria agalloca ...... 18 3.3.2 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase)…………………..19 a. Preparasi Sampel ...................................................................................... 19 b. Pengenceran ............................................................................................. 19 c. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) .............................................. 20 d. Sterilisasi Alat dan Media .......................................................................... 21 e. Penanaman Sampel pada Media LBA ....................................................... 21 f. Isolasi Bakteri ............................................................................................. 22 g. Inokulasi pada Agar Miring ........................................................................ 22 h. Skirining Bakteri Pengahasil Enzim L-Asparaginase ................................. 23 3.3.3 Tahap 2 (Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact) ........... 24
a. Pewarnaan Gram ...................................................................................... 24 b. Uji Microbact System ................................................................................. 25
4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 30
3. Struktur bakteri a) Gram Positif dan b) Gram Negatif…………………………..14
4. Tahapan pewarnaan Gram positif berwarna ungu hingga biru yang dikarenakan oleh warna kompleks dari kristal violet, dan sedangkan Gram negatif berwarna merah mudah dikarekan oleh warna safranin………………………………………..……………………………………..14
5. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati ................................ 19
6. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecaria agalloca, A.
D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5………………………………………31
7. Isolat murni dari bakteri B10-3 ....................................................................... 33
8. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3 ………………………………………35
9. Pengambilan sampel Excoecaria agalloca pada pantai Bajul Mati…………..50
10. Sampel Daun dan Batang dari Excoecaria agalloca .................................... 50
11. A.Pengenceran daun, B.Pengenceran batang, C.Pengenceran akan .......... 51
12. A. Isolat Bakteri B10-3 , B. Streak Kuadran Bakteri B10-3 .............................51
13. Isolat Bakteri pada Agar Miring .................................................................... 51
rhamnosa, sukrosa, lactosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.
Untuk penjelasan dari tiap uji dapat dijabarkan sebagai berikut:
- Uji Motilitas (Tittsler, 1996 dan Presscott, 2002)
Uji motilitas biasanya digunakan sebagai uji untuk membedakan
mikroorganisme berdasarkan matilitasnya, yaitu adalah salah satu ciri dari
mahluk hidup atau mikroorganisme yan mempunyai alat gerak sederhana yang
berupa flagel atau cilia. Bakteri menggunakan energi yang mereka dapat dari
ATP untuk bergerak. ATP diuraikan oleh koenzim ATP-ase dan membentuk fosfo
anorganik. Cara kerja pengujian ini adalah dengan menanam isolat pada media
26
NA tegak dan ditusukkan sedalam 5 mm, kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 0C.
- Uji Oksidase (Lay, 1994)
Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya sitokrom oksidase yang
dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Pertama, biakan ditumbuhkan
pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 0C. Kemudian
ditambahkan reagen uji oksidase yang terdiri dari campuran 1 % larutan α-naftol
dan 1 % larutan-p-fenilendiamin oksalat pada koloni bakteri dan selanjutnya
didiamkan selama 30 menit. Hasil uji dinyatakan postif apabila berwarna hitam.
- Uji Nitrat (Wedhastri, 2002)
Penggunaan uji nitrat adalah untuk menguji kemampuan mikroorganisme
yang dapat tumbuh pada media yang mengandung pepton sebagai sumber
nitrogen. Cara kerja dari pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media
yang mengandung KNO3, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C.
Setelah itu ditambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa-naftilamin, dan
dilihat reaksinya. Pada umumnya, pada medium agar milk, isolat akan tumbuh
berbentuk bulat, dengan warna yang beragam dan besar diameter yang beragam
pula.
- Uji Ornitin (Wahyunio, 2011)
Pada pengujian ditahap ini kita menggukan media MIO untuk dapat
mengetahui reaksi terhadap ornitin, dapat juga digunakan untuk megetahui ada
atau tidaknya pergerakan bakteri yang diuji serta kemampuan bakteri tersebut
dalam penghasilan indol.
- Uji H2S (Didje et al., 2006)
Uji H2S biasa digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam menghidrolisis logam berat yang terdapat pada media biakan. Hasil uji
dinyatakan positif apabila terjadinya pembentukan warna hitam pada media.
27
Cara kerja yang dilakukan adalah dengan menanam isolat pada media TSIA
(Triple Sugar Iron Agar).
