UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ” SEMINÁRIO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM: Estatística e Experimentação Agronômica NÍVEL: Mestrado ALUNO: Diógenes Ferreira Filho ORIENTADORA: Prof a . Dra. Roseli Aparecida Leandro TÍTULO: INTRODUÇÃO À TECNOLOGIA DE MICROARRAY PIRACICABA Estado de São Paulo - Brasil Outubro de 2008
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INTRODUÇÃO À TECNOLOGIA DE MICROARRAY · 1 1. Expressão Gênica A expressão gênica corresponde vários eventos, a começar pela transcrição do gene no núcleo até a tradução
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”
SEMINÁRIO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM: Estatística e Experimentação Agronômica NÍVEL: Mestrado ALUNO: Diógenes Ferreira Filho ORIENTADORA: Profa. Dra. Roseli Aparecida Leandro TÍTULO: INTRODUÇÃO À TECNOLOGIA DE MICROARRAY
PIRACICABA Estado de São Paulo - Brasil
Outubro de 2008
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1. Expressão Gênica
A expressão gênica corresponde vários eventos, a começar pela transcrição do gene no
núcleo até a tradução do mRNA no citoplasma (Marques, 2003).
Assim, expressão gênica corresponde ao processo em que a informação codificada por
um determinado gene é decodificada em uma proteína.
Com raras exceções todas as células que constituem um organismo vivo contêm a
mesma carga genética, ou seja, o mesmo DNA.
O que diferencia dois grupos celulares morfologicamente distintos (células de folha e
tronco, por exemplo) são os genes expressos nesses dois tipos de células e os níveis de
expressão desses genes.
A comparação dos níveis de expressão dos genes de diferentes tecidos pode levar ao
entendimento dos diversos fenômenos encontrados em um organismo.
Experimentos para a detecção de genes com expressão diferencial entre tecidos e
órgãos podem ser realizados com microarrays (microarranjos) de DNA.
2. Experimento de Microarray
Esse tipo de experimento permite mensurar os níveis de expressão de milhares de
genes simultaneamente, possibilitando comparações entre amostras de tecidos pelos
perfis de expressão.
São realizados milhares de testes simultâneos para diferentes variáveis-respostas na
mesma estrutura de unidades experimentais.
Figura 2.1: Imagem de um microarray.
2.1. Algumas aplicações de Microarray
• Análise de expressão gênica;
• Detecção de polimorfismos;
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• Re-seqüenciação genética;
• Genotipagem;
• Escalagem genômica.
2.2. Algumas técnicas de Microarray
• Ilumina bead array (www.illumina.com);
• Nylon Membrane (www.schleicher-schuell.com);
• Agilent: Long oligo Ink Jet (www.home.agilent.com);
• GeneChip Affymetrix (www.affymetrix.com);
• cDNA microarrays;
• Microarrays de proteínas e Oligo Microarrays;
2.3. Fabricação de Microarrays
A construção dos microarrays pode ser feita por diferentes técnicas. A figura abaixo
ilustra três técnicas de fabricação de microarrays: (a) Photolithography, (b) Mechanical
microspotting e (c) Ink jetting.
Veremos apenas a técnica (b) Mechanical microspotting.
Figura 2.2: Técnicas de fabricação de microarray. (a) Photolithography, (b) Mechanical
microspotting, (c) Ink jetting. Fonte: Schena et al. (1998).
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Segundo Lopes e Pais (2006) apesar da existência de microarrays de expressão gênica
em vários formatos, são usados com mais regularidade duas categorias:
• Microarrays de cDNA compostos por cDNA ou oligonucleotídeos;
• Arrays de grande densidade produzidos comercialmente que contêm
oligonucleotídeos sintetizados.
O princípio pelo qual todos os microarrays se regem é o da capacidade de uma
seqüência presa de nucleotídeos se “colar” ou hibridar com sua seqüência
complementar e formar uma seqüência dupla de DNA (Lopes e Pais, 2006).
3. cDNA Microarray
Segundo Esteves (2002) um experimento de microarray consiste de duas etapas:
I. Etapa bioquímica;
II. Etapa computacional estatística.
3.1. Etapa Bioquímica
Consiste de duas fases que podem ser consideradas independentes, são elas:
i. Fixação de cDNAs nas lâminas de vidro;
ii. Extração de RNA e hibridização.
