Interpetarea cromatogramelor
In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide
cu coloan indiferent dac aceasta este de tip cu coloan deschis sau
sau de tip HPLC . Aa cum se observ amestecul de substane este
injectat la intrarea n coloan , prin mecanisme diverse de natur
fizico chimic are loc separarea specific a speciilor chimice n timp
acestea sosind pe rnd la cellalt capt al coloanei unde sunt
detectate obinndu-se o cromatogram de tipul celei din figur.
Fig. 1. Principiul separrii cromatografice pe coloan i
cromatograma obinut pentru un amestec de trei specii chimice ntr-un
solvent
Pe cromatogram pot fi identificate trei Peak-uri:
- primul peak, de nlime mic, este cel al unei specii chimice
nereinute (neretardate) de umplutura coloanei , aceast specie
traverseaz coloana cu viteza fazei mobile, timpul scurs de la
injecie pn la traversarea coloanei de ctre aceast specie se noteaz
cu t0
- al doilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza de
traversare medie timpul de reinere fiind notat cu tr1
- al treilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza mic
de traversare aceast specie avnd timpul de reinere tr2
Mrimi specifice cromatografiei
Lungimea coloanei cromatografice (L)- reprezint lungimea
coloanei msurat de la sistemul de injecie pn la detector
Viteza liniar de curgere (u) estedefin it prin viteza de curgere
a fazei mobile i este exprimat prin:
Timpul de traversare (timpul mort) (t0 ) este timpul parcurs de
o specie chimic nereinut e (neretardate) de umplutura coloanei de
la injecie pn la traversarea coloanei, aceast specie traverseaz
coloana cu viteza fazei mobile. Acest timp espe msurat automat prin
semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de
detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului
cromatografic atinge valoarea zero. Timpul t0 formeaz baza de
plecare pentru determinarea factorului de reinereTimpul de reinere
(tr)- reprezint timpul necesar ca o specie chimic s traverseze
coloana cromatografic din momentul injectiei pn la sosirea la
detector . Ca i la timpul mort i acest timp espe msurat automat
prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de
detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului
cromatografic atinge valoarea zero. Factorul de reinere ( factorul
de capacitate ) (k). Din cromatogram din fig. 1 se observ c natura
speciilor chimice poate fi interpretat prin prisma timpului de
retenie tr acest timp depinde ns pe lng natura specieiei i de ali
factori precum : lungimea coloanei, natura i granulaia umpluturii,
etc, ca atare timpul de reinere poate fi considerat specific
naturii speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un
caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru
identificare calitativ este folosit factorul de reinere (k) denumit
in literatur i factor de capacitate:
un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de
identificare sczut iar un factor de capacitate de valoare mare
indic un timp de separare i de analiz mare cu efect negativ asupra
producivitii. Din punct de vedere al ordinului de mrime factorul de
capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10.
Gradul de separare a doi componeni () - exprim gradul de
separare cromatografic a dou substane i este definit ca :
Eficiena unei coloane cromatografice . Ca msur a eficenei unei
coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numrul N de
talere teoretice necesare separrii fie nlimea teoretic H a
talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul c o coloan
cromatografic poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane (talere)
lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se
echilibrul ntre faza mobil i cea staionar . n acest concept se ia
in considerare situaia n care un taler realizeaz singur separarea
cromatografic a componentelor, este evident c pentru aceasta viteza
fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare
a unei cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu
umplutur pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de
umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conin cca 50.000
talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul de 5 m sau
cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de
umplere cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane
cromatografice de separare crete atunci cnd dimensiunea
particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere necesar
ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:
de unde rezult nlimea talerului ca fiind :
Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este
aceea a lirii benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor
chimice prin coloana cromatografic. In condiii ideale o specie
chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda ei s se
leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la
traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular longitudinal, de
curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei
i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai
ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie
tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de
relaia:
Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv
eficiena unei coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi:
tr i W.
O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli
cercettori de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare
llimii peak-ului la jumtatea nlimii lui, figura , numrul de talere
teoretice rezultate fiind :
Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN
p1-18)
Dintre cele dou mrimi : nlimea H a talerului i numrul N de
talere ce indic ambele eficiena coloanei este preferat exprimarea
prin numrul de talere deoarece este adimensional i poate fi folosit
n comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca
eficiena s fi fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere
poate fi mrit foarte simplu prin creterea lungimii coloanei.
