Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in domeniul Patologie i Biomedicale "Victor Proiect PN-II-RU-PD-2012-3-0543 BJocarea receptorilor mineralocorticoizi 0 soJutie terapeutidi pen tr u preve nire a aparitiei nefropatiei diabetice a influentei stresului oxidativ Raport Etapa 1 /04.12.2013 Elaborat de Avizat de Ionel-Alexandru CHECHERITA Mihail Eugen l-llNESCU
57
Embed
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in domeniul ... · Lotul de şoareci vârstnici (Lotul 1, cu vârsta l meomentul sacrificării de 87 zile), a fost tratat mai mult timp
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in domeniul Patologiei ~i ~ tiintelor Biomedicale "Victor Babe~"
Proiect PN-II-RU-PD-2012-3-0543
BJocarea receptorilor mineralocorticoizi 0 soJutie terapeutidi pentru prevenirea aparitiei nefropatiei diabetice ~i a influentei stresului oxidativ
Raport ~tiintific
Etapa 1 /04.12.2013
Elaborat de Avizat de
Ionel-Alexandru CHECHERITA Mihail Eugen l-llNESCU
2
OBIECTIVUL PROIECTULUI
OB 1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor teraputice aplicate (microscopie optica
şi electronică)
OB 2. Demonstrarea diferenţelor funcţionale la nivelul ţesutului renal în diverse condiţii terapeutice,
in vivo şi după prelevarea ţesutului.
OB 3. Investigarea modificării imunofenotipului după tratament vs control.
PACHETE DE LUCRU
PL 1. Monitorizarea fiziologică a animalelor pe parcursul terapiei
PL 2. Recoltarea şi procesarea ţesutului renal
PL 3. Evaluarea morfologică a ţesutului renal prin microscopie
PL 4. Monitorizarea funcţională a probelor de ţesut
PL 5. Imunofenotipare.
OBIECTIVUL ETAPEI 1
Realizarea modelului animal, recoltarea şi stocarea probelor biologice
ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE ETAPA 1
1. Constituirea loturilor de animale
2. Terapie
3. Monitorizarea animalelor pe parcursul terapiei
4. Sacrificarea animalelor
5. Recoltarea şi stocarea probelor biologice relevante
6. Cultivarea celulelor renale
7. Determinarea parametrilor hematologici ai animalelor la finalul terapiei.
ALTE ACTIVITĂŢI ETAPA 1
Elaborarea unui draft de articol în care sunt trecute în revistă datele din literatura de specialitate în
domeniul proiectului.
3
DESCRIEREA DETALIATĂ A ACTIVITĂŢILOR
Experimentele cu animale au fost făcute în acord cu legislaţia în vigoare şi normele
metodologice de lucru pe animale. Toate protocoalele experimentelor de studiu au fost aprobate
de Comisia de etică a INCD „Victor Babeş”.
1. Constituirea loturilor de animale
Animale: şoarecii transgenici Cg-Lepob /WiscJ, heterozigoţi Lepob, cu genotipul
at/at Lepob/Lepob tf/tf, sunt şoareci diabetici cu hiperglicemie severă şi obezi, cu nivel crescut de
triglyceride. Reprezintă un model animal adecvat pentru studiul nefropatiei diabetice (diabet
insulino-independent), asociat cu obezitate.
Şoarecii cu vârstele descrise în Tabelul 1, au fost importati de la The Jackson Laboratory, SUA.
Conform informaţiilor obţinute de la furnizor, şoarecii cu mutaţia spontană Lepob manifestă
obezitate, hiperfagie, sindrom hiperglicemic, intoleranţă la glucoză, valori plasmatice mari ale
insulinei, subfertilitate, vindecare defectuoasă a rănilor şi producere crescută de hormoni de către
hipofiză şi glandele suprarenale. Sunt hipometabolici şi hipotermici. Obezitatea este caracterizată de
creşterea numărului şi a dimensiunii adipocitelor. Hiperinsulinemia nu se dezvoltă decât după
creşterea greutăţii corporale. Şoarecii Lepob dezvoltă diabet la 6 săptămâni (masculii) şi la 8
săptămâni (femelele). Hiperglicemia este severă şi progresivă.
La nivelul sistemului urinar prezintă următoarele particularităţi:
Morfologie anormală a podocitelor (densitate redusă, număr redus de podocite)
Albuminurie (începând cu 8 săptămâni)
Rinichi mărit
Hipertrofia rinichiului
Masă crescută a rinichiului
Matrice mesangială glomerulară extinsă
Glomeruloscleroză
Mesangioliză (începând cu 8
săptămâni); scleroză mesangială difuză
Hipertrofie renală glomerulară
Fibroză renală interstiţială (începând cu 12 săptămâni)
4
Tabel 1. Numărul şi vârsta şoarecilor la momentul recepţiei lor în INCD Victor Babeş.
Din care: Nr. lot Data naşterii
Vârsta la 23 oct 2013 (±3 zile)
Zile/săptămâni
Nr. total şoareci F M
1 20 aug 2013 61 / 8,7 30 13 17
2 27 aug 2013 54 / 7,7 18 11 7
3 3 sep 2013 47 / 6,7 22 11 11
Protocolul de acomodare a şoarecilor în laboratorul gazdă:
- 23 – 24 oct: şoarecii au ramas 24 h în cuştile de transport
- 24-28 oct: şoarecii au stat în cuşti obişnuite, conform repartizării descrise în Tabelul 4.
