Top Banner
Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds** By Yongjun Zhang, Shaopeng Wang, Mohammad Eghtedari, Massoud Motamedi, and Nicholas A. Kotov* 1. Introduction Spatial contacts are among the key factors influencing the development of living cells and the possible directions of their evolution via various ligand±substrate interactions on the cell surface. [1±5] Moreover, multiple studies have demonstrated that traditional two-dimensional (2D) cell cultures do not ade- quately mimic the microenvironment of three-dimensionally organized native tissue. [6±9] Hence, there is a rapidly growing need for ex-vivo development and fabrication of organs, such as the pancreas, liver, and bone marrow, that can be used for organ transplant or the study of drug interaction, or study of the normal functioning of these organs. This requires the devel- opment of a scaffold that can promote homogenous tissue re- generation by providing an optimum macro- and micro-envi- ronment for cell growth. In order to achieve three-dimensional (3D) organization of cells in engineered tissue, fibrous and porous matrices have been extensively used as scaffolds. Usually, the fibers and pores are chaotically distributed in space. Systematic studies of cell± cell interactions and the role of spatial distribution of cells re- quire the use of highly ordered mesoporous structures with controllable migration pathways. Equally as important is the ability to develop computational models for diffusion and other processes in the scaffolds with sufficient levels of detail. However, such work is nearly impossible when poorly orga- nized scaffold matrices are used. In addition, to monitor and ensure appropriate development of engineered tissue, it is de- sirable to acquire high-resolution images of cells and their in- teraction continuously. However, the high turbidity of fibrous and porous matrices limits the ability of optical methods to im- age and track cells deep within the scaffold. Hydrogels are one of the most common biomaterials and are well known in various fields of tissue engineering for nanome- ter-scale porosity and an ability to accommodate cells between arbitrarily distributed 3D networks of polymeric strands. [10±15] Hydrogels are exceptionally hydrophilic and capable of ab- sorbing large volumes of water. Additionally, they can be func- tionalized in various ways to impart the required biological or mechanical properties. [11,12,16±18] In recent years, to facilitate the growth of functionally adequate tissues, [19±21] several attempts Adv. Funct. Mater. 2005, 15, No. 5, May DOI: 10.1002/adfm.200400325 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 725 ± [*] Prof. N. A. Kotov Department of Chemical Engineering Department of Biomedical Engineering Department of Materials Science, University of Michigan Ann Arbor, MI 48198 (USA) E-mail: [email protected] Dr. Y. Zhang Department of Chemistry, Oklahoma State University Stillwater, OK 74075 (USA) Dr. S. Wang Nomadics Inc. Stillwater, OK 74075 (USA) M. Eghtedari, Prof. M. Motamedi Center for Biomedical Engineering, University of Texas Medical Branch Galveston, TX 77555 (USA) [**] The authors thank OCAST and NSF (N. A. K.) and DARPA (N. A. K., S. W., and M. M.) for support of this research. S. W. thanks Dr. J. Clarke and Dr. D. Goad at Nomadics, Dr. J. Malayer, and Dr. G. Chen at the Oklahoma State University, College of Veterinary Medicine for assistance with cell cultures, Dr. P. Doss (Microscopy Facility) for assistance with SEM microscopy, and John Ostrander (Chemistry Department) from of Oklahoma State University for the help with confocal microscopy. Supporting Information is available from WileyInterscience (www.wileyinterscience.com) or from the author. Successful engineering of functional tissues requires the development of three-dimensional (3D) scaffolds that can provide an optimum microenvironment for tissue growth and regeneration. A new class of 3D scaffolds with a high degree of organization and unique topography is fabricated from polyacrylamide hydrogel. The hydrogel matrix is molded by inverted colloidal crys- tals made from 104 lm poly(methyl methacrylate) spheres. The topography of the scaffold can be described as hexagonally packed 97 lm spherical cavities interconnected by a network of channels. The scale of the long-range ordering of the cavities exceeds several millimeters. In contrast to analogous material in the bulk, hydrogel shaped as an inverted opal exhibits much higher swelling ratios; its swelling kinetics is an order of magnitude faster as well. The engineered scaffold possesses desirable mechanical and optical properties that can facilitate tissue regeneration while allowing for continuous high-resolution optical monitoring of cell proliferation and cell±cell interaction within the scaffold. The scaffold biocompatibility as well as cellular growth and infiltration within the scaffold were observed for two distinct human cell lines which were seeded on the scaffold and were tracked microscopically up to a depth of 250 lm within the scaffold for a duration of up to five weeks. Ease of produc- tion, a unique 3D structure, biocompatibility, and optical transparency make this new type of hydrogel scaffold suitable for most challenging tasks in tissue engineering. FULL PAPER
7

Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

May 02, 2023

Download

Documents

Kyle Whyte
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

������������� ������ � ������� � ������ � �������������� ���� �� �������

�� ������� ����� ������ ��������� ��������������� �������� ��� ������� �� ������

�� ����������

����� ��� � ��� ����� �� ��� �� ��� ������� ��� ����������� �� ������ ���� ��� �� ������� ���� ���� �� ������������ ��� ������� �������������� ����� ���� �� �� �������� ������� �������� ������ ������ ���� ���������� ����������� !�"����������� #$%& ��� ������ �� �� ���"'����� ���� �� �� ������������ �� ����"�������������������(�� ����� �������)�*� +�� �� ���� �� � ������ ���!���

���� ��� �,"���� ��������� ��� ����� ���� �� ������� �� ��� �� �� ����� ������ ��� ���� �����!� �� �� �� ���� �������� ������� �� �� ���� �� ���� ����� ���� �� ���� ���� ������ ��� ������ �� ���� ������� -��� ��'����� �� �����"���� �� � � ������ �� �� ����� ���������� ����� ��"��������� �� �������� �� ����� �� ��" ��� �� ��"����"������ ��� ��� ���!��.� ����� � � ����� ����"����������� #/%& ������(���� ��

���� �� ���������� ������ ������� ��� ����� ���� �� �������� �,�������� ���� �� � �������� 0������� �� ������ ��� ������� ���� ���� ��������� �� �� �� ������� ������ �� ���� ��� ����� ���� ��� �� ���� �� ����� ���������� �� ���� ��"'���� �� ��� �� ������ ������� ��������� ��� ���� !�� ���������� �������� ��!���� 1'����� �� ������ �� �������� � ������ ��������� ������ ��� ��������� ������� �� ����� �� �� � ������� !�� ����� ��� ������ �� ������+�!����� �� � !��� �� ������ ��������� !��� ����� ����"��(�� � ������ ���� �� ��� ����� .� �������� � ������ ��������� ������� ��������� �� ���������� ������ � �� ��"������� � � '���� ����"��������� ������ �� ���� ��� ���� ��"��� ��� ����������� +�!����� �� ���� ������� �� ���������� ����� ���� �� ����� �� ������ �� �� �� ������ � ��"��� ��� �� � ���� ��� !���� �� � �������+�������� ��� ��� �� �� ��� ����� ����������� ��� ���

!��� ���!� �� ������� ������ �� ����� ����������� ��� ������"��"� ��� ������ ��� �� ������ � � ������� ���� ��!������������� ��������� /% ��!���� �� ������� ���������2����

+�������� ��� �, �������� ��������� ��� ����� �� ��"������� ����� ������� �� !���� 3����������� ��� �� �� ��� "������(�� �� ������� !��� � ���� �� ��'����� ������� �� ���� ���� �� �������������$��)��4� .� �� �� ������ � �� ����� �����!� �� ��� ������� ���'��� ���������*�$�� ������� ����

���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ��� ���� �������� ���������� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ���

�"#$ %��&� �� �� ��'�(

)�*��'�� ' �& �!���+�� � �� ���� �)�*��'�� ' �& ,����-�+�� � �� ���� �)�*��'�� ' �& ��'�����. /+�� +�� 0 �(��.�'� �& ��+!��� � ������ � 12342 50/�6������7 8�'�(9:��+!��-:)�� �� ;!� �)�*��'�� ' �& �!���.'��� <8��!��� /'�'� 0 �(��.�'�/'���=�'��� <� >1�>� 50/�6)�� /� �� �����-�+. +�/'���=�'��� <� >1�>� 50/�6�� ��!'�-���� %��&� �� ��'���-��� '�� &�� ,����-�+�� � �� ���� �� 0 �(��.�'� �& ?�@�.��-�+�� ,�� +!���(�.'� � ?A >>��� 50/�6

"##$ ?!� �:'!��. '!� 8 <��/? � - �/B 5�� �� ��6 � - )�C%� 5�� �� ���/� ��� � - �� ��6 &�� .:**��' �& '!�. ��.���+!� /� �� '!� 8.)�� D� ����8� � - )�� )� ���- �' ����-�+.� )�� D� �������� � -)�� �� �!� �' '!� <8��!��� /'�'� 0 �(��.�'�� ������� �& ��'��� �����-�+� � &�� �..�.'� +� =�'! +��� +:�':��.� )�� %� )�.. 5��+��.+�*�B�+���'�6 &�� �..�.'� +� =�'! /�� ��+��.+�*�� � - D�! <.'�� -��5�!���.'�� )�*��'�� '6 &��� �& <8��!��� /'�'� 0 �(��.�'� &�� '!�!��* =�'! +� &�+�� ��+��.+�*�� /:**��'� � &����'�� �. �(�������&��� ����� '��.+�� +� 5===�=����� '��.+�� +��+��6 �� &��� '!��:'!���

�� ������ ����������� �� ��� ����� ������ ��'����� �� ��������� �� ����"����������� #/%& � ������� �� �� ������ ������� �� ������������ ��� ����� ���!� ��� ������������ 3 ��! ���� �� /% � ������� !�� � ���� ������ �� ������(������� ���'�� ������� �� ����� ��� ���� ���� �������� ��������� -�� �������� ����, �� ������ �� ������� �������� ���"��� ���� ���� �25 �� ���#����� ���� �����& ������� -�� ������� �� �� � ������ �� �� ��� ����� �� ��,��������� ��� *6 �� ����� �� ������ ���� ���� �� �� � ��!��� �� �������� -�� � ��� �� �� ����"����� �������� �� �� �������, ���� ������� ����������� .� ����� � ��������� ������� �� �� ����� �������� ����� �� �� ������� ��� �,����� �� ������� �!������ �����7 �� �!������ ����� � �� �� ����� �� �������� ����� �� !���� -�� ���������� � ������ �������� ����������� ���� �� ��� �� �� ������� �� �� �� ����� ����� ����������� !���� ����!��� ��� �������� ����"��������� �� ����������� �� ��� ����������� ��� ���� ��� ����� ��� !���� �� � ������� -�� � ������ ��� ��������� �� !��� �� ����������!� ��� ���������� !���� �� � ������ !��� �������� ��� !� ����� ����� ��� ����� !�� � !��� ������ �� �� � ��������� !��� �� ��� �� ��� �� ���� � � � ��� �� $�2 �� !���� �� � ������ ��� � ������� �� � � ���� !����� 1��� �� ���� "���� � ���'�� /% ��� ���� ��� ���������� ��� �� �� �������� � ���� ��� ��! �� �� �������� � ������ ������� ������ ���������� ���� �� ����� ������������

����

�����

Page 2: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

���� ���� ���� � ����� �� ���� ������� /% � ������� ������������� ����� ����"���� ����� ���� !�� ��� ������ �����"��� ���� ���$$� ��� ���"8� � ���������$/�

.� ��� ���� � ����� ����� ��� �� ���� ��� �� ������"�� �������� � ������� !�� ���� ������� �� /% ������(���� ����� ������ -���� � ������� ��� ���� �� ����� �� �������" ��"������" ����� � ���'��� ����� �������� �� ������ ������(��������� 9����� �������� ������� ����� ��,�������� ���������� �� �� ����� �� ��� ���� ��� !��� ���!� ��� ���� ���'���� �� ������� �� �� ������� ����� �� !���������� ������� ���� ������ �����$5�$*� .� �� ��� �� ���� �� ���������� ���� �� �� ������ �� �������� ������ #���� ���!� �� ����� �������& ��� ������ �,������ ������ � ����� � ���� ��� �"���� �� ������ ������ /% ���������� ������� �� �� ��������� �!� ���� �������� ��� ������� .� �� ���� �� ���� � ��� ����� ��� ���� �� �������� ������ �� �������� �� ���������������� ���� ����� �����"��(�� ���, �� ���� � ��������/��/$�

:� ����� ���������� ������ !��� ������ �� �� ����(������ ������� �������� ������ �� /% ���" ����� �������/5� -������ 8������ ���� ���� �� �� ����(���� �� ������� �������� ������ ��� ��� ���!� ������ ��� ���� ��� ��� ����� /%� ������� ���� ���� ���� �� �������� -��� !��� ���� � ���"������ �� ���� �� ���� ��(� �� �� ��� ���!� �� ����� ���������//�

+���� �� �������� ��� ������� �� � �������� � ������!�� �� �������"����� ���"��� ������ ���� �� ��� ���� �� � ��� ���� ����, ��� ��� ����� �� ����� ��� �� ���� ���� ;�"����� ������ ���� ������������ ���#����� ���� �����&#< 3& ������� !�� � ������� �� �25 �� !��� ������ ���� ������� ����� ��� �����'����� ���� �� ������ ����� �������"��� ���� �� ���� ��������� 3 ������ �� ���" ��"��� �,������� ����� !� ����� ����� ��� ����� �����"����� �� ��� ����, ���� �� �� �������� ����(�� �� � /%� ������ ��� ����� ������������ -��� ����� � ������ ������������� ��������� ������� ������� �� ����� ����������!� ��� ���������� !���� �� ����� �� ������ �� �� ��"����� �������� ������ !���� ����!��� ��� ��� ������� �� ����"��� �������� ��� ���� ��� ����� ��� ��� !���� �� � �������

�� ������� �� ���������

-�� ��� ��8���� �� ��������" ����� ������ ��� ���� !����� ���� ���� ���� ������ �22�422 �� �� ������� �� ������ ������ �� ��'������� �� �� �� �� ������ �� �� �������������� =��� ������� ��� ���� ��� ���� ���� ����������������� ����� �2��22 �� �� ������� #����� ���� �2/ ���� ��������� �2* ���� �������&� �� �������� ������� ���� �� ��� ��������� ������� ���� ��� �� �� ���� �� ����� ��� � ������� !��� ���� ������ �� ��������� 3�������� ������� �� ��� �� ���� ��� �� ���������� ��� ��������� �� �� �� ������"� ������� �� ������ ��� ��� ������ ��� ������ ���������� +����� �� �������� � �� ���� � ���� ������ ������� !�� � �� �� ����� ����� ����� ����� � �������� ��� � ���'���� �� � �� ��� ������� ����������/��/)�

�������������/6�/*� ������ �����������52�5$� �������5/� ���>�������������� ����������55�5�� ���� ���� �������� ���

�� �������� �� �������� ������ ���� �22�$222 �� ���" ���� +�!����� ���� ������ �� ���� �������� ���� ��� ����� ��� ��� ��� ��������� ����� ������� !�� �������� ������ ����2 ��� +���� � ����� ����� �� ���� ��� �� �� ������� /%����� �� ����� ������� �� �������� ��� ��� �� ������ !���������� -��� ����� �� ������� � ������� ������ �������������7�5)� �� ������ ����� ���� ��� ������ � �� ������"�� �������� �������� �� �22 �� ��� ���� �� � �� ����� ����"������� ��� ��� ��!�� ���!���� �������� !��� ������!�� ����� ������"��(�� ��� ����=��� ������������ ������ �� ���� ���� �������� ���

���� � ����� � � ����"�������� ��� � ������ � ���� ������������� +�!����� !��� �� ����������� ������ �� �� � ��������� �� ������ ������ #���& #�� �� �� ���(���� �����&��� ����������� � ��� ��� ���� �'��������� ��� � ���" ���"������ ������� �� ���������56� -�� ������ �� �� < 3 ����$ ��>��� !�� � �� ��� ����� ������ ��� �� �� ������#2�6* ��>��&� -�� ����������� ��� �� < 3 ������ �������� �� �� ���� � ����� � ������ ������� ������ +�!���������� ������� ����� � ������� ��� �� ������ � ������������� ������ ��� ��� �� ��� ��� !�� �� ��!�� ������������ ��,�������� ����"� ��� ������� -�� ��� �� ������ ����"����� �� �� ������� �� �� �� ������ �� � ������ ��!���� ��� ���� !���� �� ������ � ����� � ������ ��� ��< 3 ������ � ��������� ���� �������� -�� �� ���� �������� ���������� ���� �� ���� ���� ��!��� �� ������ �� �� ������ ����� �� �� ������ � �$2 ?9 ��� $5 �� -��������� �� ��� ������ ������ � �� ���������� �����@������ � ������ ���������(���� �� �� ����� �� ���������� �������� ��������� �� ������ �� ���� ���� ��!��������� ������� �� ������� �� �� ���� �� ���� ������ ���� � ��� ���������� �� ��������54�

� ������ ��� ��� �� ��� �� #�1 & ������ �� �� ������������� ���� ���� �25 �� ������������ < 3 ���������! �� �� �������� ������ ������ �� ��� ����� ��������� � ���� ������ �� ����� �� ��� ���� ���� #@���� �3�9&� -������ � �� �� ��� ��� ��� �� ���� ��������� �� �� ����������� #@���� �3��& ��� ���� ������ ��� ��� �������� �� ����� � #@��� �%&�-�� �������� ������ �� @����� � !��� �����'����� ���������

!�� �������� �� ������ !�� � !��� ����!�� � �������(� �������� �����" �� ����,"��������� �� ��� ����� �� �� 1,���"����� �� ���� 1,�� ��� ��� ���� !����� ���� � ����� ��"����� ���� ���� ������ �������� ������ ���� � ���� ���" ���������� ������ ��������5*���� -�� ������ !��� ��������� ��������������� #-+@& A ��� ����� �� ����� ��������3��� �,����� � � -+@ ��� ��� 54 �� ������ !�� � �� -+@!�� ������ ���� ����� 5 �� ���� �� ������� �������� ���������, ���� ���� �������� !�� ��� ������� -�� �������� � ���� �������� ����!� �� ����������� �� �� ������� ���� � ���"� ����� ���� �� �� ��� �� #@��� $&� @������ �� ���"������#����B)$� ��& 9�-� ������� ���

�/2� !��� �� ������� ����� � ������ � �� ����� �� ���� ��"�� ��� �� ������-�� ����� ������ ���!� �� �� �������� � ������ �������

�������� . �� ������ �� ������� ���� � �� �� < 3 ��"���� !���� ����� �� ����� ��� ����� �� �� � �� �� �������������� ������� -��� �� ���� �� ���� ���� �� ������ �� @��"

��� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ��������� ����������� ���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ���

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.