3.1.1. Fixação dos cDNAs nas lâminas de vidro
• Seleção de clones:
A fase inicial de um experimento consiste na seleção de clones de cDNA vindos
de algum banco de clones que geralmente estão relacionados com algum
projeto genoma específico.
• Amplificação dos fragmentos por PCR:
Como em experimentos de microarray podem ser utilizados vários microarrays
a quantidade inicial de cDNAs pode não ser suficiente, e deve então ser
amplificada por PCR (Reação em cadeia por Polimerase).
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Figura 3.1: Termociclador. Aparelho utilizado para realização de PCR.
• Fixação das cDNAs:
Os fragmentos selecionados são fixados nas lâminas de vidro por um robô
chamado arrayer em posições específicas conhecidas como “spots”.
Os cDNAs fixados na lâmina são chamados cDNAs “sonda”, os quais contém,
cada um, as seqüências de um único gene. Por exemplo, em um experimento
de microarray com ratos os cDNAs sonda podem ser cDNAs com as seqüências
de todos os genes do DNA do rato.
Figura 3.2: Arrayer depositando os cDNAs nas lâminas de vidro.
3.1.2. Extração de RNA e hibridização
• Extração do mRNA ou RNA total das populações celulares de interesse;
São extraídos o RNA mensageiro (mRNA) ou RNA total das duas populações
celulares de interesse (Tratamento e Controle, por exemplo: células
cancerígenas e células normais).
• Produção de cDNA alvo por transcrição reversa incorporados com Cy3 e Cy5;
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A partir de cada amostra de RNA é produzido cDNA (DNA complemetar) por
transcrição reversa. Os cDNAs de cada amostra são “tingidos” com os corantes
fluorescentes Cy3 e Cy5 os quais serão excitados com comprimentos de onda
diferentes. Os cDNAs da população controle serão “tingidos” com Cy3 e os
cDNAs da população tratamento serão “tingidos” com Cy5.
• Os cDNAs alvo de duas amostras distintas (uma com Cy3 e outra com Cy5) são
misturados e hibridizados contra a lâmina de vidro;
Nesse processo as seqüências de cDNAs das duas amostras, em contato com a
lâmina de vidro, irão se anelar com suas seqüências complementares dos
cDNAs sonda. Haverá competição entre as duas amostras.
Figura 3.3: As duas amostras de cDNAs marcados são misturadas e colocadas
na lâmina para hibridização. Fonte: Souto (2008).
3.2. Etapa computacional estatística
Consiste das seguintes fases:
i. Aquisição de imagens,
ii. Análise de imagens,
iii. Normalização de dados,
iv. Análise de dados.
3.2.1. Aquisição de Imagens
Depois que a lâmina foi hibridizada ela passa por uma etapa de lavagens para remover
o excesso de material genético que não hibridizou com os as sondas e é feita a leitura
do microarray pelo scanner para digitalização da imagem;
Existem dois tipos de scanners:
• Scanner CCD;
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Na tecnologia CCD as lâminas são excitadas com uma luz branca em toda sua
extensão e uma câmera fotografa a imagem decorrente da emissão de
intensidade proveniente dos fluorocromos (Cy3 e Cy5) presentes nos alvos
(populações celulares de interesse) que foram utilizados para a hibridização
(Esteves, 2002).
• Scanner a laser;
Os scanners a laser fazem uma varredura na lâmina com um raio laser nos
comprimentos de onda específicos digitalizando a imagem gerada.
Os dados brutos resultantes de um experimento de microarray de duas cores são
imagens monocromáticas, uma para cada corante, usualmente um arquivo .TIF.
12130c1G 12130c1R
Figura 3.4: Imagens de um experimento de microarray. A figura 12130c1G
corresponde à leitura do scanner no comprimento de onda que excita o Cy3 e a figura
12130c1R corresponde à leitura do scanner no comprimento de onda que excita o Cy5.
Estas figuras fazem parte do experimento Apo AI o qual é tratado por Dudoit et al.
(2000). O banco de dados desse experimento, incluindo as imagens, está disponível em