- Uji Urease (Ramdany, 2008)
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat
menghidrolisis atau mendegradasi urea dengan enzim urease. Isolat pertama di
tumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa bakteri mampu
menghasilkan enzim urease yang daoan menguraikan urea menjadi amonium
dan CO2. Uji ini dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari warna
merah jingga menjadi merah ungu. Apabila telah terjadi perubahan warna maka,
penguraian urea telah terjadi.
- Uji Indol (Ramdany, 2008)
Uji indol adalah uji untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme unutk
mmbentuk lapisan cincin yang memiliki warna merah muda pada permukaan
biakan dengan penambahan larutan kovacs. Selain itu, Norman (2008) juga
menyatakan bahwa uji ini mampu menunjukan mampu atau tidaknya suatu
bakteri untul menghidrolisis triptofan dengan memanfaatkan enzim triftophanase.
Cara kerja dari pengujian ini adalah dengan menumbuhkan isolat bakteri pada
media yang mengandung triptofan dan menginkubasi biakan tersebut selama 48
jam pada suhu 37 0C. Kemudian dilakukan penambahan larutan reagen yang
mengandung paradimetil aminobenzal dehida.
- Uji V-P (Ramdany, 2008)
Uji V-P (Vogues-Proskauer) digunakan untuk menguji kemampuan bakteri
atau mikroorganisme untuk bereaksi dengan asetonin dan oksigen yang
menghasilkan fermentasi akhir berupa asetil metil karbinol. Cara kerja dari
pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa
dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C. Lalu, dilakukan penambahan
reagen KOH 40 % dan 15 tetes larutan alpha naphtol.
28
- Uji Gelatin (Ramdany, 2008)
Uji gelatin digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam mencairkan gelatin. Cara kerja dari uji ini adalah dengan cara menusukan
isolat bakteri kedalam media semi pada yang mengandung nutrient kaldu dan
gelatin dan kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati. Gelatin yang telah
mencair setelah diinkubasi kemudia diletakkan kedalam lemari es selama 30
menit. Apabila bakteri dapat mencerna gelatin maka, media semi padat gelatin
tersebut akan tetap berbentuk cair, apabila bakteri tidak mampu mencerna
gelatin, maka media akan menjadi beku.
- Uji Sitrat (Ramdany, 2008)
Uji sitrat ini biasanya dilakukan untuk mengetahui dan menguji apakah
bakteri atau mkiroorganismee mampu memfermentasikan asam sitrat sebagai
sumber karbon satu-satunya pada media. Biasanya terjadinya fermentasi asam
sitrat terjadi dengan terjadinya perubahan warna pada media menjadi biru perusi
yang dinyatakan dengan hasil yang positif (+). Apabila tidak terjadi perubahan
warna maka, hasil yang didapatkan adalah negatif (-). Bakteri yang mengalami
perubahan menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim sitrat yang
merupakan enzim yang spesifik pembawa sitrat menuju kedalam sel.
- Uji Lisin (Wayan, 2007)
Uji lisin biasanya digunakan untuk mengetahui reaksi bakteri terhadap
asam amino, dan selain itu pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah
bakteri yang diperiksa akan membetuk asam sulfida dan terjadi perubahan pH
media.
- Uji Arginin (Ramdany, 2008)
Pada pengujian arginin cara kerja yang dilakukan hampir sama dengan
kerja uji lisin. Pengujian ini dilakukan unutk mengetahui reaksi apakah yang
terjadi pada bakteri terhadap asam amino yang lebih kompleks. Apabila uji ini
29
dinyatakan positif (+) maka bakteri mampu bereaksi dengan asam amino, dan
apabila bakteri mendapatkan hasil negatif (-) maka, bakteri tidak mampu bereaksi
dengan asam amino kompleks.
- Uji Gula-gula (Tedja, 2007)
Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu
mikroorganisme dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang
akan disertai dengan adanya pembentukan asam maupun gas yang meliputi uji :
glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, galaktosa dan maltosa.