Page 3: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

��� / ������� �� �������� �� � ������ !�� ������� �� ���"������ �� �����"������ 9�-� ������� ��� #���, B �/� ��&�.� ��� ��� �� ����� �� �� ����� �� �������� �� ������� @����� $� -�� ����"�� ����� ����� ���!� �� �,���� � ������� ������ �������� �� �� ������� ��� ��� �� �� ��"����� �������� ����� #@��� /�&� -�� ���� ��(� !�� ��������

� �� ���,������ *6� / ��� !�� � �� ���� � ���� ���� ����� ������� ������� �� ������ �� �� < 3 �����#�25 ��&� ���� ���� �� �� ������� �� ��������� � ������-�� � ������ �!���� '�� ��� !��� � ��� !���� -�� ��� ��(�

�� �� �!����� � ������ �� �� �������� �� �� !���� ���� �� ����������� ���� � ������� #� &C �� ������� �� � � �� �������� ��� ��(�� -�� ����������� ��� ��� ������� �� -����� ��$�@�� �� � ������ ���� �� �����"��������� �� ��� ��(� �� ������5 �� !��� � B �2D ��� ��� �� !��� � B �D� 9������!�� �� � ������ ���� ����,"��������� �� � ������ ���� �����"�������� ��� ������ ����� !�� � �� ������ � �� ��������� �� �������� �� ����������� �� �� �������� �� ��� �����3��� ��,���� ����������� ��� ��� ������ �� ����� ��� ��� ��

�� � ������ !�� �,������ ����� �1 �3� �,� ��� �� �1 ��"���� ���!�� �� �� ����� �� ����� ��� ���� ���� �� �� ���"���� �� �2 �� �� ������� #@��� 5& ������ �� �� �� �� !������ ����� ������ �� ���� -�� ������� �� ��� ��� ��� ������ ������� � ���! �� ���������� .���������� !�� � ��� �/% ����������� �� �� � ������ ������� ���� ���� �� �� ��"� ��� � ��� �� ���� ���� �� �� ����� �� ������� 9�������"��� �� ��� �� �� ������� �������� ������ ���� ��������� �� /%� �������� �� ���� ���� ��� ������� ������ ��!��� ��� ��"���� ��������� �������� �������� ��� ��� ��������� ;�� ��������� � ��� �� ���� ������� ��� ��� ��� ������ � ������� ������� �� �� ������� �������� ������ -�� ���� ��"��� ������� �� ���� � ������� !�� ��,������ � ���� �� ������� �� ������ �� ���� ������� �� �� �1 ������� ������� � �� �� ��� ����� ���� !��� �� �1 ������ �� ������� �������� ����� � ������� ���� ���� ���� �� ����� �� ����� �� �� �"������//� 9������� ������ �� @������ $�/ ��� @����� 5� ��� �� �� ���� �� ������ �� ���� ���� ��� ������� ��������� ��������� � �� ����� � ��� � ������ ��� ��������� �� �� ���������

���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ��� ��������� ����������� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ���

A B

C D

� !��� � /�� ��+�����*!. �& '!� +�����-�� +��.'�� ��-� &��� 3�1 ��%��� .*!���. �' -�&&��� ' +��.'�� &�+�. � - ��� �&�+�'�� �

BA

� !��� � �� &�+�� �����. �& '!� .+�&&��- ��&��� .=���� �� C�-����''� �&�:���.+� ' �-?� � �*��'�+��. =��� �--�- '� !�-����� '� � +���.� '!�&�:���.+� +� +� '��.'� /+��� ���.7 �6 �� ��G ,6 1� ���

BA

� !��� � �� &�+�� �����. �& '!� .=���� .+�&&��- � � .��:'�� �& &�:���.�+� ' ���� ����''� � �-?� � �*��'�+��.7 �6 ����� &��� '!� '�*G ,6 �*'�+��+��..�.�+'�� � /+��� ���. � � � - , ��� 3�� ���

"�#�� � /=���� � +!���+'���.'�+. �& !�-����� � (��'�-�+�����-�� +��.'��. .� '!�.�H�- �� '!������ �'��'�� �

/+�&&��- .��*�� -�.�� �'�� �3 � �F �1

����!' ��'�� �& +��..�� 8� � ��� ' '� �� ���� 5 +6 3� I � I I 3 I

/=���� � ��'�� �& +���� ���. �& .��� +��*�.�'�� 5���6 �>J 5� ���J6 F�4� 5� ��3�6 J�>F 5� �6 4�4 5� ��F�6

/=���� � ��'�� �& *���:. ���. 5��6 >�F1 5� ��F�6 33�� 5� ��1�6 3>��1 5� ��J�6 �11 5� ��2�6

%���.�'� 5�6 �� I �4 I �2 I �J�3 I

��+����'���.+��� *��� .�H� "��$ 331 5� 16 3J 5� J6 3F� 5� J6 3�3 5� >6

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.

Page 4: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

�� ���� �� �� ������ ����� ��� ��� A ��� �� �� ����"���� ��� �� ������ � ��� A ��������� ����� �� ������� �������� ������ �,���� �������� �������� ������ � ���� ����� ��������� �� ����� @�� ����� �� �� ����������, ��� � �� � ������ �!������ ���� ��� ��� ��� �� �'��"������� �!����� ��� ���� ������ ��� ���� �������� ���"������$��5� @�� ����� ���� �������� #<33�& ���������� ����� ���� � ��� � �!������ �'���������� .� ������ �� ��"������� �� @����� $ ��� � �!������ �'��������� �� �������!�� � �� �������� ��� ��� ���" ����� !��� ��� �� ��������� �� ���� �������� �� ��������� ���� ���. �� ��������� � ����� �� �'��������� �!������ ����

#�& �� �� !� ����� �� <33� ��������� !�� �� ���� ���"����� #-����� ��$&� @�� ��������� ������ ����� ��� ��������

������� � �� ������ !�� � �� ���� �� � � ��� ����� ���,�"����� ���� ���� ������ ��� ��� ��������� ������ �� �� ��"������ #�2� ��� ���� ��������� �� �� ���� ��������&�

��$��5�

@��� �� ������ �� �� �� ����� �� ��� ����� �� �� 1,���"����� �� ���� �� ������ �� �� ������� �������� ���������, !�� ������� � �� ���� )2D� @�� � ������� ��� !���� ��,�������� ����"� ��� ��� ���� �� ������ �� �� ����������� �� 65D� -�� ������� ������ ����� ��� �� ��������� ���� ���� �� ������� � �!������ �� �� ������ ��"��,� E�� �� �� ��������� ���� �� �����"�������� ���� ������� �'��������� �!������ ���� ��� ���� ���� �� ����,"���"������ ������� �� �������� �� �� ������ ��,��� !�� ��"��� ����� ��� -�� � ����� �� �� �������� �� ��������� ���� ������ �� ���������� ��������� ������ �� � � �� ���� ������ �� ���� =��� ����� ����,"��������� �� ������ ���� �� �� �������� ������ !�� �����"��������� !��� ����� �� ������� ����������� �� ���� �� ���� ����� � ������ ��� � ������ �� ������� � ������ ����������

