Copyright @ 2017, Jurnal Riset Akuakultur, e-ISSN 2502-6534 369 Jurnal Riset Akuakultur, 12 (4), 2017, 369-378 # Korespondensi: Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan. Jl. Sempur No. 1, Bogor 16154, Indonesia. Tel. + 62 251 8313200 E-mail: [email protected]Tersedia online di: http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI DAN DENITRIFIKASI SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK Yosmaniar # , Hessy Novita, dan Eri Setiadi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan (Naskah diterima: 5 Desember 2017; Revisi final: 10 Januari 2018; Disetujui publikasi: 10 Januari 2018) ABSTRAK Senyawa nitrogen yang tinggi pada limbah budidaya perikanan intensif dapat memperburuk kualitas air, sehingga perlu diatasi dengan penambahan probiotik untuk proses bioremediasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi yang berpotensi sebagai kandidat probiotik pengendali senyawa nitrogen pada budidaya ikan air tawar. Tahap penelitian terdiri atas: 1) koleksi sampel air dan sedimen dari kolam budidaya ikan patin di kawasan minapolitan Desa Pudak Kecamatan Kumpeh Kabupaten Muaro Jambi Provinsi Jambi dan Desa Koto Mesjid Kecamatan XIII Koto Kampar Kabupaten Kampar Provinsi Riau; 2) pengujian sampel secara in vitro yang meliputi: a) Isolasi dan seleksi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi; b) Karakterisasi morfologis bakteri terpilih; c) Karakterisasi fisiologi/biokimia isolat bakteri terpilih; d) Karakterisasi genetika isolat bakteri terpilih dengan sekuensing 16S-rRNA. Analisis data dilakukan secara deskriptif. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh empat isolat bakteri nitrifikasi dan empat isolate bakteri denitrifikasi. Isolat bakteri nitrifikasi Pandoraea pnomenusa strain 1318 (NP1); Pseudomonas aeruginosa strain PSE12 (NP2); Pseudomonas aeruginosa strain PSE12 (NP3); Burkholderia vietnamiensis strain NE 7 (NP4); dan denitrifikasi Achromobacter xylosoxidans strain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strain BTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4) Achromobacter xylosoxidans strain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strain BTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4); yang berpotensi digunakan sebagai kandidat probiotik pengendali senyawa nitrogen pada budidaya ikan air tawar. KATA KUNCI: bakteri nitrifikasi; bakteri denitrifikasi; karakterisasi; probiotik ABSTRACT: Isolation and characterization of nitrifying and denitrifying bacteria as probiotic candidates. By: Yosmaniar, Hessy Novita, and Eri Setiadi Wastes from an intensive aquaculture contain nitrogen compounds which, if untreated, could rapidly reduce water quality condition within the system. The addition of probiotics as bioremediation to aquaculture system has been used to improve water quality with promising results. The aim of this study was to obtain potential nitrifying and denitrifying bacteria that could be used as probiotic candidates to control excessive nitrogen compounds in freshwater culture. This study consisted of two steps, 1) the collection of water samples and sediments from catfish ponds at ‘Minapolitan Area” in Pudak Village, Jambi Province and Koto Mesjid Village, Riau Province; 2) in vitro tests consisting of isolation and selection of nitrifying and denitrifying bacteria; morphological characterization of the selected nitrifying and denitrifying bacteria; characterization of physiological/biochemical selected nitrifying and denitrifying bacteria; genetic characterization of the selected nitrifying and denitrifying bacteria with 16SrRNA sequencing. All data were analyzed descriptively. The study had found four nitrifying bacteria isolates: Pandoraea pnomenusa strain 1318 (NP1); Pseudomonas aeruginosa strain PSE 12 (NP2); Pseudomonas aeruginosa strain PSE12 (NP3); Burkholderia vietnamiensis strain NE 7 (NP4). The study also found four isolates of denitrifying bacteria isolates: Achromobacter xylosoxidans strain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strain BTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4). All the identified nitrifying and denitrifying bacteria isolates have the potential to be used as probiotic candidates to control nitrogen compound in freshwater aquaculture. KEYWORDS: nitrifying bacteria; denitrifying bacteria; characterization; probiotic
10
Embed
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI DAN ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI DAN DENITRIFIKASISEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK
Yosmaniar#, Hessy Novita, dan Eri Setiadi
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan
(Naskah diterima: 5 Desember 2017; Revisi final: 10 Januari 2018; Disetujui publikasi: 10 Januari 2018)
ABSTRAK
Senyawa nitrogen yang tinggi pada limbah budidaya perikanan intensif dapat memperburuk kualitas air,sehingga perlu diatasi dengan penambahan probiotik untuk proses bioremediasi. Tujuan penelitian iniadalah untuk mendapatkan bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi yang berpotensi sebagai kandidat probiotikpengendali senyawa nitrogen pada budidaya ikan air tawar. Tahap penelitian terdiri atas: 1) koleksi sampelair dan sedimen dari kolam budidaya ikan patin di kawasan minapolitan Desa Pudak Kecamatan KumpehKabupaten Muaro Jambi Provinsi Jambi dan Desa Koto Mesjid Kecamatan XIII Koto Kampar KabupatenKampar Provinsi Riau; 2) pengujian sampel secara in vitro yang meliputi: a) Isolasi dan seleksi bakterinitrifikasi dan denitrifikasi; b) Karakterisasi morfologis bakteri terpilih; c) Karakterisasi fisiologi/biokimiaisolat bakteri terpilih; d) Karakterisasi genetika isolat bakteri terpilih dengan sekuensing 16S-rRNA. Analisisdata dilakukan secara deskriptif. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh empat isolat bakteri nitrifikasi danempat isolate bakteri denitrifikasi. Isolat bakteri nitrifikasi Pandoraea pnomenusa strain 1318 (NP1); Pseudomonasaeruginosa strain PSE12 (NP2); Pseudomonas aeruginosa strain PSE12 (NP3); Burkholderia vietnamiensis strain NE7 (NP4); dan denitrifikasi Achromobacter xylosoxidans strain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphilastrain BTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20(DP4) Achromobacter xylosoxidans strain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strain BTY (DP2);Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4); yangberpotensi digunakan sebagai kandidat probiotik pengendali senyawa nitrogen pada budidaya ikan airtawar.
