Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Bioquímica Médica PAULO JOSÉ BELTRÃO INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FUNCIONAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (QUÍMICA BIOLÓGICA) Rio de Janeiro 2009
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
PAULO JOSÉ BELTRÃO
INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA
AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E
SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO
BIOQUÍMICA E FUNCIONAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO
DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (QUÍMICA BIOLÓGICA)
Rio de Janeiro
2009
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Paulo José Beltrão
Interação entre a Proteína Precursora Amilóide secretada (sAPP) humana e
Semaforina 3A: Caracterização bioquímica e funcional
Dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (Química Biológica)
Orientadora: Profa Margaret Haiganouch Magdesian
Orientador: Prof Sérgio T. Ferreira
Rio de Janeiro
2009
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Ficha Catalográfica
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami
Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização bioquímica e funcional/ Paulo José Miranda da Silva Iwakami Beltrão. – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica, 2009.
xii, 84 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Margaret Haiganouch Magdesian e Sérgio Teixeira Ferreira
Dissertação (mestrado) – UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica / Programa de Pós-graduação em Química Biológica, 2009.
Referências bibliográficas: f. 72-83
1. Proteína Precursora Amilóide - APP. 2. Semaforinas e Sema3A. 3. Neurônios do Gânglio da
Raiz Dorsal. 4. Doença de Alzheimer - Dissertação. I. Magdesian, Margaret Haiganouch. II. Ferreira,
Sérgio Teixeira. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de
Pós-Graduação em Química Biológica. IV. Título.
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Doenças Neurodegenerativas do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) sob orientação dos professores Margaret Haiganouch Magdesian e Sérgio T. Ferreira, na vigência de auxílios financeiros concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e pelo Howard Hughes Medical Institute (HHMI)
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INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E
FUNCIONAL
PAULO JOSÉ BELTRÃO
Tese submetida ao Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau
de Doutor em Ciências (Química Biológica).
Banca examinadora:
______________________________________________
Prof. Marcus Fernandes de Oliveira
(Presidente da Banca, Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Daniela Uziel Rozental
(Profa. Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Patrícia Franca Gardino
(Profa. Associada nível II do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Jean Christophe Houzel
(Suplente Externo, Prof. Adjunto do Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Pedro Lagerblad de Oliveira
(Revisor e Suplente Interno, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Margaret Haiganouch Magdesian
(Orientadora, Profa Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Sérgio T. Ferreira
(Orientador, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
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Agradeço
À professora Margaret Magdesian;
Ao professor Sérgio Ferreira;
Ao revisor da minha dissertação, professor Pedro Lagerblad;
Aos Professores Membros da Banca;
Aos Professores Ricardo Reis, Daniela Uziel e Gilberto Weissmüller;
Aos inegrantes do Laboratório de Doenças Degenerativas e do IBqM;
Aos meus amigos;
À minha família, principalmente minha mãe;
À Talita, minha namorada.
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RESUMO
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami. Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização Bioquímica e Funcional. Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado em Química Biológica). Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009.
A Proteína Precursora Amilóide (APP) é uma proteína transmembranar
amplamente expressa em mamíferos, bem conhecida por sua importância na doença de Alzheimer pois pode ser clivada, dando origem ao peptídeo neurotóxico amilóide-β (Aβ). No entanto, pouco se sabe sobre as funções fisiológicas da APP, especialmente no sistema nervoso central. A importância da APP tem sido correlacionada à formação das sinapses, ao crescimento dendrítico e axonal, além da sobrevivência neuronal. Estudos recentes sugerem que a APP seja parte de um complexo protéico com importância na migração neuronal e transmissão sináptica. Com o objetivo de identificar novos ligantes para APP, utilizamos uma biblioteca de peptídeos apresentados em fagos (phage display library) e identificamos peptídeos com alta afinidade pela sAPP695α (principal isoforma neuronal da APP, secretada e solúvel). Dois dos heptapeptídeos selecionados apresentaram similaridade a proteínas da classe 3 da família das semaforinas, proteínas reconhecidas por sua função no direcionamento neurítico. Na presente dissertação, mostramos por ELISA, co-imunoprecipitação e por experimentos com ressonância plasmônica de superfície (SPR) que sAPP695α se liga à Semaforina 3A (Sema3A) recombinante purificada e também à Sema3A secretada por células HEK transfectadas. Além disso, mostramos que concentrações nano molares de sAPP695α inibem a retração neurítica promovida por Sema3A em culturas de neurônios de gânglio da raiz dorsal. É interessante observar que os dois peptídeos selecionados por phage display impedem a interação Sema3A-sAPP695α e permitem a retração neurítica induzida pela Sema3A. Nossos resultados indicam que sAPP695α se liga à Sema3A e modula o crescimento e direcionamento neurítico, sugerindo o envolvimento da sAPP695α no desenvolvimento e plasticidade do sistema nervoso central.