30
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan bahwa bakteri yang diisolasi
dari endofit mangrove Excoecaria agalloca mampu tumbuh dan berkembang biak
pada media uji yaitu pada media LBA (Luria bertani agar). Bakteri yang tumbuh
tersebut didapatkan dari pengenceran 10-3 - 10-6 yang telah ditanam dari endofit
mangrove Excoecaria agalloca (daun, batang, dan akar) yang telah ditumbuk
dan ditanam pada media LBA (Luria bertani agar), untuk dilakukan inkubasi
selama 24 jam. Setelah dilakukan inkubasi maka akan tumbuh koloni bakteri
yang kemudian dilakukan pemurnian koloni dengan menggunakan metode
streak kuadran. Setelah dilakukan streak kuadran kemudian dilakukan inokulasi
bakteri pada agar miring yang selanjutnya untuk dilakukan uji aktivitas L-
asparaginase. Menurut Kismiati et al. (2009), streak kuadaran dilakukan untuk
memisahkan bakteri satu dengan bakteri yang lain yang berbeda spesies pada
satu habitat yang sama. Dari penanaman yang dilakukan didapatkan 12 isolat
bakteri yang akan dilakukan untuk skrining bakteri penghasil enzim L-
Asparaginase. Isolat bakteri yang terpilih merupakan isolat yang berwarna putih
kekuningan, berbentuk bulat dengan tepian tidak rata dan membentuk elevansi
yang datar serta terpisah dari koloni yang lain. Hal tersebut sesuai dengan
pernytaan Prihanta (2008), bahwa bakteri endofit adalah bakteri yang memiliki
bentuk bulat (circulair), berwarna putih kekuningan, dan terpisah antara satu
sama lain.
Setelah didapatkan 12 isolat bakteri hasil dari pengenceran maka
dilakukan pemurnian bakteri dengan melakukan strik 3 kuadran pada media LBA
dan kemudian dilakukan inokulasi pada agar miring dan jumlah isolat dapat
dilihat pada Tabel 2.
31
Tabel 1. Endofit yang menghasilkan isolat bakteriJenis Endofit Jumlah IsolatDaun 4Batang 4Akar 4Total 12
4.2 Bakteri Penghasil L-Asparaginase
Dari 12 isolat bakteri yang didapatkan dilakukan uji skrining bakteri
penghasil L-Asparaginase dengan menggunakan media selektif L-Asparaginase.
Gambar hasil dari skrining yang telah dilakukan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 1. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecariaagalloca, A. D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5.
Dari gambar diatas dapat diasumsikan pada tabel 2 yaitu menyatakan
bahwa bakteri endofit yang mampu untuk menghasilkan zona aktivitas enzim L-
asparaginase adalah bakteri pada D10-4 dengan lebar zona aktivitas 0,9 cm,
pada D10-5 dengan lebar zona aktivitas 0,8 cm, pada B10-4 dengan lebar zona
aktivitas 1 cm, pada B10-3 dengan lebar zona aktivitas 1,5 cm, dan pada B10-5
dengan lebar zona 1,2 cm.
32
Tabel 2. Hasil Bakteri Endofit Penghasil L-AsparaginaseKode Sampel Zona Aktivitas EnzimD10-3 -D10-4 +D10-5 +D10-6 -B10-3 ++B10-4 +B10-5 +B10-6 -A10-3 -A10-4 -A10-5 -A10-6 -
Keterangan :+++ : Zona Aktivitas Enzim Besar (2,5 – 3,4 cm)++ : Zona Aktivitas Enzim Sedang (1,5 – 2,4 cm)+ : Zona Aktivitas Enzim Kecil ( 0,5 – 1,4 cm)- : Tidak Ada Zona Aktivitas Enzim
Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas enzim L-asparaginase paling
baik adalah pada sampel B10-3 dilihat dari lebar zona berwarna biru yang telah
terbentuk pada sekitar koloni yang tumbuh. Selanjutnya akan dilakukan isolasi
dan kultur kembali untuk dilakukan uji microbact system dan pewarnaan gram.
Adanya perubahan warna pada media uji adalah terjadinya aktivitas
enzim L-asparaginase yang merubah L-asparagin menjadi asam aspartat dan
ammonia. Perubahan warna pada media uji juga disebabkan karena adanya
perubahan media yang menjadi basa (Gulati et al., 1997). Bromotymol blue
(BTB) digunakan sebagai indikator perubahan warna pada suatu media, apabila
media tersebut bersifat asam maka dengan ditambahkan dengan BTB akan
berubah warna menjadi kuning dan sebaliknya ketika media bersifat basa maka
akan berubah warna menjadi biru. BTB juga merupakan indicator warna yang
lebih menonjol dibandingkan dengan menggunakan indikator warna phenol red.
