UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL MÁSTER DE BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos TRABAJO FINAL DE MÁSTER Presentado por: María Isabel Baroja Oviedo Dirigido por: Dr. José Ramón Murguía Ibáñez Valencia, Junio 2014
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL
MÁSTER DE BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA
Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos
TRABAJO FINAL DE MÁSTER
Presentado por:
María Isabel Baroja Oviedo
Dirigido por: Dr. José Ramón Murguía Ibáñez
Valencia, Junio 2014
AUTORIZACIÓN
Datos del Trabajo Fin de Máster
Autora: Isabel Baroja Oviedo
DNI: Y2644776C
Título: Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos
Yo, José ramón Murguía Ibáñez, en calidad de Director del trabajo de fin de máster
cuyos datos figuran en el apartado anterior, autorizo la presentación del mismo y
certifico que éste se adecúa plenamente a los requisitos formales, metodológicos y de
contenido exigidos a un trabajo de fin de máster, de acuerdo con la normativa
aplicable en la ETSIAMN.
__________________________
Firma
Valencia, 3 de junio de 2014
FORMULARIO DEPÓSITO TESIS FIN DE MÁSTER (TFM)
AUTOR 1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE DNI/NIE
Baroja Oviedo Isabel P172007721
DIRECTOR TFM (UPV)
1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE
Murguía Ibáñez José Ramón
DIRECTOR TFM (NO UPV)
1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE
UNIVERSIDAD MÁSTER
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA
Máster Biotecnología Biomédica
TÍTULO DE LA TESIS Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos
RESUMEN
El desarrollo de nanodispositivos como plataformas de transporte y liberación de moléculas químicas se ha convertido en una de las más innovadoras aplicaciones descritas durante los últimos años. Una característica fundamental de estos nanodispositivos consiste en que son capaces de liberar compuestos de interés únicamente bajo estímulos específicos lo cual, ha resultado especialmente útil para la investigación farmacológica. Dentro de este área, los nanodispositivos pueden ser utilizados a manera de biosensores o como transportadores de moléculas hacia dianas específicas. Entre los mencionados sistemas, las nasnopartículas mesoporosas de sílice (MSN) como vehículos multifuncionales constituyen un espacio de creciente interés, principalmente, porque estas matrices nanoscópicas tienen propiedades diferenciales como su elevada biocompatibilidad, inercia química, estabilidad térmica y porosidad homogénea. Debido a estas características las MSN se han convertido en herramientas apropiadas para la liberación espacio-temporal controlada de moléculas de interés químico. Dentro de los materiales mesoporosos de sílice, la MCM-41 (“Mobile Crystalline Material-41”), resulta apropiada para la fabricación de dispositivos nanoscópicos, ya que al hacer reaccionar los hidroxilos expuestos en el exterior de estas nanopartículas, resulta relativamente sencillo funcionalizar la matriz inorgánica dando lugar al acoplamiento de las denominadas puertas moleculares. Estas puertas, confieren selectividad a los soportes sólidos, ya que son capaces de abrirse y liberar el contenido de sus poros únicamente ante estímulos controlables como cambios de pH, temperatura, potencial redox, presencia/ausencia de proteínas, iones o ácidos nucleicos. Entre todas las puertas nanoscópicas moleculares, los ácidos nucleicos han sido reconocidos como compuestos interesantes debido a su conformación tridimensional, a su especificidad a la hora del acoplamiento en doble hebra y a su robusta estructura físico-química. En este sentido, el trabajo que nos ocupa, consiste en el diseño, elaboración y estudio de la funcionalidad de un sólido mesoporoso nanoparticulado de tipo MCM-41, cargado con un colorante (rodamina B), funcionalizado con isocianatos y tapizado con una puerta molecular de ADN. Este dispositivo tiene como objetivo de detectar patógenos bacterianos de tipo Mycoplasma. Para lograr la selectividad del sistema, la puerta molecular del nanodispositivo estará formada por dos hebras de ADN de diferentes longitudes (15 y 39 nucleótidos respectivamente) correspondientes a un fragmento altamente conservado de la región ribosomal 16S perteneciente a las bacterias del género Mycoplasma. La hebra pequeña (O1), presentará una modificación sintética (NH2) en su extremo 5´ la cual será acoplada covalentemente a la superficie del sólido al reaccionar con los grupos isocianato. La segunda hebra de ADN (O2), cumple una doble función. Primeramente, se encargará de bloquear la salida de la carga al cubrir los poros de la nanopartícula pero además, estará encargada de mediar las interacciones supramoleculares necesarias para la posterior