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ABSTRACT
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami. Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização Bioquímica e Funcional. Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado em Química Biológica). Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009.
The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein widely
expressed in mammals that plays a major role in Alzheimer’s disease by giving rise, after cleavage by secretases, to the neurotoxic amyloid-β peptide (Aβ). However, much less is known about the physiological role(s) of APP, especially in the central nervous system (CNS). APP has been implicated in synapse formation, axonal and dendritic outgrowth and neuronal survival. Recent findings suggest that APP is part of a protein complex with important functions in neuronal migration and synaptic transmission. In order to identify new ligands of APP, we screened a phage display peptide library and identified high-affinity ligands for the purified recombinant human sAPP695α (the soluble, secreted ectodomain from the main neuronal isoform of APP). Two of the selected heptapeptides were highly similar to several class 3 members of the semaphorins family, proteins implicated in neurite guidance. In the present study, we show through ELISA, co-immunoprecipitation and surface plasmon resonance (SPR) that sAPP695α binds to both purified recombinant semaphorin 3A (Sema3A) and to Sema3A secreted by HEK293 cells transfected with the Sema3A gene. Furthermore, we show that nanomolar concentrations of sAPP695α inhibit neurite retraction promoted by semaphorin in cultures of dorsal root ganglion neurons. Interestingly, the two peptides selected by phage display inhibit sAPPα binding to Sema3A and block the inhibition of neurite retraction. Our findings suggest that sAPP695α binds Sema3A and modulates neurite guidance and outgrowth, suggesting a role for the sAPP695α in the development and plasticity of the central nervous system.
Figura. 14: Ligação de Sema3A à sAPP695α revelada por Ressonância Plasmônica de
Superfície. A superfície do chip foi ativada com uma solução 1:1 EDC – NHS, sAPP695α em
tampão acetato foi imobilizada na superfície deste e etanolamina foi utilizada para retirar
proteína adsorvida ao chip por ligações não específicas. Foram utilizadas soluções de Sema3A
nas concentrações de 5 μg/ml e 10 μg/ml. Sema3A se ligou à superfície com sAPP695α
imobilizada na Flow Cell II (A)., enquanto que não se ligou ao chip sem a proteína imobilizada
na Flow Cell I (B). Na subtração do Flow Cell I da Flow Cell II (C), a ligação entre Sema3A e
sAPP695α é evidenciada (setas pretas), assim como a lenta dissociação entre essas moléculas
(setas azuis). A abscissa representa o tempo, marcado a cada 500 segundos e a ordenada
indica as unidades de ressonância (UR), marcadas a cada 50 unidades.Os gráficos
representam resultados obtidos em um experimento.
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Analisando-se detalhadamente as curvas da subtração do canal 1 do
canal 2 (Figura 14), foi possível calcular a constante de dissociação das duas
proteínas, na ordem de 10-11M. Este experimento foi realizado uma vez. Para
melhor análise, serão realizados experimentos em duplicata com pelo menos
quatro concentrações diferentes de Sema3A.
Fig. 14: Análise dos resultados da ressonância plasmônica de superfície. As curvas
obtidas pela subtração da Flow Cell I da Flow Cell II (modificado do gráfico da fig.12 C). As
curvas indicam a ligação entre sAPP695α imobilizada e Sema3A. A Sema3A foi exposta ao
chip em duas diferentes concentrações, 5 μg/ml (curva menor) e 10 μg/ml (curva maior). A
abscissa representa o tempo, marcado a cada 100 segundos e a ordenada indica as unidades
de ressonância (UR), marcadas a cada 20 unidades. As curvas foram analisadas através do
programa de análise Biaevaluation 4.1 (BIAcore) e a constante de dissociação estimada na
ordem de 10-11
M pelo mesmo programa. O programa tenta ajustar equações às curvas que
representam a associação (Aumento de UR) e a dissociação (Diminuição da UR). O método
utilizado foi o de Langmuir, que é o mais simples modelo cinético. Ainda são necessários mais
experimentos e uma maior faixa de concentrações de Sema3A para confirmar o valor de KD.