-� ������ �� ��������� �� ����� /% � ������ ��� �� �����!��� �� ����� ��� ���� �����! ��� ������ !� �������� ������� �� ���" ����� �,������� �� �� �������� � ����������� ��� �� ����"�����! ������ ��� ���� +�"� �� !��� ���� ���� ��� ���� +�"F$�+���� ������ ��� ���� +�"� !�� �� �������� ������ ��

�������" �������� � ������� ��� � ����� � � ���� !����#@��� �&� 9���"�� ��� ����� �;%.<G ������� �� ��� ��� ��"�� �� �� ��� �� !��� ����(�� � ��������� �� �������� ���� ���� �� ��� ��� �� �� � ��� ���� 9���� �� �� ��� ��!�� ���� � ������ �� �� �� ���� �� �� ���������� �� ��"���� ���� !���� �� � ������ � � � ��� �� $�2 ��� -���������� !��� ����(�� � �� ����� �� /% ����� ����������

��$ ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ��������� ����������� ���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ���

"�#�� � /=���� � +!���+'���.'�+. �& !�-����� � (��'�-�+�����-�� +��.'��. .� '!�.�H�- �� ��-�@�� �'��'�� �

/+�&&��- .��*�� -�.�� �'�� ,3 , ,F ,1 ,�

����!' ��'�� �& +��..�� 8� � ��� ' '� �� ���� 5 +6 3� I � I I 3 I ��� I

/=���� � ��'�� �& +���� ���. �& .��� +��*�.�'�� 5���6 � 5� ���J6 F��J 5� ���26 1��� 5� ��3�6 ��31 5� ��3�6 ���� 5� ��3�6

/=���� � ��'�� �& *���:. ���. 5��6 J�3� 5� ���6 4��4 5� ���6 3���F 5� ����6 3F��1 5� ��J�6 34�11 5� ��>�6

%���.�'� 5�6 �1�J I �4�2 I J2�� I �>�2 I J2�� I

%��� .�H� "��$ 3�� 5� 16 3�� 5� 16 33� 5� �6 3F 5� J6 3F� 5� >6

BA

� !��� � /�� �����. �& '!� !�-����� � (��'�- +�����-�� +��.'��. 5.��*��,F � ?���� 36 �' -�&&��� ' ��(��. �& ��� �&�+�'�� � ?!� ���� �H�'�� (�.����� /�� �����. �. .���=!�' -�.'��'�- +��*���- '� +� &�+�� ��+��.+�*������. � B��:��. �F� -:� '� -�!�-��'�� �& '!� .+�&&��-. �+�..��� &��/�� *��+�-:���

� !��� � �� &�+�� �����. �& '!� �/�� +���. ���= � !�-����� .+�&&��- &�� &�(� =��8.� �����'��+8�� ,<) %� ���� =�. :.�- '� .'�� � �� ��(� +���.� ��.�+�'�� . =��� '�8� �' -�*'!. �& 3�� �� 5�6� �� �� 5,6� � - �� �� 5�6� ?!�.� �����. .!�= '!� � &��'��'�� �& ��(� +���. �' ���.' :* '� � -�*'! �& �� ��=�'!� '!� .+�&&��-�

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.

Page 5: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

�� ���� �� �� ��������� #��� ����� ���� �� �� ���������� .�"��������&� -��� � ������ ����!�� �� ������� �� ���� ��� ����"� ��� ��� ������� �������� ����� � � ��� �� �������������� �� �������� -�� ���� �� �� �������� � �� ���� ������ �� � ������ ��������� ������ ��� ��������� ��� ��"������� �� ����� �� ��� �������� �� ����� ������������.� ������ ������ �� �,�������� +�"F$ ���� !��� �� �"

���� !�� �� �������� � ������� ��� ������ � � * ����� >�"���� ��� ��"��� ���!� �� ������� �� +�"F$ ���� !�� ��"������ !���� �� � ������� -��������� ��������� ����������� ��� �� �� ���� ��� $D �� ��� ���� !��� ���� ����* ���� �� ������ ;� ��� �� �������� ���� ����� ��� ���� ������ ������� �� ���� �� ������� �� �� ����� �� ��������� ������ �� �� ������� �� �� < 3 ������ #@���� )�6&�������� ��� ������� ;��� ������ ���� !��� � ����������������� ������ �� ������� @�� �� ������ �� ������ !��������� �����������"����H������� ������ !� ��� �� �������� ������� �� �������� � �� ��� ������ �� �� � �������� . �� �������� � ��� �� !��� !� ��� ������ ���� � �� ������������� ������� ��� � ��������� ���� ��� ������������� �� ���� ���� ��� ������� #@��� )�&� �1 ������ ��@����� 6 ������ �� �� !���� �� �� ����� �� �������� ���� ���� �� ���" ����� ��(�� -���� ������ ������ �������� ������� � ������� ���� �� ���������� �� ���� � ������"

��� �� ������� � �� ���" ����� ��(� �� ��� ��� ��� ��� ���� ��� ����� �����-� ���� �,��� �� ��� ������ �� �� ��������� ����� ��"

��� �������� -�� �������� �� ���� ��� �� ������� ����������� �������� �� �� ����� ��� ��� �������� ��� �������� �������� ��� �, �������)� -�� ������ �� �� ������� �������� �����"���"����� � ������ � ����� �� ���!� �� ���������� ������� � �������� ��� ���� ���� ������ ��� ������ � �!�������� � ����� �� ������� ���������� �� �� �������� ������������ � ���� ������������ �� �� ������� � �� �� ��"��� �� ��"���������� �� ������� �������� ��� �� ������"����� @�� ����� �� +�"F$ �� � ���� ��� ���� ��� ��� �� ��" ����� �� �� ��� ������ �� @������ )�6 �� �� ������� � ����������� �� �� ����� ��� ����� ���� �� ����� ���� ����� ����� �����-�� ���" ����� �,������� ����� �� ����� � ������ �����"

���� �� ������ �� �� � ������ � �� ����� �� ���������� �� ���� �� ������ � ������ ������ ��� !���� �� � ��������� � ����� ����� ������������ @���������� !� ���� ��"������ �� �������� �� ��� � ������ ��� ������� �� �� ����������� � �������� � ����� ������� ���������� ��� ����������� ���� ��� ����� ��� ��� !���� �� � �������

� ��������

+����� ������� ������ �� �� ������ ���� < 3 ��������25 �� �� ������� �� ����� ������� �� ������� <����� ��"������ ������� ���� !�� �� ������� �� ������� ����!��� ������ ����� ���� ������ �� ������� %�� � ���� ��"�� ���� �� ����� ��� ���� ���� ��������� ���� � �������'��������� �!������ ���� ��� ��� � �!������ �'��������� ���"���� ���� ����� ��� �� �������� ���� ����������-�� ��� �� ������� ���� �� ����� /% � ������ ��� ���� ���"