liberación selectiva del colorante. La apertura de la puerta molecular dependerá de la presencia de ADN genómico de Mycoplasma en el analito, en cuyo caso la liberación del contenido de los poros, será la consecuencia de hibridación de las bases complementarias de la hebra del ADN genómico presente en el analito con el oligonucleótido (O2) inmovilizado en el nanodispositivo. Para evaluar la fiabilidad del sistema se caracterizó la matriz mesoporosa y se realizaron pruebas de efectividad. A partir de los resultados obtenidos se puede decir, que el límite de detección del nanodispositivo es de aproximadamente 70 copias de ADN de Mycoplasma uL-1. Además, el sistema diseñado es capaz de detectar de manera selectiva la presencia de ADN del género Mycoplasma incluso en presencia de ADN interferente (Candida albicans y Legionella pneumophila). Finalmente, este diseño fue testado con muestras clínicas previamente analizadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los análisis mostraron, que el soporte sólido diseñado identifica de manera selectiva la presencia de micoplasmas en suspensión. En conjunto, estos resultados indican que la nanoformulación desarrollada es un biosensor rápido y eficiente, capaz de detectar ADN bacteriano (Mycoplasma) de manera específica y emitir una señal cuantificable mediante espectroscopia de fluorescencia, lo que lo convierte en una potencial herramienta diagnóstica. Currently, nanodevice development as platforms for the transport and release of chemical molecules has become one of the most innovative applications. A key issue in this field is the design of new “smart” systems based on nanoscale structures and a variety of biomolecules, which perform unprecedented functions. Nanoscale devices can be used to develop biosensors or to deliver molecules to specific targets. In drug delivery, the development of stimuli-responsive systems has attracted tremendous attention. In particular, the use of mesoporous silica nanoparticles (MSN) has a lot of advantages due to its properties such as high biocompatibility, chemical inertness, thermal stability, and homogeneous porosity. Because of these characteristics, MSN have become appropriate tools for spatio-temporal release of chemical molecules. Additionally, mesoporous silica nanoparticles, such as type MCM-41 (Mobile Crystalline Material-41), function as a support that serves as a reservoir in which certain compounds can be stored. Besides, some molecules or molecularly appended objects can be attached on the surface of these containers, thus acting as molecular gates. Among molecular gates, the nucleic acids have been recognized as interesting materials because of their three-dimensional conformation, specificity, double stranded coupling and robust physical-chemical structure. In this work, as a proof of principle, we designed a sensitive nanodevice for direct and rapid detection of Mycoplasma. Therefore, MSN have been selected as the inorganic support. The nanoparticles were loaded with a suitable dye (rhodamine B), and then the external surface was functionalized with isocyanates. Two complementary sequences of DNA with different lengths act as molecular gates in this system. These sequences are highly conserved in the Mycoplasma genome. The smaller DNA strand (O1) has a modification at 5 ' extreme (NH2). Through this modification, the DNA can be coupled covalently to the solid sufrase due to the reaction with the isocyanates. The second strand of DNA (O2) has two functions. First, it will be responsible for blocking the pores of the nanoparticle, but it also for mediating supramolecular interactions. These interactions will be necessary for the subsequent dye release. Consequently, dye release will depend on the presence of genomic DNA of Mycoplasma in the analyte; in which case, genomic DNA will hybridize with oligonucleotide (O2) immobilized on the nanodevice allowing for the dye release. In order to evaluate the effectiveness of this system, the MCM-41 was chemically characterized and probed through different assays. From the results, the limit of detection was calculated from approximately 70 copies of Mycoplasma uL-1. Afterwards, we found that the nanodevice was able to recognize samples selectively contaminated with Mycoplasma, even if there are other microorganisms like Candida albicans or Legionella pneumophila in the analyte. Finally, this system was tested with clinical samples previously analyzed using polymerase chain reaction (PCR). This experience confirms that our device can accurately identify the presence of Mycoplasma, in particular, Mycoplasma pneumonia, with fluorescence spectroscopy. All these results suggest that this technology is fast and efficient tool for diagnostic sensing of bacterial DNA.
URL MINISTERIO DE EDUCACIÓN Y CIENCIA: http://www.mec.es/ciencia/jsp/plantilla.jsp?area=plan_idi&id=6&contenido=/files/portada.jsp
CAMPO DISCIPLINA SUBDISCIPLINA
23 2307 2390.01
22 2210 2210.28-1
(máximo tres áreas de conocimiento)
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL DON/ÑA: María Isabel Baroja Oviedo DNI/NIE: P172007721 DIRECCIÓN: Calle Luis de Milán, Número 9, puerta 10. Código postal 46021. TELÉFONO/S: 601162326 MAIL: [email protected] TÍTULO TFM: Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos DIRECTOR UPV : José Ramón Murguía Ibáñez DIRECTOR NO UPV: E-MAIL: EXPONE:
Que habiendo cursado un total de 72 créditos de las asignaturas pertenecientes al Máster de Biotecnología Biomédica, y estando interesada en presentar el Trabajo de Fin de Máster SOLICITA:
La asignación de lugar, fecha, hora y del Tribunal que deberá valorar, mediante una exposición pública, los conocimientos adquiridos en los estudios de dicho Máster para la convocatoria:
□ Diciembre □ Marzo □ Mayo x Junio
Valencia a, 3 de junio de 2014
Fdo.:…………………………..