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4.5 – Ensaios em cultura dissociada de neurônios de Gânglios da Raiz
Dorsal de embrião
Após a avaliação, através de ensaios bioquímicos e biofísicos, da
interação entre sAPP695α e Sema3A, foram feitos experimentos buscando
elucidar quais seriam os possíveis efeitos dessa interação sobre o crescimento
neurítico, uma vez que a função de Sema3A no direcionamento do crescimento
axonal já foi bem estabelecida (Kruger e cols, 2005 para uma revisão).
O modelo de gânglio da raiz dorsal de embriões de galinha de sete dias
é um modelo clássico em que a Sema3A apresenta um efeito claro de
colabamento de cones de crescimento e retração de neuritos, sendo utilizado
para diversos experimentos com essa proteína, inclusive o que a descreveu
pela primeira vez (Luo 1993).
Os ensaios de retração de neuritos foram realizados com fotos
seqüenciais tiradas num intervalo de 30 minutos e com uma diferença de 5
minutos entre elas, totalizando 8 fotos por ensaio (Figura 15).
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Fig. 15: A sAPP695α é capaz de modular a atividade biológica de Sema3A. Cultura dissociada de neurônios de gânglios da raiz dorsal de embriões de
galinha de 7 dias foram mantidas por 24 h até o início das incubações nas diferentes condições. O efeito da Sema3A foi a retração neurítica. Cada ensaio
tinha duração de 30 minutos com fotos tiradas num mesmo campo do microscópio de 5 em 5 minutos (7 fotos) após a adição das proteínas. Culturas
expostas a 0,8 nM de Sema3A apresentaram retração neurítica. Quando a cultura foi tratada com 0,8 nM de Sema3A e 75 nM de sAPP695α, a retração
neurítica foi reduzida. A incubação com Sema3A, sAPP695α e 75 nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF), foi capaz de reverter o
efeito inibitório de sAPP695α na ação de Sema3A.
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As diferenças entre os comprimentos dos neuritos antes (tempo 0) e
depois (35 minutos) das diferentes adições ao meio de cultura foram
organizadas num gráfico de maneira que fosse possível observar os valores
individuais de todos os experimentos, além do valor de média. Os resultados
obtidos para as diferentes condições experimentais estão representados na
figura 16.
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Fig. 16: A sAPP695α modula a atividade biológica de Sema3A. Quantificação dos ensaios
em cultura de DRG de embriões de galinha de 7 dias. O gráfico representa 5 experimentos
independentes e cada círculo representa um neurito analisado. As barras horizontais
representam as médias de todos os experimentos para cada condição experimental. Valores
positivos representam a retração neurítica e valores negativos, crescimento. Os asteriscos
representam diferenças estatísticas significativas pelo desvio padrão (*p<0,0001; **p<0,00005;
***p<0,005). Observa-se que a aplicação de 0,8 nM de Sema3A (R&D systems) aumenta
significativamente a retração neurítica e a co-incubação com 75 nM de sAPP695α reverte essa
retração, voltando para níveis semelhantes ao controle. Além disso, a incubação com Sema3A,
sAPP695α e 75 nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF), impediu a
ação de sAPP695α, permitindo a retração neurítica induzida por Sema3A.
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De maneira semelhante, o experimento foi repetido substituindo-se a
Sema3A recombinante purificada pelo meio condicionado por células HEK293
transfectadas com o plastídio para Sema3A-AP. Nestes experimentos, o
procedimento foi semelhante ao descrito acima, com a diferença de que 100 µl
de meio dos poços eram retirados e 100 µl de meio condicionado contendo
Sema3A-AP ou meio condicionado controle (proveniente de culturas de
HEK293 não transfectadas com Sema3A) colocado nos poços de cultura
(Figura 17).
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Fig. 17: A sAPP695α modular a atividade biológica de Sema3A-AP secretada pela
linhagem HEK293 transfectada. O gráfico representa 5 experimentos independentes e cada
círculo representa um neurito analisado. A barra representa a média de todos os experimentos
para aquela condição. Valores positivos representam a retração neurítica e valores negativos,
crescimento. Os asteriscos representam diferenças estatísticas significativas (*p<0,02;
**p<0,05). Após a adição de 100 μl de meio condicionado por células HEK 293 contendo
Sema3A-AP, há um aumento significativo na retração neurítica e a co-incubação com 75nM de
sAPP695α impede essa retração. Além disso, a incubação de meio condicionado com
Sema3A-AP, sAPP695α e 75nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF),
foi capaz de impedir a ação de sAPP695α, permitindo o colabamento neurítico por Sema3A.