KATA KUNCI: bakteri nitrifikasi; bakteri denitrifikasi; karakterisasi; probiotik
ABSTRACT: Isolation and characterization of nitrifying and denitrifying bacteria as probiotic candidates.By: Yosmaniar, Hessy Novita, and Eri Setiadi
Wastes from an intensive aquaculture contain nitrogen compounds which, if untreated, could rapidly reduce waterquality condition within the system. The addition of probiotics as bioremediation to aquaculture system has been usedto improve water quality with promising results. The aim of this study was to obtain potential nitrifying and denitrifyingbacteria that could be used as probiotic candidates to control excessive nitrogen compounds in freshwater culture. Thisstudy consisted of two steps, 1) the collection of water samples and sediments from catfish ponds at ‘Minapolitan Area”in Pudak Village, Jambi Province and Koto Mesjid Village, Riau Province; 2) in vitro tests consisting of isolation andselection of nitrifying and denitrifying bacteria; morphological characterization of the selected nitrifying and denitrifyingbacteria; characterization of physiological/biochemical selected nitrifying and denitrifying bacteria; geneticcharacterization of the selected nitrifying and denitrifying bacteria with 16SrRNA sequencing. All data were analyzeddescriptively. The study had found four nitrifying bacteria isolates: Pandoraea pnomenusa strain 1318 (NP1);Pseudomonas aeruginosa strain PSE 12 (NP2); Pseudomonas aeruginosa strain PSE12 (NP3); Burkholderia vietnamiensisstrain NE 7 (NP4). The study also found four isolates of denitrifying bacteria isolates: Achromobacter xylosoxidansstrain TPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strain BTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strainBHWSL2 (DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4). All the identified nitrifying and denitrifying bacteriaisolates have the potential to be used as probiotic candidates to control nitrogen compound in freshwater aquaculture.
Isolasi dan karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi ..... (Yosmaniar)
PENDAHULUAN
Budidaya ikan secara intensif dengan padatpenebaran dan jumlah pakan tinggi, dapatmenyebabkan penumpukan bahan organik dan anorganik yang berasal dari sisa pakan dan ekskresimetabolisme ikan dalam wadah budidaya(Djokosetiyanto et al., 2006) dan mengendap di dasarkolam. Hal ini berdampak pada penurunan kualitas airbudidaya karena meningkatnya senyawa nitrogen(amonia, nitrit, dan nitrat) sehingga mengganggukeseimbangan siklus nitrogen seperti nitrifikasi dandenitrifikasi yang dapat menyebabkan keracunan danmortalitas ikan.
Untuk memperbaiki kualitas air dapat dilakukandengan memanfaatkan mikroorganisme(bioremediasi). Bioremediasi merupakan upaya untukmemperbaiki kualitas air melalui aktivitas biologi olehmikroorganisme (Rusmana, 2003). Beberapapersyaratan bioremediasi, antaran lain mampumengoptimalkan laju nitrifikasi untuk menjaga amoniaagar tetap rendah, mampu mengoptimalkan lajudenitrifikasi untuk mengeliminir kelebihan nitrogensebagai gas nitrogen dari kolam (Badjoeri &Widiyanto, 2008; Khasani, 2008).
Agen bioremediasi yang digunakan memilikikemampuan metabolisme nitrifikasi dan denitrifikasi,sehingga secara langsung dapat merombak bahanorganik di dalam air media (Yuhana, 2010). Nitrifikasimerupakan reaksi penting dalam siklus nitrogen yangmembutuhkan oksigen dalam proses oksidasi NH
3,
menjadi NO2 dan oksidasi NO
2 menjadi NO
3 (Agustiyani
et al., 2010). Denitrifikasi merupakan proses mikrobialdi mana NO
3 dan NO
2, diubah menjadi NO
2 dan N
2 di
sedimen aerobik maupun anerobik (Long et al., 2013).
Isolasi, seleksi, dan karakterisasi merupakantahapan penting untuk mendapatkan bakteri yangdiharapkan sebagai kandidat untuk probiotik. Tahapanproses tersebut diperlukan agar jenis bakteri yangdiperoleh memiliki kemampuan sesuai target. Padatahap seleksi dibutuhkan medium bakteri yang tepatdan pengujian secara biokimia atau fisiologis. Tahapkarakterisasi dilakukan untuk mengetahui jenisbakteri dan hubungan kekerabatannya menggunakan16S rRNA sekuensing. Analisis Taksonomimenggunakan gen 16S dan 18S rRNA untukmensekuensing data telah menunjukkan pendekatanyang valid dalam mengkarakterisasi komunitas bakteri(Sogin et al., 2006).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakterinitrifikasi dan denitrifiksi yang berpotensi sebagaikandidat probiotik pengendali senyawa nitrogen padabudidaya ikanair tawar.