�������� +�,�������� ������� ����� �� ������ !�� �����"��� �� *6 �� �� � ������� ���� � ���� ������� �������� ���������� ������ -�� ��������� ��� ��������� �� �� ��!�� �� ��� � ������ ������� !�� �������� �� �� ����"��� !��� �� ����� ���'�� ��������� ��� �� ����������� �� ���� ��� ��� ��������, ����� ����� ����� ��������� ��� ����������

!� "#$������� �

�������C ����������� < 3 ������� �25 �� �� �������� !���� ����� ���� � ����� ���� F���� ������� 33� ��� ����"�����"���"���� �������� #E �3& !��� �� ����� ���� ������ >"3� ���� � ��� -+@� ������� ��� ������� ���,��������� #I$�$;4&� ����@����� � ������ � !��� ���� �� �� ����� !���� ������ ����� �����@������ �� 9�-� ������� ��� !��� ������ ������� �� ����� ;(������ !��� ���� �� �� ������� ����� �� ������� �� ������ !������� ��� ����� ����!���� �/2��

�� !�����"�# � $������� $�#���� ��� ������������� �������!���!��� %��� ������C � �> �� ������ !�� ����� � 2�� � ��< 3 ������� -�� ��,��� !�� ���� ��� ��� ������� ������ ���� ��������� �� ������� ��������� !�� ����� -�� ���� !�� � �� �� ��"�� �� �� �������� ������ ��� !�� ����� ������ ��� � �� .� ��� !����� < 3 ������ ����"��������� ��� � �������� ������ 3� ���'��

���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ��� ��������� ����������� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ��%

BA

� !��� � �� &�+�� ��+��.+�*� �����. �& � (��.� �*�� F) .+�&&��-. 5.���*�� ,F � ?���� 36 �&'�� � +:��'�� =�'! ��%�� +���. �' -�&&��� ' ��� �&��+�'�� .� ���� 5,6 �. '!� �@*� -�- (��= �& '!� *��' ���8�- � 5�6 =�'! �.K:���� �:�':�� '���7 4 -��.� /+��� ���.7 �6 3�� ��G ,6 � ���

BA

� !��� � /�� ��+��.+�*� �����. �& � (��.� �*�� F) .+�&&��-. 5,1 � ?���� 36 �&'�� � +:��'�� =�'! ��*�� +���. �' -�&&��� ' ��� �&�+�'�� .� ����� 5,6 �. '!� �@*� -�- (��= �& '!� '�* ��&' +�� �� �& 5�6� �:�':�� '���74 -��.�

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.

Page 6: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

�� ���� ������ !�� !�����!� ��� �� ��������� ������ !�� ����!��� ������� ��� ��$ ����� -�� �������� �������� ����� ������ !�������� � �$2 ?9 ��� $5 � � ������ �� ��� ����

&#������ '� ��������C -!� �������(���� ������ !��� �������� �������(� �� ���������� @�� �����"��������� �2 �> �� $DI$�$;4 ��� 2�� �> �� !��� !��� ����� � 2�� �> �� �������� ����"��� ������� /2 !�"D 33� !�� ������� ������ #���2 !�"D& ��E �3 �� �� ����������� ����� -�� ��,��� !�� ��������� ��� ��< 3 ������ ��� ��� �������(�� � 62 ?9 ��� �$ �� @�� ����, �����"���� 2�� �> �� ������� �������� 2�� �> �� 2�2� >"�� ���� � ������ �2 �> �� $ !�"D I$�$;4 !��� ��,��� -�� ��,��� !�� ������������ �� < 3 ������ ��� �������(���� !�� ������ �� � ����"��� � ���� �������� ��� �$ �� -�� �������� ��� !�� ������ ��-+@ ��� 54 � � ������ �� < 3 ������ �������� ��� !�� ��������� �� !��� ��� ����!�� � ��� � �� �'��������� �!������ ��� ����� ���������

(������ ������C 3��� �������� ������ !��� ���� �� ����� �� ��!���� �� �!����� ��������� # �& !�� ��������� -�� �!����� ������!��� ��������� �� ������� �����!�� �� ������ � ��2 ?9 ���������-�� !���� �� �� ����� ��������� # �& !�� ��� ��������� -�� �!���"��� ���� !�� �� ����� ����� �� �����!��� �������C

� B # � � �&H � #�&

3������� �� �& �� ����� <33� ��������� ���� ���� � ���� �"��� ������� $& �� ������ ����, �� �� ����� ��� ��� �� �����!������ ���� �� �� �� �� ����� ��� !�� �� ���� ������������ /& ��� �� �!����� ���� ���� �� ���� ������ �� �� �� !���� �������� �� ������ ������� �������� �� �� ������� � ��C

�B #� � �2&H#� J �& #$&

!���� � ��� �2 ��� �� �!������ ���� �� �� ����� �������� ��� ��"��� �������� !�� �� ���� ��������� ���� ������

$��� $�������C +���� ���� �����! ������ ��� ���� +�"� #9�����E�� 9:>"��44$& ��� ����� ��� ���� +�"F$ #9����� E�� 9:>"��**6&!��� �� ����� ���� 3���� �� -�� 9����� 9���� ��� #3-99� �������� K3� 0�3&� +�"� ���� !��� ���!� �� � ����� ��������*2 ����"D %���� �L� �������� ����� ������ #% 1 � 9�����E�� /2"$22$� 3-99& ��� �2 ����"D ���� ������ ����� #@��� 9�����E�� /2"$2$2� 3-99&� +�"F$ ���� !��� ��������� �� � ��,��� �� �C��� ������ �� % 1 ��� +��L� @�$ ������ #9����� E�� /2"$22)�3-99& ��� �2D @��� 3 ������ � ������ ���� ���� % 1 H@�$�� ����� $�� � >"��������� �� � 5"#$"�����,�����&"������������� #+1<1�& 2�� � ������ ������� �$22 ��>�� ������ �� ����"���� 2�5 �� �>�� F5�4� ��� �2 ����"D @��� -�� ���� !��� ���������� /6 ?9 !�� �D 9;$ ��� ���� ����� !��� ������ !� � � !��� ������� !��� ����� ��� �������� @�� +�"�� �� � ������� !��� ������ !�� ��� ���������� !�� � �� ������� �� $ M �25 �����>��� 1� � �� ��� �� � ������ !�� �� ����� !�� � �> �� �� � � ��������� ��� �� ����� ������ �� ���� !�� $M �25 �����>��� @�� +�"F$� $ M �2� ���� ���22 �> �� ������ !��� ����� � �� ��� � ������� �22 �> ��������������� !�� ����� �2 � ���� �������� -�� ����� ������� �� ��������� ���� !�� �2) �����>���-� ���� +�"F$ ���� !�� ������� �� ��� 9�� ���"3 ���� ��� "