Hal tersebut dikarenakan BTB mampu memberikan kontras warna yang tajam
(biru tua pada pH basa) dan juga mampu untuk memberikan warna yang lebih
jelas pada zona yang terhidrolisis, sehingga efektif untuk menjadi indikator
33
perubahan warna pada media tumbuh mikroorganisme penghasil enzim L-
asparaginase (Mahajan et al., 2013).
4.3 Isolasi Koloni
Isolasi koloni dilakukan untuk mendapatkan isolat murni yang selanjutnya
akan digunakan untuk uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Isolat yang
akan diuji adalah isolat yang memiliki aktivitas L-asparaginase yang baik, yaitu
isolat B10-3 . Isolat murni yang telah didapatkan akan dilakukan uji pewarnaan
gram dan uji microbact system. Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis
dan spesies dari bakteri yang telah didapatkan.
Pada proses uji tersebut isolat yang telah murni ditanam pada media
TCBSA (Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar) dengan menggunakan cawan petri.
Adapun hasil isolat yang tumbuh pada media tersebut memiliki karakteristik
berwarna krem, dengan diameter koloni 3,11 mm, berbentuk bulat, tepi koloni
tidak rata, elevansi koloni datar, dan konsistensi koloni basah. Hasil isolat
tersebut dapat dilihat pada gambar 7.
4.4 Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri merupakan tahapan terakhir pada penelitian ini.
Identifikasi ini dilakukan dengan uji pewarnaan gram dan uji microbact system
Gambar 2. Isolat murni dari bakteri B10-3
34
yang bertujuan untuk mengetahui sifat gram dan sifat biokimia pada bakteri yang
telah didapatkan, sehingga dapat ditentukan jenis serta spesiesnya.
4.4.1 Uji Pewarnaan Gram
Uji pewarnaan gram dilakukan untik mengetahu sel bakteri dari
pewarnaan dan bentuk dari bakteri, tergolong dalam bakteri gram positif atau
gram negatif. Apabila sel bakteri berwarna ungu maka termasuk bakteri gram
positif karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat kristal warna ungu-violet,
sedangkan apabila bakteri tersebut berwarna merah maka termasuk dalam
bakteri gram negative karena bakteri mengikat zat warna sekunder yaitu safranin.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet
sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan
alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan
struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).
Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut
termasuk dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu.
Bakteri tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki
diameter koloni 3,11 mm. Adapun gambar bakteri dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 3. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3
35
4.4.2 Uji Microbact System
Setelah dilakukan uji pewarnaan gram dan diketahui bahwa isolat bakteri
merupakan jenis bakteri gram positif, maka dilakukan tahap identifikasi bakteri
dengan menggunakan microbact system. Sebelum dilakukan uji microbact
system dilakukan terlebih dahulu uji oksidase, apabila uji oksidase yang telah
dilakukan hasilnya positif maka menggunakan microbact 24E, dan apabila hasil
dari uji oksidase tersebut negatif maka menggunakan microbact 12E
(Murtiningsih,1997).
Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut
memiliki uji oksidase positif, sehingga pada uji microbact system ini
menggunakan microbact 24E. Pada uji tersebut akan dilakukan uji meliputi uji
Dari hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut termasuk
dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu. Bakteri
42
tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki diameter
koloni 3,11 mm. Memiliki reaksi oksidase dan katalase positif. Dengan warna
koloni krem dan berbentuk bulat. Memiliki tepi koloni yang tidak rata, elevansi
koloni datar, dan konsistensi koloni basah.
Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif, memiliki bentuk batang yang
membentuk rantai, terdapat beberapa spesies aerob obligat dan juga anaerob
fakultatif, memiliki endospora sebagai struktur yang mampu bertahan pada
kondisi lingkungan yang tidak mendukung. Suhu optimum pada pertumbuhan
Bacillus subtilis adalah 30-37°C, dengan suhu minimum 18°C dan maksimum
43°D (Korsten dan Cook, 1996).