Şoarecii au fost cazaţi în camere cu iluminat artificial controlat (12/12, întuneric/lumină), cu
temperatura (20-24C), umiditatea de 55 ± 10%, cuşti ventilate individual (Tehniplast, Italia) şi
aşternut (talaj autoclavat). Animalele au fost hrănite ad libidum cu nutreţ granulat concentrat
special (provenit de la INCDMI Cantacuzino) şi au fost adăpate cu apă filtrată şi sterilizată
schimbată periodic pentru a asigurare prospeţime. Toţi şoarecii au fost ţinuţi sub un program
riguros de curăţenie şi igienizare.
Constituirea loturilor de animale
Au fost constituite 3 loturi de animale, în funcţie de vârstă şi implicit în funcţie de gradul de
dezvoltare a diabetului (Tabel 2). În cadrul fiecărui lot de şoareci, au fost constituite 4 subloturi în
funcţie de tratament (Tabel 3): enalapril şi spironolactonă (En+Sp), enalapril, spironolactonă şi
vitamina E (En+Sp+VitE), vehicol (hidroxietil celuloză), apă distilată.
Animalele din fiecare lot şi sublot au fost repartizate în cuşti normale (Tabel 4).
De cel puţin 3 ori pe parcursul terapiei, căte 2 animale de acelaşi sex din fiecare sublot au fost ţinute
în cuşti metabolice (Tabel 3), pentru recoltarea urinei.
Tabel 2. Loturile de animale constituite pe baza vârstei la momentul începrii tratamentului.
Din care:
Nr. lot
Vârsta la momentul începerii
tratamentului Zile/săptămâni
Nr. total şoareci F M
1 66 / 9,4 30 13 17
2 60 / 8,5 18 11 7
3 54 / 7,7 22 11 11
5
Tabel 3. Loturi/subloturide şoareci, constituite pe baza vârstei şi a tratamentului.
F=femele, M=masculi, T=număr total de animale/sublot
Nr. animale Lot Sublot
F M T Tratament
Data începerii
tratamentului
Data plasării animalelor în cuşca metabolică pentru 24h
oligodeoxynucleotides (ODNs) [85] and soluble human TGF-β type II receptor (sT_RII.Fc) [86].
In addition, it was suggested that aldosterone antagonists can reduce TGF-β overexpression.
30
E. PKC inhibitors – ruboxistaurin (LY333531) is considered as a potent PKC inhibitor and
contributes to albuminuria decrease and inhibits extra cellular matrix protein accumulation,
interstitial fibrosis, macrophages infiltration and tubular atrophy [87,88]. In combination with
perindopril its renoprotective effects are increased [89].
F. other forms of therapies – thiazolidinediones (e.g.: troglitazone, pioglitazone, rosiglitazone)
have beneficial effects on impaired glucose tolerance and urinary albumin-creatinine ratio
[90,91,92]. Eicosapentaenoic acid (fish oil) has the following effects: antithrombotic,
hypolipidemic, antiatherogenic, antiinflammatory and antimitogenic by inhibiting the actions of
IL-1, IL-2, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF). Other renoprotective drugs: statins
independent of their cholesterol-lowering effect [93,94], vitamin D analogues, vitamin E and C
diet supplementation [95] or oleanolic acid administration [96]. Additionally, lifestyle
modification (e.g.: exercise training) can attenuate OS by lowering plasma lipids, blood glucose,
blood pressure and body mass index.
CONCLUSIONS
DN patients present several factors (e.g.: long-term hyperglycemia and dyslipidemia) that are
involved in producing an important imbalance between antioxidants and prooxidants, generating
a pathological cellular response that influences and stimulates multiple stress pathways
activation. Consequently, a profound oxidative and inflammation state is settled that markedly
contributes to DN progression towards ESRD. Therefore, it is mandatory to understand correctly
the incriminated pathophysiological mechanisms for creating future targeted-specific drugs that
will slow down DN natural evolution.
31
REFERENCES
1. National Kidney Foundation. KDOQI clinical practice guideline for diabetes and CKD: 2012 update. Am J Kidney Dis. 2012; 60(5):850-886.
2. de Boer IH, Rue TC, Hall YN, Heagerty PJ, Weiss NS, Himmelfarb J. Temporal trends in the prevalence of diabetic kidney disease in the United States. JAMA. 2011; 305(24):2532-2539.
3. US Renal Data System. USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States. Am J Kidney Dis. 2012; 59(1) (Suppl 1):e1-e420.
4. Ritz E. Pathogenesis, clinical manifestations, and natural history of diabetic nephropathy. In: Feehally J, Floege J, Johnson RJ (editors). Comprehensive clinical nephrology. 3rd Edition. Philadelphia: Mosby Elsevier, 2007; p. 353-364.
5. Bakris GL. Overview of diabetic nephropathy. UpToDate. 2013; http://www.uptodate.com/contents/overview-of-diabetic-nephropathy.com.
6. Mogensen CE, Christensen CK, Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes. 1983; 32(Suppl 2):64-78.
7. Tervaert TW, Mooyaart AL, Amann K, Cohen AH, Cook HT, Drachenberg CB, Ferrario F, Fogo AB, Haas M, de Heer E, Joh K, Noël LH, Radhakrishnan J, Seshan SV, Bajema IM, Bruijn JA, Renal Pathology Society. Pathologic classification of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2010; 21(4):556-563.
8. Katz A, Caramori ML, Sisson-Ross S, Groppoli T, Basgen JM, Mauer M. An increase in the cell component of the cortical interstitium antedates interstitial fibrosis in type 1 diabetic patients. Kidney Int. 2002; 61(6):2058-2066.
9. Gilbert RE, Cooper ME. The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease: more than an aftermath of glomerular injury? Kidney Int. 1999; 56(5):1627-1637.