���� <����� .� � #1������ ;:&� �� ����� �� �� ������ !��� ���� ��!�� $ �> �� �����"���� % 1 ����� ������ -���� � �> �� �� � ��"����� �� $ � 9�� ��� �� ������� �����,��� !�� ����� � �� ������� ���� ����� �� ������� �� � � �� �� �������� �� ������ "����� -�� ������ !��� �� ����� � /6 ?9 ��� /2 ��� ��� ��� �� ����9�� ��� !�� !����� �� ����� ����� ����� ������ .� ��� !��� 9�� ��������� �� ������ �� ���� ���� �����-� ����� +�"� ���� �� �� � ������� ������� �� �� �� �� ��������

� ������ #� ��M� ��M� ��& !��� ������ �� ������ �������� ���!��� !����� ���������� !�� ������ ������"�������� ������ #<��&��� !��� ���������� � ��,"!��� ����� ����� +�"� ���� !��� ������ �� � !��� � � �� ������� �� $2 222 ���� �� !��� ��� ��������� !��� �� ����� � /6 ?9 !�� �D 9;$� -� �� ��� ���� ����� ����� � ������ ���� !���� �� � ������� �� ����� � �� ���"� ������!��� �� ����� !�� � �� �� ���"�� ��� ����� �;%.<G # ��� ����

<������ 1������ ;:& �� ����� ���� ����� ��� 5� ��� ��� ��� !���!����� ����� ����� ������

$�� ��� ���������#C +�"F$ ������ �� �� � ������� !��� ������"���� ����� � N���� >� "5�2 ���� �� �� ��� �� �'���� !�� �2M"��� 52M"���� !������"����� � ��8� ��� ������� 9���� !��� ����������� � ����"��� �2� �� ����� !���� �, ��� � 544 ��� -� �,����� ������� ����� ������� �� 9�-� ������� ��� !��� ����� � �� ��������������� 3��� �������� �� < 3 ������ �� ���� !��� �,����������� � >�� � -9� �<$ >���� � ������ 9���� �� � ��� ��� -�� �!��"��� ���� !��� ������� ���� ������� �� ������� �� � ������� �� 9�-�������� ����9���� �� ������� �� +�"� ���� !�� �������� ����� � N���� >� "

5�2 ���� �� �� ��� �� �'���� !�� 544 �� �, ����� ����� ��� �"������ ����� ���� @���"�"�� � �� �� �� ���� �� �� ����� !���� '����� � � ��� �� $�2 �� ��� ����� ����� ��������� �� ������!��� !�� ���� � �� ����� �� /% ���������� �� ���� !���� ��� �������

������ �������� ���������#C �1 ����������� !��� ��������!�� � O1;> OP )522 � ������ 1�� ��� � ��� �� � �2 �� �� �K�-�� < 3 ������ !��� ����H�������� ���� �� � ���(�� 1% 2�2����� ���� � �,��������� @�� �1 �������� �� �������� ������!��� ���� ��,�� �� $ ����"D � ������"�������� ������������� ��� $ ��!����� ���� ���� �� 2�� � ������ ������ ��� ��� !����� ����"���� � 5 ?9� -��������� �� ������ !��� ���� ��� ��� $ � �� �D �" ������"�������� ������� !����� ���� ���� ��� $2 ��� �� � ��2�� � ������ ������� ��� ����!�� � �� �� �� ��� !������ �������� 5 ?9 ��� �$ �� -��� ��� !��� ��������� ������ �� ������ ������!�� �� �������� �� �2� 62� *2� *�� ��� �22D #/ ����� $2 ��� �� ���&� ��������� �� ��'��� ������� ��� ��� ���� � �,��� �� ���������� �� 3��� ��� �� ��� ������ �� � %���� %9<"� ��� ��"��������� ��� !��� ���� !�� �� ����H�������� ������

:� �����C 3��� �� $225@���� �������C O��� �*� $225

���� <� K������ 3� ������ �� O� O����� )� ���� �%%�� *+*� $66��$� 1� %� +��� $��� ,� ��� ,��� �%%&� -.� /)6��/� :� 3� ���!�� F� -�������� 9� %� @������� ��( ���������� �&&��

$*���5� � 3� %� @���� >� <� %� >������ � @� <����� O� 9� O����������

+� ���� ���� $���� ���� �������� �&&�� */� �)����� �� >��������� E� @� +����� 1� >����� 3� �� :������ O� .�����("1�����

:� >������ %���� ���� ���� ��� 0� �&& � *11� �$ 65���)� O� 3� <������� 9� 3� K� ���� >� O� ��������� 2������� 2����#�� 3���

$������ �&& � -*.� 6$���6� 3� %��� � ��� ���� O� >���� �� 9����� 2���������� 2������ �&&�� +1�

/2���4� �� G���� I�"@� >����� N� %�� 9�"I� 9���� ������ ���� �&&�� +� ���*� %� =� +��� ���� I� =� E�� I��� 9� =���� � �������� �� I�������

2��������� �&& � .4� 555����2� O� � I��� <� %� %����� � �� ���� ����3 2���� �&& � .+� /2������ I� -� E������ O� >� =��� 2��������� �&&�� .-� 5/26���$� I� G� >��� %� O� ������ $���� 3��� �&&�� *1*� �4)*���/� O� 3� +������������ ���� �%%'� �/6���5� �� I� 3������ � 3� :������� 9� 3� K� ��������� ��� 5���� �%%(�

.61� �$*����� 3� 9� O��� � 9� =���� 3� F� ����� 2���������� 2������ �%%)� 61�

/�6���)� �� =����������� ��� 5���� �%%(� .61� �/���6� �� O� I� @��� ��� +� -� =� ���!� 2��������� �&&&� .*� $�4*���4� >� F� F������� ��� ����� �&&&� 4+� $)/���*� :� ������������ O� <� :������� E� ��� ��� <� 3���� ���� )� 2������

����� 3��� �%%*� ./� ))/��$2� F� <� %������ P� G�� 3� ���������� O� <� :������� :� K� ������������

%��#�� ������ ���� �%%'� /6���$�� <� <������ �� @���� 3� <���� � 9� -��(�� )� ����� ���7 ����� ����

�&& � *4� )4/�

��� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ��������� ����������� ���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ���

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.

