Ion Reporter ソフトウェアデモンストレーション...5 Ion Reporterソフトウェアによる変異の絞り込み •...

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Ion Reporter™ソフトウェア デモンストレーション

Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panelを用いたがん部および非がん部の体細胞変異比較解析

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Ion Torrent システムを用いた実験例

• Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panelを2サンプル実施

サンプル1

ランレポート ランレポート

サンプル2

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研究目的

• がん部と非がん部の体細胞変異を比較• Variant Callerでは、サンプルごとの検出変異のみを表示

• Hg19をリファレンスに検出

がん部(Tumor)非がん部(Normal)

Sample_1 1300 Sample_2 2000 159

サンプル1

Variant Caller プラグインレポート Variant Caller プラグインレポート

サンプル2

1,300箇所 2,000箇所

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• がん部と非がん部で異なる変異のみを表示

Ion Reporterソフトウェアを用いた比較解析

非がん部共通1,300箇所

Ion Reporter™で違いを検出

がん部特異的700箇所

全2,000箇所

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Ion Reporterソフトウェアによる変異の絞り込み

• がん部に特異的な変異の中から意義のある変異を抽出

非がん部

Ion Reporter™で絞り込み

がん部

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解析の流れ

• ワークフロー

データ レポート解析転送 絞り込み

Torrent Server Ion Reporterのサーバー PDFやExcelファイル

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事前準備

• 各種設定

データ レポート解析転送 絞り込み

Torrent Server Ion Reporterのサーバー ExcelやPDFファイル

ラン設定• サンプル名• がん部・非がん部

転送設定• 転送用プラグイン• アカウント情報

解析設定• サンプル選択• がん部・非がん部比較

絞り込み設定• アミノ酸配列• 既知・未知

レポート作成• 結果確認• ExcelをPDFに変換

アカウント作成• ID• パスワード

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Ion Reporterアクセス画面

①登録アドレス

②登録パスワード

③ログイン

ログインのワンポイント• ブラウザのバージョン確認

• 最新版が望ましい

解析条件• サンプル選択• がん部・非がん部比較

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① サンプル読込：転送済みランデータ

② 解析条件：カスタマイズ用

③ データ解析：閲覧や絞り込み

ホーム画面

① ②③

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サンプルファイルの注意点

• 比較解析にはBAMファイルが必要• がん部と非がん部の比較• VCFファイルではアノテーション機能に限定

• 解析不能

• サンプル画面でのデータインポートはVCFのみ• BAMファイルはインポートできない

• データ転送プラグイン必須

• 手動でのデータ転送プラグイン使用時に注意• Ion Reporter Uploader

• BAMファイルを忘れずに

① サンプル読込：転送済みランデータ

サンプルファイルのワンポイント• BAM: 塩基配列、位置、QV• VCF: 変異情報のみ

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サンプル画面

サンプル画面のワンポイント

• データの転送が完了しているか確認できる

① サンプル読込：転送済みランデータ

VCFファイルの手動インポート

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目的のサンプル：CCPのNormalとTumor

解析へ

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解析を始める： Launch Analysis

• 解析条件を選択• Ion AmpliSeq™

• Comprehensive Cancer Panel• Tumor - Normal

• サンプルファイルを選択• Tumor• Normal

• 設定の確認• 解析スタート

③ データ解析：閲覧や絞り込み

解析条件のワンポイント• すでに最適化されている• 目的に合うものを選択

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解析画面

解析画面のワンポイント• 解析が始まるとリストに追加• 未解析では何も表示されない

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解析の始め方• まずはLaunch Analysisを

クリックし、Manualを選択

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解析の進め方• Workflowから順に選択• 解析条件

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解析条件の探し方• 目的に応じて絞り込み• AmpliSeq, Tumor-Normal

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解析条件を見つけたら• 目的のWorkflowをハイライト• Summaryに条件の概要 次へ

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サンプルファイルを選択• Samples画面と同様のリスト• キーワードで絞り込み

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目的のペアを見つけたら① チェックを入れる② Add Samplesをクリック

① ②

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サンプル追加のポイント• TumorとNormalに振り分け• チェックを入れた順に左・右

左右切り替えボタン

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サンプルの紐づけ• 何のがん部－非がん部か• 3文字以上

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ペアに名前を付けたら• Add to Analysis• 解析の準備へ

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解析準備完了• Ready to Analyze• Confirm & Launchへ

次へ

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プラグインはスキップ

• 現在、準備中• Nextをクリック

25次へ

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解析スタート• Launch Analysis• プラグインはスキップ

Overviewへ

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解析 : Overview Analysis

• 解析状況• 準備～実行～完了⇒結果確認

• 解析段階• 解 析～検 証～レポート作成

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解析状況• Pending• 準備中

100GBまで無償

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解析状況• Running• 実行中

ステータス更新

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解析完了• Successful• リンク生成（解析名の色が青）

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自動解析はこの段階まで自動実行

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結果検証へ• 解析名クリック⇒変異リストへ• 周辺クリック⇒詳細表示

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解析から検証作業へ

• サンプル比較（解析）• がん部と非がん部でジェノタイプの異なる個所をリストアップ

• 様々なフィルター条件で変異を絞り込み（検証）• アミノ酸配列、新規・既知

• Filter Chains

• ローカスのポジションをクリックし、リードの確認（検証）• IGV(Integrative Genomic Viewer)

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解析結果• がん部に特異的な変異を検出• タブで表示内容を変更可能

解析結果

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サマリー• ローカス、ジェノタイプなど• テーブルは右にスクロール

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機能• アミノ酸配列の変化• タンパク構造への影響

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集団• dbSNPのアクセション番号• マイナーアリル頻度

1000人ゲノム

European Global

African

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分類• データベースの遺伝子関連情報• がん、生物学的プロセスなど

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薬理• 薬剤応答性• 遺伝子型と表現型の関係

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体細胞• アレルのカバレッジ• アレルの割合

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QC• クオリティチェック• 信頼度

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絞り込み方法

• フィルター機能を利用• Filter Chains

フィルターのポイント• 目的に応じて作成• アミノ酸配列、分類など

クリックして新規作成

絞り込まれた変異

条件に合わない変異

精査して除いた変異

絞り込み設定• アミノ酸配列• 既知・未知

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フィルター条件作成

作成例①• アミノ酸配列の変化を伴う変異• ミスセンス、ナンセンス

①

②

③

③

④

⑤

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絞り込み例①

変異数• 674から156個に絞り込まれた• さらに絞り込み

条件編集

全てアミノ酸配列が変化する変異

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フィルター条件編集

作成例②• 癌種の分類(COSMIC)• 腺腫(Adenocarcinoma)

①

②

③

④

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絞り込み例②

癌種の分類• 156から11個に絞り込まれた• 過去に報告済み（新規含まず）

右スクロールで詳細情報確認

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腺腫に関連する遺伝子情報

データベース• 遺伝子の表現型情報• 遺伝子の機能情報

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COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer)

ハイパーリンク• 実際に観察された体細胞変異• ALK：3182G>T

http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/mutation/overview?id=1407666 47

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OMIM® (Online Mendelian Inheritance in Man®)

ハイパーリンク• 変異による疾患に関する情報• 融合遺伝子が含まれる

http://www.omim.org/entry/10559048

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Gene Ontology

ハイパーリンク• 生物学的プロセス• ALKはアポトーシス制御関連

http://amigo.geneontology.org/amigo/term/GO:0042981

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変異の詳細情報

個別ウィンドウ• 全アノテーション情報を閲覧• 各種データベースへのリンク

クリック

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IGVを開く

起動• Locusをクリック• Java™を事前にインストール

①

②

③

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IGV: Integrative Genomics Viewer

検証• 塩基配列の確認• がん部・非がん部を直接比較

遺伝子名で検索可能

エリアを囲んで拡大

右クリックをしてShow all bases

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着目したい変異

マーキング• 精査した変異をチェック• 意義のある変異を見失わない

①

Deleterious（悪性）

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②

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精査

取捨選択• 重要な変異はフラグを立てる• 不要な候補はリストから削除

①

Benign（良性）

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②

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絞り込み結果

最終候補（例）• 5つに絞られた重要な変異• 6つの除外された候補

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データダウンロード

出力• 絞り込まれたリストをExcel化• 全項目も可

レポート作成• 結果確認• ExcelをPDFに変換

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絞り込み条件確定

検証作業完了• レポート作成段階へ• 以降はフィルタ条件変更不可

①

②

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レポート作成

形式• リストから変異を選択• アノテーションから情報を選択

③

②

④

①選択

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レポート公開

解析完了• 最終確認• ロック後はフィルタ条件固定

Ion 318™ Chip×2枚で13GByte

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レポート PDF化

ダウンロード• ロック後に作成可能• サインの記入欄

①

③

②

④

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解析結果の共有

メール配信• ダウンロードリンク （VCFなど）• データの閲覧（ID所有者のみ）

①

③

④

②

メールアドレス入力

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