Pada Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, edisi ke-2 (2004),
disebutkan bahwa sel Bacillus subtilis berukuran 1 x 3,4 µm, berbentuk batang
dan tersusun menjadi rantai yang panjang. Dengan memiliki spora yang terletak
pada tengah sel, tidak bergerak dan memiliki flagella (Jawetz et al., 1996).
Pada GRAS Notice (GRN) No. 649 dijelaskan bahwa Bacillus subtilis
adalah bakteri non-patogen dan non-tosik yang merupakan bakteri gram positif
dan memiliki karakteristik yang baik serta banyak digunakan pada produksi food-
grade enzyme. Bacillus subtilis merupakan mikroorganisme saprophytic yang
dapat ditemukan dimana-mana, biasanya dapat ditemukan di air, tanah, udara,
dan residu pada tanaman yang membusuk.
43
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka dapat diambil
kesimpulan bahwa terdapat isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan enzim
L-asparaginase dari akar, batang, dan daun mangrove Excoecaria agalloca adalah
isolat D10-4, D10-5, B10-3, B10-4 dan B10-5.
Isolat B10-3 adalah bakteri gram positif dan menurut uji microbact system
yang telah dilakukan bakteri tersebut adalah spesies Bacillus subtilis.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka disarankan untuk
melakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan uji secara genotip dengan
identifikasi molekular gen penyandi 16S r-RNA.
44
DAFTAR PUSTAKA
Antara, N.S. 2009. Mengurangu Pembentukan Akrilamida dengan MenggunakanEnzim dan Mikroba pada Produk Pangan. FTP. UNUD.
Arrizal, S., Rachmadiarti, F., dan Yuliani. 2013. Identifikasi Rhizobakteri padaSemanggi (Marsilea crenata Presl.) yang Terpapar Logam Berat Timbal (Pb).Lent. Bio. 2(1):165-169.
Ballows, A. Butnick, S. and Loyd, J. R. 1991. Manual of Clinical Micorbiology.Washington DC. Press.
Borek, D., dan Jaskolski, M. 2001. Sequence Analysis of Enzymes withAsparaginase Activity. 48(2): 893-902.
Breed, R.S., Murray, E.G.D., dan Smith, N.R. 1957. Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology Seventh Edition. The Williams and WilkinsCompany. 620-621 hlm.
Brock, T.D and Brock, K.M. 1978. Basic Microbiology with Application. 2nd edition.New Jersey : Prentice Hall.
Cappuccino, J. .G dan Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. TheBenjamin/Cumming Publish. USA: 458.
Ciesarova, Z., Kiss, E., dan Boegl, P. 2006. Impact of L-asparaginase on AcrylamideContent In Potato Products. J. Food Nutr Res. 45(1): 141-146.
Darmayasa, I.B.G. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pendegradari Lipid (Lemak)pada Beberapa Tempat Pembuangan Limbah Estuari DAM Denpasar. J.Bumi Lestari. 8(1): 122-127.
Didje, N. Dan Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Farmasi.Universitas Hassanudin. Makasar.
El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J. 2004. Pruduction, Isolation, andPurification of L-Asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 usingSolid-state Fermentation. J. Biochem and Mol Bio. 4(37): 387-393.
El-Naggar, N.E., El-Ewasy. S., and El-Shweihy. N.M. 2014. Microbial L-Asparaginase as a Potential Therapeutic Agent for the Treatment of AcuteLymphoblastic Leukimia : The Pros and Cons. Int J. Phrm.10(4): 1811-7775.
Farmer, J. J., Clin, J., dan Micro, J. 1985. Biochemical Identificatiom of New Speciesand Biogroups of Enterobacteriaceae Isolatd from Clinical Specimens. J.ClinMicro. 21(1): 46-76.
45
Gulati, R., Saxena, R.K., dan Gupta, R. 1997. A Rapid Plate Assay for Screening L-Asparaginase Producing Micro-Organismes. Lett Appl. Micro. 24(1): 23-26.
Hadioetomo, R.S. 1995. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT. Gramedia. Jakarta.
Hendriksen, H. V., Kornbrust, B. A., Ostergaard, P.R., dan Stringer, M.A. 2009.Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range ofFood Products using an Asparaginase from Aspergillus oryzae. J. Agri.andFood Chem. 57(10): 4168-4176.
Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi ke-20. Penerbit Buku Kedokteran : Jakarta.
Jayam, D. G. and Kannan,S. 2014. The Various Sources of L-Asparaginase. Int. J.Rec Sci Res. 5(2): 34-346.
Kasi, Y.A., Posangi, J., Wowor, P.M., dan Bara, R. 2015. Uji Efek Antibakteri JamurEndofit Daun Mangrove Avecennia marina Terhadap Bakteri UjiStaphylococcus aureus dan Shigella sysenteriae. J. e-Bm. 3(1): 112-117.
Kharisma dan Abdul. 2012. Aktivitas Asam Proteolitik Bakteri Asam Laktat dalamFermentasi Susu Kedelai. UGM: Yogyakarta.
Kishore, V., Nishita, K.P., and Manonmani, H.K. 2015. Cloning, Expression andCharacterization og L-Asparaginase from Pseudomonas fluorescens forLarge Scale Production in E. coli BL21. Spring 3 Bio 5(1):975-981.
Kismiyati., Subekti, S., Yusuf, R.W.N., dan Kusdarwati, R. 2009. Isolasi danIdentifikasi Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Mas Koki (Carassiusauratus) Akibat Interfasi Ekoparasit Argulus sp. J. Ilm Per dan Kel. 1(2):129-134.
Korsten, L dan Cook, N. 1996. Optimizing Culturing Condition for Bacillus Subtilis. SAfri Avoc Grow Assosi Yb. 19 (1): 54-58.
Kumala, S., Fransisca, S., dan Priyo, W. 2006. Aktivitas Antimikroba MetabolitBioaktif Mikroba Endofitik Tanaman Trengguli (Casska fistula L.). J. FarmInd. 3(2): 97-102.
Kurniasari, R.M. 2005. Pengaruh Logam Berat Terhadap PertumbuhanMikroorganisme Pendegradari Minyak Diesel. SKRIPSI. Bogor: IPB.
Lay, B. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada: Jakarta.
Leboffe, M.J. dan Pierce, B.E. 2011. A Photographic Atlas for The MicrobiologyLaboratory. 4Th Edition. Morton Publishing Company. USA.
Lehninger, A. L. 1990. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa Dr. Ir. MaggyThenawidjaja. Bandung: Erlangga.
46
Mahajan, R.V.,Saran, S., Saxena, R.K., dan Srivastava, A.K. 2013. A Rapid,Efficientand Sensitive Plate Assay for Detection and Screening of L-Asparaginase-producing Microorganismes. FEMS Microbiol Lett. 1-5 hlm.
Makky, E.A., Ong, J.J., Karim, M.R., and Lee, C.M. 2013. Production andOptimization of L-Asparaginase by Bacillus sp. KK2S4 from Corn Cob. Afr J.Biotechnol. 12(19): 2654-2658.
Martuti,N.K.T.2013. Keanekaragaman Mangrove di Wilayah Tapak, Tugurejo,Semarang. J. MIPA. 36(2): 123-130.
Mayati, B. 2013. Identifikasi Keragaman Bakteri pada Comeal Seed PengolahanLimbah Cair Cat. IPB: Bogor.
Meiyanto, E. 2008. Efek Kemopreventif Ekstrak Etanolik Gynura procumbens (Lour.)Merr Pada Karsinogenesis Kanker Payudara Tikus. Maj Fari Ind. 18(3): 154-161.
Mungi, H., Carvalho, R., Ilegar, S., Ratnamala, G.M., and Priya, V.G.S. 2014.Optimization of L-Asparaginas Production from Pseudomonas fluorescens byResponse Surface Methodology. Int J. Cur Microbiol Appl Sci. 3(11): 350-362.
Murray, P. 2003. Isolation,Purification and Charaterization of The XylanaseProduced by Arthobacter sp. National Institute of Oceanography. DonaPaula.
Murtiningsih. 1997. Evaluation Of The SerobactTM And MicrobactTM System For TheDetection And Identification Of Listeria Spp. Department of Food Scienceand Technology, The university of New South Wales, Sydney, NWS,Australia.