Page 7: Inverted-Colloidal-Crystal Hydrogel Matrices as Three-Dimensional Cell Scaffolds

�$$� � E� 9����� O� <� @������ %� :� %���� 9� :���� � 3� F� �����)� 2������ ����� 3���� %�� 27 ����� 2������� �&& � 842� )��

�$/� :� >������� 0� +������ :� � ����(������ :� ������ 2����������&&�� .-� 55/6�

�$5� 3� ����� :� 9� � ������� $���� 9���� ����!��� ����� ��� �&&�� 6���/�

�$�� K� >� 9�������3 2���� �&&�� .8� )/6��$)� 3� K�� ���������� I� <� K������� O� <� +���������� %� >� O� K������

3� G�����8� :� %������� -� K�� %������ 3� <������ ���9 ��� ��� ���$ �&&�� 68-� $/*�

�$6� G� P��� �� F���� G� G��� G� >�� ���� ����� �&&&� *.� )*/��$4� ;� %� K����� 1� =� I����� ���� ����� �&&&� *.� �/���$*� @� �������� +� ����(� 3� ���� �� 9� >��(� 3����� 3��� ,�����

����� %�#�� �%%%� /$6��/2� �& 3� >� :��� �� >� I������� 3� I����!���� %� ��� 3� 1� ���������

+� =������ 2��� 2�����!:��� �%%)� *11� �66$� �& 3� 3� �������3� ������ � F������� E� E� �������� E� 3� I���� )� ��� $������� �&&�� *.-� 66/4� & E� E� �������� E� 3� I���� 3� >� :��� ��O� ������ ��� ;���� �&&�� *� $4�� �& 3� >� :��� �� %� E�������%� I������ E� 3� I���� $���� ����� �&&&� *.� $)6)�

�/�� O� +� +��(� �� 3� 3����� ����� �%%(� -+/� 4$*��/$� 3� 9� ������� -� O���� :� I������������ >� ���� � 3� K��8�� %� E�

@�������� �� 3� 3����� )� ��� $���� ��� �&&!� *.8� $*6���//� E� 3� I���� G� >��� �� =���� 9� 9������� � 1�������� F� K������

� ������� O� E� ����� O� 9�������� ;������ �&&!� .1� 6446��/5� �& G� >��� �� =���� E� 3� I���� 3� ������� 9� 9������� �� 6/��

����(��� 3������ ������� � ��� ������� $������ �����#� ;���"���� 9��� ;I� 0�3� ; ���� $��$4� �&& � � )$� �& G� >��� �� =����E� 3� I���� 3� ������� 9� 9������� O� 1� E� ����� O� 9�������� � ������� %��#�� ����� ��� ���� �&&!� /1� 5//� & �� =����G� >��� E� 3� I���� 3� ������� 9� 9������� O� 1� E� ����� O� 9��"������ � ������� %��#�� ����� ��� ���� �&&!� /1� 64*� �& %� O� .�"����� 3� �� ��!���� �� O��������� ��� 5���� �&& � 4.8� /$�/�

�/�� � +������� @� F�� ��"���������� 3� ���� �� � .������ 3� 9�����O� 9� ������ 9� ��� ����� O� :�'����� 3� ������ @� ��������9� >��(� ;������ �%%%� *6� 562��

�/)� 3� :��� �� E� 3� I���� %� �� I������ O� =� ;�������� F� 3� :�"������� $���� ����� �&&&� *.� $6$��

�/6� @� F�� ��"���������� 9� >��(� >� � >�(" ��(��� ;������ �&&��*+� 5�$$�

�/4� %� =���� K� �����������" � ����� >� � >�(" ��(��� @� 9������ ��������� �&&�� *4� *24�

�/*� @� F�� ��"���������� K� �����������" � ����� 9� >��(� >� � >�(" ��(��� ;������ �&&�� *+� 5��*�

�52� � 1���� :� N����� $���� ����� �&&�� *4� $�6)��5�� <� O����� O� @� ������� I� �� +!���� K� 9������ $���� ����� �%%%� **�

$�/$��5$� K� �����������" � ����� �� :�������("F��(���(� -� +���!��� >� �

>�(" ��(��� ����� )� $���� �&& � 68� �2�6��5/� N� N� F�� 3� @�8������� ;� ���� $���� ����� �&&�� *4� 6)2��55� O� :�� (������ � +����������� � F������� ���9 ��� ��� ��� ''

�&& � /*� �)/��5�� �� :� ������ �� :������� $���� ����� �&& � *6� �*4��5)� ;� K� ������ ;� I�������� 1� I��� ����� ���� ����� �&&&� *.� ��2��56� � +������� @� F�� ��"���������� 3� ���� �� � .������ 3� 9�����

+� ����(� O� 9� ������ 9� ��� ����� O� :�'����� 3� ������ @� ��"������� 9� >��(� ;������ �%%%� *6� 562��

�54� +� ����(� @� ��������� 9� >��(� @� >��("-�8����� O� ��� ��("%�"����� ���� ����� �&&�� *-� /*/�

�5*� �� -� +������� 9� @� ��������� -� %�� 3� ����� $���� ����� �%%%� **�6*��

��2� -� 9���������� @� 9������ ���� ����� �&&�� *4� /5����� :� 9� � ������� � 3�"%����� 9� @� ��������� 3� ����� $���� �����

�&&�� *4� //2����$� O� +� I��� �� �� >��� �� O� I��� G� � >��� %��#��� �&&�� 4-� 6��4���/� %� E�������� G� -������� � =������� I� I������ ����(� $����

'��� ��� �&& � 4.� 5�*6���5� G� -������� � =������� :� G������� )� ��� $���� ��� �&& � *.6�

�/ /$2����� �& �� +� F������ ,���� %���� ��� �&&&� *1.� 56/� �& E� 3� <����

<� ������ =� >���������� +� . ����!�� ���� )� %���� 2��������&&&� 61� $6� & O� � :������ <� 0������� 3�� %�#�� $���� �%%%� 66��/*� & E� 3� <���� $���� 9���� $������ '���� �� ��� �%%(� .� �/��

��)� O� @������ I� ;������� I� E���(�!�� +� .8���� G� G�������� � �������� I� �������� 1� -��8��� I� ������ ��� I� @������ $������������ �&& � *.� ���

QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ

���� ����� �� � ����� ��� ��� �� ��� ��������� ����������� ��� � ������� ������ ���� � ��� ����� ��� !��� ���

����

�����

�� ����� � ���E��-����� ��'��+�. �. F) ���� /+�&&��-.