Top Banner
Investigating protein conformation-based inheritance and disease in yeast Susan Lindquist 1,2* , Sylvia Krobitsch 1 , Liming Li 2 and Neal Sondheimer 1 1 Department of Molecular Genetics and Cell Biology, and 2 Howard Hughes Medical Institute, University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA Our work supports the hypothesis that a protein can serve as an element of genetic inheritance. This protein-only mechanism of inheritance is propagated in much the same way as hypothesized for the transmission of the protein-only infectious agent in the spongiform encephalopathies; hence these protein factors have been called yeast prions. Our work has focused on [PSI + ], a dominant cytoplasmically inherited factor that alters translational ¢delity.This change in translation is produced by a self-perpetuating change in the conformation of the translation-termination factor, Sup35. Most recently, we have deter- mined that new elements of genetic inheritance can be created by deliberate genetic engineering, opening prospects for new methods of manipulating heredity. We have also uncovered evidence that other previously unknown elements of protein-based inheritance are encoded in the yeast genome. Finally, we have begun to use yeast as a model system for studying human protein folding diseases, such as Hunting- ton's disease. Proteins responsible for some of these diseases have properties uncannily similar to those that produce protein-based mechanisms of inheritance. Keywords: amyloid; epigenetic; Huntington's disease; prion; PSI; Sup35 1. INTRODUCTION Prions were ¢rst described as the pathogenic agents that cause a group of mammalian infectious neurodegenerative diseases, the transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Unlike conventional pathogens, prions are postu- lated to be composed entirely, or primarily, of protein. The key to the infectious character of the protein is that it replicates through protein derived from the organism itself. This protein, PrP, occasionally adopts an unusual pathogenic conformation that can convert other PrP molecules to the same conformation, simultaneously killing neurons and generating new infectious material. Mammalian prions are the subject of other papers (see Caughey, this issue; Weissmann et al., this issue; Clarke et al., this issue). The prion concept of protein conformation-based infectivity was later invoked by Wickner to explain the dominant, cytoplasmic inheritance of two unusual genetic elements in yeast: [PSI + ] and [URE3 ] (Wickner 1994). This hypothesis, initially based on various unusual aspects of the genetic properties of these elements, is now substantiated by an overwhelming body of molecular data (Serio & Lindquist 2000; Tuite 2000). It is important to note that unlike the mammalian prion, these protein- based elements of heredity do not cause organisms to die, but simply change their metabolic states. [URE3 ] alters nitrogen metabolism and [PSI + ] increases the trans- lational read-through of nonsense (stop) codons during protein synthesis (Lacroute 1971; Cox 1965). Like the mammalian prion, however, the protein determinants of these elements (Ure2 and Sup35, respectively) undergo self-perpetuating changes in conformation that alter the functions of the proteins. Because proteins in the altered conformation are passed from a mother cell to its progeny, the phenotypic change that is induced by the change in protein conformation is heritable. Remarkably, the altered protein conformation for both Sup35 and Ure2 is closely linked to the production of a protein amyloid, structurally related to the certain unusual protein conformations observed in many human diseases. The realization that heritable changes in phenotype can be produced in yeast by a change in protein conform- ation, and the discovery that the type of change involved is related to those associated with human pathologies, raises many questions. Here, we brie£y review work on one of the yeast prions [PSI + ] and then describe our recent progress on three outstanding questions. (i) Can we create new protein-based elements of inheritance, a¡ecting novel functions, by genetic engineering? (ii) Do other protein-based elements of inheritance exist in yeast? (iii) Can we use yeast as a model system for studying related protein conformational changes involved in human diseases? 2. THE PRION [PSI + ] AND ITS PROTEIN DETERMINANT Sup35, the protein determinant of the yeast genetic element known as [PSI + ], is a subunit of the translation termination complex. (The brackets indicate that it segre- gates in genetic crosses as a non-chromosomal element, as Phil.Trans. R. Soc. Lond. B (2001) 356, 169^176 169 & 2001 The Royal Society doi 10.1098/rstb.2000.0762 * Author for correspondence ([email protected]).
8

Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

Feb 21, 2022

Download

Documents

dariahiddleston
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

������������ ������ ����������������������� � �� ������ �� ����

����� ������������ �� ��� ���������� ������ ��� ��� ��� �����������

����������� ��� ���� ������ � ��� ���� ������ ��� ������ ������ ���� �� ���������� ���������� ��� ��� ��� ����� � �!"� �#$

��� �� ����� � �� ��� ����� �� � �� ��� ��� ����� �� �� ������ � ���� �� ������ ����� ������ ������� ��������� � ������ ���� �� ������ �� �� ���� �� ���� ��� �� ��� ������� �� �� ���������� � �� �� ������� ����� ��� ���� �� �� �������� ���������� ����� ����� ���� �� ������ �� ���� ��� ������ ���� ������ ��� �� ��� ������ � !%#� " #� � ������ �� ����������������� �� ��� � �� �� ��� ������ ���� $���� ������ ������ �� ������ �� �� ������� � � ���������� �� ��������� �� �� ������ �� � �� ������ ��� ������ �� ��� �� %��&'� (� ����� ��� �� ���� �� �������� �� ��� ������ � � ���� �� ������ ���� ��� � ���� �� � ���� ��� � ���� �� ������������ ������������ � �� ��� �� ��� � �������� ��� ������ �� )� ���� ��� �������� �������� �� ������������ ����� ������ � � �� ���� ���� ������ ���� ��� ������ �� �� ���� ������ *������� ������ ���� ��� ���� �� � ���� ��� �� �� � ������ ����� �� ��� ������ ��������� ���� �� +�� ���� �,� �������� -� ���� ������� �� �� ��� � ���� �������� ���� ����� ��� ��������� ������� ��� �� ������ �� ���� ���� ���������� � ������ �����

�������� ������� ������� ��� +�� ��� �,� �������� ����� -%.� %��&'

�� ����������

-���� ���� $�� ������ �� �� �� �� ������ ���� � �� ����� � ���� � ��������� ����� ��� ������������ ������������ �� ��������� �� �������� ���������� ����/�%0�1� 2���� ����� ���� �� ������ ����� ��� �� ���� �� � ������ �� ������ � ���������� � �� ������� �� �� ����� ��� ������ �� � �� �� ��� �� �� � ������� �� ����� �� ��� ������� ��� �� �������� ����� ���� �� ���� -�-� ���������� ��� � �� ��������� ������ ������ �� �� ��� ����� ��� -�-�������� �� ���� ������ ��� ����� ������������� ������ ��� ������ ��� ��� ����� ��� �� ������(�������� ����� ��� �� �� 3�� � ��� ������ /���4������� ��� ������ )�������� �� ��&� ��� ������ 4������ ��&� ��� �����1���� ���� ����� � �� ��� ������ ��� ����

����� ��� � ��� �� �� ����� � )����� �5����� �������� � �� ������� ������ ���� � � ������� ���� �������� � �� ���� 6 !%#� " # ��� !�'(!# /)����� �7781����� ��� ������ ��� ����� ���� � ������ ������������ � � �� ���� �� ����� ��� � ���� ������ �� �� ���� � �� �� �� � �� ����������� �� � �������� �� �/%��� 9 :���;��� �<<<� ��� � �<<<1� . �� ���� �� � � �� ����� �� ��������� ����� ���� �� ���� ���� ������ � � ������ � � � ����� �������� ���� � ������ ������ ���� �� � ��� � � ��� !�'(!# �� ����� ���� �� � ���� ��� !%#� " # ��������� �� ������� ���� ����� ����� � ������� /� �1 ���� ������

�� ��� ��� ����� /:���� � �7=�� 45 �7>'1� :�� ����������� ����� ������� �� �� ��� �� ������� � � ���� ������ � /2��� ��� %��&'� ������ �����1 ���������������� �� ��� ������� �� ������ �� �� �� �� ������ ��� � �� �� ����� ?������ �� ���� �� �� �� ���������� �� ��� ������ ��� � � ��� ���� � �������� �� ���� ���� ������ �� �� ������� � �������� �� �� ��� ������ �� �� ���� � ��� @����� ��� �� �� ���� �� ��� ������ �� �� � %��&' ���2��� �� ������ ����� �� ����� �� � � �� ���������� � ��� ������ ���� �� �� ��� ��� ��������� ��� ������ ��� ������ �� ���� ����� ������������ ������� �� �� ���� � �� ������� �� ���� ���

��� � ������� �� ���� � � ������ �� �� ��� ������� ��� ��� �� �������� �� �� ��� � ������ ��������� ���� �� ��� ������ �� �� � ����� �� ������������� ���� ;��� ���� +���� �� ���A� ������ �� ��� � �� ���� ����� !%#� " # ��� ��� ������ � ������� ������� � ���� � � ������ ;��� ���� /�1 4���� ���� � ��� �� ���� ���� ������ � � ������ ������B�� ��� ���� ���� ���� � ���� �� �����������C /��1 D ��� �� ���� ���� ������ � � ������ ���� �5�� ������ C /���1 4�� �� ��� ���� �� � ���� ��� �� ��� ������ ���� �� �� ��� ������ ���� ������� ��������� ����� ��������C

�� �� ����� ���� � � ��� ��� ���� ��

� � �������

%��&'� �� �� ��� �� ������� � �� ���� ���� �������� ��� �� !%#� " #� �� � �� ��� � �� ������ �� ������ �� �����5� /��� ���� � ������ � �� � �������� �� �� ���� �� ������ �� � ����������� ������ � ��

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1 ��� �>7E�=> �>7 � �<<� ��� @��� %��� �

�� �<��<7FG�� ��<<<�<=>�

�H� �� �� ������������ /������;��� I�����������1�

Page 2: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

�5��� �� �� � ���� ��� ������ � � ���������� �� ��������� �� �� ��� ������ ��� �� ���� �� �� ��� ������� � �� �� ������ �� ���� ��� �� ������ �1 .� ! ����#������ %��&' �� ��� �� ��� ��� �� �� ������ �� �������� ���� �� ��������� @JH� /% ���$��� �� ��&�77'� -� �� �� ��& �77>1� .� �� ��� � �� !%#� " # ������ �� %��&' �� ����� ��K ��� �� �� � ���������� �� ��� �������� �K��� ������� ���� �� ������ �� ������ ��/-� �� �� ��� �77>1� @� ���� ������� ���� ������������ ���� � �� �������� �� ���;������ ��� ������� �� �� ������� ���������� � �� ���������� �������� ���� �� ��5 ����� �������!%#� " # ������ �� ����� �� � ��� � � %��&' �� ���

�� �� !%#� " # � � � ��A����� ����� ��� ������� %��&'�� ��� ��� �� ���� � � ������ ������ ��� � ����������� �� ������ ����� �� � ����� A������� �� ��� /L*-1����� %��&' /-� �� �� ��& �77>1� J���� ��� ��������� ��� ������� ��� �� ��� ����� ��� �� � �� �� ! ����#������ � �� ��� ���� �� �����5�� ��� ������� �� �%��&' �� !%#� " # ����� ��� ������� �������� �� ������ ����� ��� ������ �� � �� !%#� " # ������ ��� ��� �������� �� ����� )��� �� ����� � %��&' �� ��������� �� �� �� ���� �� � ��������� �� ��� ��� ������ /J(1 �� ���� ��� ���� ���� ��� ���� �� �� �B��� � ����� ��� ���� ����� �� ������ $ ���� +������ �������5�� ��� $ ��� � ���� �� � !%#� " # ����� ��� ����� �� ��� ��� $ ��� ��� ���� ������� /L���� �� ��& �77=1�%����� ��������� �� � %��&' ������� � ��������

��������� �� �5������ �� ������� ������ � � ���� ��� ������ � ���������� �� ��� ������ �� ������� �� ��� � ���� � �� ������ �� ���� ���� ��� ����������� /������� ��1 � � � �� ��M��� �������� � ��� � ��� ������ ����� ���� �� ��� ������� ���� � � ������ �� ��� �� �� ���� � � �� ���� ��� ����� ������� �� � � ���� ����� � � ��������� ��� ���� ��

�5������� � /-������ �� ��& �77=� D�-��� �� ��& �77F�%�� � �� ��& �<<<1�

�� � ����� �� � � � ����� ������

� � �� ���� ����

��� ���� %��&' �� ��� �� ���� ���� ��� ��� ������/N������� �� ��& �7FF1� ��� J� ������� ����� /J1 �� ������ ��� ������ ���������� ��� ��� ���� ���� ������ . �� ��� ���� �� !%#� " # ������ ��� � �� �������� �� ��%��&',� ����� �������� ���� �� /N������� �� ��& �7FF�4����B �� ��& �77&1� ����� � �� ����� �� ������� �������� ������ ��� ������ ����� /(1 �� ������������� ��� ������� � ������� � ��� ������� ��� �� �B�� � �� � � ��� � � !%#� " # /O� O� :�� ��� %� :���;��� ����� ������ �� �1� ��� 4� ������� ����� /41 �������� �� ������ �� ������ �� �� ��� � �� �� ����� ��� ������ ��� ��� � /P��������� �� ��& �77'1� .� ���� ������ ���!%#� " #� �� J� ������� ����� � 2��� �� ��� ���� ������ ���� ������ ��� �������� �� �� �� �� ���,������ �������� ���� �� � ����� ��� �� ������ �� � �� !�'(!# ����� ��� ��� �� �� ������� �������������� ��� ���� ���� ������ � � !%#� " # ���!�'(!# ���� ��� ��� ��������� ����� ��� ������ � �� �� ������� �������� ����� ���� � ������� ���;��� �� ������6 ��� ���� ������� �������� ������ � ���������� ��� ������ �� �� ���� ���� � ���������� �� � ��� ���� ���� ��� �C 0��������� ��������� � ��� ���� ���� � ���� ����� � � ����

�=< %� :���;��� ��� ���� %����� �����* ��������� � ��� �������

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

N M C

(a)

DBD LBDAD

NMGR

NMGR526

Sup35

GR

(b)GRE/CYC1

β-galactosidase

*����� �� ��� ������ ���� ����� � /L@1 ���� �� ��� ���/�1 H ������ �� � ��� ��� � �� L@ �� � �� ���� ��� ��� ������ ����� HD� �� ��� �� ������ D?D� DJH� ������������ :?D� ������� ������ ������ /+1 ������� ���������� �� ���� ����� �� ������ �� � L@0 ��� �� ���� 4Q4� ��� ��� *����� �� J(L@'�> �5�� � �� � � � ��� ��� ��� ���� ����

� � ��� H ������ ���� � /�1 � ��� � � /+1 � ��� ���� � ����� ����� �5�������� J(L@'�> ��� ��� ����� � L@0����P���� �� /� ���� =8D�>78 �,�#�%!-1 ��� � ����� � ����� ��� ������ �� � ����� ��� ����������� �� � R�LH: �� ������ ��� � �� ���� ��������� ��� H ����� ����� ���� ���� � � ��� �� �������� ��� �� �� �� � ��� � � �� ��� ��� ��� � ������

Page 3: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

������ �� ����������� � ��� ������ ��� ��� ����� ���� � ����� ��� ��� �� ��� �� �������� ��� ������� ���� ������ �� �� ���� �� �� ������� �������� ����� ��

�������� ��� �� ����� �� J ��� ( ����� � %��&' �� �� ������ ���� ����� � /L@1� �� ������ ����������� �������� �� ��� � /$���� ��1� ���� ���J(L@�)� ���� L@ �� ������� �������

/�1 . �� ��� �� ���� ������� ��� �� ������� ��� ��� ����� �� ����� ��� ������ �� �� � %��&'�

/��1 . � �� ��� � � � � ��� � ��A����� �� ������� �� �� ���� � ���� �

/���1 L@ �� ��� � ��� � ������ �������� �� ���� ������� ������ � ���� �� ������� �� � � L@ ������������� /L@01 ����� � ������� ������ ���� ����� ��� /%����� 9 Q���� �7FF1 /$���� �+1�

/��1 L@ ��;����� ���������� �� �� � � �� ��� �� ������;������� �� ���� �� ������ ���� �� ������� ���� �������� ��� �� �� ���� ������� ���� � � �� ��� ��� ����� �����5��� .� ���������5�� ��� ���� � ��� � � ��� ������������� ���

-������ � ��� � ���� � ��� ����� � ������ ��������� �������� ����� � 2��� ������� ������ � �� J( ����� � %��&' $��A� ���������� ������ ���� ��� � ������� ������ ��� ����������� ��� �5����� ��

�� ���� ����� � �� �� ���� �� �� ���� ������ � ������� �� ���� ���� ��� �� � � ��� �� ���� ���������� ���� ������ �� ��� ������ ���� �� � �� �� �������� � ��� ������ ��B��� ��� ��������� �������� ������� �� � ��� �� ���� �� ��;���� �����$� ������� ��� ����� �� �� ���� �� ��� ��� ��� � �� ������� �� �� �� ���� �� � ��� ������ %���� L@ ����� � ���� �� �� ������� �� � � ���� ��� �� ���� ��� � ��J(L@ ����� �� ��� ��� ����� ������� �� ��� �������� ������� � L@ ���� ��� .� �� �������� � � L@������� �� ������� ������ ���� �� ���� /�'(.�� / 1 ����������� � �� � �� � /R�LH:1� ���� ����� �� ������J(L@ �� � �� ����� ������ ���� � � � ����� � ���� � ����� �� � J(L@ �� �� ���� ��� ����������� ��� ��� ���� �� ���� ��� ������ �� ������� �

��� � � ��� ������ � L@ ������ L@'�>� � ���� �������� ��� ��� �������� J( ������ � %��&'� ��������� � ���� � ���� �� ����� ��� ����� ��� ���� ����� �� ������� /�,�#�%!- =8D�>781� � �� ������� �� J(L@ ���� ���� �� �� � ���� � � � ��� ���� ���� ��� ��������� �� � L@'�> ��� J(L@'�> �5�������� ��������� .������ � ��� ��� ��� � ������ �������� �$�� ��� ����� �5�������� J(L@'�>� � ��� ��������� ���� ������ �� L@'�>� 2�� ���� ������� ��J(L@'�> ����� ���� ����� ���� ����� /$���� �1� :�� �� !%#� " # ������ � ����� ��� ��� ������� ��� ��

%����� �����* ��������� � ��� ������� %� :���;��� ��� ���� �=�

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

W B W B W B

1 2 3{ { {

W B W B W B

1 2 3

{{{

1

2

3

4

5

6

7

(a)

(b)

–GdHCl +GdHCl

β-ga

l act

ivity

(×1

07 )

NMGR526

*����� &� ��� ���� ��� �� �B�� � L�+4� � J(L@'�>� /�1 H ��� � ���� � � J(L@'�> ��� � ����� � � ����� ��� ��� �� ������� � /%41 ��� � ��� ����������� �� � %4 ��� �� �� � � �� �� '�( L�+4�� H� �� � ����, ��� �� ����� ��������������� �� � R�LH: �� ������ ��� �� �� ���� ��������� ��� /+1 ����� ����� � ������ ���� ����� ��� ������������� ��� � /�L�+4�1 ��� ��� / "L�+4�1 ��� �� ��� ������ �� �� &�� %4 ��;��� ������� H� �� ������� ��� �� &< �4� ��� ��� ��� ��� ���� ������ � �<�� ����� ������� 0��� � &�� ��� ��� ��� ���� �� ������� ������ ����� ���� ���� ���� � ������� ��� ������ ������ �� �� 8 � ��� � � &< �4� ��� �� �� �� � ������� ������ �� ��� �� %D% E-HL0� �������� � ��� �������� ����� L@������$� ������� �� � �� ?�L@�� ���� �������� �� ������ �� �� :� 9 :���;��� /�<<<1�

Page 4: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

� ���� ! ����# ��� !%#� " # � � �� � � �� ���;�����/45 �7>'1� ��� ����� ���� ���� ��� � ����� ��� ��� ������ ���� ���� ��� ����� � � �� �� � /$���� �1� .� ������ � !%#� " # ��� �� ��� ���� ���� !�'(!#� ��� ���� � �� � � �� ����� �� �� � �� �� ��� ���� ���� ���������� ����������� /L�+4�1� ��� ������ � ������ � � ��� ����� ��� �� ������� ���� ���� ������� ���� � � � �� ��� ��� ���� ���� ������ ���� � � �/��� � �� ��& �7F�1� ���� ���� ��� ��� ������ �� �����S������,� � �� ��� ��� J(L@ ����� ��� �� 3�� ������� �� ��� � ����� � J(L@'�> ���� ����������� ��� ����� �� � � �� �� ' �( L�+4� ���� ������������� �� � R�LH: ��� ��� H� ���� ����� �� �� L�+4� ��� ��� �������� ��� �� ����� �� ����������� ����� L�+4� ����� ��� /$���� &�1� ���������� � ������ ���� ����� ��� ��� �� �� � � �� �� L�+4� ;��� ��� �� ���� �� �� ��� �� ��� ��B������ �� �� �� ��� � � L@ �� ��� � ��� ��� ������ ��� �� ���� �� � �& ������ /$���� &+� ��� 1� .���� � ����������� ����� � L@������$� �� � �� ������ �� �� ���� � ��� ��� ����� ������� � ������� ���� �J(L@'�> ����� �� ��� /$���� &+� ���� 1� ����� L�+4� ��� ��� � �� ���� ����� ��� � ������ �� �5������������ � �� ����� �������� ���� ��� �� .�� ���� � ������� � ���� � �� ������ �� � � �� ��� �� �� � �� ��� � ������ �� J(L@'�> ������ ��� H� ��� �� � ���� ��� ������ �� ��� �� �� L@ �� ��� � ������ ���� ��� �������� ��� � +���<8� ����� ����� � ��� ������� �� !%#� " # ������ ��� 0� ��� ����5������� ����� �� � +���<8 � ������ !%#� " # /4����B �� ��& �77'�-� �� �� ��& �77>1 %��������� ���� �� ��� � J(L@'�>

����� ���� ��������� �� � �� +���<8 ����5��������������� ��� ������� ��� /�� � � ����1� 0��� �� �� +���<8 �5������� ������� ��� ������� ����������� ���� ������ ��� �� � ������� �5������� �+���<8 �� ����� ����� �� � ���� � �� ��� �� � ������� J(L@'�> ��� �� ���� ��� ���� ������ �� ���� ��� ������ ���%���� �� �5������� � ������ �� ���� �������� �� �

���� � ���� ���� �������� J( ����� � %��&' ������� �� ��� �� ������ �� �������� �� J(L@'�> ��

���� �� � ��������� ���������� �� ��� ������� �������� �� �� ����� �� ���� � �� ������� �� ����� ���� ���� �� J(L@'�> ����� �� ��� ��� �� �� � ����� � � ��� ��� ����� �� �� �� ��� � J(L@'�>

����� ��� ���� �� � ����� ��� ��� ��� L�+4� ��� ���� ��� +���<8 ����5������� ��� ������ �� �� ����� ���� �� ������� �� L�+4� ��� +���<8 �� ���� �� ���� ��� �� J( ����� � %��&'� ���� �� ���� ��� �� ����� � ����� �� � �� �� J(L@'�> ������� ��� ��� �5�� �� � ���� � ��B���� ������ ����� � ��� ����� ��� �� ��������� �� ��� �5������� ���������� ���� ����� �� ���� �� ������ �� ����� �%��&' �� � ������ ��� �������� ���

�� �� ���������� �� � � ������

-������� ���� �� ������ � ���� ��� ���� �� �#� ����� �� ��������� ��� %����� ��������� .� ���� ������ �� !+� ��# ���� � %����� ��� �������� �� ���� �� ���� ��� ��������� �� ������ � �� ������ � �������/4�� � �� ��& �77=1� . �� ���� ��� �������� �� ����������� �� ���� �� ��� ������� ��������� ���������� �� �� �� ����� ��� ��� ��������� . ��� ���� �� ������� �� ��� �������� ������ ������� ����� �� ������� �� ��;����� �� ��� ���� ��� ��� ��� ������� ��� ��� ;��� �� �� ���� ��� ��� � ��� �� �� ��� ������ ���� �� � ����� �� ���� ��� ����� ��� �� � � ������ �� ��� ����� �� �� ����

������ �� $�� ��� �� �������� ��� � ���� ������� !%#�0# ��� !�'(!# �� ���� ������ ����� ������ ����� H� ���� �� ����������� ����;������ � �� � ��� ����� ��� ;�� � ��� ��� K����� ����� �� � ���� � ����������� � �� ���� �� ��K ���� ���� ���� �������� � � ���� �� � �� ���� �� �������� ���� ������ ? � %��&' ��� 2��� �� ��� ������ ������ �� ���� ����� �� �� �5 ������ ���� ������ ���� ������ .� � ������ �� ���� ����� ������� ��� �� �� ���� �� � �� ����� � �� � ��;����� �� �� S�����, ���� �� � %��&' � 2����)� �5��� �� ��� ���� ��� ��� �� � ������ �� ���

���� �� ����� H ?:H%� ������ � �� ���� �����

�=� %� :���;��� ��� ���� %����� �����* ��������� � ��� �������

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

donoraggregated

Rnq1

recipientsolubleRnq1

plating to5mM GdHCI

recipientafter

cytoduction

*����� 8� 4� ��� �� ������� �� ������� ������ ���� � � @�;�� ���� ����� ��� �������� � � 1��2.2 ������ �� �� � ��� ��� ��� ���� ������ �� ��� ��� �� ������� ����� � ���� � �� ��� ��� ���� �� �� ������� ����� � �5��������������� � �� ����� �� ����� �� ��� �� ������� ������ ���� � ��� �� .� ��� �5������� � @�;� ������� ��� ��� � ����/����� �� ������ �� �������� DJH1 �� �� �� � @�;� ��� �� �������� /��� " � ������ �� �������� DJH1� ��� ����� ������ ������ ��� � ����� �� � ����� ������ ��� ���� ��� �� ������ ������� �� � ��� � ������ 05������� �@�;��L*- ����� �� �� �� ������� �� � � � � �� @�;� �� ���� ��� � ��� � ���� �� ���� � �� ������� �� � � � �@�;� �� ����� �� �� � ��� ��� '�( L�+4��

Page 5: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

����� �� ���� ������ � %��&' ��� 2��� /���� ������E��8 ��� �E>'� ������ �����1 ���� �� �� ��� ��� ��� �������� ��� )� ����� ��� ��� ��� � ����� ��� �� ���� �� ��� �� ��� �����G��������������� ����� � �� ���� �� �� ��� ��;����� �� �� ����� �� ��� ������� � ����� ��������� ����� ��� ��� � ����� ����� ���� �� ���� �5������� � � ��� �� ����� ������ �� ���� ������ )� ��� ����� �� ������� � ���� ������ L*- �� ������ ��� ��� �5������� � �� �� ������ ������� ����� ������ �� ���� �� � ������� ���%������ � �� ������� � ��� ������� ������ ����� ���� ������� ��� �� ������� ���� � @�;� ������ � �������� �� ��� �� ���� ��� ��� ������� �� �� ��� ����� � +���<8� ���� ������� �� ��� � ������� $����� ������ � ����� ���� ���� �� !%#�0# �� ��������� ��� �� �������� � +���<8 /4����B �� ��& �77'1����� ��� ���� �� � � ��������� ��� ��� � � ����� � � ������� � �������� � �� ��� ��� ���������2���� � ����� � � �����;��� �� ����� �� �� ��

@�;� ��� � ������� ���� ������ �� #& ��������� /%��������� 9 :���;��� �<<<1� ��� �� ��� �5�� �� �� ���B���� � � ��� ������� �� ��� ��� ��� ��� ���� �������� ��� �� ��� �� �� ������� �� � � � ������� ��� �� /��� $���� 81� .� ��� ����� � � ����� �� � �� �� ��� �� ��B���� � � �� ���� �����K������� �� �������� ��5���� � � ������� �������� )��� �� ��� ������ ���������� ��� � ����� ���� ������� ��� � ��� ������ �� ��� ��� ��� ��� �� �� ������� ���� � �� ������ ��� �� �� �� ��� � � � ��� ��� ������� �� � �� ������� �� �� ����� ��� � ��B���� � � �� ���� � � �� ��� ���� � ��� ��� �� �� ��� ���� ���� ���� � ���� �� � � � �� ����� ���� �� ��� ��������� �����;��� /���� �� ���2 3 ���� �� ���

L�+4� ��� ��� 1 /%�������� 9 :���;��� �<<<�$���� 81���� ���� �� � @�;� �� ������ ��� �� ���� � � �

� @�;� ��� � ������ �� ����� �� ���� ���� ��� ������ �� @�;� ��� ���� �� � �������� � ����������� �� �� �� ��� ���� ��� �� ���� �� � ������������������� �� ����� �� �� ������� �� �� ��� ��� ��������� � @�;� ��� ����� �� �� ����� � �� ��������� � ������ %��&' /$���� '�1 ��� �� � ��� � � �� @�;� ���� ����� ������ � ��B���� ������� �� �� ��� � � � �� /������� �� !%#�0# ��� ! ����#� � ��1 ��� ��������� ��� ����� � @�;�/�'&E8<'1 �� �%��&'/��'E>'&1 ���� �� � ����� ���� ���� �� ��� �� ����� �������� �� ���� ����� �������� �� ��� �� �%��&' /$���� '+1�L���� �� ���� �������� ������� �� ���� �� ��

�� � ��� ������� � ����� ����� �� ��� ��� � ����� ������������ �� ��� �� � ��� ���� �� ���� �� #& ������������ ��� ������ ��� ��� ������� ����� J��� �� ���� ������ �� �� ���� �� � �������� �� �� ��� � � ��%��&' 4� ������� ����� �� �� ����� ������� ������������ �� � @�;� /%�� � �� ��& �<<<1� ������ ����� ���� ���� ������ �� ��� ���� ;��� ��� � ��

%����� �����* ��������� � ��� ������� %� :���;��� ��� ���� �=&

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

PrD

N M C

PrD M C

(a)candidate ORF

Sup35

YPD SD-ade(b)

[PSI+]

[psi–]

PrDMC [+]

PrDMC [–]

*����� '� H �������������� �� �� �� �5������� ������������� ������ ��� � �� � ��� ���� ������ /-�D1���� -�D � � ������� � ��� ������� ����� �� ����� �� �� ������� �� ����� � �� J� ������� -�D � %��&' /�1� ��������� � � ��� ����� �� ��� �� �������� �� ������� �����*��� � � ��� �������� �� ���� �� � %��&'� %���� � ��� ���� �� �5�� ���� � � ���� � � ��� �� ��� �� �%4���� /��� !%#� " # ��� -�D(4 !" # �� /+11� ��� �� ����� ��� %4���� /��� ! ����# ��� -�D(4 !�# �� /+11� ����5������� ���� �� $���� 8+ ���� @�;�/�'&E8<'1 �� ���� � � � �� -�D�

Q25 Q47 Q72 Q103

supernatant pellet

vect

or

Q25

Q47

Q72

Q10

3

vect

or

Q25

Q47

Q72

Q10

3

(a)

(b)

*����� >� 4��������� � ��� ��� �� ������� � �� ���� �� � � ������ ����� ����� � /�1 T�������� �� � ��� ��� ������������ �� ������ ���� ����� � A���������� 4���� ���������� ������ � ���������� ��� �� ������ �������������� ���������� � ��H5����� ��������� /P����� L������1�/+1 %�� ��� � ������ ��� ���� ����� � ���� ����� ��� ������5�������� ��B���� ��� ��� ��EL*- ����� �� ���� ����������� ����� ���� ����� ��� %����� ��� ����� /$�������� �� �� �U1� H� �� ��� ������ ��� ������� �� �������� ���� ��� ���� �� 3�� �� FU %D%E-HL0 �������� � ��� ����� �� � ���� ����� �� ������ L*-�(���� ��� ��� ��� ������ �� � �� ��� ��� �� � �������� F&� '��F /D�1� ��� ���� ���� �� � � �� ����

Page 6: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

������ ���� $���6 +� ���� ��� ����� �� �� ���C+� � ���� ������ �����C +� ��� ��� � ���$ ���� �� �C

�� � ��� �� � ��� � ���� � ���

����������� ��� ��

��� ������� ���� � ����� ������ � �� �� ���� ��� �� �� � ������� � �� ����� ��� ��� ���������� �� ��������� ���� ������� � �� ����� H ���� ������������������� ���� ����� ������������ ��� ��������������� �� ���� ������ �� � �� ����� H� ���� ����������� ��� ������� ���� �� ����� ��� ������ ��� �� ����� ��� �� �� ������� �� ������� ��� �� �� ������� �� ���� �� �������� �� ���� �)� ��� �� ����� ��� � �������$� �� �� �������� �� �� �������� � ������� ���� ������� �� �� ���� ���� � ������ �� ��� �� � ��������� ���� � ���� �� �������� �� ���� � ����� ��� � ���� ��������� ��� $�� ���� � � ��� �� +�� ��� �,�������� /+D1�H ������� � +D �� �� �������� � ������� ���

����� �� ������� �� ����� � J� ��������� ����� ����� ��� �� �� ��� �� � �� �5������ � ������ ����� �� ���� ����� � +D �� ��� � ��� ��������� ���� /@������ ��& �7771� ��� J� ������� ����� � ��� ��� ����� ������ �'� 8=� =� � �<& ��� ������ /V�'� V8=� V=��V�<&1� ��� ����� L*- ��� �5������� �� ����� ������� � *���������� � V�' ��� ��B����� ��� �� � �� �� �������� /$���� >�1� V8= ��� ��������� ��B����� ��� �� � ����� � ���� ��� �U � �� ����� �5�� � ��� � ������ ���� �A���������� (�� ��� ���� � �� ����� �5�������� V=��� ����� � ������ ���� �� � �������� �� ��B��� �������� A���������� .� �� ����� �5�������� V�<& ���� ��� �������� �� � ������ ���� ��� �� �������A��������� ��� �� /$���� >�1� ����� �� ���������� �J� ������� ��� ��� �� ������� � ������� � �� ���� �� �� ������ ����� ����� �� ����� ��� � ��� ��� ���� �������� ��� ��A�� ��

���� �� � ����������� �����5��� ���� ����� ������������� �� ��� ����� �� �� �������� � �� �� ����� %������ H� �� ��� ������ ��� �� ������� �� ��� ����� ���� ��� ���� ���� �� ������ �B�� �� � 'U %D% ���<���� ������ �� � FU %D%E-HL0 ��� �������� ������ � ��� /$���� >+1� V�' � V8= ��� �� �� ��

��� �� �� ������� �� ���� ��� ������� V=� ��� ����� �;��� ����� �� ��� �� � ���� ���� .� �� ��� ��� V�<& ��� �� �� �� �� �� ����� ���� ��� ��� ���3� ���� �� � ��� �������� � �� � � �� ���� )�������� �� �� ���������� �� ��� �� ���� �� ������������ �����5���4������� �� ���� ��� �� � �;�� ��G�� �����

�� ���� ��� ���� � ������� �� �� ��������� ���������� �� � ������ �������5������ �� �� �� ����/4��� �� ��& �777��+� 4������� �� ��& �77F� % ����� �� ��&�777� )� �� ��� �� ��& �<<<1� � ������� �� ;��� �� ���� ��� �������� �� ���� ��� �� � �;�� �� �� ������� ������� �� �� ��������� � ��� ��� �� �� �5������A��������� ��� �� V�<&EL*- ����� �� � ����� �� ������� �5������� � ������� +��� /���� �� �� �� � �������5������� ��������1 /$���� =1 ��� �� � �� � ��� �� �� � �;�� ��G�� ����� �� �����

�� ��� ������ ��������� ���� �� � �� ����� �� �� �������� �� ����

��� � �����$��� �B�� � �� ���� �� � ������� ��

�=8 %� :���;��� ��� ���� %����� �����* ��������� � ��� �������

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

WT Sis1 Hsp70 Hsp104 hsp104∆

no foci offluorescence

most proteincoalesces

into one ormore foci withconsiderablebackgroundfluorescence

most proteincoalesces

into one ormore foci withconsiderablebackgroundfluorescence

most proteincoalesces

into two fociwith low

backgroundfluorescence

most proteincoalesces

into one singlefocus with

low backgroundfluorescence

*����� =� 4������� �� ���� �B�� �� ���� �� � ��� ��� �� ������� ��� (������� ��� �������� �� � ���� ����� ���� +���<8���$���� ����� �5�������� �� J� ������� ����� � ��� ��� �� �� � �<& ��� ������� H��� ������� ����� ��� ������������� ��� ��� �� �� � �<& ��� ������ ���� ��������� �� � ��������DJH ����5����� %���� +��=< � +���<8�

Hsp-deficientstrains

Hsp-overexpressingstrains

hsc82

hsp26

hsp35

ydj1

ssalssa2

ssa3ssa4

hsp104

SIS1

SSA1

HSP104

HSP82

YDJ1

*����� F� +�� ��� �� ������� �� ������� � �� ������ ��������� �� ��� ��� �� �� ����� ��� ����� �� �� ���������� �� ��� ���� �� � +�� ����5�������� � ����� ����� .� � �������� �� �� �� ������ � �� �������� ������� �� �� A����������� ��� ���� ������ �� �������� �� A����������� ��� � ����� ��� ������

Page 7: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

/$���� F1� H ����� �� �B�� � ������� ��� ���� �� �� ���� ��$���� �� +���<8� ��� A��������� � V�<& ������ �� � �� ��B����� ������ �� ����� ������� �� ����� ��� ����� � ������ A������� ���� ��� ������/$���� =1�

�� ��� ������������� ����5������� � ���� �������� �� ���� ��� �

�����$��� �B�� � �� ������� �� � V�<&� .� �� ��� ����� ��� ������ ����� ��� � ������ �� ���� ����� ���������5�������� %��� / �� ���� +�3� ������1 �5�� � �� � �� ���� ��� /$���� =1� .� ����� ����5�������� +��=<� +���<8� �� � ��� �������� ��� ���� ��������� �� ������� A��������� ��� �������� �� ������ ��� �� ����� ��� ����� /$���� =1�

�� ���������������� �������������� ��� � ������

J ���� �B�� � V�<& ������� �� ��� ������ ����� � �� ���� � ����� �� �5������ �� � ��� ��� ���������� �� �� � ��� �� �� �� ����� �� ���� /�� � � ����1� .� ���� � ����� �� � �;�� ����� ��� ��� ������/� ��1� � �� ��� �� �� ��� � �� �<% �� ����� /��&��1�� � �� ��� � �� �7% �� ����� ������ �� �����5/���&��1 ��� �B�� �������� ����� ��� �� � ���� ���� �� � ���� ��� ��

�� ����� ��� ��� �� ���� �� �B�� �� ��������� ���� ��� �� �� ���� �� � �5������ ��� ����� ��� ��H� ���� ��� ��� �� �� ����� ��� �� � �� �� ���������� ���������� ������ �� ����� ��� � �� 5�� �� ���� �� �� � ������ �� � ��� � ��� ���� .� �� ���� ��� �� �� �5������� � J� ��������� ����� �� ��� ��� �� �������� � �� � ��� ����� �5������ �� ��� 5�� /�� ��� �� �� ��� �� � ������� �� � � �1� ��� ������� ����� ������ �� � ������ �� ��� �� �� ��A����� 5��� � ���� �������5������ �� �� �� H��� ������� ���� ��������� � ��B���� ������ �������5������ �� ���� ��� ����� ���� ��� � �� ��� ������� �� ���� � ��� ���� ���������$� ��� �� �� �B�� ���������� ������� ����� ������� ���

� � � � �

4���� Q�� N���������� %� :�� %����� �� %� O�� -����� (� N� 9-������ +� :� �777� 0������� �� �� ����� ��������� �� ������ ����� �������6 ������� �� ������� ��������� ��%4H&G(OD ��� ���������� � ������ ����� ������� �� ������� ���& ��& �����& �� >=&E>F��

4���� Q�� N���������� %� :�� ?����� J� (� 9 -������ +� :��777+ H������� � �� ��� � ��� ��� �� ��� /+��1 ��������� ��������� �� ������ ����� �������� 4& ,���� �& ����< &&FE�< &8=�

4����B� Q� ��� D������ .� :� 9 .����T��� ��� %� L� �77&(�� ���� #�%!- ���� ������� �� �� ���������� � ���������� �� �� �� ���� #� ����� �� ���������� ����& �����& ��� �>FE�=<�

4����B�Q� ��� :���;��� � %� :�� ��� ?�� .����T��� ��� %� L�9 :�� ���� %�)� �77' @�� � �� �������� �� ��� +���<8�� ������ �� � �� ���� �������� ��� � !���"#� # ��� ����� FF<EFF8�

4�� �� T�� D����� 4�� %����� %� 9 ?������ � O� �77= ����� ��� ����� � �� ���.� �� ������ ������ � ��� � ����� �� ������ %����� �������� ������ �� � ���� ������ %� &,��� $ ��& # �& �#$ ��� 7==&E7==F�

45� ?� %� �7>' � H �� ������� ��������� � ����������������� ���� � �������� ��� '<'E'���

4�������� 4� O�� (������� (� H�� H� ��B�� ?�� D�*�����D� ?�� ���� +� �� 9 P�� �� +� Q� �77F 4����������������� � ������� �� ��� �� ���� �� �������� �� ������ ������� �� ����� �� ��� ��������� �� %4H�� ,����������& ��� �8FE�'8�

D�-���� H� +�� %�� �� H�� +������� -� 9 )�������� O� %� �77FH ��� ���� ��� �� ����� ������� ��� �����G��������������� � �� �� ���� �� ��� ������ �� � � ���� ����� ������ ��8�E��'��

L����� O� @�� N���� H� %�� %�������� 0� 4�� -� ��� (� (��:��� O� O� 9 :���;��� � %� �77= %���������� $ ��� ����� �%��&'� �� �� ��� �� ������� � !-%. " #� � ���� � �� �������� ��� � � #& ���������� ���� ��� F��EF�7�

N�������� T� T�� ����H��������� (� D�� ������ (� T��%�������� H� -�� %������ T� J� 9 .����T��� ��� %� L��7FF J���� ��� ��;����� � �� #�%5 /#�%!-1 ���� �#� ����� �� ���������� ���� ��� 8'E'8�

:���� �� *� �7=� J��(�������� �� � �� ������� �������������� ���� �� �� �� ���� � 4& �� �����& ���� '�7E'���

:�� :� 9 :���;��� � %� �<<< 4��� ��� � �� ���� ���� ������ ������� ����� # ��� � ���� >>�E>>8�

-� ��� (� (�� :��� O� O�� L����� O� @� 9 :���;��� � %� �77>%���� �� �� ���� ��� ����� �� ������ ���� � � ����� ���� ��� �� ���� � # ��� � ��� >��E>�>�

-������� %� T�� N�������� T� T�� %������ T� J� 9 ����H��������� (� D� �77= �� ���� ������ �� � �� ��������� � � � ���� %��&' �� ���� # ��� � ���� &F�E&F&�

@����� -� +�� )�������� (� 9 ������ D� H� �777 @���� �������� �� ������ ������ �� �� �������� � +�� ��� �,���������)����� ,���� �& ��� �8FE�''�

%�� �� H�� 4����� -�� ���������� :� P� 9 )�������� O� %��<<< (������� ���� � � ���� ���� ������� ������� ���� �����==E�FF�

%������ (� 9 Q���� � N� @� �7FF (�������� ������ ����� ����� � ������ ���� ������� �������� �� �� ���� �# ��� � ���� 7>'E7>=�

%���� �� @� 9 :���;��� � %� :� �<<< -� ������� ������ ���� ������ 6 ��� ���� �� !-%."#����� � � �)����� ���� ���& ���7FE�<'�

%��������� J� 9 :���;��� � %� �<<< @�;�6 �� ������� �� ����$�� � �� ��� ���� �� �� ���� � ��& ����& �� �>&E�=��

% ���$���� .�� O���� N� (�� N��������T�T�� D�������������H� @�� -�������� H� .�� -������� %� T�� J������� 4� @��45� ?� %�� ����H��������� (� D� 9 ��� �� (� *� �77' �������� � � �� #�%3- /�'621 ��� #�%!- ����� �� ���� ����� � ������ �� ������ �� �� #� ����� �� ����������(��74& ��� 8&>'E8&=&�

% ������ D� :�� 4�������� 4� O�� H����� +� -�� (������� (� L��-� ��� N�� D�(�� ��� L� J�� (�������� (�� )������ J� :� 9(������� (� H� �777 -����� �������5������ ������������ �� ��� ������� �� �� ��;��� �� ��� ��� �� ������� ����� ������ � ��� %@4��� ��� ��� ���������� � �� +DO�� ��������� ���& ��& �����& �� =&�E=8��

��� �� (� *� �<<< Q��� ����� ��� ���� ����������� ���������� ���� �F7E�7��

��� �� (� *�� (����� 4� @� 9 45� ?� %� �7F� H��� � �� ������ ���� ���;����� � ���� �� ������ ��� ! ���"# ! ����# ��#� ����� �� ���������� ������ � ��� >7�E=���

)������ @� ?� �778 !2@0&# �� �� �� ���� 2@0� �� ���6�������� �� � ���� ����� �� #� ����� �� ���������� # ��� ����� '>>E'>7�

)� �� ���� H�� 4���������� O�� %��� �� O�� *������ @� H��J������ Q�� @����� O� 9 @� ���� ���� D� 4� �<<< 0B�� � ���� ���� ��� ��� �� ��� 8< /+DO��1� ��� �� ��������� � �� � �� ��� ������� �� �� �������� ����� �+�� ��� �,� �������� %� & ,��� $ ��& # �& �#$ ��� �F7FE�7<&�

%����� �����* ��������� � ��� ������� %� :���;��� ��� ���� �='

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1

Page 8: Investigating protein conformation-based inheritance - Lindquist Lab

P���������� L�� *����� :�� :� LB� R�� :� L������� @��.����T��� ��� %�� N�������� :� 9 -�������� (� �77'������� �� � ������ �� �� ����� �� �� ������� � ��� ���� ��� ������ ��� ����� ������� ��� ��� �@*� ��� �@*&�(��74& ��� 8<>'E8<=��

��������+� -� /���������� �� ��������� ���������� ���+�������81� 4���� D �� ��� ���� ������� �� �� ��� ��� �� �� ��� �� �� ������� ��� � �� ���� ��� ������� ��� �� ��� ������ �� ��;��� �� � �� ����� .� ��� ��� �� ���� ����� �� ���� ��� ���� �� � �5��� �� �� ����� �� ��� �� ���� ������ � � ������� ��� � ������ �� �������� �������� �� ����C (��� %��&' � �� ��� ��� � �� �����C