SECRETARÍA DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA E.T.S.I.A.M.N. (Planta Baja del Edificio 3J)
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. E.T.S.I.A.M.N Camino de Vera, s/nº. 46022 VALENCIA●Tel. +34 963877420●Fax +34 96 3877429
A mi familia en Ecuador por su ejemplo de entrega y generosidad.
A mi familia en Vilafranca del Penedès, por su apoyo y cariño.
A Pau, por ser mi inagotable fuente comprensión, ternura y aliento cada día.
A Sindy, Gabriela y Lorena, por su amistad inquebrantable.
A todos quienes de una u otra manera han hecho este sueño realidad.
“Los científicos dicen que estamos hechos de átomos, pero a mí un pajarito me contó
que estamos hechos de historias”
Eduardo Galeano
Índice de puntos
ÍNDICE DE PUNTOS
I. Introducción……………………………………………………………………………………………..... 1
1. Características biológicas del género Mycoplasma…………………………………….. 3
2. Infecciones producidas por Mycoplasma……………………………………………………. 6
2.1 Neumonías adquiridas en la comunidad y Mycoplasma pneumoniae…. 6
S1 Sólido funcionalizado con isocianatos y cargado con rodamina B
S1-‐O1-‐O2 Sólido funcionalizado con ADN como puerta molecular
SLF Sistema de liberación de fármacos
TEOS Tetraetilortosilicato
TEM Microscopía electrónica de transmisión
TEA Trietilamina
TG Análisis termogravimétrico
I. INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1. Características biológicas del género Mycoplasma
Las bacterias del género Mycoplasma (familia Mycoplasmataceae, orden
Mycoplasmatales) pertenecen a la clase Mollicutes que significa “piel blanda”;
término que hace referencia a su carencia de pared celular. Filogenéticamente, se
relacionan con un grupo de bacterias grampositivas (Bacillus, Lactobacillus,
Clostridium y Streptococcus) de las que divergieron mediante un proceso de evolución
reductiva que provocó la perdida de su pared celular y a una reducción graduada de
su genoma convirtiéndose en las bacterias más pequeñas con capacidad de división
autónoma y vida libre (Matas et al., 2005). Sin embargo, no se conoce el tipo de
presión selectiva que condujo al mencionado proceso de evolución regresiva. Estos
microorganismos de alta complejidad y sofisticación se encuentran ampliamente
distribuidos en la naturaleza. De hecho, se han identificado aproximadamente 200
especies de ellos; de las que apenas 12 han sido aisladas en humanos (Lluch, 2010).
En la tabla 1 se observan los tipos de micoplasmas obtenidos a partir de muestras
clínicas humanas, el lugar de aislamiento y su posible asociación con una patología.
Tabla 1. Especies de micoplasmas aisladas en muestras clínicas de origen humano, tipos de mucosas
que colonizan y posible patogenia (Modificado de Acosta et al., 2010)
Especie Mucosa colonizada Especie
patológica Orofaringe Tracto genitourinario M. pneumoniae + -‐ + M. salivarium + -‐ -‐ M. orale + -‐ -‐ M. buccale + -‐ -‐ M. faucium + -‐ -‐ M. lipophilum + -‐ -‐ M. hominis + + + M. genitalium * + + M. fermentans + + + M. primatum -‐ + -‐ M. spermatophilum -‐ + -‐ M. penetrans -‐ + Desconocida
* aunque se ha encontrado en orofaringe, se desconoce su papel en el tracto respiratorio
Introducción
4
Estos microorganismos tienen tres características biológicas fundamentales que les
hacen ser únicos entre el resto de bacterias y que además, definen su relación con el
hospedador. La primera característica es de carácter morfológico, y se resume por
una parte en la carencia de pared celular y por otra, en su tamaño reducido tanto en
lo que tiene que ver con su dimensión celular (0,2 -‐ 0,8 μm) como con el tamaño de
su genoma (Acosta et al., 2011). La segunda característica es de tipo funcional, y
consiste en la escasa dotación de vías metabólicas; lo cual se puso de manifiesto,
mediante el estudio de los genomas de M. pneumoniae y M. genitalum. A partir de
estas investigaciones se constató la ausencia de los genes implicados en la síntesis de
aminoácidos y la presencia de pocos genes vinculados a la biosíntesis de vitaminas,
precursores de ácidos nucleicos, ácidos grasos y colesterol; lo que hace que estas
bacterias sean altamente dependientes del aporte exógeno (Himmelreich et al., 2002;
Narita, 2009). Como consecuencia de lo anterior, se produce la tercera característica,
que consiste en la íntima relación de dependencia del microorganismo hacia su
hospedador (Lluch, 2010).
Estructuralmente, los micoplasmas son organismos bastante sencillos. Están
conformados por una membrana plasmática trilaminar, un citoplasma con algunos
ribosomas y una molécula de ADN de doble cadena, circular, densamente
empaquetada (Acosta, 2010). Adicionalmente, algunas especies de Mycoplasma,
poseen una estructura terminal denominada orgánulo de adherencia, la cual les
otorga la capacidad de fijarse con gran habilidad en los epitelios de sus hospedadores
(figura 1). La membrana celular tiene una conformación proteo-‐lipídica dependiente
de la aportación exógena de ácidos grasos y colesterol, ya que las escasas vías
metabólicas bacterianas, están principalmente dedicadas a la generación de energía y
en menor grado a la formación de sustratos para las rutas sintéticas. Por otra parte y
como se había mencionado anteriormente, estas bacterias carecen de pared celular
lo que podría explicar su alta sensibilidad frente a choques osmóticos y a la presencia
de detergentes. En contraste, esta característica también les confiere resistencia
frente a los antibióticos β-‐lactámicos (Waites et al., 2004).
Introducción
5
Figura 1. Fotografía tomada mediante de microscopía de transmisión electrónica de Mycoplasma
pneumoniae infectando anillos traqueales. (Imagen de Waites et al., 2004)
Estas bacterias a pesar de su aparente simplicidad, son capaces de formar complejas
relaciones con otros organismos. Es así que, la mayoría de micoplasmas establecen
con el hospedador una relación de comensalismo, pero algunas especies pueden
llegar a ser patógenas (Acosta, 2011). Las especies que se comportan como
patógenas, producen infecciones que son generalmente crónicas y rara vez
fulminantes. En investigaciones publicadas por Waites y Talkington en el año 2004, se
observó que durante el proceso de adherencia algunos micoplasmas lesionan a la
célula hospedadora e interfieren en su metabolismo. Se ha visto además que ciertas
especies incluso están en capacidad de penetrar en una amplia variedad de células
humanas tanto in vitro como in vivo, logrando sobrevivir en el medio intracelular de
manera prolongada. Como es evidente, la localización intracelular protege a estos
microorganismos frente a los potenciales efectos del sistema inmunitario del
hospedador y a la presencia de antibióticos, lo cual dificulta su erradicación y justifica
el aparecimiento de infecciones latentes o crónicas (Waites et al., 2004).
Ahora bien, en términos de salud pública las bacterias del género Mycoplasma son
importantes debido a su actividad como agentes infecciosos y también a su rol como
contaminantes de laboratorio. En relación a esto último, se debe mencionar que los
Introducción
6
cultivos celulares utilizados en la investigación biotecnológica, biomédica y en el
diagnóstico hospitalario son objeto de contaminación con micoplasmas lo cual altera
el crecimiento celular, los patrones enzimáticos, la composición de la membrana e
induce anormalidades cromosómicas. En consecuencia, la mencionada problemática
afecta considerablemente los resultados obtenidos; lo que conlleva pérdidas
económicas y de tiempo. Por esta razón, muchos laboratorios se han visto obligados a
seguir estrictos protocolos de calidad para evitar el aparecimiento de dichos
contaminaciones (Rivera et al., 2006).
Por otra parte, en relación a la participación de los micoplasmas con el aparecimiento
de patologías, se ha visto que estas bacterias están implicadas principalmente en el
desarrollo de neumonías, enfermedades urogenitales no gonocócicas, artritis
reumatoide y enfermedades inflamatorias pélvicas. No obstante con menor
frecuencia, se han descrito meningoencefalitis, neuritis óptica, parálisis de nervios
craneales, ataxia, erupción eritematosa papular o vesicular, mialgias, artralgias,
artritis séptica, pericarditis, miocarditis, glomerulonefritis, vómito, diarrea, otitis y
conjuntivitis asociadas a Mycoplasma (Michelow et al., 2004).
2. Infecciones producidas por Mycoplasma
Por efectos didácticos, en los siguientes apartados profundizaremos únicamente en la
actividad de Mycoplasma pneumoniae y Mycoplasma fermentans dentro del
desarrollo de algunas patologías.
2.1 Neumonías adquiridas en la comunidad y Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae es un patógeno intracelular facultativo cuya distribución es
universal. Esta bacteria es causante de entre un 15 y un 30% de las neumonías
adquiridas en la comunidad, lo cual supone una frecuencia de 2 casos por cada 1000
personas al año y dichas infecciones normalmente son producto de ciclos epidémicos
(Matas et al., 2005). Pero, M. pneumoniae también produce infecciones de vías
respiratorias altas, siendo el segundo agente causal de estas enfermedades después
Introducción
7
del virus influenza A (Ausina, 2004; Matas et al., 1998).
Las infecciones del aparato respiratorio producidas por esta bacteria, de acuerdo a
sus características clínico radiológicas, se denominan neumonías atípicas primarias.
Los síntomas se presentan de manera gradual en el transcurso de algunos días y
consisten en fiebre, tos no productiva, cefalea, mialgias y también pueden estar
acompañados de inflamación del tracto respiratorio. Haciendo uso de una radiografía
de tórax se consigue observar infiltrados ritículonodulillares parahiliares o
peribronquiales que pueden ser uni o bilaterales y además ocasionalmente, aparecen
pequeños derrames pleurales (Ausina, 2004).
Aunque estas bacterias no suelen ser demasiado agresivas, esporádicamente se han
visto casos en los que la infección producida por Mycoplasma pneumonie resulta
fulminante. Esto ocurre especialmente en niños con alteraciones inmunológicas como
anemia falciforme, anaesplenia funcional, hipogammaglobulinemia o síndrome de
Down (Michelow et al., 2004).
2.2 Artritis reumatoide y Mycoplasma fermentans
Aproximadamente desde el año 1970, se ha sospechado una correlación entre el
desarrollo de la artritis reumatoide y la presencia de Mycoplasma fermentans. Sin
embargo, esta asociación ha resultado difícil de probar (Johnson et al., 2000). Pero
con el advenimiento de técnicas moleculares, particularmente con el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se ha explicado de mejor manera el papel
de M. fermentans en el desarrollo de dicha patología (Gilroy et al., 2001). Es así que
para el año 2000, Horowitz y colaboradores logran detectar la presencia de
Mycoplasma fermentans en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide,
artritis inflamatoria no reumatoide y artritis no diferenciadas, haciendo uso de la
citada tecnología (Horowitz et al., 2000).
Estos hallazgos han permitido suponer que microorganismos como Mycoplasma
fermentans, son capaces de iniciar procesos de artritis ya sea por medio de una
Introducción
8
infección crónica, con una cantidad mínima pero persistente de la bacteria, o a través
del mecanismo denominado “hit and run” (Rivera et al., 2002; Rivera, 2003). Este
mecanismo supone que el agente infeccioso se establece en la articulación por un
periodo de tiempo corto y posteriormente es eliminado. No obstante, para este
momento ya ha desencadenado una cascada de eventos que conducen al proceso
inflamatorio (Johnson et al., 2000). Esto se comprobó en 2002, mediante ensayos in
vitro con conejos a los que se inocularon tanto Mycoplasma fermentas como
Mycoplasma arthriditis. En dichas investigaciones realizadas por Rivera et al., se
observó que los mencionados agentes infecciosos únicamente pudieron aislarse a
partir de las articulaciones de los animales de experimentación durante las primeras
semanas post-‐infección, pero el proceso inflamatorio característico de la artritis
prevalece incluso después de la erradicación de las bacterias (Rivera et al., 2002;
Rivera, 2003).
3. Diagnóstico de infecciones por micoplasmas
El diagnóstico clínico de las infecciones causadas por micoplasmas se ha visto limitado
por el crecimiento dificultoso que presentan estos microorganismos y porque hasta
hace poco, se contaba con escasos procedimientos rápidos y sensibles para su
detección. En consecuencia, esto ha llevado a subestimar la participación de estas
bacterias en el contexto de las enfermedades infecciosas. En los próximos párrafos
resumiremos los métodos diagnósticos más comunes aplicados actualmente.
El diagnóstico microbiológico es la práctica más habitual; sin embargo, conseguir un
buen aislado de Mycoplasma a partir de cultivos de muestras respiratorias,
urogenitales o sinoviales es altamente complejo. Principalmente, porque en este tipo
de muestras suelen estar presentes otras especies patógenas lo que lleva a resultados
parcialmente erróneos. Estas dificultades han llevado a la aplicación de técnicas
alternativas como PCR y PCR en tiempo real por su alto nivel de especificidad
(Templeton et al., 2003).
Aun cuando las técnicas moleculares presentan grandes ventajas, los análisis
Introducción
9
serológicos siguen estando más difundidos, especialmente para el diagnóstico de
Mycoplasma pneumoniae; tanto por la facilidad que ofrecen estas técnicas durante la
recogida de la muestra, como por la disponibilidad de múltiples pruebas. Sin
embargo, los mencionados análisis resultan deficientes si se precisa investigar
muestras con los denominados “micoplasmas genitales” (M. hominis, Ureaplasma spp
y M. genitalum) (Sánchez et al., 2003; Talkington, 2004).
Se debe agregar que según los reportes publicados, el diagnóstico de bacterias del
género Mycoplasma haciendo uso de las técnicas vigentes, continúa siendo
dificultoso (Wenisch et al., 2003). Por tanto, es un reto a nivel científico-‐técnico el
perfeccionamiento de las herramientas actuales o en su defecto, la creación de
nuevas estrategias diagnósticas capaces de aportar mayor información acerca del
desarrollo de las enfermedades y de la presencia/ausencia del patógeno examinado.
En este sentido, el desarrollo de plataformas nanotecnológicas resulta un área de
especial interés principalmente por su alta especificidad y versatilidad.
4. La nanobiotecnología frente a la detección de patógenos bacterianos
Durante la última década, el desarrollo de nanodispositivos como plataformas de
transporte y liberación de moléculas químicas se ha convertido en una de las más
innovadoras aplicaciones (Vallet-‐Regi, et al., 2007). Así por ejemplo, en biología los
nanodispositivos sirven para controlar un sinnúmero de procesos presentes en
organismos y microorganismos haciendo uso de nanomateriales y nanopartículas
capaces de operar a nivel molecular. Concretamente, una de las aplicaciones de
mayor interés dentro de la nanobiotecnología se centra en el diseño de sistemas de
liberación controlada de fármacos (SLFs) (Slowing, 2008; Sáez, 2002; Fakruddin,
2012). El objetivo principal de la liberación controlada es en conseguir que la cantidad
correcta de agente activo esté disponible en el momento adecuado y en el lugar
preciso (Sáez, 2002). Para ello, será necesario que el sistema responda a un estímulo
específico, de modo que la liberación sea selectiva. A partir de este concepto en bio-‐
medicina por ejemplo, diversos tipos de nanopartículas han sido desarrolladas bien
sea como sistemas de carga y liberación de fármacos, o como plataformas para el
Introducción
10
diagnóstico de enfermedades. En este último caso, la sustancia a liberarse deberán
tener características colorimétricas, puesto que así facilitarán el diagnóstico
diferencial (Bawarski, 2008).
Entre los nanodispositivos más estudiados se encuentran los liposomas funcionales,
los polímeros terapéuticos (micelas poliméricas, dendrímeros, conjugados polímero-‐
proteína o plímero-‐fármaco), los nanocristales, los nanogeles y las nanopartículas
sólidas (Bawarski, 2008).
Aunque tradicionalmente los liposomas y las micelas poliméricas han sido los
sistemas más investigados, ellos presentan inconvenientes como su baja eficiencia de
encapsulación, deficiente reproducibilidad y acelerada liberación de la carga
(Medvedeva, 2007). En respuesta a dichas limitaciones, ha sido necesario centrar las
investigaciones en otros sistemas como los materiales mesoporosos
nanoparticulados. Este tipo de matrices resultan atractivas debido a algunas de sus
características específicas como la alta capacidad de carga, su relativamente fácil
funcionalización, la basta superficie interna que presentan y la estructura ordenada
de sus poros, lo cual les confiere estabilidad térmica y una fuerte resistencia química
(Li et al., 2012).
5. Materiales mesoporosos nanoparticulados
El uso de materiales mesoporosos nanoparticulados como sistemas de liberación
controlada ha resultado interesante en diversas áreas, especialmente dentro de la
nanomedicina. Esto se debe de manera particular a la capacidad que presentan estas
matrices para funcionar como vehículos multifuncionales a la hora de diseñar nuevos
fármacos. En este contexto, los materiales de base silícea son cada vez más utilizados
para la fabricación de nanodispositivos, pues se ha visto que son plataformas de
liberación adecuadas; tanto para su uso diagnóstico, como terapéutico (Bawarski,
2008; Bandow et al., 2009).
Los materiales mesoporosos de sílice (MSN) se encuentran en la familia de materiales
Introducción
11
sintéticos denominada M41S, creada por la compañía Mobil Oil en el año 1992
(Bernardos, 2010). Este tipo de materiales con características de soportes sólidos,
resultaron ventajosos por la configuración ordenada de sus poros y por su capacidad
para absorber (encapsular) cantidades relativamente grandes de moléculas bioactivas
(Slowing et al., 2008; Argyo et al., 2013).
Figura 2. Familia de materiales mesoporosos M41S (Mas-‐Font, 2010)
Un ejemplo significativo de este tipo de materiales es la MCM-‐41 (Mobile Crystalline
Material-‐41), la cual puede encontrarse tanto de forma nanoparticulada como
microparticulada. En el caso que nos ocupa, haremos referencia únicamente a los
soportes sólidos nanoparticulados. Su característica diferencial de los otros sólidos
M41S, es que presentan una fase hexagonal, mientras que los demás miembros de la
familia están constituidos por fases cúbicas (MCM-‐48) o laminares (MCM-‐50). Estos
tres materiales son fácilmente identificables mediante difracción de rayos X
(Bernardos, 2010), como se puede observar en la figura 2.
Los sólidos se obtienen a partir de la polimerización de un precursor inorgánico (como
el tetraetilortosilicato, TEOS, en disolución acuosa) alrededor de las micelas del
surfactante (bromuro de cetiltrimetilamonio, CTABr). En el caso de la matriz MCM-‐41,
las moléculas del surfactante se encuentran asociadas formando un
Introducción
12
empaquetamiento hexagonal a manera de cilindros que tras la eliminación del
surfactante, bien sea mediante calcinación o por extracción, darán lugar las
estructuras mesoporosas deseadas, con poros del orden de 2-‐3 nm (Beck et al., 1992;
Coll, 2010; Kresge et al., 2012).
Una vez formada la matriz mesoporosa, se observa que en la superficie del sólido
permanecen defectos estructurales en forma de grupos silanol (Si-‐OH) los cuales
resultan de gran utilizad a la hora de funcionalizar las nanopartículas (figura 3).
Durante dicha funcionalización, los grupos silanoles son derivatizados mediante
reacciones de substitución nucleofílica con compuestos de tipo trialcoxisilano cuya
cadena alifática contiene el grupo funcional deseado para el recubrimiento de la
superficie (Mas-‐Font, 2010; Climent-‐Terol, 2012).
