This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS
Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA Nama Mahasiswa : Dessy Christina Sianturi Nomor Pokok : 067030006 Program Studi : Ilmu Biologi
Menyetujui Komisi Pembimbing
(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.) Ketua Anggota Ketua Program Studi Direktur
(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc.) Tanggal lulus : 26 September 2008
Telah dilakukan isolasi bakteri termofil penghasil enzim amilase dari sumber air panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara di Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Sumatera Utara dari bulan Februari-Juli 2008. Enam belas isolat bakteri penghasil amilase didapatkan melalui uji iodin pada media pati yang digunakan untuk pertumbuhan isolat-isolat tersebut. Melalui pengukuran diameter zona bening pada media selektif amilase dengan uji iodin dipilih tiga isolat yang paling besar zona beningnya yaitu PN1, PN4 dan PN9. Enzim amilase kasar yang dihasilkan ketiga isolat terpilih tersebut diuji aktivitasnya lewat konsentrasi glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis pati pada pengaruh suhu inkubasi dan pH yang berbeda. Dari hasil pengujian didapatkan hasil amilase kasar isolat PN9 menghasilkan glukosa lebih banyak pada suhu 80oC (165,78µg/ml) diikuti oleh amilase kasar isolat PN1 (117,88 µg/ml) dan PN4 (129,19 µg/ml), meskipun pada suhu optimum aktifitasnya (60°C) amilase isolat PN4 menghasilkan glukosa yang lebih banyak sebagai hasil hidrolisis pati yaitu 437,22 µg/ml. Amilase kasar isolat PN1 memiliki aktivitas katalik yang lebih tinggi pada pH yang alkalis (pH 9,0) dibandingkan dengan PN4 dan PN9. Amilase kasar isolat PN4 aktivitas amilasenya lebih tinggi di suasana pH yang sifatnya sedikit asam sampai netral (pH 5,0 – pH 7,0). Amilase kasar isolat PN9 memiliki aktivitas katalik yang tertinggi dari ketiga isolat dan optimum aktivitasnya pada pH substrat yang bersifat netral (pH 7,0) dengan glukosa hasil hidrolisis tertinggi (390,11µg/ml). Kata kunci : Amilase termofil, air panas Penen, enzim amilase, isolasi bakteri.
Isolation of amylolytic thermophile bacteria from Penen Hot spring Sibirubiru has been carried out in Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to July 2008. Sixteen amylolytic bacterial isolates were obtained through the Iodine test on starch media. Three out of sixteen isolates showed relatively high hydrolytic activity and were used for further study. PN9 showed enzyme activity at 80oC by producing 165,78 µg/ml glucose, followed by PN4 with 129,19 µg/ml and PN1 with 117,88 µg/ml glucose, respectively. Optimum activity were showed by PN4 at 60oC by producing 437,22 µg/ml glucose. This isolate also showed relatively high enzyme activity at pH 5,0-7,0. Crude enzyme activity were measured at different of temperature and pH. However PN9 showed the highest activity among isolates tested and has optimum activity at pH 7,0 with glucose production 390,11µg/ml. Key word : Thermophile amylase, Penen hot spring, amylase enzyme, isolation of bacteria.
Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Dr. Dwi Suryanto, M.Sc selaku pembimbing I dan Bapak Prof. Dr. Erman
Munir, M.Sc selaku pembimbing II saya, yang selama penelitian dan penyusunan
tesis ini telah banyak memberikan bantuan dan masukan sehingga tesis ini dapat
selesai.
2. Bapak Dr. Delvian, SP, MP dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin MS, selaku dosen
penguji yang telah banyak memberikan masukan saran untuk penyelesaian tesis
ini agar lebih baik, terima kasih buat dukungannya.
3. Bapak Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. selaku Kepala Laboratorium Mikrobiologi
FMIPA USU dan Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si. Apt., selaku Kepala
Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi USU yang memberi
saya kesempatan melakukan penelitian tesis di laboratorium tersebut.
4. Bapak dan Ibu dosen di Program Studi Biologi Magister SPs USU, terima kasih
untuk ilmu yang sudah diberikan selama ini.
5. Bu Nurhasni Muluk Laboran Mikrobiologi dan Bu May Laboran Kimia Farmasi Kuantitatif, terima kasih buat bantuannya selama saya melakukan penelitian di
laboratorium. Buat adik-adik Asisten Lab Mikrobiologi Atika, Lidya, Netty,Ginta,
Ansen dan yang lainnya, juga buat Muti dan Faksi di Lab Kimia Farmasi
Kuantitatif. Terima kasih atas bantuannya selama di Laboratorium.