BAHAN DAN METODE
Koleksi Sampel dari Sedimen dan Air
Sampel air dan sedimen dikoleksi dari kolambudidaya ikan patin pada tahun 2013, di kawasanminapolitan Desa Pudak Kecamatan KumpehKabupaten Muaro Jambi Provinsi Jambi dan Desa KotoMesjid Kecamatan XIII Koto Kampar Kabupaten KamparProvinsi Riau (Gambar 2). Kedua Desa tersebutmerupakan sentra budidaya ikan patin intensif dandijadikan sebagai kawasan minapolitan (Yantos, 2016).Pengambilan sampel air permukaan pada kolam ikanpatin dilakukan di kedua desa dengan setiap desasebanyak empat kolam. Kriteria kolam yang diambilsampel air dan sedimen merupakan kolam budidayapatin intensif. Untuk sampel air permukaan kolam ikandilakukan lima titik per kolam, yaitu di setiap sudutkolam (empat sampel) dan di tengah kolam (satusampel) menggunakan bobot sampel dengan volume600 mL yang steril. Untuk sedimen, dilakukan tigatitik setiap kolam yaitu dua titik di dua sudut kolamdan satu titik di tengah kolam menggunakan eigmentgrab, kemudian sampel sedimen diambil sebanyak 300g pada setiap titik. Selanjutnya sedimen dipindah kedalam botol sampel steril. Botol sampel yang telahterisi air maupun sedimen dimasukkan ke dalam coolbox.
Isolasi dan Seleksi Bakteri Nitrifikasi danDenitrifikasi
Media spesifik untuk isolasi bakteri nitrifikasi dandenitrifikasi berdasarkan (Rodina, 1972), untuk 1000mL, yaitu: 13,5 g KH
2PO
4; 0,7 g K
2HPO
4; 0,1 g
MgCl2
.6H2O; 0,18 g CaCl
2.2H
2O; 0,1 g NH
4Cl; 0,2 g EDTA
dan 0,5 g Na2CO
3; 0,18 g FeCl
3.6H
2O; dan 0,5 g glukosa.
Sedangkan untuk bakteri denitrifikasi: 10 g Na-asetat,5 g KNO
3; 0,2 g KH
2PO
4; 0,9 g K
2HPO
4; 0,1 g CaCl
2.2H
2O;
0,5 g MgSO4
.7H2O; dan 0,2 g EDTA.
Sebanyak 5 mL sampel air dan 1 g sedimendimasukkan ke dalam media nitrifikasi cair padaerlenmeyer, kemudian diinkubasi selama 7 harimenggunakan shaker pada suhu 28°C dengankecepatan 130 rpm, selanjutnya senyawa nitrat yangdihasilkan diukur menggunakan metode Brucinemenggunakan Spectrofotometer (Clesceri et al., 1998).
Sebanyak 5 mL suspensi dari kultur bakteri yangpositif menghasilkan nitrat diinokulasi ulang padaerlenmeyer media nitrifikasi kemudian diinkubasiselama 7 hari menggunakan shaker pada suhu 28°Cdengan kecepatan 130 rpm. Sebanyak satu ose darikultur bakteri digores pada media agar nitrifikasidengan menggunakan metode kuadran (Sanders, 2012),kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 29°C
selama 5-7 hari. Koloni yang terpisah dimurnikankembali dengan cara menggores ulang pada media agarnitrifikasi. Isolat murni yang diperoleh digunakanuntuk uji selanjutnya.
Sebanyak 1 mL sampel air dan 1 g sedimendimasukkan ke dalam tabung ulir yang berisi 20 mLmedia denitrifikasi cair, kemudian diinkubasi padasuhu 28°C selama 7 hari. Perubahan tingkat kekeruhandan gas yang dihasilkan pada tabung durhammenunjukkan adanya bakteri denitrifikasi. Sebanyak2 mLsuspensi kultur bakteri yang positif menghasilkangas diinokulasi ulang dalam media denitrifikasi cairpada tabung reaksi volume 22 mL yangmengandungbakteri denitrifikasi, kemudian diinkubasi pada suhu28°C selama 7 hari. Satu ose dari kultur bakteri digorespada media agar denitrifikasi dengan menggunakanmetode kuadran dan diinkubasi pada kondisi anaerobdalam Anaerobik jar selama 7–10 hari. Koloni sel yangterpisah dimurnikan kembali dengan digores kuadranpada media cawan dan diinkubasi pada kondisianaerobik. Isolat murni yang diperoleh selanjutnyadilakukan uji oksidatif/fermentatif.