Rezoluia de separare Rs - reprezint msura separrii unui mai
avansate sau mai puin avansate aunui component de altul , cu ct
distana ntre dou peak-uri este mai mare cu atit rezoluia este mai
bun, totodat crete i timpul de analiz cromatografic:
EMBED Equation.3 unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor
celor dou componente. Exprimarea pentru t i w poate fi n uniti de
timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru cele dou mrimi
se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt complet
separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou
Peak-uri neseparate complet.
Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilorDac cele dou
peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia ()
devine
ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic
asupra rezoluieiei prin termenul de la numrtor i a eficienei de
separare prin abaterea standard. In situaia in care:
tr2 tr1 = 4
rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei
separri avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea
termenilor de statistic matematic este justificat de asemnarea
dintre peak-urilor cromatografice i curbe de tip Gauss valoarea
lirii W fiind egal cu 4Lirea de band
Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin coloan este
influenat de patru factori:
1. difuzia radial
2. difuzia longitudinal
3. efectele transportului de mas
4. efectele exterioare
Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de
curgere distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite
fcnd ca ea s soseasc pe un interval mai mare de timp (band lit).
Diferenele de lungime iau natere ca urmare a diferitelor forme i
dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit golurilor
neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n
figura
Fig. Efectul difuziei radiale asupra lirii benzii [VARIAN
P1-25]Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie
ca ea s aibe o umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct
mai uniform. Difuzia radial este cu atit mai ridicat cu ct proba
traverseaz mai ncet coloana. La coloane capilare fr umplutur ,
folosite n gazcromatografie, difuzia radial poate fi neglijat.
Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de
curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat
pe msura creterii timpului de staionare a probei n coloan. Spre
deosebire de difuzia radial la cea axial se poate reduce efectul
asupra lirii de band prin mrirea vitezei fazei mobile. Din cauza
coeficientului de difuzie mai mic cu cca 103-104 Fig. Efectul
difuziei longitudinale asupra lirii benzii VARIAN p1-26
la lichide dect la gaze difuzia longitudinal este minor n cazul
cromatografiei de lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac
un rol hotrtor. Influena efectului difuziei longitudinale asupra
lirii de band este reprezentat n figura Efectele transportului de
mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului c cinetica de
absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea
mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci
cnd o molecul a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar
petrece pe i n aceasta un un anumit timp pn cnd intr din nou n
fluxul de curgere i este transportat mai departe de faza mobil. In
tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au
interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia
moleculelor o joac i structura poroas (atunci cnd este cazul) a
fazei staionare. Fenomenele de transport de mas devin cu att mai
pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca atare
lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus
prin scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea
poate fi redus prin folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor
particule cu diametru ct mai mic i neporoase pentru umplutur,
precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la cromatografia
de lichide) .
Fig.
Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de
band
Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii
de band . i- la curgere a unui lichid printr-o conduct viteza
liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c moleculele din
centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a
peretelui, ii- i difuzia multidirecional a probelor lichide duce la
lirea de band
Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul
coloanei i snt cauzate de volume moarte n injector , n detector,
precum i n conductele de transport. Suma efectelor enunate mai sus
se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1] simplu poate
demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul
de lichid iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei
situa\ii concrete :
Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o
cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea
coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul interior de
0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre
detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un
diametru interior de 4,6 mm
Simetria Peak-urtilor. Forma peak-urilor poate fi foarte diferit
, n vederea caracterizrii acestora IUPAC a elaborat o clasificare ,
astfel: la crestere mai accentuat a frontului Peak-ului decit a
scderii acestuia denumirea este de Tailing
la cresterea mai lin a frontului peak-ului fa de scderea
acestuia denumirea este de Fronting
Factorul de Tailing sau de fronting reprezint o msur a simetriei
peak-ului i se determin la valoarea de 10% din nlimea peak-ului dup
relaiile din figura
Analiza calitativ
Analiza cantitativMetoda normrii suprafeei (nlimii)
La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa
respectiv inlimea unui peak este proportional cu concentraia
componentului reprezentat de acel peak. Pentru a exprima
concentraia procentual a unui component trebuie avut n vedere
nlimea total sau suprafaa total a tuturor componentelor din amestec
care este considerat ca avnd o compoziie de 100% . Concentraia
fiecrui component din amestec se determin pe urm prin regula de
trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se
accept urmtoarele:
1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate
componentele i c fiecare component apare sub forma unui peak
individual bine definit. Aceast presupunere nu ine cont de faptul c
dou sau mai multe componente pot parsi n acelai timp coloana fiind
identificate ca o singur specie, sau unele specii pot fi reinute
total pe coloan i iar altele eventual nici nu snt detectate
2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru
toate componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu
se adeverete
bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se
procedeaz la calibrarea sensibilitii detectorului prin diferite
metode care vor fi descrise n continuare.