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4.6 – Ensaios em Culturas de Explantes
Foram feitos, inicialmente, experimentos-piloto nos quais culturas de
explantes de córtex de embriões de camundongo foram tratadas com Sema3A,
Sema3A e sAPP695α ou nada. Este primeiro resultado obtido é mostrado na
figura 18
Fig. 18: Ensaios em culturas de explantes de córtex de camundongo E14. A adição de
Sema3A foi capaz de bloquear o crescimento neurítico (B), e a co-incubação com a sAPP695α
reverteu esse bloqueio (C), apresentando aspecto semelhante ao controle (A). culturas foram
mantidas por 24 até o início do experimento, e foram fotografadas 120 horas após as diferentes
adições. Fotos representativas de um experimento piloto realizado. Apesar do resultado inicial
promissor, não foi possível reproduzir essa resposta em experimentos subseqüentes, tanto
com córtex de embriões de camundongo (E14 e E17) quanto de rato (E18), além de explantes
de DRG de embriões de galinha E7.
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Apesar de, neste experimento inicial, ter havido muita migração celular e
não tanto crescimento neurítico, os resultados pareciam promissores. No
entanto, o experimento não pode ser reproduzido, nem em culturas de córtices
de embrião de camundongo ou rato, nem em culturas de DRG de embrião de
galinha. É importante ressaltar que esses experimentos foram feitos sem uma
imobilização dos explantes em uma matriz de colágeno e sem a co-cultura com
uma célula secretando Sema3A, diferente de Puschel e cols em 1995. O fato
de uma matiz de colágeno envolver o explante junto com uma fonte de
secreção contínua de Sema3A permitiria a formação de um gradiente de
sema3A dentro da matriz de colágeno, fazendo com que fosse visto não um
colabamento neurítico e sim um direcionamento axonal na direção das
menores concentrações de Sema3A.
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5 – Discussão:
A proteína sinalizadora sema3A é uma forma secretada de semaforina
envolvida em diferentes processos no sistema nervoso, como colabamento de
cones de crescimento, quimiorepulsão e apoptose neuronal (Mann e cols,
2007).
Nossos experimentos mostraram que a sAPP695α e a sema3A se ligam
in vitro e que os peptídeos selecionados por “phage display” inibem essa
ligação. Os experimentos de ligação in vitro foram realizados por ensaios de
ligação do tipo ELISA, através de ensaios de co-imunoprecipitação e revelação
por western blot ou ainda por ressonância plasmônica de superfície.
De maneira complementar, os peptídeos LRSHPLG e TFASVMT foram
capazes de bloquear a ligação entre Sema3A e sAPP695α, sugerindo que LR e
TF correspondem ao sítio (ou a parte do sítio) da Sema3A que interage
diretamente com sAPP695α. Além disso, resultados preliminares obtidos em
experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) sugerem que a
ligação entre sAPP695α e Sema3A é bastante forte, com constante de
dissociação em torno de 10-11.
Recentemente, outros estudos identificaram proteínas que apresentam
interação com sAPP695 e relevância para o sistema nervoso central. Um
estudo por Pawlik e cols em 2007 buscou ligantes para a região de seqüência
de aminoácidos RERMS da APP (403-407), descrita por induzir o crescimento
neurítico e a sobrevivência neuronal (Yamamoto e cols, 1994). No trabalho de
Pawlik, imobilizou-se um peptídeo contendo essa seqüência em uma coluna e,
67
por cromatografia de afinidade, identificou-se a Collapsin response mediator
protein 2 (CRMP-2) como possível receptor para APP. A CRMP-2 é um
importante mediador downstream da atividade de sema3A, e essa forte ligação
entre CRMP-2 e APP indica uma atuação de APP na via da sema3A e sugere
uma ligação da APP com o complexo receptor para a sema3A. É possível que
a região RERMS possa ser importante para a ligação entre APP e sema3A,
mas tal conclusão necessitaria de maior embasamento experimental.