10. Vashistha H, Meggs L. Diabetic nephropathy: lessons from the mouse. Ochsner J. 2013; 13(1):140-146.
11. Huang W, Gallois Y, Bouby N, Bruneval P, Heudes D, Belair MF, Krege JH, Meneton P, Marre M, Smithies O, Alhenc-Gelas F. Genetically increased angiotensin I-converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(23):13330-13334.
12. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(36):13302-13305.
13. Kakoki M, Kizer CM, Yi X, Takahashi N, Kim HS, Bagnell CR, Edgell CJ, Maeda N, Jennette JC, Smithies O. Senescence-associated phenotypes in Akita diabetic mice are enhanced by absence of bradykinin B2 receptors. J Clin Invest. 2006; 116(5):1302-1309.
14. Kakoki M, McGarrah RW, Kim HS, Smithies O. Bradykinin B1 and B2 receptors both have protective roles in renal ischemia/reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(18):7576-7581.
15. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 2005; 54(6):1615-1625.
16. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen species regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(8) (Suppl 3):S241-S245.
17. Li JM, Shah AM. ROS generation by nonphagocytic NADPH oxidase: potential relevance in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(8) (Suppl 3):S221-S226.
32
18. Mima A. Inflammation and oxidative stress in diabetic nephropathy: new insights on its inhibitions as new therapeutic targets. J Diabetes Res. 2013; doi: 10.1155/2013/248563. [Epub ahead of print].
19. Banba N, Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K. Possible relationship of monocyte chemoattractant protein-1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000; 58(2):684-690.
20. Sassy-Prigent C, Heudes D, Mandet C, Bélair MF, Michel O, Perdereau B, Bariéty J, Bruneval P. Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 2000; 49(3):466-475.
21. Okada S, Shikata K, Matsuda M, Ogawa D, Usui H, Kido Y, Nagase R, Wada J, Shikata Y, Makino H. Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes. Diabetes. 2003; 52(10):2586-2593.
22. Chow F, Ozols E, Nikolic-Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH. Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy: correlation with diabetic state and progressive renal injury. Kidney Int. 2004; 65(1):116-128.
23. Gæde P, Poulsen HE, Parving HH, Pedersen O. Double-blind, randomised study of the effect of combined treatment with vitamin C and E on albuminuria in Type 2 diabetic patients. Diabet Med. 2001; 18(9):756-760.
24. Locatelli F, Canaud B, Eckardt K-U, Stenvinkel P, Wanner C, Zoccali C. Oxidative stress in end-stage renal disease: an emerging threat to patient outcome. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18(7):1272-1280.
25. Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol. 1997; 82(2): 291-295.
26. Sun YM, Su Y, Li J, Wang LF. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic nephropathy. Biochem Biophys Res Commun. 2013; 433(4):359-361.
27. Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res. 2010; 107(9):1058-1070.
28. Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr Rev. 2002; 23(5):599-622.
29. Galler A, Muller G, Schinzel R, Kratzsch J, Kiess W, Munch G. Impact of metabolic control and serum lipids on the concentration of advanced glycation end products in the serum of children and adolescents with type 1 diabetes, as determined by fluorescence spectroscopy and nepsilon-(carboxymethyl) lysine ELISA. Diabetes Care. 2003; 26 (9):2609-2615.
30. Vlassara H, Striker LJ, Teichberg S, Fuh H, Li YM, Steffes M. Advanced glycation end products induce glomerular sclerosis and albuminuria in normal rats. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(24):11704-11708.
31. Lu M, Kuroki M, Amano S, Tolentino M, Keough K, Kim I, Bucala R, Adamis AP. Advanced glycation end products increase retinal vascular endothelial growth factor expression. J Clin Invest. 1998; 101:1219-1224.
32. Galkina E, Ley K. Leukocyte recruitment and vascular injury in diabetic nephropathy, J Am Soc Nephro. 2006; 17(2):368-377.
33. Imani F, Horii Y, Suthanthiran M, Skolnik EY, Makita Z, Sharma V, Sehajpal P, Vlassara H. Advanced glycosylation endproduct-specific receptors on human and rat Tlymphocytes mediate synthesis of interferon �: role in tissue remodeling. J Exp Med. 1993; 178(6):2165-2172.
33
34. Wu CC, Chen JS, Lu KC, Chen CC, Lin SH, Chu P, Sytwu HK, Lin YF. Aberrant cytokines/chemokines production correlate with proteinuria in patients with overt diabetic nephropathy. Clinica Chim Acta. 2010; 411(9-10):700-704.
35. Glogowski EA, Tsiani E, Zhou X, Fantus IG, Whiteside C. High glucose alters the response of mesangial cell protein kinase C isoforms to endothelin-1. Kidney Int. 1999; 55(2):486-499.
36. Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S, Danesh FR. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008; 233(11):4-11.
37. Singh SB, Malamas MS, Hohman TC, Nilakantan R, Carper DA, Kitchen D. Molecular modeling of the aldose reductase-inhibitor complex based on the X-ray crystal structure and studies with single-site-directed mutants. J Med Chem. 2000; 43(6):1062-1070.
38. Hebert LF, Daniels MC, Zhou JX, Crook ED, Turner RL, Simmons ST, Neidigh JL, Zhu JS, Baron AD, McClain DA. Overexpression of glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase in transgenic mice leads to insulin resistance. J Clin Invest. 1996; 98(4):930-936.
39. Tang J, Neidigh JL, Cooksey RC, McClain DA. Transgenic mice with increased hexosamine flux specifically targeted to β-cells exhibit hyperinsulinemia and peripheral insulin resistance. Diabetes. 2000; 49(9):1492-1499.
