INTERFERENZA DELL’IPERLIPEMIA E DELL’IPERPROTEINEMIA NELLA DETERMINAZIONE DEGLI ELETTROLITI: CONFRONTO TRA UN METODO DIRETTO ED UNO INDIRETTO SAMUELA BALESTRA TECNICO IN ANALISI BIOMEDICHE SSMT – LOCARNO Responsabile: Roberto Della Bruna Eseguito al laboratorio dell’Ospedale La Carità di Locarno
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INTERFERENZA DELL’IPERLIPEMIA E
DELL’IPERPROTEINEMIA NELLA
DETERMINAZIONE DEGLI
ELETTROLITI: CONFRONTO TRA UN
METODO DIRETTO ED UNO
INDIRETTO
SAMUELA BALESTRA
TECNICO IN ANALISI BIOMEDICHE
SSMT – LOCARNO
Responsabile: Roberto Della Bruna
Eseguito al laboratorio dell’Ospedale La Carità di Locarno
Samuela Balestra Lavoro di Diploma 2008‐2009
Riassunto Abstract
Introduzione e obiettivo
La misura della concentrazione degli elettroliti nel siero è
utile per la diagnosi e per il controllo di alcune patologie.
A dipendenza dell’apparecchio utilizzato per l’analisi, sono
usati principalmente due metodi: uno indiretto ed uno
diretto. La differenza tra i due metodi è che il primo
effettua una diluizione del campione con della soluzione
tamponata prima della misurazione del campione, mentre
il secondo no. Questa diluizione potrebbe, nei campioni
iperlipemici, o anche in caso di iperproteinemia,
modificare il valore della concentrazione degli elettroliti:
infatti una parte del volume pipettato sarebbe “occupato”
dai lipidi o, analogamente, dalle proteine. I risultati
sarebbero quindi falsamente diminuiti nel metodo
indiretto. Obiettivo del lavoro è quindi stabilire se esista
una differenza significativa tra i due metodi, tramite un
confronto di campioni.
Materiali e metodi
Sono stati analizzati 59 campioni iperlipemici di siero
raccolti dai laboratori ODL e ORL. L’apparecchio EML100,
che utilizza un metodo ISE diretto, e l’apparecchio
Beckman Coulter DXC600, che utilizza invece un metodo
ISE indiretto, hanno permesso il confronto dei campioni
con i due metodi. I risultati sono poi stati analizzati e
confrontati tramite il programma statistico “Analyse-it”.
Risultati
Il programma ha determinato che esiste una modesta
influenza dei lipidi nella differenza tra il metodo diretto e
quello indiretto per la misurazione della concentrazione
del sodio e del cloro, mentre non ne è influenzato il valore
del potassio. Lo stesso vale per l’iperproteinemia, anche se
l’influenza è meno marcata.
Conclusione
In base ai risultati ottenuti con il seguente lavoro, si è
deciso che non si effettuerà nessuna correzione automatica
del valore, ma questo lavoro dimostra che in caso di forte
iperlipemia o iperproteinemia, si dovrebbe utilizzare un
metodo diretto piuttosto che uno indiretto. Questa
conclusione è dovuta al fatto che la concentrazione dei
lipidi o delle proteine deve essere veramente molto
elevata, affinché ci sia una differenza clinicamente
rilevante tra i due metodi.
Introduction and objective
The measure of the electrolyte's concentration in serum is
useful for the diagnosis and the checking of some
pathologies.
Depending on which apparatus is used for the test,
basically two methods are used: a direct one and an
indirect one.
The difference between the two methods is: the indirect
method makes a dilution with a buffer solution before the
measuring, the direct method does not. This dilution could
change the readings of sodium concentration in
hyperlipemic and hyperproteinemic samples: a share of
the pipetted volume would be occupied by lipids or
proteins. The results could therefore be falsely diminished
with the indirect method. The objective of this work is to
establish if there is a significant difference between those
two methods by comparing the samples.
Materials and methods
59 Hyperlipemic serum samples taken from the
laboratories of ODL and ORL were analyzed.
The apparatus EML100, which utilizes a ISE direct
method, and the apparatus Beckman Coulter DXC600,
which instead uses a ISE indirect method, allowed the
comparison of the samples with these two methods.
The results were analyzed and compared with the
statistical program “Analyse-it”.
Results
The program determines that there is a modest influence
of the lipids in the difference between direct and indirect
method for the sodium and chlorine measuring; whereas
there is no influence on the potassium value. The same
applies for hyperproteinemia, but in this case the influence
is minor.
Conclusion
Based upon the results obtained by this diploma study, it
has been decided that the method used until now will not
be changed. But this work demonstrates that in case of a
high hyperlipemia or hyperproteinemia, the direct method
should be used instead of the indirect one.
This conclusion is due to the fact that the lipid's
concentration has to be really very high to show a relevant
difference between the two methods.