Outro estudo indicou também que a APP, tanto sob a forma secretada
como sob a forma transmembranar, interage bioquímica e funcionalmente com
a integrina beta 1, mediando o crescimento neuronal (Young-Perce e cols,
2008). É importante lembrar que as vias de sinalização das semaforinas e das
integrinas são intimamente correlacionadas e modulações da atividade de
integrinas são fundamentais para a atuação de diversos membros da família
das semaforinas (Zhou e cols, 2008).
Um trabalho recente também mostrou a interação de APP com
contactinas 3 e 4 associadas a Neuroglia Cell Adhesion Molecule (NgCAM) em
axônios retinianos crescendo em direção ao tecto do nervo óptico em cérebro
de embrião de galinha (Osterfeild e cols, 2008). Naquele trabalho, foram
revelados efeitos regulatórios no crescimento por NgCAM dependentes de APP
e contactina 4, mas mecanismos precisos de ligação de APP a esses ligantes
não ficaram claros, assim como a existência de outras proteínas que possam
estar participando ou mediando esse processo.
É interessante ressaltar que, embora nosso trabalho tenha realizado
experimentos com Sema3A, os peptídeos apresentaram homologia com outras
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semaforinas, principalmente da classe 3 (figura 6), o que permite pensarmos
que, talvez, a APP tenha ação fisiológica através de mais de um tipo de
semaforina, podendo atuar em diversos aspectos do crescimento neuronal.
Além disso, a APP é descrita como um possível receptor celular que
poderia atuar através de uma proteína G e sinalização por GMP cíclico
(Mattson e Furtukawa, 1998). Alterações nas concentrações de GMP cíclico
são importantes na mediação de efeitos de crescimento axonal, inclusive na
sinalização por semaforinas (Dontchev e Letourneau, 2003). Desta forma, é
possível que a afinidade da Sema3A pela sAPP695α tenha importância na
sinalização através da APP965 transmembranar.
Apesar do grande número de estudos realizados com a Sema3A desde
a sua descoberta em 1993, houve uma grande ênfase no papel dessa proteína
no direcionamento axonal no desenvolvimento, ao passo que sua importância
para o indivíduo adulto, como no estabelecimento de novas sinapses ou
regeneração, continuam sendo bem menos compreendidas. Trabalhos
analisando a localização de semaforinas secretadas revelaram que a Sema3A
está em vesículas secretórias que são transportadas rapidamente por
microtúbulos em direção a terminais axonais e que essa secreção é regulada
por atividade neural (DeWit e cols, 2006). No entanto, em regiões dendríticas,
vesículas contendo Sema3A parecem relativamente inativas. Esses dados
indicam uma importância para a Sema3A no sistema nervoso adulto, sugerindo
a liberação atividade-dependente de Sema3A em sítios sinápticos in vivo. Essa
idéia poderia ainda ser extrapolada para outras formas secretadas de
semaforinas.
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Um fato relevante que pode se relacionar aos trabalhos mencionados
acima é que a APP, de maneira semelhante, é transportada por vesículas
através de axônios por mecanismos rápidos dependentes de kinesinas
(proteínas importantes para um transporte ativo dependente de ATP através de
microtúbulos) (Kamale cols, 2001). Além disso, a super expressão de APP em
larvas de drosófila induz complicações no transporte axonal de vesículas, além
de anormalidades na plasticidade sináptica (Rusu e cols, 2007). Deste modo,
essas informações sustentam a idéia de que a interação entre APP e Sema3A
pode atuar na regulação da transmissão e na plasticidade sináptica.
De modo geral, os diversos experimentos e dados da literatura ajudam a
sustentar a idéia de que existe uma interação entre APP e Semaforinas, mais
especificamente Sema3A e que essa interação é fisiologicamente relevante,
podendo atuar de diversos modos no sistema nervoso.
Uma das questões importantes sobre esta sinalização seria pesquisar o
papel das plexinas na sinalização mediada por APP-Sema3A. É interessante
lembrar que os peptídeos RPAASDR e NLANSFV são homólogos a plexinas e
foram detectados pelo phage display, possuindo grande afinidade pela APP. A
presente análise da Sema3A como ligante da APP foi também baseada na
disponibilidade comercial de proteínas recombinantes e anticorpos disponíveis
para o trabalho. No entanto, seria interessante analisar também a importância
das plexinas numa sinalização mediada por APP-sema3A e seu possível papel
como receptor ou co-receptor.