Karakterisasi, Morfologis, Biokimia BakteriNitrifikasi, dan Denitrifikasi
Karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasidilakukan dengan melakukan pengamatan secaramorfologis pada bentuk dan warna koloni bakteriserta melalui pewarnaan gram. Setelah itu, isolat yangterseleksi kemudian diuji secara biokimia (Novita etal., 2014). Isolat yang terseleksi kemudian diuji secarabiokimia dengan menggunakan kit API untuk melihatkemampuan bakteri dalam menggunakan gula-gulayang ada pada media sebagai sumer C dan N. Ciribiokimia merupakan kriteria yang amat penting didalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal
karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteriyang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasilpengamatan fisiologis yang memadai mengenaiorganik yang diperiksa maka penentuan spesiesnyatidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasisebagai mikroba seperti bakteri berdasarkan padareaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapattumbuh pada beberapa tipe media memproduksimetabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksimikroba dengan reagen test yang mana menghasilkanperubahan warna reagen (Murray et al., 2005).
Karakterisasi Isolat Bakteri Nitrifikasi danDenitrifikasi Terpilih dengan Sekuensing 16S-rRNA
Karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasiyang terpilih secara molekuler dengan 16S rRNAsekuensing dilakukan untuk mengetahui jenis dankekerabatan isolat bakteri. DNA isolat terpilihdiekstraksi dengan metode geneaid kit (prosedursesuai dengan instruksi manual dalam kit). Setelahitu dilakukan uji PCR menggunakan primer 16SrRNA(Marchesi et al., 1998) dengan susunan primer forward63f (52 -CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-32 ), danprimer Reverese, 1387r (52 -GGG CGG WGT GTA CAAGGC-32 ). Amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 30siklus menggunakan suhu predenaturasi 95°C selama5 menit, denaturasi pada suhu 92°C selama 30 detik,annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, elongation72°C selama 1 menit, dan final extention dengan suhu72°C selama 5 menit.
Sekuensing dan Dendogram
Hasil PCR 16S rRNA menunjukkan target pita DNAberada pada 1300 bp. Isolat yang telah di PCRkemudian di sekuensing. Hasil sekuensing dari masing-
Gambar 1. Lokasi pengambilan sampel air dan sedimen di kawasan minapolitan Desa PudakKecamatan Kumpeh Kabupaten Muaro Jambi (A), Desa Koto Mesjid KecamatanXIII Koto Kampar Kabupaten Kampar Provinsi Riau (B).
Figure 1. Locations of water and sediment sampling in the study sites: (A) Pudak Village, (B)Koto Mesjid Village.
Isolasi dan karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi ..... (Yosmaniar)
masing isolat disejajarkan dengan sekuen dariGenebank selanjutnya dilakukan BLAST di NCBI untukmelihat tingkat kemiripannya dengan sekuen diGenebank.
Kemudian hasil sekuensing disejajarkan lagi denganprogram MEGA 5 untuk mendapatkan dendogram
Analisis Data
Semua data yang diperoleh ditabulasi denganbantuan Microsoft Excel 2010. Data yang diperolehdari isolasi, seleksi, dan identifikasi bakteri kandidatprobiotik dianalisis secara deskriptif dan ditampilkandalam tabel.
HASIL DAN BAHASAN
Isolasi Bakteri Nitrifikasi dan Denitrifikasi
Hasil isolasi bakteri kandidat probiotik yangteridentifikasi. Kelompok denitrifikasi di Desa Pudak,Jambi lebih banyak dibandingkan nitrifikasi, sedangkandi Riau nitrifikasi lebih dominan dibandingkandenitrifikasi. Kondisi perbedaan tersebutmengindikasikan bahwa kedalaman kolam (kolom air)dan kandungan bahan organik baik di air maupun disedimen diduga berpengaruh terhadap perbedaanjumlah bakteri nitrifikasi dan bakteri denitrifikasi.Azhar et al. (2017) melaporkan bahwa kelimpahan dankeanekaragaman bakteri dipengaruhi oleh kedalamanair, ketebalan sedimen, dan kandungan bahan organikbaik di air maupun di sedimen.
Jumlah isolat yang berhasil diisolasi dari dua lokasipengambilan contoh disajikan pada Tabel 1.
Diperoleh 4 isolat bakteri nitrifikasi dan 4 isolatbakteri denitrifikasi dengan ciri morfologi koloniisolat tepian sama yaitu licin sedangkan warna,permukaan, dan bentuk umumnya hampir sama (Tabel2). Bakteri nitrifikasi terpilih NP1 dan NP4 bersifat
gram positif sedangkan NP2 dan NP3 merupakan gramnegatif. Pada isolate bakteri nitrifikasi ditemukan adayang gram negatif. Hal ini menunjukkan bahwa iso-late NP2 dan NP3 dapat berperan ganda (nitrifikasidan denitrifikasi). Semua bakteri denitrifikasimerupakan gram negatif. Empat isolat bakterinitrifikasi yaitu NP1, NP2, NP3, NP4 termasuk kedalam kelompok bakteri heterotrof.
Pertumbuhan bakteri heterotrof lebih baikdibandingkan dengan bakteri autrotof. Dengandemikian dapat dikatakan bahwa keempat isolatbakteri nitrifikasi termasuk ke dalam kelompokbakteri heterotrof. Bakteri ini merupakan bakteri yangtidak dapat memfiksasi karbon dan menggunakankarbon organik untuk pertumbuhannya (Tabel 3).Bakteri heterotrof terbagi menjadi dua kelompokberdasarkan pada penggunaan energi, yaitu: a)fotoheterotrof, yang menggunakan cahaya sebagaisumber energi, dan b) kemoheterotrof, yangmenggunakan senyawa organik maupun anorganiksebagai sumber energi (Hogg & Stuart, 2013).Pertumbuhan bakteri heterotrof lebih baikdibandingkan dengan bakteri autrotof. Hal ini sesuaidengan penelitian yang dilakukan oleh Michauda et al.(2006) yang melaporkan bahwa pertumbuhan bakteriheterotrof lebih cepat dibandingkan dengan bakteriautrotof.