%� :���;��� � (� �� ���� ���� ������ ���� ��� ���� �� �� ����� ��� ��� ������ $ ����� +������ ��� ��� � ��� ���� ��� ������� �� ��� � � ����� �� ��� �� ��� ������� ������ ���� �B�� ����� ���� ����� ����� ��� � ���� � � � �� � ��B���� ���� � ������ ���� �� � �� ���� ������ %���� ���� ��� ��'E&< ���� �� ���� �� �� ���� ����� �� ���� � ���� ������� ���� ��� � �� �� ������ � 3�� �� �� ������������ � �� �� �� �����

H������� 4�� �� ��� �� ���� -�� ����� ��� ���� ��� ��� �� ���� ���� ����� ��� �� �������C

%� :���;��� � J� )� ���� �� ��� �� ���� ���������� �� �� %��&' �� ��� � ���� � ��������� ������ ����� � %��&'�)� ���� � �� ���� �� ��� ��%��&' �� ��� �� ��������

H������� .� ����<8 �������� �����$����� �� ��� ���C

%� :���;��� � ���� �� �� �� ���� ��� ;��� ��� )� ���� ��� ����� �� ����<8 �5�� �� ������ ���� �������� � � � ��� �� �� ���� �������� ����� ���� �� � )� ���� ����� �� ��� � ����<8 ������ ���$��+������ ��� ���� �� � �� ����� ������ � ����<8 �� ��� ���� � �� ��� �� ��� �������� � �������� �� ����� ������� � ���� ���� �� % �� ��� � ����<8 �� ���� ������� �� ������ �������� ��� ��� ����� ������ �� �� ���� ��� )� ��� �� � � � � ��A����� �������� �� ���������� �� ���� ��

H������� Q�� ����������� ������ � ������������ � ����� ������ �� ���� ���� ��� � �� ������� ���)�� �� ���C

%� :���;��� � ��� ���� ��� �� �� ����� �������� ��� �� ��� �� ��� ����� �� �� ���� ����� ��� ����� � ��� ���� ������ ������� � �� ��� �� �� ���� ����� ��� �� �� �� ���� � � � �� � ��� � ��� �� ���� �� ���� � � �� ��� � ��� �� � ���������� � � ������� ��� % �� ���� ��� �� ��� ����� �� �� � ����� �� ��� �� � ����� ���� ����� ������� ����� �� ��� �� ������ � �� � �� � �� �������� �� ���� ����

4� (� D �� /79�� ������ � ��� ���� # ��� ��� ,����������� ��+������ ���������� 79��� �81� ��� ��������� � �� � �� ������ �������� ���� � ���� ���� �� ��� �� ����� ������ �� ��� �� ����� �� � ��� �� �������� �� ��������� � � � �� ���� �� ���� � 3�� ��� ��� � ����� �� � �� ���� � ��� � ���������� �� �� � � ������� �� �� �� ���� ���� � � ��

H������� D�� . ������ ��� �� ��� �� �� ��������� �� ��� �� �� ���� ��� � ������ ��;�����C

%� :���;��� � J� ��� ������ �� ���� ��� � ��������;����� ��� �� �� ��� ���� �� �� �� ���

H������� .� ����<8 �����$� �� ��������� ��� ������������� ��C

%� :���;��� � ��� �� �� ���� �� ;��� ��6 � �� � �����$�K� ���� ���������� � � ���� ����� � ��� ������ ���� �� ���� �� ���� � )� � ������ ����� �� ���� ���� �� ��� ��� ��� �����5� +���<8 ����5������� ��������� ������ ����� �� ��� ������� �� �������� � ����<8 ���� �� ��� ������ ���� ������� �� ��������)� ��� �� �� � �� �� �� �� ���� �� ���������� ��� � � ����<8 �� ��;����� �� �� �� ��� �������� � ������ � �� � � �� )�� ��� ������� ������ �� ������� � �� � � � ������� � ��� ��� ���� �� � �����5�� ��� ���� ���� � � � -������ +���<8 ���� ��������� ������ ���������� �� ����� � � ��� � ����� ��� �� ���� ������ ��� ��� ������� �� �� ������� ��

(� *� -��� � /���� �� '����� � ��� �� ��+����� ��� ���� ������ ���+������ �81� . � ��� �� ��� ����� ��;����� �� � ��� � �� ���� ��� ����� ������������� � +� ��� ����� ����� ������� � ��� ������������� ������ ������������ +��� �� ���� �� �������� ��� ��� ��� ��� ���� �� ������� �� ������ � ��������������� ��� ������� ���� ���� ��C

%� :���;��� � O�� ��� )�������� ��� �� �� � ��� �� �� ������ ������ �� �� � �� ������ �� � ������� ��� �� � ���� ��� �� �� ��� ����� ���������)���� 3�� � �� ��� � ������� �� �������� � ������

(� -���� /���������� ���� ���� '��� 6��� ��� ���������������� ���� �� # ��� ����� �81� H� ��� ���� �������� �� � ������ �������� �� �� ����� �������������� ������ ��������� ��� � �� �� ���� ���� ����� ��� HH ��������� �� �� ������� � ��������A���� ��� ��� ��� � ��� ���������� �� �� � �������� ����� �� ��� � �������� �� ����� ������ ������� ���� �� ��A���� �� � ������ � ������ ��3�� ��� ���� ����� ���� � � �5 ��� � � ������ �� ������� ���� �9 ��� ������ $ ����� ���� ������� �� ��� �����5 ���� ��� �8 ���� �� �� ����� ���� �� ��� �������� ��������� ������� ��� $������ �� � ���� ������

H������� Q� ���� � � ���� ��� � � ���� �������� �� .� �� ������ $��� �� �� ���� ���� ��� � � ��������� ������ ����������� ��� �� �� ����� �� �� � ���� �&�'U ������ �� % ����������� �� ������ ����� ���� �� ���� �� �� ������� �� ������ ��

(� 0� L�� ��� /%������ ���������� %����� 6��� �1� Q���5������� � � $ �� ���� �� �� ���� �� � �� !%#� " #�� ��� ���� ��� ������ �� ������ � �� �� ���� .��� ��5 �� � �� ��� � � �� � �� �� ���� . ������ ��� �� ��� � � �� �������� ����� ��������� ����� ���� � ��� ������� �� �� ��� ����<8C

%� :���;��� � )� ��� ���� ���� �5������� � ��� )� �� �� ��� �� S�����, � � � � �� J( ����� ��� . ���� � ������� ��� �� �������� ��� ��� ���=<�� �� ����� ��� 4� ������� ����� �� ��� � ����� � �� � � � � �� J( ����� �� ��������

�=> %� :���;��� ��� ���� %����� �����* ��������� � ��� �������

%���&)����& '& # & ���& ? /�<<�1