Uma das questões relevantes a cerca da sinalização mediada por APP-
Sema3A é de como ocorre a transmissão desse sinal. A inibição do
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colabamento neurítico visto na incubação com APP e Sema3A juntos poderia
ocorrer por diversas maneiras, incluindo a ligação de APP-Sema3A a plexinas
e sinalização para crescimento neuronal, ou a ligação de APP-Sema3A a
outros receptores neuronais com sinalização para crescimento neuronal ou
ainda a simples não ativação de plexinas, ou seja, o seqüestro de Sema3A por
APP, impedindo que essa induza o colabamento dos cones de crescimento em
cultura.
Também seria interessante analisar se, de maneira alternativa, a APP é
capaz de se ligar e sinalizar através de plexinas de maneira independente de
Sema3A, o que poderia revelar rede de sinalização entre essas proteínas ainda
não caracterizada.
Além disso, os peptídeos revelados por phage display LRSHPLG e
TFASVMT também possuíam homologia com outros membros da família das
semaforinas, principalmente da classe 3, e seria interessante também analisar
o comportamento de APP em relação a esses outros ligantes, através de
ensaios bioquímicos e funcionais semelhantes.
Outra abordagem interessante para aprofundamento na questão da
sinalização através de APP, semaforinas e plexinas seria por ensaios de imuno
citoquímica, buscando determinar se existe colocalização entre as moléculas
analisadas. Esses ensaios poderiam envolver a interação entre essas
moléculas endógenas (por exemplo, em vesículas) ou adicionadas ao meio de
cultura, ativando receptores neuronais.
Outra possível abordagem interessante sobre outros parceiros de APP-
Sema3A seria através da transferência de marcação de APP para possíveis
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ligantes celulares. O kit sulfo-SBED Biotin label transfer da Pierce permite que,
a partir da biotinilação de APP, seja possível, posteriormente, transferir essa
marcação de biotina para proteínas que estejam muito próximas da APP,
possivelmente ligantes (Ilver e cols, 1998). Essa abordagem permitiria analisar
de outra forma ligantes fisiológicos de sAPP, incluindo potencialmente plexinas,
uma confirmação da ligação à semaforinas ou ainda a revelação de novos
ligantes. Uma terceira abordagem interessante seria através de FRET (Forster
Resonance Energy Transfer). A marcação da APP e de outras proteínas-alvo
com anticorpos carreando fluoróforos distintos desenhados para o experimento
permitiria inferir se as duas moléculas marcadas estão ou não muito próximas,
o que pode sugerir possíveis receptores.
A hibridação in situ é uma técnica que permite visualizar regiões, em
tecidos, em que há altos níveis de expressão de determinados genes, e seria
uma abordagem complementar para melhor compreender a importância da
interação entre estas proteínas no desenvolvimento. Uma abordagem por
hibridação in situ de cérebros de embriões de diferentes idades de ratos ou
camundongos marcando para RNAs de APP, semaforinas e plexinas indicaria
as regiões, em diferentes idades, de expressões desses genes. Análises
posteriores permitiriam explorar as possíveis relações entre essas proteínas e
as características morfológicas encontradas nas etapas correspondentes,
permitindo a construção de um paralelo entre a sinalização dessas proteínas e
o crescimento neuronal no desenvolvimento.
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6 – Conclusões:
O presente trabalho demonstrou, por meio de ensaios bioquímicos,
biofísicos e funcionais, a interação entre APP e Sema3A, sugerida pela análise
de peptídeos obtidos por phage display para APP e que apresentaram, em
alguns casos, homologia com proteínas da família das semaforinas.
Foi visto também, nesse trabalho, que os peptídeos selecionados por
phage display apresentam a capacidade de bloquear a ligação entre APP e
Sema3A e o efeito fisiológico em resposta a essa ligação. Isso reforça a idéia
de que esses peptídeos correspondem, na Sema3A, a uma região importante,
possivelmente o sítio ativo, de ligação entre APP e Sema3A.
Por fim, a descoberta desse novo ligante para a Proteína Precursora
Amilóide ajuda a melhor compreender o papel da isoforma neuronal no sistema
nervoso, sugerindo possíveis vias de sinalização para a atuação dessa
proteína amplamente expressa, amplamente conservada e, no entanto, ainda
pouco estudada. Além disso, um melhor conhecimento sobre as funções da
APP poderá contribuir para uma melhor compreensão de mecanismos
importantes na Doença de Alzheimer.
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Anexo I – Artigo submetido à publicação
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