Uji oksidatif-fermentatif dilakukan pada bakteridenitrifikasi dengan tujuan mencari isolat yangbersifat oksidatif dan fermentatif. Jika bakteri bersifatfermentatif akan terjadi perubahan warna dari yanghijau menjadi kuning, sedangkan bakteri yang bersifatoksidatif akan tetap bewarna hijau (Novita et al., 2014).
Isolat bakteri DP1 dan DP4 serta bakteri NP2 danNP3 merupakan gram negatif. Bentuk sel semua isolatadalah basil. Keempat isolat bakteri nitrifikasi bersifatoksidatif. Umumnya bakteri denitrifikasi bersifatoksidatif, karena dalam proses metabolisme untuktumbuh dan berkembang membutuhkan oksigen.
Tabel 1. Jumlah isolat bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi yang diisolasi dari budidaya ikan patin di Jambidan Riau
Table 1. Number of nitrifying and denitrifying isolates from catfish culture in Jambi and Riau
Bakteri nitrifikasiNitrification bacteria
Bakteri denitrifikasiDenitrification bacteria
TotalTotal
7 8 15
7 7 14
9 9 18
10 9 19
Total 33 33 66
Jumlah isolat (Number of isolate )
Desa Pudak Kecamatan Kumpeh Kabupaten Muaro Jambi Provinsi Jambi
Desa Koto Mesjid Kecamatan XIII Koto Kampar Kabupaten Kampar Provinsi Riau
Karakterisasi Biokimia Isolat BakteriNitrifikasi dan Denitrifikasi
Dari hasil Table 4 di atas menunjukkan bahwabakteri nitrifikasi dan denitrifikasi terpilih (NP2 danNP4) dan (DP1 dan DP3) dapat memanfaatkan bahanuji biokimia dengan baik sebagai media tumbuhsehingga berotensi sebagai kandidat.
Karakterisasi Isolat Bakteri Nitrifikasi danDenitrifikasi Terpilih dengan Sekuensing 16S-rRNA
Hasil karakterisasi berdasarkan 16SrRNA dapatdilihat pada Gambar 3. Hasil PCR dengan 16S rRNAmenunjukkan bahwa isolat terpilih menghasilkan pitaPCR pada target 1300 bp. Hasil sekuensing yangdilakukan dengan membandingkan sekuen yang adadi Genebank diperoleh hasil BLAST N seperti disajikanpada Tabel 5.
Dendogram filogeni dari isolat bakteri nitrifikasidan denitrifikasi, disajikan pada Gambar 3 dan 4. Isolat
DP1 menunjukkan kemiripan 100% denganAchromobacter xylosoxidans strain TPL14. Isolat DP2dan DP3 homolog dengan Stenotrophomonasacidaminiphila strain BTY dan Stenotrophomonasmaltophiliastrain BHWSL2 dengan tingkat kemiripan100% dan 99%. Sedangkan untuk isolat NP1 homologdengan Pandoraea pnomenusa strain 1318 dengantingkat kemiripan 99% begitu juga dengan NP2, NP3homolog dengan Pseudomonas aeruginosa strain PSE12dengan kemiripan 99%, sedangkan isolat NP4 homolog98% dengan Burkholderia vietnamiensis strain NE 7.
Hasil sekuensing isolat bakteri nitrifikasi NP1menunjukkan bahwa bakteri isolat NP1 memilikikekerabatan terdekat dengan genus Pandoraea danBurkholderia. Namun paling dekat dengan jenisPandoraea pnomenusa strain 1318. Jenis bakteri ge-nus Pandoraea yang pertama kali terbukti memilikikemampuan dalam mendegradasi dichlorometanadalah Pandoraea pnomenusa LX-1 (Fu et al., 2012).Bakteri Pandoraea pnomenusa memiliki kemampuandalam memanfaatkan sumber karbon sebagai energi
Tabel 2. Morfologi dan karakteristikkoloni isolat bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi yang terpilihTable 2. Morphology and characteristic of selected isolates of nitrifying and denitrifying bacteria
Isolasi dan karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi ..... (Yosmaniar)
dan kemampuan dalam mereduksi senyawadichlorometan (DMC) sebesar 56-85% (Yu et al., 2013).