6. Ayahandaku Drs. F. Sianturi dan Ibundaku R. A. Tambunan, BA. Tiada terbalas
segala doa, kebaikan, dukunganmu, dan pengorbananmu sehingga ananda bisa
menyelesaikan tugas akhir tesis ini. Kupersembahkan semua yang kudapatkan ini
ABSTRACT..................................................................................................................ii UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................................................iii RIWAYAT HIDUP ....................................................................................................vii DAFTAR ISI .............................................................................................................viii DAFTAR TABEL .......................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xiii BAB I. PENDAHULUAN .........................................................................................1 1.1. Latar Belakang Masalah .........................................................................1 1.2. Permasalahan …………………………………………………………..4 1.3. Tujuan penelitian ………………………………………………………5 1.4. Hipotesis ……………………………………………………………….5 1.5. Manfaat Penelitian ..................................................................................5 1.6. Pembatasan masalah ...............................................................................5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................7 2.1. Amilum ..................................................................................................7 2.2. Enzim .....................................................................................................9 2.3. Enzim Amilase .....................................................................................11
2.4. Bakteri Termofil .................................................................................16 2.5. Amilase dari Mikroorganisma .............................................................19 2.6. Amilase dari Mikroba Termofil ……………………………………..21 2.7. Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .. ……………………………….24 BAB III. METODE PENELITIAN ...........................................................................26 3.1. Waktu dan Tempat ...............................................................................26 3.2. Bahan dan Alat ....................................................................................26 3.3. Sampel Percobaan ................................................................................26 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas ...........................................................27 3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri ................................................27 3.6. Pembuatan Stok Kultur ........................................................................28 3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati .................................29 3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil ...............................................................................................29 3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis ............30 3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik …...………………30 3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa .................................................31 3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat ...............................................32 3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri .........................................32 3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri Termofil .............................................................................................33 3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ..................................................................................................33
3.16. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim ...........................................34 3.17. Metode Statistik dan Analisis Data ....................................................35 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................37 4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik .................................................37 4.2. Karakterisasi Morfologi dan Uji Biokimia ..........................................37 4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar .....................................................................................41 4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ....43 4.5. Pengaruh pH terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ......................47 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................52 5.1. Kesimpulan ..........................................................................................52 5.2. Saran ....................................................................................................53 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................54
Tabel 1. Penggunaan Amilum Di Bidang Industri .......................................................9 Tabel 2. Enzim Amilase Dari Mikroorganisma Dan Aplikasinya Pada Bidang Industri .........................................................................................................22 Tabel 3. Karakter Morfologi dan Uji Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru ..........................................................................38 Tabel 4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............43 Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .......................48
DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman Gambar 1. Struktur Kimia Dari Amilosa Dan Amilopektin ........................................8 Gambar 2. Jenis Reaksi Hidrolisis Yang Dikatalis Oleh Enzim Amilase .................13 Gambar 3. Konversi Amilum Menjadi Glukosa Oleh Enzim α dan ß Amilase .................................................................................................14 Gambar 4. Rentang Suhu Lingkungan Yang Menggambarkan Keberadaan Tempat Hidup Bakteri .............................................................................16 Gambar 5. Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisa Pati oleh Enzim Amilase Isolat Bakteri Termofil Penen .................................................................41 Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin ........42 Gambar 7. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru ..................44 Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen ....................................50
1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ..................................................................60 2. Uji Adanya Produksi Enzim Amilase Oleh Isolat Bakteri ...................................61 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase .........................................62 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur ................................63 5. Pembuatan Larutan StandarGlukosa ......................................................................64 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............................................................................................65 7. Pengukuran Pengaruh pH Substrat Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ........................................................................................................66 8. Pembuatan Larutan Blanko ...................................................................................67 9. Hasil Uji Diameter Zona Bening Hidrolisa Pati ...................................................68 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim ..............................................................69 11. Kurva Standart Glukosa .................................................................................... 72 12. Foto-Foto Pewarnaan Bakteri Isolat Penen ..........................................................73
Dalam kehidupan manusia amilum berperan sebagai sumber makanan
penghasil energi utama dari golongan karbohidrat, disamping itu amilum juga
dapat berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan, misalnya
sebagai penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam
pembuatan sirup dan pemanis buatan seperti sakarin. Dalam bidang non makanan,
amilum digunakan untuk bahan baku dalam proses pembuatan kertas, pakaian dari
katun, industri cat, maupun untuk produksi hidrogen. Tabel 1. di bawah ini
menunjukkan peran amilum di berbagai bidang.