40. Veerababu G, Tang J, Hoffman RT, Daniels MC, Hebert Jr LF, Crook ED, Cooksey RC, McClain DA. Overexpression of glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase in the liver of transgenic mice results in enhanced glycogen storage, hyperlipidemia, obesity, and impaired glucose tolerance. Diabetes. 2000; 49(12):2070-2078.
41. James LR, Tang D, Ingram A, Ly H, Thai K, Cai L, Scholey JW. Flux through the hexosamine pathway is a determinant of nuclear factor κB-dependent promoter activation. Diabetes. 2002; 51(4):1146-1156.
42. Ha H, Hwang IA, Park JH, Lee HB. Role of reactive oxygen species in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Diabetes Res Clin Pract. 2008; 82(Suppl 1):S42-S45.
43. Rösen P, Nawroth PP, King G, Möller W, Tritschler HJ, Packer L. The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a congress series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society. Diab Metab Res Rev. 2001; 17(3):189-212.
44. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen species-regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(Suppl 8):S241-S245.
45. Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007; 87(1):245-313.
46. Cave AC, Brewer AC, Narayanapanicker A, Ray R, Grieve DJ, Walker S, Shah AM. NADPH oxidases in cardiovascular health and disease. Antioxid Redox Signal. 2006; 8(5-6):691-728.
47. Giugliano D, Ceriello A, Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care. 1996; 19(3):257-267.
49. Pryor WA. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes and reactions. Annu Rev Physiol. 1986; 48:657-667.
34
50. Furukawa M, Gohda T, Tanimoto M, Tomino Y. Pathogenesis and novel treatment from the mouse model of type 2 diabetic nephropathy. Scientific World Journal. 2013; doi: 10.1155/2013/928197. [Epub ahead of print].
51. Balakumar P, Arora MK, Ganti SS, Reddy J, Singh M. Recent advances in pharmacotherapy for diabetic nephropathy: current perspectives and future directions. Pharmacol Res. 2009; 60(1):24-32.
52. Kagami S, Border WA, Miller DE, Noble NA. Angiotensin II stimulated extracellular matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor-β expression in rat glomerular cells. J Clin Invest. 1994; 93(6):2431-2437.
53. Kagami S, Kuhara T, Okada K, Kuroda Y, Border WA, Noble NA. Dual effects of angiotensin II on the plasminogen/plasmin system in rat mesangial cells. Kidney Int. 1997; 51(3):664-671.
54. Wilson HM, Haites NE, Booth NA. Effect of angiotensin II on plasminogen activator inhibitor-1 production by cultured human mesangial cells. Nephron. 1997; 77(2):197-204.
55. Singh R, Alavi N, Singh AK, Leehey DJ. Role of angiotensin II in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation. Diabetes. 1999; 48(10):2066-2073.
57. Ortega MR, Ruperez M, Esteban V, Vita JR, Lopez ES, Carvajal G, Egido J. Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases. Nephrol Dial Transplant. 2006; 21(1):16-20.
58. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. New Engl J Med. 1993; 329(20):1456-1462.
59. Andersen S, Tarnow L, Rossing P, Hansen BV, Parving HH. Renoprotective effects of angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000; 57(2):601-606.
60. Hong SW, Isono M, Chen S, Iglesias-De La Cruz MC, Han DC, Ziyadeh FN. Increased glomerular and tubular expression of transforming growth factor-β1, its type II receptor, and activation of the smad signaling pathway in the db/db mouse. Am J Pathol. 2001; 158(5):1653-1663.
61. Ha H, Kim KH. Amelioration of diabetic microalbuminuria and lipid peroxidation by captopril. Yonsei Med J. 1992; 33(3):217-223.
62. Amann B, Tinzmann R, Angelkort B. ACE inhibitors improve diabetic nephropathy through suppression of renal MCP-1. Diabetes Care. 2003; 26(8):2421-2425.
63. Katayamaa S, Kikkawab R, Isogaic S, Sasakia N, Matsuura N, Tajima N, Urakami T, Uchigata Y, Ohashi Y. Effect of captopril or imidapril on the progression of diabetic nephropathy in Japanese with type 1 diabetes mellitus: a randomized controlled study (JAPAN-IDDM). Diabetes Res Clin Pract. 2002; 55(2):113-121.
64. Gerstein HC. Diabetes and the HOPE study: implications for macrovascular and microvascular disease. Int J Clin Pract Suppl. 2001; 117:8-12.
65. McLennan SV, Kelly DJ, Cox AJ, Cao Z, Lyons JG, Yue DK, Gilbert RE. Decreased matrix degradation in diabetic nephropathy: effects of ACE inhibition on the expression and activities of matrix metalloproteinases. Diabetologia. 2002; 45(2):268-275.
66. Lin H, Huang S, Mi X, Sha Z. Effects of cilazapril on the expression of vascular endothelial growth factor and intercellular adhesion molecule-1 in diabetic rat glomeruli. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2003; 34(4):694-697.
35
67. Yongman LV, Junwu D, Xiaochun N, Xiaocheng L. Renoprotective effect of benazepril on diabetic nephropathy mediated by P42/44MAPK. J Huazhong Uni Sci Technol. 2005; 25(1):32-35.
68. Singh R, Alavi N, Singh AK, Leehey DJ. Role of angiotensin II in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation. Diabetes. 1999; 48(10):2066-2073.
