Investigación en arbovirosis en el CISA: Avances en el reconocimiento y control del virus de la fiebre del Valle del Rift Alejandro Brun Centro de Investigación en Sanidad Animal INIA II Jornadas sobre zoonosis y enfermedades emergentes: enfermedades virales transmitidas por mosquitos Barcelona. 23-24 de mayo de 2013
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Investigación en arbovirosis en el CISA:
Avances en el reconocimiento y control del virus de la fiebre del
Valle del Rift
Alejandro Brun Centro de Investigación en Sanidad Animal
INIA
II Jornadas sobre zoonosis y enfermedades emergentes: enfermedades virales transmitidas por mosquitos Barcelona. 23-24 de mayo de 2013
CISA. Laboratorio de biocontención Valdeolmos
ñ
11,000 m2 Nivel de seguridad biológica 3 y 3+
Findlay, G.M, 1932
Transmisión transovárica
Transmisión transovárica
Zoonosis
Mosquitos periurbanos
¿Roedores?
mosquitos
mosquitos
Epizootía Periodo interepizoótico
Clínica en el hombre
Madani et al., 2003
Líneas de investigación sobre FVR en el CISA-INIA
• Reconocimiento: Desarrollo de herramientas para la detección del virus, detección de infección (anticuerpos), clínica y patología en animales.
• Control: Desarrollo de estrategias de vacunación en modelos animales y su validación en rumiantes
ssRNA(-) L,M, S •RNA tri segmentado, polaridad negativa •Circular 5’-3’ NCRs “panhandle” •Variabilidad del genoma (total: 5%) •Seg M más variable entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV
CGGACTTGGAGACTTTGCATCA
...G.................. W
.................T.... SA-75
..................G... Zimbabwe 70
S-segment
ACGTTGCACCTCCACCAGCGAAGC
...................A.... SEC
.T.................A.... Wf
G..................A.... KenyaIB8/65
ACAAGGTTCCCCAATCTGAAAGAA
.................A...... SEC
...................G.... ArD38388
.......................G 2269/74
TTCTTTGCTTCTGATACCCTCTG
....................T.. ArD38388
..............C........ SECa
........A.............. SECb
.....C................. SECc
.....C........C........ SECd
AGGGGCCTGTGTGGACTTGTGCAA
......................G. SECe
......................T. ArD38388
CAGATGATGCAAGGAAGTGGAAC
................A...... SA-51
L-segment
Fwd primer FAM-probe (rc) Rev primer (rc)
Rev primer (rc) Cys5-probe Fwd primer
Aed
es-L
Man
sonia
-L
Aed
es-S
Man
sonia
-S
102
103
104
105
106
107
108
109
GE
C/m
l
Mwaengo et al., 2012
Detección de RVFV en mosquitos mediante RT-qPCR
Variabilidad del segmento M
cDNA RVFV-Segmento M
Regiones de > variabilidad de secuencias
cDNA RVFV-Segmento M
Amplificación de la region 3’ del cDNA segmento M
cDNA RVFV-Segmento M (amplicón 480nt)
MRV1(ag) Emfwd(ag) Emrev(g) cDNA primer
1 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 1 1
0.5kb
secuenciación
Amplificación de la region 3’ del cDNA segmento M
Mosquito pooles
0.96
1
1
1
0.99
0.29
1
1
1
0.82
0.28
1
0.96
1
1 1
0.98
1 0.93
0.96
1
0.95
1
0.28
0.36
0.06
1
Mwaengo et al., 2012
Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV (resumen)
RVFV: nucleoproteína N
Nucleoproteina (N)
S M
L
ssRNA(-) L,M, S •Altamente conservada entre aislados •Muy abundante e inmunogénica •Anticuerpos anti-N en suero: evidencia de infección en animales
Desarrollo de tests serológicos
Martín Folgar et al., 2010
Empleo de AcMo anti-N en ensayos de competición
El-Harrak et al., 2011
Detección de anticuerpos anti-RVFV en sueros de camellos en el Norte de Africa
Utilización de la proteína N recombinante en ELISA anti-FVR DE DOBLE RECONOCIMIENTO DR (Ingezym FVR-DR, Ingenasa)
Expresión y purificación De Trx-N en E.coli
Van der Vaal et al., 2012
Empleo de proteínas N y Gn recombinantes para la detección simultánea de anticuerpos mediante técnica Luminex
5.6um
Gn N
Fluorescencia roja e infrarroja
Fluorescencia verde
Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV
Desarrollo de test serológicos (resumen)
Desarrollo de un ELISA de competición mediante AcMo Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Desarrollo de ELISA comercial de “doble reconocimiento” Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Mejora la detección de IgMs o IgAs específicas Desarrollo de ELISA Luminex Detección simultánea de anticuerpos anti Gn y N Discriminación de animales vacunados /infectados
FVR: necesidad de nuevas vacunas
• Mejorar la eficacia y seguridad de las vacunas actuales
• Varias opciones de éxito: vectores virales, genetica reversa, virus atenuados..
• Antígenos diana: glicoproteinas GnGc
• Vacunas animales y humanas necesarias
Desarrollo de vacunas experimentales para RVF
Vacunas de ADN
• Facilidad de producción y conservación y transporte
• Expresión intracelular de antígenos (virus-like)
• Excelentes resultados en modelos de infección en ratón
• Vacunas DNA comerciales para WNV (USA) y IPNV
Vacunas basadas en el vector viral MVA
• Vector muy atenuado (pérdida de factores de virulencia)
• Bajos niveles de replicación en células de mamífero
• Altamente inmunogénico
• Buen inductor de respuestas T
• Aplicación en ensayos clínicos humanos
Mecanismos de presentación de antígenos tras una vacunación ADN/Vector
Muscle/ skin cell
Secreted/Released antigen
APC
B-cell
IMMUNE RESPONSE
T-cell
T cell
Antigen Presenting Cell
Plasmid/Viral vector
21 480 2091 3614 1103 1842
1 1198 691 154 RVFV M segment cDNA
pCMV-M4 Gn Gc
nt
aa
Met4
pCMV-M4 pCMV
Construcción de vectores vacunales pCMV-M4 y MVA-GNGc
tPA leader
VV p7.5
pb9 V5 tag
VV p11 gfp TKL TKR
250 150 100 75
50
37
25
20
15
Mr
anti-Gn anti-Gc
MVA-GnGc Gn Gc
Met4
Esquema de immunización y desafío en ratones Balb/c