Tabel 1. Penggunaan amilum di bidang industri (Liu, 2005)
Jenis Industri Penggunaan Amilum/ Amilum Termodifikasi
Makanan Pengental, pelapis makanan, film makanan Bahan perekat Pembuat lem Kertas dan papan Kertas penjilid, pembungkus,pengepak Textil Dalam proses sizing, finishing dan printing Farmasi Kapsul obat, bahan pelarut obat Pengeboran minyak Modifikasi pengental Detergen Surfaktan, bahan pensuspensi, bahan pemutih, aktivator pemutih Kimia pertanian Pemungkus biji, pembungkus pestisida,benang pintal Plastik Pembungkus makanan, filler Kosmetik Bedak dan talk Purifikasi Flokulan Bidang Medis Scaffold, plasma eksterder, produk absorben untuk sanitasi
2.2. Enzim
Enzim merupakan protein khusus yang dapat bergabung dengan suatu
substrat spesifik untuk mengkatalisasi reaksi biokimia dari substrat tersebut
(Maier et al., 2000). Dalam reaksi tersebut enzim mengubah senyawa yang
perlu ditemukan banyak sumber-sumber penghasil enzim amilase dengan
karakteristik yang sesuai dengan yang dibutuhkan.
2.4. Bakteri Termofil
Suhu merupakan salah satu faktor penting di lingkungan yang mengontrol
aktivitas dan evolusi dari organisma hidup (Brock, 1978). Tidak semua tingkatan
suhu cocok bagi pertumbuhan dan reproduksi dari organisma. Dengan demikian
tinggi rendahnya suhu lingkungan sangat penting bagi organisma. Secara Umum
ada 4 kelompok pembagian mikroorganisma berdasarkan suhu lingkungan
tempatnya hidup yaitu mikroorganisma psikrofil, mesofil, termofil dan
hipertermofil, sebagaimana yang di gambarkan oleh Thiel (Gambar 4.)
Thermal vents > 100oC 100oC 90oC Hipertermofil 80oC-100oC 80oC Mata air panas 60oC–80 oC 70oC Termofil 45oC-80oC Pasteurisasi 65oC 60oC 50oC
40oC Tubuh manusia Mesofil 20oC-50oC 37oC
30oC 20oC 10oC Refrigerator 4oC Psikrofil -10oC-25 oC 0oC -10o C Freezer -20oC Gambar 4. Rentang suhu lingkungan yang menggambarkan keberadaan tempat hidup mikroorganisma (Thiel, 1999)
Tabel 3. Karakter Morfologi dan Sifat Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru Karakter morfologis Uji biokimia sederhana Kode Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk/ G S T S G S K isolat koloni koloni koloni koloni tataan sel r p S I e C a a o I M l A t m r A a a a t l i a n se PN1 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, strepto PN2 bulat berombak datar putih pseudobasil + + + + + + + Mono,strepto PN3 tidak beraturan berombak naik krem pseudobasil - - + + + + + mono,diplo PN4 bulat berombak datar krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN5 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, diplo PN6 tidak beraturan rata datar krem pseudobasil + + - + + - - mono, diplo PN7 tidak beraturan rata naik krem pseudobasil + + + + + + - mono, diplo
Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil
enzim amilase dengan aktifitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi
tinggi adalah yang zona beningnya > 26 mm, potensi sedang bila diameter zona
beningnya berkisar 14–26 mm dan potensi rendah bila diameter zona beningnya <
14 mm. Zona bening yang terbentuk di sekeliling isolat setelah ditetesi larutan
iodin menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut telah menghidrolisis pati di
bagian media pati tersebut (Cappuccino, 1983). Dengan demikian berdasarkan
kriteria potensi yang dibuat oleh Igarashi et al. (1998) dari 16 isolat bakteri
termofil amilolitik Penen tersebut 6 isolat berpotensi rendah yaitu PN10, PN13,
PN16, PN8, PN5 dan PN7. Potensi sedang dimiliki oleh 7 isolat yaitu PN2, PN12,
PN11, PN6, PN14, PN15, PN3 sedangkan yang berpotensi tinggi ada 3 isolat
yaitu PN4, PN1 dan PN9 seperti terlihat pada Gambar 6.