69. Eijkelkamp WBA, Zhang Z, Remuzzi G, Parving HH, Cooper ME, Keane WF, Shahinfar S, Gleim GW, Weir MR, Brenner BM, de Zeeuw D. Albuminuria is a target for renoprotective therapy independent from blood pressure in patients with type 2 diabetic nephropathy: post hoc analysis from the reduction of endpoints in NIDDM with the Angiotensin II Antagonist Losartan (RENAAL) Trial. J Am Soc Nephrol. 2007; 18(5):1540-1546.
70. Lewis EJ, Hunsicker LG, Clarke WR, Berl T, PohlMA, Lewis JB, Ritz E, Atkins RC, Rohde R, Raz I; Collaborative Study Group. Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Eng J Med. 2001; 345(12):851-860.
71. Hunsicker LG. Emerging trends for prevention and treatment of diabetic nephropathy: blockade of the RAAS and BP control. J Manag Care Pharm. 2004; 10(5) (Suppl A):S12-S17.
72. Pugsley MK. The angiotensin-II (AT-II) receptor blocker olmesartan reduces renal damage in animal models of hypertension and diabetes. Proc West Pharmacol Soc. 2005; 48:35-38.
73. Lioa J, Kobayashi M, Kanamuru Y, Nakamura S, Makita Y, Funabiki K, Horikoshi S, Tomino Y. Effects of candesartan, an angiotensin II type 1 receptor blocker, on diabetic nephropathy in KK/Ta mice. J Nephrol. 2003; 16(6):841-849.
74. Yang CW, Vlassarat H, Peten EP, He CJ, Striker GE, Striker LJ. Advanced glycation end products up-regulate gene expression found in diabetic glomerular disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(20):9436-9440.
75. WautierMP, ChappeyO, Corda S, Stern DM, Schmidt AM, Wautier JL. Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001; 280(5):E685-E694.
76. Tsuchida K, Makita Z, Yamagishi S, Atsumi T,Miyoshi H, Obara S, Ishida M, Ishikawa S, Yasumura K, Koike T. Suppression of transforming growthfactor beta and vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy in rats by a novel advanced glycation end product inhibitor, OPB-9195. Diabetologia. 1999; 42(5):579-588.
77. Forbes JM, Soulis T, Thallas V, Panagiotopoulos S, Long DM, Vasan S, Wagle D, Jerums G, Cooper ME. Renoprotective effects of a novel inhibitor of advanced glycation. Diabetologia. 2001; 44(1):108-114.
78. Bonke VT, Lindschau C, Rizkalla B, Bach LA, Boner G, Meier M, Haller H, Cooper ME, Forbes JM. Attenuation of extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy by the advanced glycation end product cross-link breaker ALT-711 via a protein kinase C dependent pathway. Diabetes. 2004; 53(11):2921-2930.
79. Twigg SM, Cao Z, Mclennan SV, BurnsWC, Brammar G, Forbes JM, Cooper ME. Renal connective tissue growth factor induction in experimental diabetes is prevented by aminoguanidine. Endocrinology. 2002; 143(12):4907-4915.
80. Izuhara Y, Nangaku M, Takizawa S, Takahashi S, Shao J, Oishi H, Kobayashi H, van Ypersele de Strihou C, Miyata T. A novel class of advanced glycation inhibitors ameliorates renal and cardiovascular damage in experimental rat models. Nephrol Dial Transplant. 2008; 23(2):497-509.
81. Figarola J, Loera S, Weng Y, Shanmugam N, Natarajan R, Rahbar S. LR-90 prevents dyslipidaemia and diabetic nephropathy in the Zucker diabetic fatty rat. Diabetologia. 2008; 51(5):882-891.
36
82. Hill C, Flyvbjerg A, Rasch R, Bak M, Logan A. Transforming growth factor-β antibody attenuates fibrosis in the experimental diabetic rat kidney. J Endocrinol. 2001; 170(3):647-651.
83. Benigni A, Zojaa C, Campanaa M, Cornaa D, Sangallia F, Rottolia D, Gagliardini E, Conti S, Ledbetter S, Remuzzi G. Beneficial effect of TGF- β antagonism in treating diabetic nephropathy depends on when treatment is started. Nephron Exp Nephrol. 2006; 104(4):e158-e168.
84. Mizuno S, Nakamura T. Suppressions of chronic glomerular injuries and TGF-β1 production by HGF in attenuation of murine diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2004; 286(1):F134-F143.
85. Jeong HS, Park KK, Kim SP, Choi IJ, Lee IK, Kim HC. Effect of antisense TGF-β1 oligodeoxynucleotides in streptozotocin-induced diabetic rat kidney. J Kor Med Sci. 2004; 19(3):374-383.
86. Russo LM, Re ED, Brown D, Lin HY. Evidence for a role of transforming growth factor (TGF)-β1 in the induction of postglomerular albuminuria in diabetic nephropathy. Amelioration by soluble (TGF)-β1 type II receptor. Diabetes. 2007; 56(2):380-388.
87. Tuttle KR, Anderson PW. A novel potential therapy for diabetic nephropathy and vascular complications: protein kinase C beta inhibition. Am J Kidney Dis. 2003; 42(3):456-465.
88. Kelly DJ, Chanty A, Gow RM, Zhang Y, Gilbert RE. Protein kinase C beta inhibition attenuates osteopontin expression, macrophage recruitment, and tubulointerstitial injury in advanced experimental diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2005; 16(6):1654-1660.
89. Kelly DJ, Buck D, Cox AJ, Zhang Y, Gilbert RE. Effects on protein kinase C-beta inhibition on glomerular vascular endothelial growth factor expression and endothelial cells in advanced experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2007; 293(2):F565-F574.