Berdasarkan hasil sekuensing, isolat bakterinitrifikasi NP2 dan NP3 merupakan kelompokproteobakteri yang memiliki kekerabatan terdekat
dengan jenis Pseudomonas sp. yaitu Pseudomonasaeruginosa strain PSE 12 (Gambar 2). Syahputra et al.(2011) menyebutkan bakteri Pseudomonas aeruginosadapat digunakan sebagai agen bioremediasi yang ramahlingkungan untuk pengendalian pencemaran limbah
Tabel 4. Karakteristik biokimia isolat bakteri nitrifikasi dan denitrifikasiTable 4. Biochemistry characteristics of the nitrifying and denitrifying bacteria
Kode isolat bakteri nitrifikasiCode of nitrifying bacteria isolates
Kode isolat bakteri denitrifikasiCode of denitrifying bacteria isolates
Uji biokimiaBiochemical test
Uji biokimiaBiochemical test
Keterngan (Note): (+) isolat dapat memanfaatkan mineral dan gula- gula sebagai sumber C dan Cuntuk pertumbuhannya (isolates able to to use minerals and sugars as C and Csources for growth)(-). Isolat tidak mampu memanfaatkan mineral dan gula- gula sebagai sumber C danC untuk pertumbuhannya (isolates not able to to use minerals and sugars as C andC sources for growth)
nitrogen anorganik seperti nitrat dan nitrit. Bakterijenis Pseudomonas sp. merupakan bakteri yangdominan berperan sebagai bakteri nitrifikasi dan pal-ing banyak digunakan sebagai probiotik pengolahanair limbah industri perikanan, karena kemampuannyadalam mendegradasi senyawa nitrogen (Kumar et al.,2013). Pseudomonas sp. diketahui cukup toleranterhadap logam Cd dan resisten terhadap antibiotik(Patra et al., 2010). Bakteri ini dapat mereduksi nitratdengan produk akhir berupa gas nitrogen (N) kerenadidukung dengan kelengkapan enzim yang dimilikinya(Rusmana, 2006).
Isolat bakteri nitrifikasi NP 4 (Gambar 4)menunjukkan kekerabatan terdekat dengan jenisBurkholderia vietnamiensis strain NE 7. Bakteri jenis
ini berperan penting dalam proses nitrifikasi diperairandan merupakan bakteri yang predominan (Sombatjindaet al., 2011). Bakteri nitrifikasi heterotrof sepertiBurkohlderia cepacai NH-17 dapat mengkonversi nitrit(NO
2-) menjadi nitrat (NO
3-) yang selanjutnya mengubah
nitrit (NO2
-) menjadi NO dengan bantuan enzim nitritreduktase. NO yangsudah terbentuk diubah lebih lanjutmenjadi nitrat (NO
3-) oleh enzim NO dioksigenase
dalam kondisi aerob (Matsuzaka et al., 2003).
Hasil sekuen isolat bakteri denitrifikasi DP3menunjukkan bahwa bakteri tersebut memilikikedekatan dengan jenis Stenotrhopomonas sp. danpseudomonas sp. Namun, kerabat yang terdekat adalahdengan jenis Stenotrophomonas maltophilia strainBHWSL2 (Gambar 4). Genus Stenotrophomonas secara
Gambar 2. Hasil PCR 16SrRNA bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi. Pada gambar hasilPCR terdapat pita DNA pada panjang sekitar 1.300 bp ukuran tersebutmengacu pada 1 Kb DNA ladder.
Figure 2. Results PCR 16SrRNA from the selected nitrifying and denitrfying bacteria.The PCR results showed the lenght of DNA band is roughly 1,300 bp the sizerefers to 1 Kb DNA ladder.
10.0008.0006.0005.0004.0003.0002.5002.000
1.500
1.000
750
500
250
2828282818923434
20
92
23
30
45
Tabel 5. Hasil BLAST N dari sekuen 16SrRNATable 5. BLASTN results from 16S rRNA sequence
Isolasi dan karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi ..... (Yosmaniar)
filogeni ditempatkan dalam gama proteobacteri yangawalnya dikenal dengan nama Stenotrophomonasmaltophilia dan merupakan Xanthomonas yangtermasuk ke dalam sub kelas proteobakteri (Anzai etal., 2000). Genus Stenotrophomonas merupakan ge-nus yang dominan di alam (air, tanah, dan tumbuhan)dan memiliki distribusi yang luas serta berperanpenting dalam siklus nitrogen dan sulfur (Ryan et al.,2009). Genus Stenotrophomonas baru diketahui ada8 jenis (Yoon et al., 2006).
Hasil sekuen isolat bakteri nitrifikasi DP4menunjukkan bahwa bakteri tersebut memilikikekerabatan dengan genus Ochrobactrum dan yangterdekat dengan jenis Ochrobactrum intermedium strain:SQ 20. Bakteri jenis Ocrhobactrum antrhopi merupakanbakteri denitrifikasi di tanah maupun di air (Bothe etal., 2000). Bakteri O. anthropi memiliki bentuk sepertibatang atau basil, gram negatif, dan merupakan bakteripereduksi NO
3 and NO
2 (Mahmood et al., 2009; Bathe
et al., 2006). Bakteri jenis ini dapat hidup dalam
Gambar 3. Dendogram filogeni isolate bakteri nitrifikasi berdasarkan sekuen 16S-rRNA.Figure 3. Phylogeny dendogram of nitrifying bacteria isolates based on 16S-rRNA sequence.
lingkungan ekstrim seperti lumpur dan air yangtercemar (Mahmood et al., 2009; Kesseru et al., 2002).Onchrobactrum adalah organisme mesofilik yang dapattumbuh pada kisaran suhu 4-40ºC dan kisaran pH 3-9,tetapi optimal pada suhu 30ºC dan pH kisaran 6-7(Lebuhn et al., 2000).