(A) (B) (C) Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin. Setelah Inkubasi 72 jam: (A) Isolat PN1 (B) Isolat PN4 dan (C) Isolat PN9 Dari hasil uji hidrolisis zona bening dipilih tiga isolat terbesar zona
beningnya yaitu isolat PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27,33 mm)
Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil
Isolat pH konsentrasi
glukosa Aktivitas enzim Notasi (µg/ml) (Unit/ml per menit) = 0.05
PN1 4,0 75.68 0.021 e 5,0 122.79 0.034 d 6,0 157.09 0.044 c 7,0 188.65 0.052 ab 8,0 203.28 0.056 a 9,0 172.6 0.048 bc
PN4 4,0 117.53 0.033 c 5,0 180.41 0.050 b 6,0 224.78 0.062 a 7,0 176.98 0.049 b 8,0 117.07 0.033 c 9,0 94.2 0.026 d
PN9 4,0 267.31 0.074 bc 5,0 285.6 0.079 b 6,0 350.09 0.097 a 7,0 390.11 0.108 a 8,0 239.18 0.066 c 9,0 134.91 0.037 d
Keterangan: Huruf yang sama pada notasi dari masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%. Amilase dari isolat PN1 menunjukkan aktivitas optimumnya pada pH 8.
Aktifitas optimum pada pH 8,0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat
Bacillus sp strain SMIA-2 (Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat
Bacillus sp KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan
pada pH 10,0 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001).
Aktifitas enzim PN1 meningkat mulai dari pH 4 sampai pH 8 hal ini menunjukkan
jika amilase isolat PN1 lebih cocok digunakan pada pH lingkungan yang sifatnya
PN9 ini menunjukkan peningkatan dari pH 4,0 sampai pH 7,0, tetapi mulai terjadi
penurunan sebesar 38% ketika pH meningkat menjadi 8. Aktivitas terus menurun
sebesar 65 % dari aktivitas optimumnya dengan peningkatan pH sampai 9,0. pH
substrat berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN9
(Lampiran 10.6). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan aktivitas enzim amilase
kasar PN9 berbeda nyata ketika pH substrat berubah dari pH 5,0 menjadi 6,0 dan
pada pH 8,0 serta 9,0 aktifitas juga menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Hal ini
menunjukkan enzim amilase dari isolat PN9 ini lebih cocok digunakan pada pH
yang cenderung netral untuk mendapatkan hasil yang optimum.
Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase kasar ketiga isolat tersebut dapat
dilihat pada Gambar 8 di bawah ini
Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Dari grafik terlihat jika pada pH yang paling rendah (pH4) aktivitas
amilase terbesar untuk 20 menit masa inkubasi tenyata PN9 menghasilkan glukosa
terbanyak (267,31 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN4 (117,53 µg/ml) dan
DAFTAR PUSTAKA Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 125–1529. Ajayi OA & Fagade EO. 2007. Heat activation and stability of amylase from Bacillus species. African Journal of Biotechnology. 6: 1181–1184. Alexander M. 1977. Introduction to soil microbiology. John Wiley & Son. p.191. Al-Qodah Z, Daghstani H, Geopel & Lafi W. 2007. Determination of kinetic parameters of -Amylase producing thermophile Bacillus sphaericus. African Journal of Biotechnology. 6: 699–706. Bailey MJ. 1988. A note on the use to dinitrosalicyclic acid for determining the products of enzymatic reaction. App. Microbiol. Biotechnol. 29: 494 – 496. Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown Publication. Bernfeld. 1951. Enzyme of starch degradation and synthesis. In: Advance in Enzymology. Interscience Publications. Inc. New York. Bessler C, Schmitt J, Maurer KH & Schmitt RD. 2003. Directed evolution of bacterial -amylase: Toward enhance pH- performance and higher specific activity, Protein Science 12: 2141– 149. Biology Amylase Lab. http://departement.oxy/edu/test/Amylase. (12 April 2008). Brock TD & Brock KM. 1978. Basic microbiology with application. 2nd edition. Prentice Hall, Inc, New Jersey. p.583. Brock TD. 1978. Thermophillic microorganisms and life at high temperatures. Springer–Verlag, New York. Brock TD. 1986. Thermophiles: General, Molecular. 2nd Applied Microbiology. A Willey Interscience Publication. Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company.