90. Schwartz S, Raskin P, Fonseca V, Graveline JF. Effect of troglitazone in insulin-treated patients with type II diabetes mellitus. Troglitazone and Exogenous Insulin Study Group. New Engl J Med. 1998; 338(13):861-866.
91. Imano E, Kanda T, Nakatani Y, Nishida T, Arai K, Motomura M, Kajimoto Y, Yamasaki Y, Hori M. Effect of troglitazone on microalbuminuria in patients with incipient diabetic nephropathy. Diabetes Care. 1998; 21(12):2135-2139.
92. Fujii M, Takemura R, Yamaguchi M, Hasegawa G, Shigeta H, Nakano K, Kondo M. Troglitazone (CS-045) ameliorates albuminuria in streptozotocin-induced diabetic rats. Metabolism. 1997; 46(9):981-983.
93. McFarlane SI, Muniyappa R, Francisco R, Sowers JR. Clinical review145: pleiotropic effects of statins: lipid reduction and beyond. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87(4):1451-1458.
94. Endres M, Laufs U. Effects of statins on endothelium and signaling mechanisms. Stroke. 2004; 35(11):2708-2711.
95. Baburao Jain A, Anand Jain V. Vitamin E, its beneficial role in diabetes mellitus (DM) and its complications. J Clin Diagn Res. 2012; 6(10):1624-1628.
ale schemelor terapeutice aplicate 1.2. Investigarea modificărilor morfologice la nivelul tesutului renal și a altor țesuturi
2.1. Determinarea și analiza parametrilor hematologici 2. Investigarea consecințelor schemelor terapeutice aplicate asupra parametrilor hematologici și biochimici 2.2. Determinarea și analiza parametrilor biochimici
urinari
3.1. Determinarea și analiza markerilor de stres oxidativ în urină
3.2. Evaluarea activității oxidative și a răspunsului la stres oxidativ în țesutul renal
3. Investigarea consecințelor schemelor terapeutice asupra statusului oxidativ la nivelul rinichiului
3.3. Investigații genomice pentru evaluarea răspunsului la stres oxidativ în țesutul renal
4. Diseminarea rezultatelor 4.1. Redactarea unui articol de tip review în domeniul proiectului
3
REZUMAT
In aceasta etapa am realizat investigarea probelor biologice recoltate de la soarecii Cg-Lepob /WiscJ,
tratati cu enalapril si spironolactona, in prezenta sau in absenta de vitamina E. Au fost realizate
investigatii in rinichii si urina animalelor exeprimentale, pentru: 1) detectarea eventualelor
modificari histologice si ultrastructurale; 2) evaluarea statusului oxidativ si a capacitatii
antioxidante in urina; 3) identificarea genelor cu profil de expresie modificat, implicate in raspunsul
celulelor renale la stres oxidativ; 4) evidentierea unor modificari biochimice in urina 5) evidentierea
modificarilor hematologice.
Rezultatele experimentale au relevat urmatoarele: 1) Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica
amplitudine, si, pe esantioanele studiate, neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara
continuarea colectarii de imagini pentru a identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in
termeni ultratstructurali. 2) Modificarile histopatologice identificate sunt reprezentate de scleroza
mesangiala usoara-moderata si hipercelularitate mesangiala (prezenta de 3 celule mesangiale in
majoritatea spatiilor mesangiale hipercelulare). Nu se observa hialinizare arteriolara sau alte leziuni
vasculare si nici ingrosarea membranei bazale ale tubilor renali. 3) Lotul de soareci cu varsta cea
mai mare este responsiv la terapia cu spironolactona si enalapril, in absenta sau in prezenta de
vitamina E. Terapia determina scaderea statistic semnificativa a concentratiei de ADN oxidat in
urina (Trat 1 – netratat p=0,004256; Trat 2 – netratat p=0,0324). Nu am constatat diferente intre
loturile de soareci Cg-Lepob /WiscJ netratati, ceea ce sugereaza ca soarecii prezinta status oxidativ
similar la nivel renal, in intervalul de varsta 87-70 zile. 4) Subexpimarea unor gene importante
pentru sistemul antioxidant, documentate in aceasta etapa a proiectului, s-ar putea sa fie consecinta
gradului scazut de stres oxidativ in rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ. Alternativ, este posibil sa
reprezinte un defect de combatere a stresului oxidativ, si sa influenteze de asemenea negativ
semnalizarea redox intracelulara. Prin evaluarea markerilor de stres oxidativ in rinichiul soarecilor
Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu animale normale, se va putea clarifica statusul oxidativ al rinichilor
animalelor transgenice studiate, ceea ce va clarifica cauza subexprimarii antioxidantilor endogeni.
5) A fost evidentiata subexprimarea genei Scd1 care determina scaderea sintezei de acizi grasi
nesaturati si cresterea susceptibilitatii la peroxidare lipidica. Perturbarea este adancita prin
subexprimarea apolipoproteinei E, care mediaza legarea, internalizarea si catabolizarea
lipoproteinelor. Prin subexprimarea genei Ucp3 scade capacitatea mitocondriilor de a controla
fluxul de acizi grasi.
Au fost submise pentru publicare 2 articole de tip review in domeniul proiectului, dintre care
unul la revista “Mediators of inflammation” (factor de impact 2,417), cel de-al doilea la Chinese
Medical Journal..
4
REZULTATE
1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor terapeutice aplicate
1.1. Investigarea ultrastructurii tesutului renal prin microscopie electronică
Microscopie electronica
Tehnica prelucrarii fragmentelor de tesut cardiac pentru analiza ultrastructurala Analiza structurii si ultrastructurii tesutului renal a fost efectuata pe materialul inclus in rasina epoxidica (Epon) conform procedurii standard in laboratorul de Patologie Ultrastructurala.