Berdasarkan hasil seleksi dan karakterisasi bakterinitrifikasi dan denitrifikasi, diperoleh masing-masingempat isolat sebagai kandidat probiotik untukpengendalian senyawa nitrogen pada lingkunganbudidaya ikan. Hasil yang sama juga telah dilakukanoleh Saputra et al. (2011) yang mengisolasi bakteridenitrifikasi dari muara Sungai Cisadane denganmemproleh isolat Pseudomonas aeruginosai di manadari bakteri ini dapat berperan nitrifikasi dengan ujicouple process.
Berdasarkan hasil seleksi dan karakterisasi bakterinitrifikasi dan denitrifikasi, diperoleh masing-masingempat isolat sebagai kandidat probiotik untukpengendalian senyawa nitrogen pada lingkunganbudidaya ikan.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh bakterikandidat probiotik pengendali senyawa nitrogen padabudidaya ikan air tawar dari kelompok nitrifikasi antaralain: Pandoraea pnomenusa strain 1318 (NP1); Pseudomo-nas aeruginosa strain PSE12 (NP2); Pseudomonasaeruginosa strain PSE12 (NP3); Burkholderiavietnamiensis strain NE 7 (NP4) dan kelompokdenitrifikasi yaitu: Achromobacter xylosoxidans strainTPL14 (DP1); Stenotrophomonas acidaminiphila strainBTY (DP2); Stenotrophomonas maltophilia strain BHWSL2(DP3); Ochrobactrum intermedium strain: SQ 20 (DP4).
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kami sampaikan kepada BalaiRiset Perikanan Budidaya Air Tawar dan PenyuluhanPerikanan, Bogor yang telah membiayai penelitian inimelalui APBN 2013. Ucapan terima kasih kepada BapakHernowo dari Dinas Perikanan dan Kelautan ProvinsiJambi dan Bapak Hasiben dari Dinas PerikananKabupaten Kampar Provinsi Riau.
DAFTAR ACUAN
Agustiyani, D., Kayadoe, R.M., & Imamuddin, H.(2010). Oksidasi nitrit oleh bakteri heterotrofikpada kondisi aerobik. Jurnal Biologi lndonesia,6(2),265-275.
Anzai, Y., Kim, H., Park, J.Y., Wakvabayashi, H., &Oyaizu, H. (2000). Phylogenetic affiliation of thepseudomonads based on 16S rRNA sequence. IntJ Syst Evol Microbiol, 50, 1563–1589.
Azhar, H.M., Ulkhaq, M.F., Suciyono, dan Prayogo.2017. Kelimpahan dan keanekaragaman bakteripada pembenihan ikan lele (Clarias gariepinus)dengan sistem air tertutup (close water system).Journal of Aquaculture Science,2(4), 81-89.
Badjoeri, M. & Widiyanto, T. (2008). Penggunaanbakteri nitrifikasi untuk bioremediasi danpengaruhnya terhadap konsentrasi amonia dannitrit di tambak udang. Oseanologi dan Limnologi diIndonesia, 34(2), 261-278.
Bathe, S., Achouak, W., Hartmann, A., Heulin, T.,Schloter, M., & Lebuhn, M. (2006). Genetic andphenotypic microdiversity of Ochrobactrum spp.FEMS microbiology ecology, 56(2), 272-280.
Bock, E., Koops, H.P., & Harms, H. (1989). Nitrifyingbacteria. In H.G. Schlegel and B. Bowien (Editors),Autotrophic Bacteria. Science Tech Publishers, Madi-son, WI, 81-96.
Bothe, H., Jost, G., Schloter, M., Ward, B., & Karl-Paul, W. (2000). Molecular analysis of ammoniaoxidation and denitrification in natural environ-ments. FEMS Microbiology Reviews, 24, 673-690.
Clesceri, L.S., Greenberg, A.E., & Eaton, A.D. (1998).Standard Methods for the Examinationof Waterand Wastewater. 20th Edition.AmericanPublicHealth Association, Washington, D.C., 1325 pp.
Djokosetiyanto, D., Sunarma, A., & Widanarni. (2006).Perubahan amonia (NH-N) nitrit (NO2-N) dan nitrat(NO-N) pada media pemeliharaan ikan nila merah(Oreochromis sp.) di dalam sistem resirkulasi. JurnalAkuakultur Indonesi, 5(1), 13-20.
United States Environmental Protection Agency (EPA).(1971). Method 352.1: Nitrogen, Nitarte (Colori-metric, Brucine) Spectrophotometer.
Hogg & Stuart. (2013). Essential Microbiology (2nd ed.).Wiley-Blackwell. 86 p.
Jun, X., Xiuzheng, X., & Tongbing, Y. (2000). Phyxico–chemical factors & bacteria in fish ponds. TheICLARM Quartel, 23(4), 16-20.
Kesseru, P., Kiss, I., Bihari, Z., & Polyak, B. (2002).The effects of NaCl and some heavy metals onthe denitrification activity of Ochrobactrumanthropi Journal of basic microbial, 42(4), 268-276.
Khasani, I. (2008). Isolasi dan skrining bakteri nitrifkasiserta aplikasinya pada biofiltrasi mediapemeliharaan larva udang galah Macrobrachiumrosenbergii de Man. Jurnal Riset Akuakultur, 3(3),413-430.
