2019-02-24 1 Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I • Badanie ekspresji genów • Kolokwium (14pkt) Część II • Podstawy klonowania i różnicowania transformantów • Klonowanie ekspresyjne • Od genu do białka • Kolokwium (26pkt) EGZAMIN 55pkt bonus: 5pkt DNAmRNAbiałko • Informacje o ekspresji genów • Informacje o odpowiedzi komórkowej na zadany czynnik • Informacje o produkcji białka (nie zawsze) • Dokładna liczba kopii genu • Wykrywanie kopii wirusów i patogenów • Wykrywanie metylacji DNA • Wykrywanie mutacji Rodzaje reakcji ABSOLUTE QUANTIFICATION • Krzywa standardowa • Standardem musi być dobrze mianowany roztwór patogenu • Reakcja najczęściej stosowana do obliczania ilości kopii wirusów • W przypadku posiadania krzywych uniwersalnych również bakterii RELATIVE QUANTIFICATION • Krzywa standardowa • Standardem jest wielokrotnie rozcieńczana matryca • Reakcja najczęściej stosowana do badania ekspresji genów
19
Embed
Inżynieria genetyczna- 6 ECTS - kgohz.sggw.plkgohz.sggw.pl/wp-content/uploads/2019/02/Bioz_inzgen_w1i2.pdf · Inny gen Uśredniona ekspresja genu badanego lub innego Gen referencyjny
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
2019-02-24
1
Inżynieria genetyczna- 6 ECTS
Część I• Badanie ekspresji genów• Kolokwium (14pkt)
Część II• Podstawy klonowania
i różnicowania transformantów• Klonowanie ekspresyjne• Od genu do białka• Kolokwium (26pkt)
EGZAMIN 55pktbonus: 5pkt
DNAmRNAbiałko
• Informacje o ekspresji genów• Informacje o odpowiedzi komórkowej na zadany czynnik• Informacje o produkcji białka (nie zawsze)• Dokładna liczba kopii genu• Wykrywanie kopii wirusów i patogenów• Wykrywanie metylacji DNA• Wykrywanie mutacji
Rodzaje reakcji ABSOLUTE QUANTIFICATION• Krzywa standardowa• Standardem musi być dobrze mianowany roztwór patogenu• Reakcja najczęściej stosowana do obliczania ilości kopii wirusów• W przypadku posiadania krzywych uniwersalnych również
bakterii
RELATIVE QUANTIFICATION• Krzywa standardowa• Standardem jest wielokrotnie rozcieńczana matryca• Reakcja najczęściej stosowana do badania ekspresji genów
2019-02-24
2
RQ-ANALIZA EKSPRESJI
Reakcja Real-Time PCR
Analiza wyników
Izolacja RNA
Odwrotna transkrypcja
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
Reakcja amplifikacji DNA na matrycy RNA- odwrotnatranskrypcja (Reverse Transcription)
• enzym używany w reakcji RT-PCR to odwrotna transkryptaza• powstały DNA jest komplementarny do RNA i nazywany jest
cDNA (complementary DNA)• w badaniu ekspresji genów cDNA powinien powstawać na
matrycy mRNA• cząsteczki mRNA (w przeciwieństwie do rRNA) są w naturalny
sposób zakończone „ogonkami poliadeninowymi” AAAAAAAAdołączanymi w czasie transkrypcji za kodonem STOP
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
• Obecność ogonkówpoliadeninowych (poli-A)jest wykorzystana jakonaturalne miejscewiązania ze starterami„oligo dT” (dTTP)<TTTTTTTT>
2019-02-24
3
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
• w reakcji RT- PCR na jednej kopii RNA powstaje jedna kopiacDNA!
Startery typu Oligo dT to:o oligonukleotydy składające się zazwyczaj z 24 nukleozydów
zawierających tyminę. Przyłączają się one do ogonków poli-Aw mRNA
LUBo oligonukleotydy składające się z 23 reszt tyminowych i
dodatkowego nukleotydu kotwiczącego A, C lub G, w tensposób ich przyłączenie następuje przy fragmencie łączącymogonek poli-A z 3’ UTR
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
Startery typu „random hexamer” to:o mieszanina oligonukleotydów reprezentująca wszystkie
możliwe kombinacje sześcionukleotydowe
Oligo dT Random HexamerStosowane jedynie dla organizmóweukariotycznych i retrowirusówzawierających ogonki Poli-A
Stosowane dla wszystkich organizmów
Tylko dla mRNA Dla wszystkich rodzajów RNAPrzydatne przy krótkich fragmentach,zwłaszcza zlokalizowanych przy 3’ końcumRNA
Przydatne przy długich fragmentach RNA(>2000pz) oraz przy RNA o słabej jakości
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
www.thermofisher.com
2019-02-24
4
ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR
Czy można stosować proteinazę K podczas izolacji RNA?
Czy izolując RNA można wyizolować DNA? Kiedy? Dlaczego?
Jak można pozbyć się DNA z izolatu RNA? Na jakim etapie?
Czy wyizolowany podczas ekstrakcji DNA może mieć wpływna wydajność reakcji RT PCR?
Czy można sprawdzić wydajność reakcji RT PCR przy pomocyelektroforezy?
Rodzaje technik wyzwalania świecenia
Rodzaje technik wyzwalania świecenia
wydłużanie
5’ 3’
5’3’
Wzbudzenie świecenia
5’ 3’
5’3’
Taq
Taq
3’
5’3’
Taq
Taq
Brak świecenia po denaturacji
ID ID
ID IDID
ID ID ID
ID ID
λ λ λ
λλ
ID ID
ID ID
www.biorad.com
2019-02-24
5
Rodzaje technik wyzwalania świecenia
5’ 3’
RQ
5’ 3’
TaqQ
R
5’ 3’
Q Taq
R
5’
5’ 3’
TaqR
5’
5’ 3’
TaqR
5’
λ
Wydłużanie
Hydroliza sondy
Wzbudzenie świecenia
www.biorad.com
Filtr 1 2 3 4 5
Fluorochrom •FAM•SYBRGreen
•JOE•VIC
•TAMRA•NED•Cy3
•ROX•Texas Red
•Cy5
SPEKTRA
Wykładnicza◦ Jeżeli wydajność reakcji wynosi 100%– to każda z dwóch nici matrycy
jest podstawą do replikacji; najwyższa precyzja i specyficznośćpowielania
Liniowa◦ Zmienna. Matryca zaczyna ulegać rozpadowi i wydajność reakcji
zaczyna się pogarszać
Plateau◦ Reakcja zatrzymuje się, a przeprowadzana dalej będzie degradować
wytworzone produkty
Fazy reakcji PCR
2019-02-24
6
[DNA]
Cykl #
PCR phases in linear view
Wykładnicza
Liniowa
Plateau
Fazy reakcji PCR
liniowo logarytmicznie
Fazy reakcji PCR
NUMER CYKLU LICZBA KOPII DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512
Współczynnik nachylenia(informuje o wydajnościreakcji)
R2 – współczynnikdeterminacji(miara dopasowaniaoszacowanego modeluliniowego do zmiennej)
Ef=10(-1/nachylenie krzywej)
1,89
2,09
WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR
2019-02-24
11
2,21
2,17
Ef=10(-1/nachylenie krzywej)
WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR
WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- co jest potrzebne?
UDANE DOŚWIADCZENIE: specyficzne startery do genu badanego specyficzne startery do genu referencyjnego cDNA o znanej i określonej koncentracji odrobina RNA/DNA bardzo czysta woda zoptymalizowane warunki pracy: miejsce/ pipety/ plastiki/ czas APARAT do RealTime-PCR
UDANA ANALIZA: zoptymalizowane warunki reakcji duża liczba powtórzeń reakcji- wszystkie obliczenia mają charakter statystyczny!!! znana wydajność reakcji dla wszystkich genów
2019-02-24
12
Real Time PCR
Real Time PCR
Przebieg reakcji
• 50˚C, 2 min - 1x• 95˚C, 10 min - 1x• 95˚C, 15 s
60˚C, 1 min - 40x
2019-02-24
13
NORMALIZACJA W BADANIU EKSPRESJI GENÓW
1. Normalizacja jakości izolatu RNA- w wyizolowanych próbach brak DNA
2. Normalizacja ilości (i jakości) RNA przepisywanego na cDNA
do przepisania należy wziąć tyle samo RNA z każdej próby
jakość (integralność) RNA wszystkich przepisywanych prób powinna być
taka sama
ta sama ilość przy różnej jakości będzie fałszować wynik reakcji RT PCR
3. Normalizacja ilości cDNA- każda próba analizowana w reakcji Real Time PCR
powinna zawierać tę samą ilość matrycy
optymalna koncentracja dobierana jest w krzywej standardowej
4. Normalizacja wyniku reakcji PCR- każdą reakcję PCR należy powtórzyć
minimum trzykrotnie z tą samą matrycą na tej samej płytce!
KONTROLE W BADANIU EKSPRESJI GENÓW
1. NTC – wszystkie reagenty oprócz matrycy
2. -RT- wszystkie reagenty, matrycą jest RNA nieprzepisany na cDNA
3. Pasywna referencja (tylko dla wybranych termocyklerów)- substancja
dodana do KAŻDEJ próbki, która wykazuje stały poziom świecenia np. ROX
4. NAC- wszystkie reagenty z inhibitorem reakcji zamiast matrycy
Krzywa topnienia- denaturacja produktu reakcji PCR- pokazuje specyficznośćstarterów i zoptymalizowanie przebiegu reakcji- tylko dla reakcji z SYBR green!
Reakcja OK- startery o tej samej temperaturzetopnienia- brak niespecyficzności
Problem - startery o różnej temperaturze topnienia-brak niespecyficzności
Problem - startery o tej samej temperaturzetopnienia + primer-dimer
Problem - startery o tej samej temperaturzetopnienia + primer-dimer + produkt niespecyficzny
Względna różnica poziomu ekspresji badanego genu (T-target) i genukontrolnego, referencyjnego (R-reference), znormalizowana względem„kalibratora”. Wynik to wielokrotność ekspresji kalibratora.