Includerea fragmentului bioptic renal in rasina epoxidica
Temperatura Timp
Fixarea tesutului in glutaraldehida 4% tamponata cu TCS 0,1M. Tesutul a fost taiat in cuburi de aproximativ 1 mm3 pentru a fi corect fixat.
4 o C min 4 ore
Spalare in tampon cacodilat de sodiu (TCS) 0,1 M 4 o C 2 x 1 h Post-fixare cu tetraoxid de osmiu 0,1 M 4 o C 1 h Spalare in TCS 0,1 M 4 o C 2x 10-15min Deshidratare alcool etilic 30o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 50 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 70 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 90 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 96 o TC 2x15 min Deshidratare alcool etilic 100 o TC 3x15 min Propilen oxid TC 2x15 min Baia I: Propilen oxid/ rasina epoxidica (2/1) TC 2 h Baia II: Propilen oxid/ rasina epoxidica (1/2) TC peste noapte Baia III: Rasina epoxidica in recipiente neacoperite (pentru a se evapora restul de propylen oxid)
TC 2-3 h
Includere in rasina epoxidica in capsule de plastic etichetate TC - Polimerizarea rasinii epoxidice 60 o C 48 h
Examinarea fragmentelor de tesut a fost efectuata in prima etapa cu microscopul optic pe sectiuni
(semifine) de 1 micron grosime pentru evaluare hitologica. Colorarea sectiunilor semifine a fost
facuta cu albastru de toluidina.
Dupa apreciere generala microscopo-optica a sectiunilor semifine am orientat structurilor de interes
pentru realizarea sectiunilor ultrafine (60-80 nm) necesare evaluarii electrono-microscopice.
Contrastarea sectiunile fine incluse in epon a fost facuta cu acetat de uranyl 1% si solutie Reynolds.
Sectionarea a fost realizata cu un ultramicrotom RMC iar examinarea la un microscop electronic cu
transmisie FEI Morgagni 268 la 80kV. Imaginile relevante au fost achizitionate cu CCD
MegaView III (Olympus).
P*
5
LOT 1 Lot 1.1
Rare zone cu MBG ingrosate
Lot 1.2 Aspect ultrastructural in limite normale
Lot 1.3
Rare zone cu MBG ingrosate
Lot 1.4 Aspect ultrastructural in limite normale
LOT 2 Lot 2.1
rare zone cu MBG ingrosate
LOT 3
6
Lot 3.1
Rare zone cu MBG ingrosate
Lot 3.2
Rare zone cu MBG ingrosate
Lot 3.3
Zone cu MBG ingrosate
In aceasta etapa au fost examinate doar o parte din esantioanele tisulare recoltate, din fiecare
lot, cu exceptia loturilor 2.2, 2.3.
Tehnica de microscopie electronica presupune un volum mare de mnca si este consumatoare
de timp. Inainte de a dispune de o colectie semnificativa de imagini pentru fiecare din loturi, se
poate identifica doar o tendinta de constituire a leziunilor, iar efectele interventie farmacologice nu
pot fi inca evaluate corect, inainte de a dispune de intreaga colectie de imagini.
Pentru aceasta etapa s-au observat: o mare variabilitate inter-individuala in ceea ce priveste
dezvoltatrea spontana a leziunilor si diferente, acolo unde leziunile s-au instalat, in prezenta unui
tratament, distributia leziunilor decelabile ultrastructural este neuniforma si inegala. Exista spre
7
exemplu, sectiuni ultrastrcturale in care apar leziuni la nivelul unui singur glomerul, care se gaseste
la mica distanta de alti doi glomerului cu aspect ultrastructural normal.
Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica amplitudine, si, pe esantioanele studiate,
neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara continuarea colectarii de imagini pentru a
identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in termeni ultratstructurali. Aceste studii
vor fi efectuate in etapa urmatoare.
1.2. Investigarea modificărilor morfologice la nivelul ţesutului renal şi a altor ţesuturi
LOTUL 2
Sublot 2.1 – Terapie 1 (bloc de parafina 216224)
Fragmentele de tesut renal recoltate de la cei 5 soricei din sublotul 2.1 au la coloratia conventionala
hematoxilin-eozina (HE) aspect histologic de parenchim renal cu arhitectura prezervata, marginit de
tesut adipos perirenal, cu zone de tesut adipos brun. Capsula renala este subtire, fara modificari
histologice. Corticala renala este compusa din glomeruli predominant cu arhitectura conservata si
sunt formati dintr-o retea de capilare sustinuta de 1-2 celule mesangiale si tubi renali contorti
proximali si contorti fara modificari histologice evidente la coloratiile HE si PAS. Aproximativ 5%
dintre glomeruli prezinta usoara hipercelularitate mesangiala (un numar de 3, maxim 4 celule
mesangiale) si aproximativ 10—15% prezinta scleroza mesangiala, evidentiata de coloratia PAS.
Capsula Bowman este alcatuita dintr-un strat de celule epiteliale parietale plate sau cuboide, fara
ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali corticali sunt tapetati de celule cubice cu
citoplasma eozinofila, granulara, in zonele corticale superficiale citoplasma fiind vacuolizata, si
nuclei cu cromatina uniform dispersata. Ei nu prezinta ingrosare a membranei bazale tubulare la
prezervata, fara scleroza sau ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti
proximali si contorti de la nivelul cortexului renal nu prezinta modificari histopatologice evidente la
coloratiile HE si PAS, fara ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia PAS. Zona
medulara renala contine tubi renali fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS.