Isolasi dan karakterisasi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi ..... (Yosmaniar)
Kumar, V.J.R., Sukumaran, V., Achuthan, C., Joseph,V., Philip, R., & Singh, S.B. (2013). Molecularcharacterization of the nitrifying bacterial con-sortia employed for the activation of bioreactorsused in brackish and marine aquaculture systems.International Biodeterioration & Biodegradation, 78,74-81.
Lebuhn, M., Achouak, W., Schloter, M., Berge, O.,Meier, H., Barakat, M., & Heulin, T. (2000). Taxo-nomic characterization of Ochrobactrum sp. iso-lates from soil samples and wheat roots, anddescription of Ochrobactrum tritici sp. nov. andOchrobactrum grignonense sp. International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiolog, 50(6),2200-2207.
Long, A., Heitman, J., Tobias, C., Philips, R., & Song,B. (2013). Anammox, denitrification, andcodenitriflcation in agricultural soils. Appl. Environ.Microbiol, 79(1), 168-176.
Mahmood, Q., Hu, B., Cai, J., Zheng, P., Azim, M.,Jilani, G., & Islam, E. (2009). Isolation ofOchrobactrum sp. QZ2 from sulfide and nitritetreatment system. Journal of Hazardous Ma-terials,165(1), 558-565.
Marchesi, J.R., Sato, T., Andrew, T., Weightman,Martin, T.A., Fry, J.C., Hiom, S.J., & Wade, W.G.(1998). Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes codingfor bacterial 16S-rRNA. App Env of Microbi, 64(2),795-799.
Matsuzaka, E., Nomura, N., & Maseda, H. (2003).Participation of nitrite reductase in conversionof NO2- to NO3- in a heterotrophic nitrifier,Burkholderia cepacia NH-17, with denitrificationactivity. Microbes Environ, 18, 203–209.
Michaud, L., Blancheton, J.P., Bruni, V., & Piedrahita,R. (2006). Effect of particulate organic carbon onheterotrophic bacterial populations and nitrifica-tion efficiency in biological filters. AquaculturalEngineering, 34, 224-233.
Novita, L., Rusmana, I., & Widiyanto, T. (2014).Struktur pengoksidasi ammonia berdasarkan genamoA di situ Sawangan Bojongsari, Jawa Barat.Limnotek, 21(1), 74-86
Patra, S., Das, T.K., Ghosh, S.C., Sarkar, D., & Jana,B.B. (2010). Cadmium tolerance and antibioticresistance of Pseudomonas sp. isolated from wa-ter, sludges, and fish raised in wastewater-fedtropical ponds. Indian Journal of ExperimentalBiology, 48, 383-393.
Rodina, G.A. (1972). Methode in aquatic microbiology.Dalam Rita RC. Machael S. editor: University ParkPress. Baltimore USA, 461 pp.
Rusmana, I. (2003). Nitrous oxida formation in bac-teria. Journal Microbiology Indonesia, 8, 63-66.
Rusmana, I. (2006). Gaseous and products of nitratand nitrit reduction by denitrifying pseudomonadsisolated from estuarine sediment. JurnalMikrobiologi Indonesia, 11(2), 63-66.
Ryan, R.P., Monchy, S., Cardinale, M., Taghavi, S.,Crossman, L., Avison, M.B., Berg, G., Van der Lelie,D., & Dow, J.M. (2009). The versatility and adap-tation of bacteria from the genusStenotrophomonas. Nature ReviewsMocrobiology. Macmillan Publishers Limited, 7,514-525.
Sogin, M.L., Morrison, H.G., Huber, J.A., Welch, D.M.,Huse, S.M., Neal, P.R., Arrieta, J.M., & Herndl, G.J.(2006). Microbial diversity in the deep sea andthe underexplored”rare biosphere”. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 103, 12115–12120.
Sombatjinda, S., Boonapathchareon, N.,Ruengjitchatchawalya, M., Wantawin, C.,Withyachumnarnkul, B., & Techkarnjanaruk, S.(2011). Dynamics of microbial communities in anearthen shrimp pond during the shrimp growingperiod. Environment and Natural Resources Research,1(1), 171-180.
Syahputra, K., Rusmana, I., & Widyastuti, U. (2011).Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasisebagai agen bioremediasi nitrogen anorganik.Jurnal Riset Akuakultur, 6(2), 197-209.
Widiyanto, T. (2006). Seleksi bakteri nitrifikasi dandenitrifikasi untuk bioremediasi di tambak udang.Disertasi. Sekolah Pasca Sarjana Institut PertanianBogor, 121 hlm.
Yantos. (2016). Kebijakan pemerintah KabupatenKampar terhadap peningkatan daya sain UMKMDesa Koto Mesjid dalam menghadapi masyarakatekonomi ASEAN (MEA). Jurnal Risalah, 27(1),32-45.
Yoon, J.H., Kang, S.J., Oh, H.W., & Oh, T.K. (2006).Stenotrophomonas dokdonensissp. isolated from soil.Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 56, 1363–1367.
Yu, J., Cai, W., Cheng, Z., & Chen, J. (2013). Degrada-tion of dichloromethane by an isolated strainPandoraea pnomenusa and its performance in abiotrickling filter. Journal Enviroment Science, 13,1-23.
Yuhana, M. (2010). Agen biokontrol dalam akuakultur:Produksi dan aplikasinya. Jurnal Akuakultur Indo-nesia, 9(1), 16–20.