Samuela Balestra Lavoro di Diploma 2008‐2009
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Indice
Introduzione 4
Obiettivo 6
Materiali e metodi 7
Risultati 9
Discussione 20
Conclusioni 22
Bibliografia 23
Ringraziamenti 24
Samuela Balestra Lavoro di Diploma 2008‐2009
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Introduzione
Il sodio è un elettrolita che fa parte, insieme al potassio, al cloro e al magnesio, di quelli
quantitativamente più importanti. Il 97% del sodio totale si trova nello spazio
extracellulare; la sua assunzione avviene in maniera preponderante attraverso il sale da
cucina, mentre la sua eliminazione avviene principalmente attraverso i reni.
I valori di riferimento del sodio nel siero/plasma in EOLAB sono di 135 – 145 mmol/L (1).
La misura della concentrazione del sodio nel siero rappresenta una misura della
regolazione dell’osmolalità e del volume extracellulare: è quindi utile per la diagnosi e per
il controllo di alcune patologie come l’aldosteronismo, il diabete insipido, il morbo di
Addison, la disidratazione ed anche per altre malattie che potrebbero provocare
un’alterazione degli elettroliti (2).
Il cloro è presente prevalentemente nello spazio extracellulare, nella misura del 56%, e la
sua assunzione dipende prevalentemente dalla dieta. Lo ione cloro, oltre ad essere
importante per il bilancio idrico, lo è anche per l’equilibrio acido-base (2).
I valori di riferimento del cloro nel siero/plasma in EOLAB sono di 97 – 107 mmol/L (3).
La maggior quantità del potassio, ovvero il 98%, è intracellulare. La concentrazione
extracellulare, anche se non è rappresentativa della quantità totale del potassio, è
importante perché colpisce la conduzione neuromuscolare e cardiaca. Concentrazioni
sieriche < a 2,0 mmol/l possono essere mortali: è importante, in questo caso, sapere se la
diminuzione è dovuta a una carenza di potassio o a causa della sua distribuzione nelle
cellule (2).
I valori di riferimento del potassio nel siero/plasma in EOLAB sono di 3,5 – 5,0 mmol/L
(4).
A dipendenza dell’apparecchio utilizzato per l’analisi, per gli elettroliti vengono usati
principalmente due metodi: la potenziometria diretta (“ISE diretto”, ISE sta per Ion-
Selective Electrode, elettrodo ionoselettivo o a membrana), rispettivamente la
potenziometria indiretta (“ISE indiretto”). Come dicono già le parole stesse, si tratta di un
metodo diretto e di uno indiretto. La differenza tra i due metodi consiste nella diluizione
effettuata sul campione prima della misurazione, quando si utilizza un metodo indiretto.
Questa diluizione potrebbe, nei campioni iperlipemici o iperproteinemici, modificare il
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risultato della concentrazione degli elettroliti (possibile pseudoiponatriemia,
pseudoipocloremia o pseudoipopotassiemia): infatti per ottenerla si preleva una piccola
quantità di campione che potrebbe essere occupata in buona parte dai lipidi o dalle
proteine, i quali hanno un volume “molto grande” rispetto agli elettroliti. I valori possono
quindi essere erroneamente diminuiti con il metodo indiretto, mentre dovrebbero esserlo
di meno nei risultati ottenuti con il metodo diretto. Per quest'ultimo, il campione viene
misurato direttamente sul siero, senza procedere a nessuna precedente diluizione (5, 6,7).
Infatti nel liquido a contatto con gli elettrodi, la concentrazione degli elettroliti è quella
effettiva e fisiologicamente rilevante. I lipidi non influenzano la misura. Un discorso
analogo vale per una concentrazione molto elevata di proteine nel siero, anche se questo
stato si presenta, nella routine, con una frequenza nettamente minore di quanto non
avvenga per le iperlipemie (5, 6, 7).
Attualmente nei laboratori vengono usati sia il metodo a potenziometria diretta che quello
a potenziometria indiretta. Di regola la misura diretta viene eseguita nei reparti
(gasometria), mentre le misure eseguite nel laboratorio sono solitamente indirette.
Nei laboratori di EOLAB viene usato l’apparecchio Beckman Coulter DXC 600/800 per la
misura indiretta, mentre vengono utilizzati apparecchi della Radiometer (EML100 o ABL)
per la misura diretta.
Per stimare l’effetto di un'iperlipemia e di un'iperproteinemia nella determinazione degli
elettroliti e per stimare l’eventuale importanza nella diagnostica di routine, si è deciso di
analizzare il problema più a fondo mediante un confronto tra le misure con i due metodi.
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Obiettivo
L’obiettivo del mio lavoro di diploma è di stabilire, raccogliendo il maggior numero
possibile di campioni di siero iperlipemici, e per mezzo di un confronto dei due metodi
(diretto e indiretto), se esista una differenza reale e significativa; e in caso ci fosse, di
quantificarla.
Scopo di questo lavoro è quindi anche di stabilire se, nei campioni iperlipemici, o in quelli
con un'iperproteinemia, gli elettroliti debbano venire direttamente misurati con un
apparecchio che utilizza un metodo ISE diretto; oppure di trovare una formula di
correzione che si possa mettere in relazione ai risultati.
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Materiali e metodi
Nel periodo compreso tra gennaio ed aprile 2009, sono stati raccolti 59 campioni
iperlipemici di siero provenienti dai laboratori dell'Ospedale La Carità e dell'Ospedale
Civico.
I campioni raccolti hanno un valore aumentato del colesterolo e/o dei trigliceridi. Si tratta
quindi di valori > 1,70 mmol/L per quel che riguarda i trigliceridi, oppure > 5,00 mmol/L
per il colesterolo.
Per quello che riguarda le proteine invece, la scelta è stata casuale in quanto un'
iperproteinemia è meno frequente e sarebbe stato quindi molto difficile trovare dei
campioni adatti. Per ottenere quindi il valore delle proteine, sono stati utilizzati i campioni
iperlipemici.
I campioni sono stati analizzati subito, tenuti in frigo per un massimo di 7 giorni, oppure
congelati ed analizzati il prima possibile.
Con il Beckman Coulter DXC600 sono state eseguite le analisi delle proteine totali, del
colesterolo, dei trigliceridi, del sodio, del potassio e del cloro, mentre con l’EML100 sono
state effettuate le analisi del sodio, del potassio e del cloro.
Tutti i campioni sono stati esaminati in doppio su entrambi gli apparecchi.
Alcuni campioni (numeri 7, 29, 39 e 53) sono stati diluiti 1:3 con soluzione fisiologica (Nacl
0,9%) per poter ottenere il risultato dei trigliceridi, altrimenti soppresso dall’apparecchio
perché troppo elevato: i limiti dell’apparecchio per l’analisi dei trigliceridi sono di
0,1 – 11,3 mmol/L.
Il Beckman Coulter DXC600 utilizza, per quel che riguarda il colesterolo, i trigliceridi e le
proteine totali, un metodo "end point" temporizzato; mentre per quel che riguarda gli
elettroliti impiega la potenziometria indiretta (“ISE” indiretto) mediante due elettrodi
ionoselettivi, dei quali uno agisce come elettrodo di riferimento (comune per sodio,
potassio e cloro)(1,3,4).
La concentrazione degli elettroliti viene misurata in seguito a una diluizione 1:33 con della
soluzione tamponata. Il tampone è utilizzato per stabilire un coefficiente di attività
costante per gli ioni, calibrando l’elettrodo sui valori di concentrazione. Gli elettrodi degli
elettroliti sono costituiti per ognuno in un modo diverso: per il sodio si tratta di un
elettrodo in vetro al silicato di alluminio – sodio – litio, per il cloro è costituito da un
composto di cloruro di argento, mentre per il potassio è costituito da una membrana di
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valinomicina. Per tutti e tre gli elettroliti l’elettrodo di riferimento è, come già spiegato,
comune per tutti gli elettroliti e cioè, in questo caso quello di riferimento del sodio.
fig.1 elettrodo ionoselettivo per le misurazioni potenziometriche
Quando la diluizione viene a contatto con l’elettrodo e ha quindi luogo il processo di
scambio ionico, si sviluppa una variazione di potenziale dell’elettrodo. Queste variazioni
vengono messe in relazione con l’elettrodo di riferimento. Il potenziale di riferimento
consente di calcolare, per mezzo dell’equazione di Nernst, la concentrazione dell'elettrolita
(1,3,4).
L’EML100 sfrutta invece la potenziometria diretta (“ISE diretto”) per effettuare le stesse
analisi. I risultati ottenuti con questo metodo dovrebbero essere paragonabili ai risultati
ottenuti con la potenziometria indiretta e viceversa (8).
Il principio del metodo è simile, si basa anch’esso sull'utilizzo di elettrodi ionoselettivi, ma
differisce per il fatto che il campione è misurato direttamente, senza procedere ad alcuna
diluizione precedente del siero (8).
La potenziometria diretta dà un valore più vicino alle reali condizioni fisiologiche che non
quella indiretta.
Per ogni apparecchio sono utilizzati reagenti appositi forniti dalla ditta stessa
dell’apparecchio.
L’analisi dei dati è stata resa possibile tramite la ricerca della relazione tra la somma dei
lipidi, o il valore delle proteine totali, e la differenza tra la misura diretta – indiretta.
I dati sono stati in seguito ordinati e inseriti nel programma statistico “Analyse-it” e
analizzati con il metodo non parametrico di Passing & Bablok.