Carolina M, Pereira N & Andrade A. 1999. Thermophilic microorganism and their polymer–hidrolytic enzyme. Brazilian Archives of Biology and Technol. 12: 12-130. Cordeiro CA, Martin ML & Luciano AB. 2002. Production and properties of -amylase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 33: 57– 61. De Carvalho RV, Correa T & da Silva J. 2008. Properties of an amylase from thermophillic Bacillus sp. Brazillian Journal of Microbiology. 39: 102-107. De Rossa M, Gambacorta A & Gliozzi A. 1986. Structure, Biosynthesis and Physicochemichal Properties of Archaebacterial Lipids. Microbiological Reviews. 50: 70-80. De Rossa M, Morana A, Riccio A, Gambacorta A, Trincone A & Incani, O. 1994. Lipid of the archaea: a new tool for bioelectronic. Biosens. Bioelectr. 9: 669– 675. Dwidjoseputro D. 1989. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Erickson HM. 1992. Usage recommendations for -amylase: maximizing enzyme activity while minimizing enzyme-artifact binding residues. The 1992 Book And Paper Group Annual.p. 24–33. Everly C & Alberto J. 2000. Stressors, stress and survival: overview. Front Bioscience. 5: 780–86. Fu Shaw J., Fu Pang L & Chiu Chen S. 1995. Purification and properties of an extracellular -amylase from Thermus sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 36: 195-200. Hagihara H, Igarashi K & Hayashi Y. 2001. Novel -amylase that is highly Resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1744–1750. Haki GD & Rakshit SK. 2003. Developments in industrially importants thermostable enzymes: a review. Bioresource Technol. 89: 17- 34. Haq I, Ashraf H, Qadeer MA & Iqbal J.2005. A source of alpha amylase production by Bacillus licheniformis. Bioresource Technol. 96: 1201-1204.
Hartuti MS. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase dari kawasan wisata Pemandian Air Panas Pawan-Roka Hulu. Skripsi. Unversitas Riau. Herbert R & Sharp R.1992. Molecular Biology and Biotechnology of Extremophiles. Chapman and Hall, New York. Hibino Y, Nosoch Y & Samejima J. 1974. Structur stabillity relationship in proteins: new approach to stability enzymes. Biochem. 75: 553–561. Holt JG. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. William & Wilkins, United Stated of Amerika. Hyun HH. & Zeikus JG. 1985. General biochemial characterization of thermostable extracellular ß-amylase from Clostridium thermosulfurogenes. Appl Environ Microbiol. 49: 1162–167. Igarshi YH, Hiroshi H, Katsuhisha S & Mikio S. 1998. Enzymatic properties of a novel liquefying-amylase from an alkaliphilic Bacillus Isolate and entire nucleotida and amino acid sequences. Appl Environ Microbiol 64: 3282–3289. Illanes A. 1999. Stability of biocatalysts. Electronic Journal of Biotechnology. 2: 1-9. Junaidi HM. 2008. Deteksi produksi Amilase. http://www.blogger.com/profile/. <1 Juni 2008)> Kombong H . 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar. 5: 16–20. Kumar S & Nussinov R. 2001. How do thermophillic protein deal with heat ? A review. Cell. Moll. Life Sci. 58: 1216– 233. Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor & Francis Group, LLC. Madi E, Antranikian G, Ohmiya, K & Gottschalk. 1987. Thermostable amylolytic enzyme from a new Clostridiumisolates . Appl Environ Microbiol. 53: 1661-1667. Maier RM, Pepper IL & Gerba CP. 2000. Environmental Microbiology. Academic Press. London.
Maxwell A. 1999. DNA Gyrase and the mechanism of DNA supercoiling. Dept. Biochemistry of Leichester . Mohan C. 2003. Buffers. EMD Bioscience Calbiochem. Germany. Morrison LE & Tanner FW. 1921. Aerobic thermophilic bacteria from water in studies on thermophilic bacteria. Journal Bacteriol. p. 343–366. Muchtadi S, Nurleni & Made. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Institut Pertanian Bogor. Murray RK, Granner DK, Mayes PA & Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. ECC Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Nickerson WJ & Brown RG. 1965. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 275. Oboh G. 2005. Isolation and Characterization of amylase from fermentedcassava (Manihot esculenta Crantz) waste water. African Journal of Biotechnology. 4: 1117–1123. Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher. Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D & Mohan R. 2000. Advance In microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem.31: 135–152. Pelczar MJ & Chan EC. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Poedjiadi A. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Poernomo AT & Purwanto DA. 2003. Uji aktifitas crude enzim proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majalah Farmasi Airlangga. 3: 103–107. Properties of enzymes isolated from thermophilic microbes. http://www.osmania.ac.in/Microbiology. <12 Oktober 2007> Rath CC & Subramanyam VR. 1998. Isolation of thermophilic bacteria from hot spring of Orissa, India. Geobios. 25: 113-119.
Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of themicrobial -Amylase family. African Journal of Biotechnology. 2: 645–648. Rothschild LJ & Mancinelli RL. 2001. Life in extreme environments. Nature. 409: 1092-1011. Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw Hill Book Company, Inc. Santos EO & Martin ML. 2003. Effect of the Medium Composition on Formation of Amylase by Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and Technology. 46: 129–134. Silva T, Tony M, Derlene A & Carvalho, AF. 2005. Production of Saccharogenic and Dextinogenic Amylases by Rhizomucor pusilus A 13.36. The Journal of Microbiology. 43: 561 – 568. Singleton R & Amelunxen RE. 1973. Proteins from Thermophilic Microorganism. Bacteriological Review. 37 : 320–342. Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri KD, Sossol CR & Pandey A.2006. α-amylase from microbial sources- An overview on recent developments. Food. Technol. Biotechnol. 44: 173-184. Swammy MV, Saerami N & Seenayya G. 1994. β-amylase from Clostridium thermocelluum SS8 a thermophillic, anaerobic, cellulolytic bacterium. Lett. App. Microbial.18: 301–304. Swammy MV & Seenayya G. 1996. Thermostable Pullulanase and -amylases activity from Clostridium thermosulforogenes SV9 Optimization of Culture condition for enzyme productions. Process Biochem. 157– 162. Syu MJ & Chen YH. 1997. A study on the -amylase fermentation perfomed by Bacillus amyloliquefaciens. Chem. Eng. Journal. 65: 237–247. Tarigan J. 1988. PengantarMikrobiologi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan. Thiel T. 1999. Introduction to Bacteria. In Science in The Real World. Dept. of Biology Univ. of Missouri –St. Louis.
Viara N, Elena P & Elka I. 1993. Purification and Characterization of thermostable Bacillus stearothermophilus alpha - amylase. Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 427- 435. Vieille C & Zeikus G. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Source, Uses, and Molecular Mechanism for Thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65: 1–43. Vihinen M & Mantsala P. 1990. Characterization of an thermostable Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Biotechnol. App. Biochem. 12: 427-433. Walter WW & Nagesh S. 1965. Microbial Amylases. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 273–304. Yitnosumarto S. 1991. Percobaan: Perancangan, Analisis danInterpretasinya. P.T. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
LAMPIRAN 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur
Diambil satu ose Dilarutkan dalam media produksi amilase yang sudah disterilisasi Diinkubasi pada suhu 65°C selama 72 jam pada shaker waterbath kecepatan 150 rpm
Disentrifuge selama 20 menit Kecepatan 6000 rpm Supernatan disedot pelan dengan mikropipet, supernatan ini adalah bagian yang mengandung enzim kasar amilase
Isolat tunggal penghasil amilase
Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase
Supernatan yang mengandung amilase kasar
Uji pengaruh suhu inkubasi & pH substrat terhadap aktivitas amilase kasar
LAMPIRAN 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar
Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada pH 6,5 Diinkubasi pada waterbath suhu 40°C, 50°C, 60°C, 65°C, 70°C dan 80°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa
LAMPIRAN 7. Pengukuran Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar
Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada variasi pH 4,0, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 Diinkubasi pada waterbath suhu 65°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa
LAMPIRAN 8. Pembuatan Larutan Blanko Diambil 2ml Dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit Ditambah larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 Diinkubasi 20 menit pada variasi suhu 65°C Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan 15 menit dengan air mengalir Ditambah 20 ml aquabidest
Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
LAMPIRAN 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim Tabel 1. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN1
SK db JK KT F hit
F.05=3,11
perlakuan F.01=5,06 5 128883.84 25776.77
Galat Percob. 12 2402.16 200.18
Total 17 128.77 **
KK = 0.0666117 x 100% 6.66%
Tabel 2. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN4