iQ-Check Salmonella II Manual

iQ-Check™ Salmonella II KitCatalog #: 357-8123

User Guide

Test for the real-time PCR detection of Salmonella spp.in food, animal feed and environmental samples

TABLE OF CONTENTS

I. Introduction

II. iQ-Check Salmonella spp. technology

III. Kit components

IV. Shelf life and storage

V. Material required but not supplied

VI. Precautions and recommendations

VII. ProtocolA. Sample enrichmentB. DNA extractionC. Real-time PCRD. Data analysis

VIII. Confirmation of positive results

IX. Confirmation of single colonies using iQ-Check

X. Test performances and validations

XI. References

APPENDIX A: PCR Mix Calculation Guide

2 © 2008 Bio-Rad

I. INTRODUCTIONSalmonellae are the most frequent causes of food poisoning in the world,despite the many preventive measures taken to control these organisms. Inthe United States and other industrialized countries, declared cases ofsalmonellosis vary around 70,000-100,000, however the true incidence offood-borne Salmonella infection is estimated to be much higher, in the orderof 4-5 million cases a year. Eggs, dairy products, meat and poultry are themost common foods associated with the transmission of Salmonellae (65%of cases). More than 2000 serotypes have been identified, all of which arepotentially pathogenic to man. Due to the low infective dose and the seriousthreat posed to producers and consumers of food, several countries nowrequire total absence of salmonellae in food products.Conventional bacteriological methods are often long and tedious. Incomparison, iQ-Check Salmonella II is a simple and rapid qualitative test,allowing the detection of specific DNA sequences unique to Salmonellaspp. found in food products, animal feed and environmental samples.Using real-time polymerase chain reaction (PCR), Salmonella spp. specificDNA sequences are amplified and detected simultaneously by means offluorescent probes. Up to 94 samples can be processed, with a minimizedrisk of contamination and an easy to use procedure. The use of this testallows results to be obtained within a few hours following pre-enrichmentof a sample. The intended users of this kit are trained laboratory personnelwho are performing tests to detect Salmonella spp.

II. THE iQ-Check Salmonella II TECHNOLOGYThe iQ-Check Salmonella II kit is a test based on gene amplification anddetection by real-time PCR. Ready-to-use PCR reagents contain DNA primersand a DNA probe specific for Salmonella spp., as well as DNA polymeraseand nucleotides. Detection and data analysis are optimized for use with aBio-Rad real-time PCR instrument, such as the Chromo4™ System andMiniOpticon™.PCR is a powerful technique used to generate many copies of target DNA.During the PCR reaction, several cycles of heating and cooling allow DNAdenaturation, by heat, followed by primers binding to the target region.The DNA polymerase then uses these primers and deoxynucleotidetriphosphates (dNTPs) to extend the DNA, creating copies of the targetDNA. These copies are called amplicons.In real-time PCR, specific probes are used to detect the DNA during theamplification, by hybridizing to the amplicons. These probes are linked toa fluorophore which fluoresces only when hybridized to the target

3© 2008 Bio-Rad

sequence; in the iQ-Check Salmonella kits, FAM is the fluorophore linkedto the probe hybridizing to the Salmonella spp. specific DNA sequence. Inthe absence of target DNA, no fluorescence will be detected, and thesample determined to be negative. As the amount of amplicons increaseswith each round of amplification, fluorescence intensity also increases.During each PCR cycle, at the annealing step, the optical module ordetector measures this fluorescence, whereas the associated software plotsthe fluorescence intensity versus number of cycles. This method allows asimple determination of the presence of Salmonella spp in a sample.To monitor for a successful DNA amplification in each reaction tube, asynthetic DNA "internal control" is included in the reaction mix. This controlis amplified with a specific probe at the same time as the Salmonella targetDNA sequence, and detected by a second fluorophore.This test allows the detection of Salmonella spp. in all food products, animalfeed and environmental samples previously enriched by culture (18h ± 2h ,or8h for raw meats) in buffered peptone water. It includes the following fourmain steps:

III. KIT COMPONENTS

The iQ-Check Salmonella II kit contains sufficient reagents for 96 tests.

IV. SHELF LIFE AND STORAGEOnce received, the kit must be stored between +2°C and +8°C. Reagentsstored between +2°C and +8°C can be used until the expiration dateindicated on the reagent tube.

4 © 2008 Bio-Rad

ENRICHMENT DNA EXTRACTION REAL-TIME PCRDATA ANALYSIS &INTERPRETATION

Reference ID Reagent Quantity Provided

A Lysis reagent 1 bottle (20 ml)

B Fluorescent probes 1 tube (0.55 ml)

C Amplification mix 2 tubes (2 x 2.2 ml)

D PCR negative control 1 tube (0.5 ml)

E PCR positive control 1 tube (0.25 ml)

V. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED

Equipment:• Bio-Rad real-time PCR system, eg Chromo4 or MiniOpticon™ Systems.

See real-t ime PCR system user guide for iQ-Check kits(Chromo4™/MiniOpticon™ #: 93269, Rev. B - iQ™5 #: 93270, Rev. A - iCycleriQ™ #: 93271, Rev. A)

• Stomacher®, masticator or equivalent for homogenizing test samples• Incubator, capable of maintaining 37°C ± 2°C• Dry Heat block, for 1.5 ml tubes and/or for 96-well plates (100°C ± 5°C),• Bench top centrifuge (maximum 10,000-12,000 g, for 1.5 ml tubes)• Optional: centrifuge with rotor for 96-well plates or 8-tube strips (max 2,000 g)• Vortex apparatus• Magnetic stir plate• 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipettes• Combitip pipettes, or equivalent repeat pipettors • Optional for extraction with grinding step (Standard protocol II only):

- Cell Disruptor, such as a “Disruptor Genie”* (Scientific Industries),Bio-Rad cat #: 359-1456

* Contact Bio-Rad for detai led information on instrumentsrecommended by our technical department

Note: We recommend using a universal power source (UPS) with thethermal cycler.

Supplies• PCR plates, tubes, sealing tape and caps, see real-time PCR system

user guide for iQ-Check kits • Optional for extraction:

- 96-well plate “full-profile”, (Bio-Rad cat.#: 223-9441)- 8 tube-strip 200μl “full-profile”, (Bio-Rad cat. #: 223-9469)- 8-cap strips; for 0.2 ml tubes and plates, ultraclear, 120 cap-strips

(Bio-Rad cat. #: TCS-0803)• Pre-enrichment medium: buffered peptone water, (Eg. Bio-Rad cat. #:

356-4684 for 500 g; 355-4179 for 225 ml x 6 bottles; 355-5789 for2.3 L x 5 bags; 355-5790 for 5 L x 2 bags)

• RAPID’Salmonella agar** (Eg. Bio-Rad cat #: 356-3961 for 90 mm X 20dishes; 356-4705 for 500 g; 356-4706 for 100 g)** Can be used outside scope of AOAC-RI validation.

• Lysis beads (reagent F - for Standard Protocol II only) Bio-Rad cat. #:357-8136

5© 2008 Bio-Rad

• Stomacher bag with incorporated filter• 1 ml and 10 ml pipettes• Sterile filter tips, adaptable to 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipettes • 1.5 ml conical screwcap sterile tubes (E.g. Bio-Rad cat.#: 224-0110)• Tips for Combitip pipettes or equivalent repeat pipettors, sterile, individual

package• 2 ml and 5 ml sterile test tubes• Powder-free gloves• Distilled sterile water• Bleach 5%• Cleaning agent such as DNA AWAY® or RNase AWAY®

VI. PRECAUTIONS AND RECOMMENDATIONS FOR BEST RESULTS• This test must be performed by adequately trained personnel.• Food samples and enrichment cultures must be handled as potentially

infectious material and eliminated according to local rules and regulations.• All potentially infectious material should be autoclaved before disposal.• The quality of results depends on strict compliance with the following

Good Laboratory Practice, especially concerning PCR:- The laboratory equipment (pipettes, tubes, etc.) must not circulate

from one work station to another.- It is essential to use a positive control and a negative control for each

series of amplification reactions.- Do not use reagents after their expiration date.- Vortex reagents from the kit before using them to ensure

homogeneity.- Periodically, verify the accuracy and precision of pipettes, as well as

correct functioning of the instruments.- Change gloves often, especially if you suspect they are contaminated.- Clean work spaces periodically with at least 5% bleach and other

decontaminating agent such as DNA AWAY®.- Use powder-free gloves and avoid fingerprints and writing on caps

of tubes. Both cases will interfere with data acquisition.• It is strongly advised to follow the general requirements described in the

standard EN ISO 22174:2005 “Microbiology of food and animal feedingstuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of foodpathogens – General requirements and definitions”

6 © 2008 Bio-Rad

VII. PROTOCOLIt is strongly recommended to read the entire protocol before starting the test.The following table outlines the different protocols that can be useddepending on the application and the scope of the validation:

* Protocol used when also detecting E.coli O157:H7 from the same raw ground beef sample.

A. Sample EnrichmentEnrichment media must be at the appropriate incubation temperaturebefore use.Homogenize 25 g of sample in 225 ml of pre-heated buffered peptonewater, in a stomacher bag with incorporated filter.

Standard protocol I- Incubate without shaking for 18 hours ± 2 hours at 37° C ± 1°C.- Collect 1 ml of decanted, enriched suspension into a 1.5 ml conical tube

with screw cap. See DNA extraction below.

Standard protocol II- Incubate without shaking for 10 hours ± 2 hours, at 37° C ± 1°C**-Collect 1.0 ml of decanted, enriched sample using a disposable 1 mlpipette, into a 1.5 ml conical tube with screw cap. See DNA Extractionbelow (Standard protocol II).

** Within the scope of the AOAC-RI validation, incubate at 36°C ± 1°C.

Easy protocols I and II- Incubate without shaking for 21 hours ± 1 hour at 37° C ± 1°C.- Collect 100 µl of decanted, enriched suspension into a 1.5 ml conical

tube with screw cap, tube-strip or well in 96-well plate containing thelysis reagent. See DNA extraction below (Easy protocol).

7© 2008 Bio-Rad

Protocol Enrichment Certification Scope

Standard I 18h ± 2h, 37°C AFNOR VALIDATIONFood products, animal feed, & environmentalsamples

Easy I 21h ± 1h, 37°C AFNOR VALIDATIONFood products, animal feed, & environmentalsamples

Standard II 8h , 37°C AFNOR VALIDATION Raw meats

Easy II 21h ± 1h, 37°C AFNOR VALIDATION Raw beef *

Easy I 21h ± 1h, 37°C AOAC-RI Eggs, raw chicken, raw beef, cantaloupe

Standard II 8h, 36°C AOAC-RI Raw ground beef *

Note: Do not shake the suspension before collecting sample, except forthe Standard protocol II and Easy protocol II, in which case it is importantto shake the suspension to homogenize the culture and then allow anydebris to decant before collecting the sample. In general, avoid collectinglarge fragments of food debris. For food samples with a fatty supernatant,collect the sample just below this layer.

B. DNA Extraction

Before starting the test:

* Reagent F (lysis beads) is included in the iQ-Check E.coli O157:H7 kit orcan be ordered separately.

Standard protocol I1 - Centrifuge collected 1 ml enriched sample at 10,000-12,000 g. for 5

minutes.2 - Discard all the supernatant.3 - Add 200 μl of the lysis reagent (reagent A) to the pellet.

Note: Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on amagnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the resin.

4 - Resuspend pellet by pipetting the reagent up and down in the tube.5 - Vortex at high speed.6 - Place the tube in the heat block at 95°C - 100°C for 10 to 15 minutes.7 - Vortex at high speed.8 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for 5 minutes.

Preheat dry heat block Turn on heat block and set it to 95°C - 100°C

Prepare lysis reagent

Standard protocol I and Easy protocol I: use lysis reagent A asprovided.

Standard protocol II and Easy protocol II:Reconstitute the final lysis reagent as follows:• Carefully pour all the contents from reagent F† (lysis beads) into

reagent A (lysis reagent) • The lysis reagent mixed with lysis beads (reagents A + F) has a shelf

life of 6 months, when stored at 4°C.

8 © 2008 Bio-Rad

Standard protocol II (includes grinding step)1 - Centrifuge collected 1.0 ml enriched sample at 10,000-12,000 g for 5

minutes.Discard all the supernatant.

2 - Add 200 μl of the final lysis reagent (reagents A + F) to the pellet.

Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads.Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stirplate, in order to keep it in suspension and collect the beads. Use consumableswith a wide enough tip to allow pipetting of the homogenized lysis reagent.

3 - Resuspend pellet by pipetting the reagent up and down in the tube.4 - Place tube in the Cell Disruptor for 3 min ± 1min.5 - Place tube in the heat block at 95°C - 100°C for 10 to 15 minutes.6 - Vortex at high speed.7 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for 5 minutes.

Easy protocol I1- Aliquote 100 µl of homogenized lysis reagent to the 1.5 ml screw

cap tubes, tube-strips or wells in 96-well “full-profile” plate that will beused for the DNA extraction.

Note: Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on amagnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the resin.

2 - Add 100 μl of the enriched suspension to 100 μl of the lysis reagent. Mixthe solution by pipetting up and down in the tube and close with caps.

3 - Incubate in heat block at 95°C - 100°C for 10 to 15 minutes.4 - Vortex at high speed (for tubes).5 - If using tube-strips or a plate, allow to cool down to room temperature6 - Centrifuge at 10,000-12,000 g at least 2 minutes for 1.5 ml screw cap

tubes (2,000 g for plates and tube-strips for 1 minute). Open tubestr ips or wel ls in plate careful ly, one by one, to avoidcross-contaminations between wells.

9© 2008 Bio-Rad

Easy protocol II (includes grinding step)1 - Aliquote 100 μl of reconstituted and homogenized lysis reagent

(reagents A + F) to the 1.5 ml screw cap tubes that will be used for theDNA extraction.

Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads.Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stirplate, in order to keep it in suspension and collect the beads. Use consumableswith a wide enough tip to allow pipetting of the homogenized lysis reagent.

2 - Add 100 μl of the enriched suspension. Mix the solution by pipettingup and down in the tube until homogenized.

3 - Place tube in the Cell Disruptor for 3 min ± 1min.4 - Incubate in the heat block at 95°C - 100°C for 10 to 15 minutes.5 - Vortex at high speed, for a few seconds.6 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for at least 2 minutes.

For all extraction protocols:• Open tubes carefully to avoid any possible cross contaminations.• For the amplification reaction, use 5 µl of the supernatant obtained,

containing the DNA extract* (do not vortex before collecting 5 μl sample).*At this step:For samples showing inhibition on a previous test, perform a 1/10 dilutionin distilled sterile water, using 10 ul of DNA extract. Then use 5 μl of theappropriate dilution for amplification1.• The remaining supernatant can be stored for up to 1 year at -20°C.

Before reusing the supernatant, always allow it to thaw, then centrifuge itat 10,000-12,000 g for 5 minutes.

If you choose to temporarily stop the procedure, this is the recommendedstopping point.

1 In the scope of the AFNOR certified method for samples showing inhibition with a 1/10 dilution of theDNA extract, it is possible to remove this inhibition by using the following modified enrichment protocol:

- Homogenize 25 g of sample in 225 ml of buffered peptone water, in a stomacher bag withincorporated filter.

- Incubate without shaking for 18h ± 1 hour at 37°C.- Mix the suspension, collect 20 μl and add it to 1 ml of buffered peptone water (warmed to

37°C), in a 1.5 ml conical screw cap tube.- Incubate without shaking for 4h ± 1 hour at 37°C.- Carry out the iQ-Check test by centrifuging directly this tube containing the secondary

enrichment and following the standard extraction protocol I.

10 © 2008 Bio-Rad

C. Real-time PCR

1. Instrument and software setupFor instrument and software setup, follow instructions in the real-time PCRsystem user guide for iQ-Check kits.

2. PCR mix preparation2.1 Prepare a PCR mix containing the amplification solution (reagent C)

and the fluorescent probes (reagent B) according to the PCR mixcalculation guide found in Appendix A. To find the correct volumes touse, add the total number of samples and controls to be analyzed,and find the corresponding volumes in the table. At least one positiveand one negative control must be included in each PCR run.

2.2 After preparation, the PCR mix (reagent B + C) must be used immediatelyor is stable for 1 hour at 4°C.

2.3 Pipette 45 µl of this PCR mix in each well according to your platesetup.

2.4 Add 5 µl of sample or reagent D (negative control) or reagent E(positive control) and seal the wells. It is important to avoid bubbles atthe bottom of the wells by pipetting carefully. To eliminate any bubbles,centrifuge the sealed PCR plate or the PCR strips (quick spin).

2.5 Place the plate or strips in the thermal cycler. Be sure to place the platecorrectly: A1 well at the upper left corner. Close the reaction module.

3. PCR StartTo start the PCR run, follow instructions in the real-time PCR system userguide for iQ-Check kits.

D. Data Analysis

Data can be analyzed directly at the end of the PCR run or at a later timeby opening the stored data file. Follow instructions in the correspondingreal-time PCR system user guide for iQ-Check kits, for opening data filesand setting the data analysis parameters.

11© 2008 Bio-Rad

1. Interpreting ResultsOnce the data analysis parameters have been set, results are interpretedby analyzing the Ct values of each sample (the cycle at which theamplification curve crosses the threshold).

It is also possible to use the software iQ-Check Analysis (cat. # 359-3135)for an automated interpretation and report generation of all data (seeiQ-Check Analysis user guide). A complete automated analysis is availablewith the Opticon Monitor Software, for the Chromo4 and MiniOpticonsystems (see Chromo4 and MiniOpticon User Guide for iQ-Check kits, #:93269, Rev. B).

1.1 Controls:Before interpreting sample results, it is necessary to verify the positive andnegative controls.

For the experiment to be valid, the controls must have the followingresults, as summarized in the table below, otherwise the PCR reactionneeds to be repeated.

* The software indicates a Ct value of N/A (not applicable) when the fluorescence of a sample doesnot rise significantly above the background noise, and hence does not cross the threshold.

1.2 Samples:A positive Salmonella sample must have a Ct value ≥ 10 for the FAM

fluorophore.

If the Ct value is below 10, verify that as raw data the curve is a regularamplification curve (with a flat base line, followed by a rapid increase offluorescence and then a flattening out). If the curve seems correct, it maybe considered a positive Salmonella sample.

If there is no Ct value (Ct=N/A) for FAM, or the curve is not a typicalamplification curve, the internal control for that sample must then be analyzed:- This sample is considered as a negative Salmonella sample if there is no

Ct value in FAM, and the internal control has a Ct ≥ 28.

Salmonella detection (FAM) Internal Control detection

Negative control Ct = N/A* 28 ≤ Ct ≤ 40

Positive control 26 ≤ Ct ≤ 36 Not significant

12 © 2008 Bio-Rad

- Should the internal control also not have a Ct value (Ct = N/A), then it isnot possible to interpret the result. Such a result probably indicates aninhibition of the PCR reaction. The sample needs to be diluted (1/10, indistilled sterile water), and the PCR repeated (see section VII.B. DNAextraction).

- Should the Ct value for the internal control be < 28 it is not possible tointerpret the result. Verify that the threshold was correctly placed, or that thecurve as raw data is a regular amplification curve. If the curve does not havea characteristic shape, it will be necessary to repeat the PCR test.

Interpretation of sample results is summarized in the following table:

** When both Salmonella and internal control detection give a Ct value = N/A, the sample must betested again but diluted (1/10).

VIII. CONFIRMATION OF POSITIVE RESULTSIn the context of the AFNOR VALIDATION certified method, all positiveiQ-Check Salmonella II results need to be confirmed in one of two ways:

1. Using standard tests described in the standardized CEN or ISOmethods (including the purification step). For the confirmation test, it isnecessary to start from the buffered peptone water enrichment brothafter the full 18h ± 2h enrichment at 37°C.

2. Using any other method certified AFNOR VALIDATION and based on aprinciple different from that used in the iQ-Check Salmonella II PCR test,for example the chromogenic medium RAPID’Salmonella. The validatedprotocol of this second method must be followed entirely; theconfirmation is carried out from the buffered peptone water enrichmentbroth, if this step is common to both methods.

In the event of results that are not in agreement, between iQ-CheckSalmonella II and one of the confirmation options listed above, the laboratoryshould follow the necessary steps to ensure the validity of their results.

Salmonella detection (FAM) Internal control detection Interpretation

Ct ≥ 10 Not significant Positive

Ct = N/A Ct ≥ 28 Negative

Ct = N/A Ct = N/A Inhibition**

13© 2008 Bio-Rad

It is possible to store the enriched buffered peptone water between +2°Cand +8°C for 48 hours maximum, following the last incubation at 37°C.

In the context of AOAC-RI validation, a positive iQ-Check Salmonella IIresult is considered presumptive positive and it is recommended it beconfirmed according to the USDA MLG standard method (available onlineat http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf ) or FDA BAM standardmethod (available online at http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html)

IX. CONFIRMATION OF SINGLE COLONIES USING iQ-CHECK

iQ-Check Salmonella II may also be used for confirming single isolatedSalmonella colonies on agar plates.

1. Pick an isolated colony, from an agar plate, selective or non-selective, with atooth-pick or sterile loop, or other adapted consumable (e.g. pipette tip).

2. Resuspend the colony in 100 μl tryptone salt or distilled sterile water ina microfuge tube. Homogenize using a vortex,

3. Use 5 μl of the supernatant with 45 μl of PCR mix (see section VII.CReal-time PCR) and follow the rest of the iQ-Check Salmonella IIprotocol for the data and result interpretation.

X. TEST PERFORMANCES AND VALIDATIONSiQ-Check Salmonella II is specific for the Salmonella genus. With this kit itis possible to detect 1-10 CFU/25 g sample, according to therecommended enrichment.

14 © 2008 Bio-Rad

AFNOR VALIDATIONiQ-Check Salmonella II is certified by AFNORVALIDATION as an alternative method to the referencemethod NF EN ISO 6579 (2002), for the detection ofSalmonella spp. in all products for human and animalconsumption, as well as environmental samples. Thevalidation followed the protocol of the NF EN ISO16140: 2003 standard, and includes the use of theiCycler iQ™ Chromo4™, iQ™5 and MiniOpticon™systems. Certificate number: BRD 07/06 – 07/04.Valid until 01/07/2012.

AOAC-RI VALIDATION

iQ-Check Salmonella II (Easy protocol I) is validatedby AOAC-Research Institute under the PerformanceTested Method Program for detection of Salmonellaspp. in eggs, raw chicken, raw beef and cantaloupe.Standard protocol II is also validated by AOAC-RI forthe simultaneous detection of Salmonella spp. andE.coli O157:H7 in raw ground beef. A positive resultwith iQ-Check should be considered presumptiveand it is recommended it be confirmed by standardreference methods. (See 3 and 4, section XI).Certificate number: 010803.

XI. REFERENCES1 - Miras, I., Hermant, N., Arricau, N., and Popoff, M.Y.1995. Nucleotide

sequence of iagA and iagB genes involved in invasion of HeLa cells bySalmonella enteritica subsp. Enteritica ser. Typhi. Research inMicrobiology. 146. 17-20.

2 - Standard NF EN ISO 6579. Microbiology of food and animal feeding stuffs– Horizontal method for the detection of Salmonella spp. December 2002.

3 - United States Department of Agriculture, Food Safety and InspectionService. Microbiology Laboratory Guidebook – Chapter 4.03. Isolationand Identification of Salmonella from Meat, Poultry and Egg Products.October 1, 2004. On line at http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf

4 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety andApplied Nutrition. Bacteriological Analytical Manual - Chapter 5. Salmonella.June 2006. On line at http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

15© 2008 Bio-Rad

BRD 07/06 – 07/04

ALTERNATIVE ANALYSYSMETHODS FOR AGRIBUSINESS

Certified by AFNOR Certificationwww.afnor-validation.org

Notice to purchaser: limited licenseUse of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patentclaims outside the US: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152 (claims 1 to 23 only)and 5,773,258 (claims 1 and 6 only), and claims outside the US corresponding to US Patent No.4,889,818. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit underthe foregoing patent claims for using only this amount of product solely in Food testing, Environmentaltesting, and Industrial microbiology, including reporting results of purchaser's activities for a fee or othercommercial consideration, and also for the purchaser’s own research. No right under any patent claim(such as the 5’ Nuclease Process claims in US Patent Nos. 5,210,015 and 5,487,972) is conveyedexpressly, by implication, or by estoppel. Further information on purchasing licenses may be obtainedby contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City,California 94404, USA.

16 © 2008 Bio-Rad

APPENDIX A- PCR Mix Calculation GuideTo find the correct volumes to use when preparing the PCR mix, add thetotal number of samples and controls to be analyzed, and find thecorresponding volumes of reagent B and reagent C in the table.

17© 2008 Bio-Rad

Total number ofsamples & controls

ProbesReagent B (µl)

Amplification mixReagent C (µl)

Total number ofsamples & controls

ProbesReagent B (µl)

Amplification mixReagent C (µl)

1 5 40 49 265 21002 11 86 50 270 22003 16 130 51 275 22004 22 173 52 281 22005 27 216 53 286 23006 32 259 54 292 23007 38 302 55 297 24008 43 346 56 302 24009 49 389 57 308 250010 54 432 58 313 250011 59 475 59 319 250012 65 518 60 324 260013 70 562 61 329 260014 76 605 62 335 270015 81 648 63 340 270016 86 691 64 346 280017 92 734 65 351 280018 97 778 66 356 290019 103 821 67 362 290020 108 864 68 367 290021 113 907 69 373 300022 119 950 70 378 300023 124 994 71 383 310024 130 1000 72 389 310025 135 1100 73 394 320026 140 1100 74 400 320027 146 1200 75 405 320028 151 1200 76 410 330029 157 1300 77 416 330030 162 1300 78 421 340031 167 1300 79 427 340032 173 1400 80 432 350033 178 1400 81 437 350034 184 1500 82 443 350035 189 1500 83 448 360036 194 1600 84 454 360037 200 1600 85 459 370038 205 1600 86 464 370039 211 1700 87 470 380040 216 1700 88 475 380041 221 1800 89 481 380042 227 1800 90 486 390043 232 1900 91 491 390044 238 1900 92 497 400045 243 1900 93 502 400046 248 2000 94 508 410047 254 2000 95 513 410048 259 2100 96 518 4100

18 © 2008 Bio-Rad

19

iQ-Check™ Salmonella II KitRéf. : 357-8123

Notice d’utilisation

Test pour la détection par PCR en temps réel dessalmonelles dans les produits d’alimentation humaineet animale, et les échantillons d’environnement

20 © 2008 Bio-Rad

SOMMAIRE

I. Introduction

II. Principe

III. Composition du kit

IV. Validité et conservation

V. Matériel nécessaire non fourni

VI. Précautions et recommandations

VII. ProtocoleA. Enrichissement de l’échantillonB. Extraction de l’ADNC. PCR en temps réelD. Analyse des données

VIII. Confirmation des résultats positifs

IX. Protocole de confirmation à partir de colonies isolées

X. Performances du test et validations

XI. Bibliographie

ANNEXE A : Tableau de pipetage

I. INTRODUCTIONLes salmonelles sont toujours en tête de liste des toxi-infectionsalimentaires en dépit des nombreuses actions préventives menées contreelles. En France, dans 85% des cas de toxi-infections alimentairescollectives déclarées où l'agent responsable est identifié, Salmonella a étémis en évidence. Les œufs et ovoproduits, viandes et volailles, sont lesaliments qui le plus souvent transmettent des salmonelles (65% des cas).On a dénombré plus de 2000 sérotypes, tous potentiellement pathogènespour l'homme. La réglementation française et européenne exige uneabsence de salmonelles dans 25 g d'aliments.Face à la méthode bactériologique traditionnelle souvent longue etcoûteuse, la méthode iQ-Check Salmonella II est un test qualitatifpermettant la détection spécifique de Salmonella spp. dans les produitsd’alimentation humaine, animale et les échantillons d’environnement parRéaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) en temps réel. Une séquenced’ADN spécifique du genre Salmonella est amplifiée et détectéesimultanément grâce à une sonde fluorescente. Jusqu'à 94 échantillonspeuvent être analysés avec un risque minimum de contamination et uneprocédure facile d’utilisation. L’utilisation de ce test est destinée aupersonnel de laboratoire qualifié, dans le cadre de la recherche deSalmonella spp. La mise en oeuvre de ce test permet l'obtention d'unrésultat dès le lendemain de la mise en pré-enrichissement.

II. PRINCIPECe test repose sur l’amplification génique et la détection par la technique dePCR en temps réel. Il utilise des amorces et une sonde d’ADN spécifiques deSalmonella spp. La détection et l’analyse des résultats sont optimisées pourl’utilisation avec un thermocycleur pour la PCR en temps réel Bio-Rad, tel quele Chromo4™ et MiniOpticon™.

Au cours de la réaction de PCR, les amorces vont se lier à la région cible puis,la polymérase catalyse leur extension dans le sens 5’-3’ en utilisant lesdésoxynucléotides triphosphates (dNTPs), créant ainsi une séquencecomplémentaire d’ADN, appelée “amplicon”.

Pendant la PCR, des sondes spécifiques vont s’hybrider aux amplicons. Cessondes, marquées par des fluorophores, émettent de la fluorescenceuniquement quand l’hybridation a lieu. La sonde qui se lie à la séquence ciblede Salmonella spp. est marquée par le fluorophore FAM. L’intensité defluorescence augmente proportionnellement à l’augmentation de la quantité

21© 2008 Bio-Rad

des produits d’amplification dans le tube de PCR. La fluorescence est mesuréedirectement par le module optique du thermocycleur. Le logiciel associé àl’appareil calcule automatiquement la relation entre l’intensité de lafluorescence et le cycle d’amplification. Cette relation indique la présence, oul’absence, de Salmonella dans l’échantillon.

Un ADN synthétique appelé “Contrôle interne” est ajouté à chaque réaction. Ilest amplifié en même temps que la séquence cible de Salmonella, mais estdétecté par une sonde marquée avec un deuxième fluorophore.

Ce test permet la détection de Salmonella dans tous les produits d’alimentationhumaine et animale et les échantillons d’environnement préalablement enrichisen eau peptonée tamponnée (18h ± 2h, ou 8h pour viandes crues). Laméthode est composée des étapes suivantes :

III. COMPOSITION DU KIT

Ce kit contient la quantité de réactif nécessaire pour 96 réactions.

IV. VALIDITÉ ET CONSERVATIONDès réception, le kit doit être conservé entre +2°C et +8°C. Chaque réactifconservé entre +2°C et +8°C peut être utilisé jusqu'à la date depéremption indiquée sur le tube.

Référence Réactif Volume

A Réactif de lyse 1 flacon (20 ml)

B Sondes fluorescentes 1 tube (0,55 ml)

C Solution d’amplification 2 tubes (2 x 2,2 ml)

D Contrôle PCR négatif 1 tube (0,5 ml)

E Contrôle PCR positif 1 tube (0,25 ml)

22 © 2008 Bio-Rad

ENRICHISSEMENT EXTRACTION ADNPCR EN TEMPS

REELANALYSE &

INTERPRETATION

V. EQUIPEMENTS ET MATERIEL NECESSAIRES NON FOURNIS

Equipement• Thermocycleur Bio-Rad pour la PCR en temps réel, tel que le Chromo4

et MiniOpticon™. Cf. manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pourles kits iQ-Check (Chromo4™/MiniOpticon™ Réf. : 93269, Rev. B - iQ™5 Réf. :93270, Rev. A - iCycler iQ™ Réf. : 93271, Rev. A).

• Stomacher®, homogénéiseur ou equivalent• Etuve (37°C ± 2°C)• Bloc chauffant (100°C ± 5°C), pour tubes coniques de 1,5 ml et/ou

plaque PCR de 96 puits• Centrifugeuse de paillasse (max. 10.000 à 12.000 g, pour tubes 1,5 ml)• En option: centrifugeuse avec rotor pour plaque ou barrette (max. 2.000 g)• Vortex• Agitateur magnétique• 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipettes• Multi-distributeur, tel que combitips pipettes• En option pour protocole d’extraction Standard II (avec étape de broyage) :

- Agitateur vibrant, tel que “Disruptor Genie”* (Scientific Industries),Réf. Bio-Rad : 359-1456

* Nous consulter pour une information précise concernant lesappareils recommandés par nos services techniques.

Remarque : Nous recommandons l’utilisation d’un onduleur électriqueavec le thermocycleur

Consommables• Pour les plaques et tubes PCR, film et capuchons se reporter au manuel

utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check.• En option pour l’extraction :

- Plaque de 96 puits “full-profile”, réf. Bio-Rad: 223-9441.- Barrettes de 8 tubes de 200μl “full-profile”, Réf. Bio-Rad: 223-9469- Barrettes de 8 capuchons optiques plats, pour tubes ou plaques de

puits de 0,2 ml, 120 barrettes Réf. Bio-Rad : TCS-0803.• Milieu de pré-enrichissement : eau peptonée tamponnée (Exemple Réf.

Bio-Rad: 356-4684 pour 500 g; 355-4179 pour 225 ml x 6 flacons ;355-5789 pour 2.3 L x 5 poches ; et 355-5790 pour 5 L x 2 poches)

• Gélose RAPID’Salmonella* (Réf Bio-Rad : 356-3961 pour 90 mm x 20boites ; 356-4705 pour 500 g ; 356-4706 pour 100 g).* Utilisable hors du cadre de la validation AOAC-RI.

23© 2008 Bio-Rad

• Billes de lyse (réactif F, pour le Protocole Standard II) Réf. Bio-Rad 357-8136.• Sac à stomacher avec filtre incorporé.• Pipettes de 1 ml et 10 ml• Embouts à filtre stériles, adaptables sur les micropipettes de 20 μl, 200 μl

et 1000 μl• Tubes à vis coniques de 1.5ml, stériles, (Exemple Réf. Bio-Rad: 224-0110)• Pointes pour Combitip ou multi-distributeur, stériles à emballage individuel• Tubes stériles de 2 ml et de 5 ml• Gants non poudrés• Eau distillée stérile• Eau de javel 5%• Agent décontaminant tel que DNA AWAY® ou RNAse AWAY®

VI. PRECAUTIONS ET RECOMMANDATIONS• Cet essai doit être réalisé par des personnes ayant reçu une formation

adéquate.• Les échantillons d'aliments et les cultures d'enrichissement doivent être

manipulés comme des matières potentiellement infectieuses et éliminésselon les réglementations locales.

• Tous les déchets potentiellement infectieux doivent être autoclavésavant élimination.

• La qualité des résultats dépend du respect scrupuleux des BonnesPratiques de Laboratoire, en particulier en matière de PCR :

- Le matériel (pipettes, tubes etc...) ne doit pas circuler d'un poste à l'autre.- Il est indispensable d'utiliser un contrôle positif et un contrôle négatif

pour chaque série de réactions d'amplification.- Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption.- Vortexer les réactifs du kit avant leur utilisation pour travailler avec

des solutions homogènes. - Vérifier l'exactitude et la précision des pipettes ainsi que le bon

fonctionnement des instruments.- Changer de gants régulièrement et dès que vous soupçonnez qu’ils

peuvent être contaminés.- Nettoyer les surfaces de travail régulièrement avec de l’eau de javel

5% et autre agent tel que DNA AWAY® ou RNase AWAY®.- Porter des gants non poudrés pour ne pas laisser de traces de

doigts sur le film optique utilisé pour sceller les microplaques. Ne pasécrire sur les bouchons des tubes PCR. Dans les deux cas,l’enregistrement des données par l’appareil peut être perturbé.

- Il est recommandé aux utilisateurs d’être conforme aux exigences

24 © 2008 Bio-Rad

générales pour la méthode PCR décrites dans la norme EN ISO 22174 :2005 “Microbiologie des aliments – Réaction de polymérase en chaîne(PCR) pour la recherche de micro-organismes pathogènes dans lesaliments – Exigences générales et définitions”.

VII. PROTOCOLENous vous recommandons vivement de lire l'ensemble du protocole avantde commencer l'essai.Respecter scrupuleusement le protocole proposé.

Le tableau suivant liste les différents protocoles disponibles selon le cadrede validation et l’application utilisé:

* Protocole également préconisé pour la recherche de E.coli O157 :H7.

A. Enrichissement de l'échantillonLes milieux d'enrichissement doivent être portés à la températured'incubation appropriée avant utilisation.

Homogénéiser 25 g d'échantillon dans 225 ml d'eau peptonée tamponnéepréchauffée dans un sac à stomacher avec filtre incorporé.

Protocole Standard I- Incuber sans agitation pendant 18h ± 2h, à 37°C ± 1°C. Une décantation

naturelle a lieu lors de cette incubation.- Réaliser le test iQ-Check sur 1 ml de la suspension enrichie décantée en

suivant le protocole Standard I pour l’extraction de l’ADN (Cf. section B).

Protocole Enrichissement Certification Domaine

Standard I 18h ± 2h, 37°C AFNOR VALIDATIONAlimentation humaine et animale, etéchantillons d’environnement

Simplifié I 21h ± 1h, 37°C AFNOR VALIDATIONAlimentation humaine et animale, etéchantillons d’environnement

Standard II 8h , 37°C AFNOR VALIDATION Viandes crues

Simplifié II 21h ± 1h, 37°C AFNOR VALIDATION Viande crue de boeuf *

Simplifié I 21h ± 1h, 37°C AOAC-RIOeufs, volaille crue, viande crue de boeuf,melon

Standard II 8h, 36°C AOAC-RI Viande crue de boeuf *

25© 2008 Bio-Rad

Protocole Standard II- Incuber sans agitation pendant 10h ± 2h, à 37°C ± 1°C*. Une

décantation naturelle a lieu lors de cette incubation.- Réaliser le test iQ-Check sur 1 ml de la suspension enrichie décantée en

suivant le protocole Standard II pour l’extraction de l’ADN (Cf. section B).

* Dans le cadre de la validation AOAC-RI, une incubation à 36°C ± 1°C estpréconisée.

Protocoles Simplifié I et II- Incuber sans agitation pendant 21h ± 1h à 37°C ± 1°C. Une décantation

naturelle a lieu lors de cette incubation.- Réaliser le test iQ-Check sur 100 µl de la suspension enrichie décantée

en suivant le protocole simplifié pour l’extraction de l’ADN (Cf. section B).

Remarque : Ne pas agiter les enrichissements avant de prélever l’échantillonpour le test iQ-Check, sauf pour les protocoles Standard II et Simplifié II. Pources protocoles agiter les enrichissements et laisser décanter. En général, éviterla prise de gros débris. Pour les aliments présentant une couche grassesurnageante, prélever juste en dessous de cette couche.

B. Extraction des acides nucléiques

Avant le début de l'essai, allumer le bloc chauffant et le régler à 95°C -100°C.

* Réactif F (billes de lyse) est inclus dans les kits iQ-Check E.coli O157:H7ou il peut être commandé séparément.

Pré-chauffer le bloc chauffant Allumer le bloc chauffant et le régler à 95°C - 100°C

Préparer le réactif de lyse

Protocoles Standard I et Simplifié I : utiliser le réactif de lyse Atel que.

Protocoles Standard II et Simplifié IIReconstituer le réactif de lyse :• Verser tout le contenu du réactif F* (billes de lyse) dans le

flacon du réactif A (tampon de lyse). • Le réactif de lyse mélangé avec les billes de lyse (réactifs A + F)

peut être conservé jusqu’à 6 mois à 4°C.

26 © 2008 Bio-Rad

Protocole Standard I1 - Introduire 1 ml de suspension enrichie dans un tube à centrifuger à vis

de 1,5 ml.2 - Centrifuger à 10.000-12.000 g pendant 5 minutes et éliminer le

surnageant.3 - Ajouter 200 μl du réactif de lyse (réactif A) au culot obtenu, et mélanger

par aspiration/refoulement avec la pipette et vortexer.

Remarque : Lors du prélèvement, le réactif de lyse doit être homogénéiséà vitesse modérée au moyen du barreau magnétique contenu dans leflacon afin de maintenir le réactif de lyse en suspension.

4 - Incuber le tube dans le bloc chauffant à 95°C - 100°C pendant 10 à 15minutes.

5 - Vortexer à grande vitesse6 - Centrifuger à 10.000-12.000 g pendant 5 minutes.

Protocole Standard II (incluant une étape de broyage)1 - Introduire 1 ml de suspension enrichie dans un tube à centrifuger à vis

de 1,5 ml.2 - Centrifuger à 10.000-12.000 g pendant 5 minutes et éliminer le

surnageant.3 - Ajouter 200 μl du réactif de lyse reconstitué (réactifs A + F) au culot

obtenu, et mélanger par aspiration/ refoulement avec la pipette

Remarque : Agiter doucement le flacon de réactif de lyse à la main afin demettre en suspension les billes. Lors du prélèvement, maintenir le réactifde lyse homogénéisé à vitesse modérée au moyen du barreaumagnétique contenu dans le flacon.Utiliser des consommables adaptéspour un prélèvement homogène du réactif de lyse reconstitué.

4 - Agiter 3 min ± 1min avec l’agitateur vibrant tel que le “Disruptor Genie”.5 - Incuber le tube dans le bloc chauffant à 95°C - 100°C pendant 10 à

15 minutes.6. - Vortexer à grande vitesse et centrifuger à 10.000-12.000 g pendant 5

minutes.

27© 2008 Bio-Rad

Protocole Simplifié I1 - Pré-répartir, selon le nombre d’échantillons à tester, 50 μl de réactif de

lyse A homogénéisé dans un tube de 1,5 ml ou des barrettes ou uneplaque “full profile” transparentes.

Remarque : Lors du prélèvement, le réactif de lyse doit être homogénéiséà vitesse modérée au moyen du barreau magnétique contenu dans leflacon afin de maintenir le réactif de lyse en suspension.

2 - Ajouter 100 μl de bouillon enrichi dans chaque tube et mélanger paraspiration/refoulement avec la pipette.

3 - Fermer les tubes utilisés (à l’aide de barrettes de capuchons si enplaque ou barrette).

4 - Incuber à 95°C - 100°C pendant 10 à 15 minutes.5 - Vortexer les tubes à grande vitesse.6 - En barrettes ou plaque laisser refroidir jusqu’à température ambiante,

en laissant décanter7 - Centrifuger les tubes au moins 2 minutes à 10.000-12.000 g ou 1

minute à 2000 g si en plaque ou barrette.8 - Ouvrir les barrettes ou les puits de la plaque un par un, avec

précaution, pour éviter les risques de contaminations croisées.

Protocole Simplifié II (incluant une étape de broyage)1 - Pré-répartir, selon le nombre d’échantillons à tester, 100 μl de réactif

de lyse reconstitué (réactifs A + F) et homogénéisé dans des tubes àcentrifuger à vis de 1,5 ml.

Remarque : Agiter doucement le flacon de réactif de lyse à la main afin demettre en suspension les billes. Lors du prélèvement, maintenir le réactif de lysehomogénéisé à vitesse modérée au moyen du barreau magnétique contenudans le flacon. Utiliser des consommables adaptés pour un prélèvementhomogène du réactif de lyse reconstitué.

2 - Ajouter 100 μl de suspension enrichie et mélanger paraspiration/refoulement avec la pipette jusqu’à homogénéisation.

3 - Agiter 3 min ± 1 min avec l’agitateur vibrant tel que le “Disruptor Genie”.4 - Incuber à 95°C - 100°C pendant 10 à 15 minutes.5 - Vortexer à grande vitesse quelques secondes.6 - Centrifuger au minimum 2 minutes à 10.000-12.000 g pour faciliter le

pipetage du surnageant.

28 © 2008 Bio-Rad

Pour tous les protocoles :• Ouvrir les puits avec précaution, pour éviter les r isques de

contaminations croisées.• Utiliser 5 μl du surnageant obtenu (contenant l'ADN extrait) pour la

réaction d'amplification* (ne pas vortexer avant de prélever les 5 μl).• Le surnageant restant peut être conservé jusqu’à un an à -20°C. Après

une éventuelle décongélation en vu d’une réutilisation du surnageant,toujours centrifuger 5 minutes à 10.000-12.000 g.

Si vous souhaitez vous arrêter dans le protocole, cette étape est la plusappropriée.

* A cette étape :Pour des échantillons ayant présenté une inhibition lors d'un testprécédent, procéder à une dilution au 1/10e, en eau distillée stérile, enutilisant 10 μl du surnageant obtenu. 5 μl de la dilution appropriée seront àutiliser pour l'amplification 1.

1 Dans le cas éventuel d’échantillons ayant présenté une inhibition avec une dilution au 1/10ème del’ADN extrait, lors d'un test iQ-Check précédent, et dans le cadre de la certification AFNORValidation, il est possible d’utiliser un protocole d’enrichissement modifié afin de prévenir cetteinhibition:

- Homogénéiser 25 g d'échantillon dans 225 ml d'eau peptonée tamponnée.- Incuber sans agitation pendant 18h ± 1 heures à 37°C.- Bien agiter le sac, prélever 20 μl de la suspension et les rajouter à 1 ml d'eau peptonée

tamponnée (préchauffé à 37°C) dans un tube à vis de 1,5 ml.- Incuber sans agitation pendant 4h ± 1 heures à 37°C.- Réaliser le test iQ-Check en centrifugeant directement cet enrichissement secondaire, et en

suivant le Protocole d’extraction Standard I.

29© 2008 Bio-Rad

C. PCR en temps réel

1. Mise en marche appareil PCRPour la mise en marche et la définition des paramètres du logicielconsulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kitsiQ-Check.

2. Préparations des réactions PCR2.1 Préparer le mélange réactionnel PCR en mélangeant la solution

d’amplification (réactif C) et les sondes fluorescentes (réactif B) enfonction du nombre d’échantillons et des contrôles à analyser (auminimum un contrôle positif et un contrôle négatif doivent être utiliséspar plaque). Utiliser le tableau de pipetage en annexe A pourconnaître les quantités nécessaires de chaque réactif.

2.2 Après préparation, le mélange réactionnel (réactif B +C) doit être utiliséimmédiatement, ou il peut être conservé pendant 1h à 4°C.

2.3 Répartir 45 µl de ce mélange réactionnel par puits, selon le plan deplaque défini.

2.4 Ajouter 5 µl d’échantillon ou de réactif D (contrôle négatif) ou deréactif E (contrôle positif) et sceller de façon hermétique les puits de laplaque ou des barrettes.Il est important d’éviter la présence de bulles au fond des puits enpipetant précautionneusement. Pour éliminer des bulles centrifugerbrièvement la plaque scellée ou les barrettes PCR.

2.5 Placer la plaque ou les barrettes PCR dans le thermocycleur.S’assurer de leur bonne orientation (puits A1 en haut à gauche).Fermer le module réactionnel.

3. Lancement de la réaction d’amplificationPour le lancement de la PCR, consulter le manuel uti l isateur duthermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check.

30 © 2008 Bio-Rad

D. Analyse des donnéesL’analyse des données peut être réalisée directement à la fin de laréaction d’amplification ou ultérieurement en re-ouvrant le fichier dedonnées. Pour ouvrir des fichiers de données et régler les paramètresd’analyse consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pourles kits iQ-Check.

1. Interprétation des résultats :Pour obtenir les résultats de l’analyse, il suffit de lire les valeurs de Ct(cycle à partir duquel la fluorescence s’élève significativement au-dessusdu bruit de fond), une fois réglés les paramètres d’analyse.

Il est également possible d’utiliser le logiciel iQ-Check Analysis (Réf.359-3135) pour une interprétation automatisée et l’impression d’unrapport complet (Cf. notice d’utilisation de iQ-Check Analysis). Le logicielOpticon Monitor permet une analyse automatisée complète pour lessystèmes Chromo4 et MiniOpticon (Cf. notice d’utilisation du Chromo4 etMiniOpticon pour les kits iQ-Check, Réf. 93269, Rev. B).

1.1 Contrôles :Avant l’interprétation finale des résultats il est nécessaire de vérifier lesrésultats des contrôles négatifs et positifs. Pour que le test soit valide, les résultats des contrôles négatifs et positifsdoivent être les suivants :

* N/A signifie « Not Applicable ». Le logiciel indique N/A pour le Ct d’un échantillon quand la courbede fluorescence ne croise pas le seuil.

Si les résultats des contrôles positifs et négatifs sont différents de ceuxdécrits dans le tableau ci-dessus, il est nécessaire de recommencer laPCR.

Détection de Salmonella (FAM) Détection du contrôle interne

Contrôle négatif Ct = N/A* 28 ≤ Ct ≤ 40

Contrôle positif 26 ≤ Ct ≤ 36 Non significatif

31© 2008 Bio-Rad

1.2 Echantillons :Un échantillon est considéré positif pour Salmonella si une valeur de Ct ≥ 10est obtenue pour le fluorophore FAM.

Si une valeur inférieure à 10 est obtenue, vérifier que la courbe en tempsque donnée brute montre un aspect caractéristique d’amplificationexponentielle (ligne de base plate, puis augmentation régulière de lafluorescence, suivi par un plateau). Si la courbe observée est correcte, onpeut considérer l’échantillon positif pour la présence de Salmonella.

Si aucune valeur n’est obtenue pour le CtFAM (Ct = N/A), ou si la courbeobservée n’est pas caractéristique, l’interprétation du résultat dépend dela valeur du contrôle interne :- Un échantillon est considéré négatif pour Salmonella si aucune valeur de

Ct n’est obtenu pour le fluorophore FAM (CtFAM=N/A) et le Ct pour lecontrôle interne est supérieur ou égale à 28.

- Une valeur N/A pour le Ct du contrôle interne indique, lorsque son Ct enFAM est également N/A, qu’un phénomène d’inhibition de la réaction dePCR a probablement eu lieu. Dans ce cas, l’échantillon d’ADN doit êtredilué au 1/10e, en eau distillée stérile, puis soumis à une nouvelle PCR.(cf. partie VII.B. Extraction des acides nucléiques).

- Si le Ct pour le contrôle interne est inférieure à 28 il n’est pas possibled’interpréter le résultat. Vérifier que le seuil a été correctement placé ouque la courbe brute montre un aspect caractéristique d’amplificationexponentielle. Si la courbe observée n’est pas correcte il sera nécessairede répéter le test PCR pour cet échantillon.

Interprétation des résultats obtenus sur les échantillons :

* : En cas de valeur nulle pour un échantillon et son contrôle interne (Ct = N/A), l’analyse doit êtrerenouvelée avec l’échantillon d’ADN dilué au 1/10.

Détection de Salmonella (FAM) Détection du contrôle interne Interprétation

Ct ≥ 10 Non significatif Positif

Ct = N/A Ct ≥ 28 Négatif

Ct = N/A Ct = N/A Inhibition*

32 © 2008 Bio-Rad

VIII. CONFIRMATION DES RESULTATS POSITIFSDans le cadre de la certification AFNOR VALIDATION, tous les résultatspositifs iQ-Check devront être confirmés de l'une des manières suivantes :

1. Mise en œuvre des tests classiques décrits dans les méthodesnormalisées par le CEN ou l'ISO (en incluant l'étape de purification).Pour effectuer la confirmation, i l faut repart ir du boui l lond'enrichissement d’eau peptonée tamponnée après un enrichissementcomplet de 18h ± 2h, à 37°C.

2. Utilisation de toute autre méthode certifiée AFNOR VALIDATION deprincipe différent de la PCR utilisée par iQ-Check Salmonella II, tel quele milieu chromogénique RAPID’Salmonella. Le protocole validé de laseconde méthode devra être respecté dans son ensemble, laconfirmation s'effectuera à partir du bouil lon d’eau peptonéetamponnée, cette étape étant commune aux deux méthodes.

En cas de résultats discordants entre iQ-Check Salmonella II et l’une desoptions de confirmation décrites ci-dessus, le laboratoire devra mettre enœuvre les moyens suffisants pour s'assurer de la validité du résultat rendu.

Il est possible de conserver le bouillon d’eau peptonée tamponnée entre +2°Cest +8°C pendant 48h maximum suivant la fin de l’incubation à 37°C.

Dans le cadre de la validation AOAC-RI, un résultat positif avec iQ-CheckSalmonella II est considéré présomptif et il est recommandé de le confirmer parla méthode de référence USDA MLG (disponible en ligne àhttp://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf) ou la méthode de référenceFDA BAM (disponible en ligne à http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html),selon l’échantillon utilisé.

IX. PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIESISOLEES

Il est possible d’utiliser le kit iQ-Check Salmonella II pour la confirmation decolonies isolées sur gélose.

1. Piquer une colonie isolée, à partir d’un milieu sélectif ou non, à l’aide d’uncure-dent ou d’une öse de 1 μl, ou autre consommable adapté (cônepipette par exemple).

33© 2008 Bio-Rad

2. Resuspendre la colonie dans 100 μl de tryptone sel ou eau distillée stériledans un tube de type Eppendorf. Bien homogénéiser la suspension à l’aided’un vortex.

3. Intégrer 5 μl du surnageant dans 45 μl du mélange réactionnel PCR (Cf.partie VII.C PCR en temps réel) et suivre le reste de la méthode iQ-CheckSalmonella II pour l’obtention et l’interprétation des résultats.

X. PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONSLe kit iQ-Check Salmonella II est spécifique pour la détection deSalmonella spp. Il est possible de détecter de 1 à 10 CFU/25 gd’échantillon selon l’enrichissement recommandé.

AFNOR VALIDATIONiQ-Check Salmonel la I I est cert i f ié AFNORVALIDATION comme méthode alternative à lanorme de référence NF EN ISO 6579 (2002), pourla détection des Salmonella spp. pour tousproduits d’alimentation humaine et animale ainsique les échantillons d’environnement. La validationa suivi le protocole de la norme NF EN ISO 16140 :2003 et inclut l ’ut i l isat ion du Chromo4™,MiniOpticon™, iQ™5 et l ’ iCycler iQ™. N°d’attestation : BRD : 07/06 – 07/04. Fin de validité01/07/2012.

VALIDATION AOAC-RIiQ-Check Salmonella II (protocole Simplifié I) estvalidé par AOAC-Research Institute selon leprogramme Performance Tested Method pour ladétection de Salmonella spp. dans les viandescrues de bœuf, la volaille crue, les œufs, et lemelon. Le protocole Standard II est aussi validépar AOAC-RI pour la détection de E.coli O157:H7et Salmonella spp. dans le même échantillon deviande crue de bœuf. Un résultat positif aveciQ-Check est considéré présomptif et i l estrecommandé de confirmer le résultat par lesméthodes de références. (cf. 3 et 4, partie XI.).Attestation n° 010803.

34 © 2008 Bio-Rad

BRD 07/06 – 07/04

ALTERNATIVE ANALYSYSMETHODS FOR AGRIBUSINESS

Certified by AFNOR Certificationwww.afnor-validation.org

X. BIBLIOGRAPHIE1 - Miras, I., Hermant, N., Arricau, N., and Popoff, M.Y.1995. Nucleotide

sequence of iagA and iagB genes involved in invasion of HeLa cells bySalmonella enteritica subsp. Enteritica ser. Typhi. Research inMicrobiology. 146. 17-20.

2 - Norme NF EN ISO 6579. Microbiologie des aliments – Méthodehorizontale pour la recherche des Salmonella spp. Décembre 2002.

3 - United States Department of Agriculture, Food Safety and InspectionService. Microbiology Laboratory Guidebook – Chapter 4.03. Isolationand Identification of Salmonella from Meat, Poultry and Egg Products.October 1, 2004. En ligne http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf

4 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety andApplied Nutrition. Bacteriological Analytical Manual - Chapter 5.Salmonella. June 2006. En ligne http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

Avis concernant l'acheteur : licence limitéeL’utilisation de ce produit est couverte par un ou plusieurs des brevets US suivants et lesrevendications de brevet correspondantes hors Etats-Unis : 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6127 155, 5 677 152 (revendications 1 à 23 seulement) et 5 773 258 (revendications 1 et 6seulement) et par les revendications hors Etats-Unis correspondant au brevet US n° 4 889 818.L’achat de ce produit comprend une immunité de poursuite restreinte et non transférable selon lesrevendications de brevet précédentes lorsque cette quantité de produit est uniquement utilisée àdes fins d’analyse alimentaire, d’analyse environnementale et en microbiologie industrielle, ycompris la publication des résultats des activités de l’acheteur moyennant paiement ou toute autrecontrepartie commerciale, et lorsqu’elle est également utilisée aux fins des propres recherches del’acheteur. Aucun droit selon une quelconque revendication de brevet (comme les revendicationsde la méthode 5’-nucléase dans les brevets US n° 5 210 015 et 5 487 972) n’est expressémentcédé, que ce soit par implication ou par préclusion. De plus amples informations concernantl’achat de licences peuvent être obtenues en contactant le Directeur des Licences, AppliedBiosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Californie, 94404, Etats-Unis.

35© 2008 Bio-Rad

ANNEXE A - Tableau de PipetageUtiliser ce tableau pour trouver les quantités nécessaire de réactif B etréactif C pour préparer le mélange réactionnel. Le “nombre d’échantillons”inclut les contrôles positif et négatif.

36 © 2008 Bio-Rad

Nombred’échantillons

Sondesfluorescentes(µl) Réactif B

Mix PCR(µl) Réactif C

Nombred’échantillons

Sondesfluorescentes(µl) Réactif B

Mix PCR(µl) Réactif C

1 5 40 49 265 21002 11 86 50 270 22003 16 130 51 275 22004 22 173 52 281 22005 27 216 53 286 23006 32 259 54 292 23007 38 302 55 297 24008 43 346 56 302 24009 49 389 57 308 250010 54 432 58 313 250011 59 475 59 319 250012 65 518 60 324 260013 70 562 61 329 260014 76 605 62 335 270015 81 648 63 340 270016 86 691 64 346 280017 92 734 65 351 280018 97 778 66 356 290019 103 821 67 362 290020 108 864 68 367 290021 113 907 69 373 300022 119 950 70 378 300023 124 994 71 383 310024 130 1000 72 389 310025 135 1100 73 394 320026 140 1100 74 400 320027 146 1200 75 405 320028 151 1200 76 410 330029 157 1300 77 416 330030 162 1300 78 421 340031 167 1300 79 427 340032 173 1400 80 432 350033 178 1400 81 437 350034 184 1500 82 443 350035 189 1500 83 448 360036 194 1600 84 454 360037 200 1600 85 459 370038 205 1600 86 464 370039 211 1700 87 470 380040 216 1700 88 475 380041 221 1800 89 481 380042 227 1800 90 486 390043 232 1900 91 491 390044 238 1900 92 497 400045 243 1900 93 502 400046 248 2000 94 508 410047 254 2000 95 513 410048 259 2100 96 518 4100

NOTES

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37© 2008 Bio-Rad

NOTES

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38 © 2008 Bio-Rad

NOTES

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39© 2008 Bio-Rad

Bio-Rad3, bd Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette - FranceTél.: +33 1 47 95 60 00 Rev. B - 12/2008Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 808463

Distributed in the U.S. by:Bio-Rad Laboratories2000 Alfred Nobel DriveHercules California 94547Toll-Free Phone: 1-(800) 424-6723Fax: (510) 741-5800

In the United States, for technical assistance, please call (800) 4BIORAD. Select option 2 fortechnical support and option 2 again for the Food Science Division. To place an order, pleasecall (800) 4BIORAD and press option 1 for customer service. Orders can also be faxed to (800)879-2289.