Figura 3. Representación esquemática de los grupos silanol presentes en la superficie del material
mesoporoso y la posterior reacción de sustitución nucleofílica alifática que tiene lugar en el proceso
de funcionalización de las nanopartículas (Climent-‐Terol, 2012)
El proceso de funcionalización que acabamos de describir puede realizarse durante la
síntesis del material mesopoproso, a lo cual se denomina co-‐condensación, o una vez
ella ha concluido (post-‐síntesis), dependiendo del grado de funcionalización que se
prenda obtener (Bernardos, 2010).
5.1 Propiedades de las nanopartículas mesoporosas de sílice
Primeramente, tienen un tamaño variable (50-‐300 nm), una porosidad homogénea y
un tamaño de poro regulable (2-‐10 nm) (Argyo et al., 2013). Adicionalmente, cabe
destacar la elevada estabilidad de su estructura tridimensional, así como la gran
Introducción
13
superficie específica (500-‐1000 m2/g) que muestran (Mamaeva et al., 2013).
Asimismo, tienen una apreciable inercia química y una alta capacidad de carga. Pero
sin duda, una de sus cualidades más importantes es la biocompatibilidad (Yang,
2012).
De acuerdo a lo detallado anteriormente, las nanopartículas de sílice mesoporosas
son capaces de albergar de manera eficiente especies de interés químico o biológico.
Sin embargo, para que estos soportes híbridos sean capaces de transportar y liberar
de manera controlada la materia contenida en sus poros, ha sido necesario hacer uso
de las denominadas “puertas nanoscópicas moleculares” las cuales describiremos a
continuación.
6. Puertas nanoscópicas moleculares
Hasta hace poco tiempo, la liberación del contenido de los mesoporos resultaba difícil
de manipular. Lo que quiere decir que la sustancia de interés se difundía de manera
espontánea, sin existir un control sobre la cantidad de materia liberada, ni sobre el
momento en que este evento se producía (Slowing et al., 2008).
Figura 4. Representación esquemática de la actividad de una puerta molecular de tipo reversible
(Climent-‐Terol, 2010)
Para dar solución a dicho inconveniente, se ha introducido el uso de las llamadas
puertas nanoscópicas moleculares. Estas estructuras son generalmente moléculas
orgánicas ancladas en la superficie del sólido mesoporoso. De esta manera, el
dispositivo nanoscópico tiene la capacidad de ocluir en sus poros la carga deseada de
!"#$%&'()*+#*,-()
Introducción
14
manera reversible (figura 4). Esto implica que la puerta molecular permanecerá
cerrada únicamente hasta que el nanodispositivo sea sometido a un estímulo externo
capaz de inducir la apertura de la puerta y de esta manera, facilitar la liberación del
contenido de los poros (Mas Font, 2010).
El desarrollo de las puertas moleculares está estrechamente relacionado con la
aplicación de conceptos tanto de química molecular, como supramolecular (Coll,
2013). A diferencia de la química molecular (entendida como la química del enlace
covalente) la química supramolecular, se enfoca en el estudio de sistemas de
agregados moleculares o iones unidos mediante interacciones no covalentes
(electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, puentes
intermoleculares entre otras). Esta disciplina científica, nace con la intención de imitar
la capacidad que tienen las macromoléculas biológicas para formar supramoléculas
mediante procesos de reconocimiento selectivo (Bernardos, 2010). Un ejemplo claro
de ello, es la capacidad que presentan tanto las proteínas como el ADN para
reconocer de manera selectiva a moléculas afines y unirse con ellas para formar
complejos más grandes involucrados en una serie de procesos bioquímicos (Climent-‐
Terol, 2012).
Aplicando estos conceptos al desarrollo de nanodispositivos de interés biomédico, se
consiguió la fabricación de soportes sólidos de tipo MCM-‐41, constituidos por una
fracción inorgánica de base silícea y una superficie externa funcionalizada con
moléculas orgánicas que presentan un comportamiento cooperativo funcional
(puerta molecular) capaces de encapsular diversas especies químicas en sus poros, las
cuales serán liberadas únicamente bajo estímulos externos específicos (Mas Font,
2010).
Los estímulos moleculares que se utilizan para lograr la apertura de la puerta pueden
ser cambios de pH (Chen et al., 2011; Casasús et al., 2004), temperatura (Yu et al.,
2014; Fu et al., 2003) o potencial redox (Slowing et al., 2007) así como, la presencia o
ausencia de proteínas (Oroval et al., 2013), enzimas de restricción (Zhang, 2013),
iones (Climent et al., 2010; Tan et al.,2012) o ácidos nucleicos (Climent et al., 2013).
Introducción
15
Dentro de los sistemas de liberación controlada, el empleo de ácidos nucleicos a
manera de puertas moleculares ha resultado de particular interés ya que, estas
moléculas presentan ventajas funcionales debido a su conformación tridimensional,
su especificidad a la hora del acoplamiento en doble hebra y su robusta estructura
físico-‐química. Cabe destacar, que la atención se ha centrado fundamentalmente en
las estructuras de ADN monocatenarias, bicatenarias y aptaméricas, así como en el
uso ARN y micro ARNs. Por efectos explicativos, el presente trabajo solo detallará el
uso de ADN como puerta molecular.