Metoda standardului extern
La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care
conine specia (speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime
al concentraiei componentei (componentelor) urmrite este bine ca la
standardul extern concentraia s fie n acelai domeniu. Faza mobil
astfel preparat se trimite prin cromatograf i se traseaz o
cromatogram , operaia se repet pentru proba de analizat. Din
cromatograma standard se determin pentru peak- ul urmrit, figura,
un factor de rspuns r ca fiind raportul dintre concentraia
componentei [Ai] urmrite i nlimea h sau suprafaa S a peak-ului,
:
b
Fig. Mrimi caracteristice ale peak-ului luate n calcul la
determinarea concentraiei prin metoda standardului externn
continuare concentraia oricrei componente din prob se determin prin
nmulirea factorului de rspuns r cu nlimea h sau cu suprafaa S
peak-ului. De fapt prin calcularea acestui factor de rspuns r se
simplific determinarea concentraiei prin regula de trei simple,
factorul de rspuns regsindu-se de fiecare dat n aceast regul sub
forma unei constante, la calcularea concentraiei diferitelor
componente din amestec. Acest mod de determinare a concentraiei
unei componente presupune o dependen liniar ntre nlimea respectiv
suprafaa peak-ului i concentraie. Atunci cnd aceast dependen este
cunoscut sau bnuit ca fiind neliniar se efectueaz mai multe
cromatograme etalon cu concentraii cunoscute care includ n domeniu
valoarea concentra iei necunoscute , figura i cu valorile obinute
se traseaz o curb de
Fig. nlimea i forma peak-urilor la calibrarea multipl cu
concentraii cresctoare a componentului urmritFig. Curba de
etalonare a componentului urmrit oarecare
etalonare n coordonate h(S) i concentraie. Pe aceast curb de
etalonare se extrapoleaz valorile nlimii sau suprafeei peak-ului
urmrit pentru detrminarea concentraiei speciei pe care o reprezint
acesta. Imprecizia acestei metode este legat de erorile de dozare
ale probei de analizat avnd n vedere i volumele mici ce se
dozeaz.
Metoda standardului intern
La folosirea acestei metode se obin cele mai mari precizii
deoarece snt evitate erorile datorate impreciziei de dozare a
probei la injecie. Tehnica se bazeaz pe adugarea atit la proba
standard ct i la proba urmrit o cantitate bine stabilit dintr-un
standard intern. Raportul dintre suprafeele peak-urilor sau a
nlimii probei i suprafaa peak-ului standardului intern reprezint
parametrul analitic urmrit respectiv factorul de rspuns r :
factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de
corespondena dintre suprafaa S a peak-ului i concentraia c , i ca
fiind [LINDSAY]:
unde: c - concentraia componentei care intereseaz
S - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului
cs - concentraia standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardukui
intern
In aceste condiii concentraia componentei urmrite cu are
expresia:
unde: cu - concentraia componentei analizateSu - suprafaa
(respectiv nlimea) peak-ului componentei analizatecs - concentraia
standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardului
intern
PAGE 14
_1272654517.unknown
_1272655441.unknown
_1298178338.unknown
_1298141341.unknown
_1272655177.unknown
_1272654896.unknown
_1271783782.unknown
_1272614124.unknown
_1272647645.unknown
_1271942818.unknown
_1272614105.unknown
_1272006761.unknown
_1271942781.unknown
_1269325249.unknown
_1269333197.unknown
_1269325047.unknown