Muslim, S.N., Al-Kadmy, I.M.S., Hussein, N.H., Ali, A.N.M., and Dwaish, A.S. 2015.Enhancement of the Activity and Stability of L-Asparaginase Food AdditivePurified from Acinetobacter baumannii as Anticarcinogenic in ProcessedFoods. Int J. Adv Chem Engg and Bio Sci. 2(1): 1349-1507.
Nikaido, H. 1996. Outer Membrane In: Escherichia coli and Salmonella lyphimurium:Cellular and Molecular Biology. American Society of Microbiology Press.
Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari DaerahBekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. J.Natur Ind. 6(2): 67-74.
Noor, Y.R., Khazali, M., dan Suryadiputra, I.N.N. 1999. Panduan PengenalanMangrove di Indonesia. Wetlands International Indonesia Programme: Bogor.
Norman, P. 2008. Asam Indol Asetat yang Dihasilkan Azosprillium sp. J. AgroBiogen. 3(2): 66-72.
47
Pastra, D. A., Melki., dan Surbakti, H. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosisdengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari PerairanPulau Tegal Lampung. Masp J. 4(1): 77-82.
Presscott. 2002. Laboratory Excercise In Microbiology. The Mac-Graw HillCompanies. New York.
Prihanto, A. A., Firdaus, M., dan Nurdiani, R. 2011. Endophytic Fungi Isolatt from(Rhyzopora mucronata) and Its Antibacterial Activity on Staphylococcusaureus and Escherichia coli. J. Food Sci Engineer. 1(1): 386-389.
Rakhmawati, A. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. FMIPA. Yogyakarta: UNY.
Ramdany. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolitycus Dengan Metode BiologiSecara PCR. J. Sain Tek Farm. 13(1): 1-7.
Richana,N., Lestina, P., dan Irawadi,T.T. 2004. Karakterisasi Lignoselulosa DariLimbah Tanaman Pangan dan Pemanfaatannya Untuk Pertumbuhan BakteriRXA III-5 Penghasil Xilanase. J. Pen Pert Tanam Pangan. 23(3): 171-176.
Rohmah, N. S. 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Berpotensi sebagai AgenBioremediasi Timbal (Pb) dari Lumpur Lapindo. Skripsi. UIN : Malang.
Safnowandi. 2015. Struktur Komunitas Mangrove Di Teluk Poton Bako SebagaiBuku Panduan Untuk Pemantapan Konsep Ekosistem Pada guru BiologiSMA Di Kabupaten Lombok Timur. J. Ilmi IKIP Mataram. 2(1): 2355-2358.
Sartiono, A. 2007. Profil Mangrove Taman Nasional Baluran. FMIPA ITS : Surabaya.
Sinaga, E., Noverita., dan Fitria, D. 2009. Daya Antibakteri Jamur Endofit yangDiisolasi dari Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galangal Sw.). J, FarmInd. 4(4): 161-170.
Sridhar, R. P.N. 2006. Polymerase Chain Reaction (PCR). Dept. Of Microbiology.JJMMC. Davangere.
Suryabrata, S. 1983. Metodologi Penelitian Ilmiah. Raja Grafindo. Jakarta.
Tedja, I. 2007. Seleksi Galur-galur Bradyrhizobium japanicum Resisten LogamBerat. Laporan Penelitian KB VI. FMIPA IPB. Bogor.
Tittsler, M. 1996. Introduction to Soil Microbiology. 2 ed. Willey Eastern Limited, NewDelhi.
Volk, S. 1988. Mikrobiologi Dasar. Erlangga: Jakarta.
Wahyunio. 2011. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta.
Wayan, dan Qomariah. 2007. Isolasi dan Identifikasi E.coli. Bali J. 52 hlm.
48
Wedhastri, S. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacterspp. Pengahsil Faktor Tumbuhdan Penghambat Nitrogen dari Tanah Masam. J. Ilmu Tanah dan Lingk. 3(1):45-51.
Yousef, A.E dan Clastrom, C. 2003. Food Microbiology (A Laboratory Manual).Wiley-interscience, John Wiley and Sons, Inc. Ohiostate University : USA.
Yulvizar, C. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.Biospecies. 6(2): 1-7.
Yuniarsih, M. 2012. Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari n-HeksanaBuah Ketapang (Terminalia catappa) sebagai Inhibitor α-Glukosidase danPenapisan Fitokimia dari Fraksi Teraktif. UI: Depok.