6.1 Uso de ADN como puerta molecular
A nivel científico el uso ADN se ha extendido en diversos campos de la
nanotecnología. En los últimos años, las investigaciones se han enfocado de manera
reiterada en la inmovilización de ADN en soportes sólidos. Dicha inmovilización puede
lograrse gracias a métodos de adsorción, a la formación de enlaces covalentes (Yu et
al., 2014) o al aprovechamiento de las cargas electrostáticas presentes en las
moléculas de ADN (Climent et al., 2013).
Existen estudios relativamente recientes que han permitido evidenciar que es posible
utilizar oligonucleótidos con la intención de identificar la presencia de
microorganismos bacterianos en una suspensión. En relación a ello, el grupo de
Martínez-‐Mañez en el año 2010, demuestra que al funcionalizar la superficie de un
sólido de tipo MCM-‐41 con grupos amino, el entorno de las nanopartículas adquiere
una carga parcialmente positiva, con lo cual es capaz de establecer interacciones
electrostáticas y de enlace hidrógeno con los oligonucleótidos.
Mediante este mecanismo, el grupo de investigadores logró comprobar que al
interactuar el soporte sólido con un oligonucleótido seleccionado, el colorante
(fluoresceína) queda encapsulado. Para revertir este proceso, es necesaria la
presencia de la cadena complementaria al ADN monocatenario inmovilizado. De
modo que al formar la doble hélice, exista un desplazamiento de la puerta molecular
y esto permita la liberación de la carga (colorante). El sistema descrito es sin duda
Introducción
16
atractivo. No obstante resulta bastante complejo, debido principalmente a lo
dificultoso que puede llegar a ser encontrar el equilibrio adecuado entre cargas
positivas y negativas en la superficie del sólido.
* * *
Como se ha visto a lo largo de este capítulo, aunque el desarrollo de nuevos sólidos
híbridos con función de puerta molecular es un tema de gran actualidad y rápido
avance, todavía se encuentra en una etapa primaria de desarrollo. Sin embargo, a lo
largo de los últimos años estas sofisticadas arquitecturas han demostrado ser
excelentes candidatas para el diseño de nanodispositivos encargados de la liberación
controlada de diversas especies a distintos niveles. Es así que, una aplicación
interesante para estos dispositivos es su incorporación en el campo del diagnóstico
específico de patógenos de interés clínico; en cuyo caso, el reconocimiento molecular
estaría acoplado a procesos de liberación controlada.
En el desarrollo de estas plataformas, la presencia del microorganismo que se
pretenda identificar, provocará el desplazamiento de la puerta molecular, lo que de
manera inmediata, dará lugar la liberación del indicador, el cual producirá una
respuesta óptica cuantificable.
Considerando lo anterior y debido a la problemática existente con respecto a la
detección de bacterias del género Mycoplasma haciendo uso de las técnicas
convencionales, se pensó en desarrollar un sistema sensor encargado de revelar la
presencia de estas bacterias de manera específica. Para llevar a cabo este propósito,
se pretende elaborar un nuevo soporte mesoporoso de tipo MCM-‐41 recubierto con
una puerta molecular oligonucleotídica, anclada mediante enlaces covalentes y capaz
de liberar la carga confinada en su interior únicamente en presencia del ADN
específico del género Mycoplasma; en cuyo caso, generará una señal detectable
mediante espectroscopia de fluorescencia la cual, permitirá diagnosticar la presencia
de este patógeno en la muestra analizada.
II. Objetivos
Objetivos
20
1. Diseñar, sintetizar y caracterizar un soporte nanoparticulado mesoporoso de
tipo MCM-‐41 que sirva para la detección específica de bacterias del género
Mycoplasma.
2. Estudiar la efectividad diagnóstica del sistema empleando ADN genómico de
Mycoplasma fermentans.
3. Identificar el límite de detección del nanodispositivo diseñado.
4. Comprobar la especificidad del sistema al evaluar la apertura de la puerta en
presencia de ADN interferente procedente de Candida albicans y Legionella
pneumophila.
5. Haciendo uso del nanodispositivo diseñado, analizar muestras clínicas de
esputo previamente diagnosticadas mediante PCR y comparar los resultados
obtenidos.
III. Materiales y Métodos
Materiales y métodos
24
1. Síntesis de los materiales MCM-‐41, S1-‐Rodamina, S1-‐Pneumo
1.1 Reactivos
Los reactivos tetraetilortosilicato (TEOS) 98%, hidróxido de sodio (≥98%), rodamina B,
bromuro n-‐cetiltrimetilamonio (CTABr) (≥99%), cloruro de magnesio hexahidratado
(MgCl2.6 H2O), α,α,α-‐Tris-‐(hidroximetil)-‐metilamina (Tris) (≥99%) y los