Pelvisul renal si ureterul, de asemenea, nu prezinta modificari histologice atat la coloratia
conventionala HE, cat si la coloratia speciala PAS.
Structurile vasculare de tip arterial (arteriole si artere) prezinta structura histologica prezervata, fara
hialinizare a peretelui sau fibroza intimala. Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.
11
Figura 1.2.1. Scleroza mesangiala si hipercelularitatea mesangiala usoara. Coloratie HE 20x
Figura 1.2.2. Scleroza mesangiala in comparatie cu un glomerul normal. Coloratie HE 20x
Figura 1.2.3. Scleroza mesangiala. Coloratie PAS 20x
12
Figura 1.2.4. Artera cu aspect histologic conservat 2. Investigarea consecintelor schemelor terapeutice aplicate asupra parametrilor hematologici
si biochimici 2.1. Determinarea si analiza parametrilor hematologici
La sacrificarea sorecilor a fost recoltat sange si s-a realizat testarea hematologica. Datele prezentate
in Figura 2.1 arata ca, in cazul lotului 1 de animale (cu varsta cea mai mare), terapia cu enalapril si
spironolactona induce cresterea numarului de limfocite si monocite periferice. Un efect similar se
inregistreaza in cazul lotului 3 de animale (cu varsta cea mai mica).
O manifestare diferita se remarca in cazul lotului 3 (cu varsta intermediara). Asistam la scaderea
numarului de limfocite periferice, fara ca monocitele sa fie statistic afectate ca numar (comparatie
cu sublotul de animale tratate cu vehicul). Lotul 2 este singurul lot in care am constatat modificari
hematologice induse de vehicol, respectiv scaderea drastica a numarului de monocite si limfocite
periferice.
Hematologie WBC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
En + Sp En + Sp + vitE Vehicol Control
WB
C (
K/m
icro
L)
Lot 3
Lot 2
Lot 1
13
Hematologie LY
0
2
4
6
8
10
12
En + Sp En + Sp + vitE Vehicol Control
LY
(K
/mic
roL
)
Lot 3
Lot 2
Lot 1
Hematologie MO
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
En + Sp En + Sp + vitE Vehicol Control
MO
(K
/mic
roL
)
Lot 3
Lot 2
Lot 1
Figura 2.1. Parametri hematologici statistici ai soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16-21 zile cEn+Sp+VitE). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.
14
2.2. Determinarea şi analiza parametrilor biochimici urinari
Proteine urinare (evaluare calitativa) Numarul de soareci cu proteine urinare la 100 mg/dL, din numarul total de animale pe sublot
netratat tratat LOT 1 2 din 7 0 din 6 LOT 2 4 din 6 2 din 5 LOT 3 6 din 8 5 din 6
Conform datelor obţinute la evaluarea calitativă, şi prezentate în graficele de mai sus, s-a înregistrat o creştere semnificativă a glicemiei la animalele din lotul 3, netratat.
3. Investigarea consecinţelor schemelor terapeutice asupra statusului oxidativ la nivel renal
15
3.1. Determinarea şi analiza markerilor de stres oxidativ în urină
In urina animalelor experimentale, recoltata in ultimele 24 h inainte de sacrificare, am investigat
stresul oxidativ, analizand ca marker ADN-ul mitocondrial si genomic oxidat, respectiv 8-hidroxi-
2'-deoxiguanozina (8-OhdG) urinara. Determinarea s-a realizat prin ELISA, cu kitul DNA Damage
ELISA Kit (Enzo Life Sciences), conform protocolului furnizat de producator.
Datele experimentale din Figura 3.1 arata ca numai lotul 1 de soareci (cu varsta cea mai mare) este
responsiv la terapia cu spironolactona si enalapril, in absenta sau in prezenta de vitamina E (Treat 1,
respective Treat 2). Terapia determina scaderea statistic semnificativa a concentratiei de ADN
oxidat in urina (Treat 1 – netratat p=0,004256; Treat 2 – netratat p=0,0324). Nu am constatat
diferente intre loturile de soareci Cg-Lepob /WiscJ netratati, ceea ce sugereaza ca soarecii prezinta
status oxidativ similar la nivel renal, in intervalul de varsta 87-70 zile.
Urine oxidized DNA
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Group 1 Group 2 Group 3
Experimental mice groups
8-O
Hd
G c
on
cen
trat
ion
(n
g/m
L)
Treat 1
Treat 2
Untreat
Figura 3.1. Concentratia de ADN oxidat (8-OHdG) in urina soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16 zile cu spironolactona si enalapril (Treat 1), sau cu spironolactona, enalapril si vitamina E (Treat 1). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.
3.2. Evaluarea activitătii oxidative si a răspunsului la stres oxidativ în tesutul renal
In urina animalelor experimentale, recoltata in ultimele 24 h inainte de sacrificare, am investigat
capacitatea antioxidanta totala. Am utilizat kitul Total Antioxidant Capacity Colorimetric Assay kit
(BioVision), care se bazeaza pe reactia de oxidoreducere a Cu2+.
Datele experimentale descrise in Figura 3.2 arata ca terapia cu enalapril si spironolactona,
suplimentata sau nesuplimentata cu vitamina E, nu afecteaza statistic semnificativ capacitatea
antioxidanta a urinei soarecilor din loturile 1 si 2 (cu varsta mare si intermediara). Remarcam totusi
faptul ca scaderea stresului oxidativ indusa de terapia cu enalapril si spironolactona in cazul
soarecilor din lotul 1 (Figura 3.1) este insotita de tendinta de crestere a capacitatii antioxidante in
urina (Figura 3.2).
In mod surprinzator, constatam ca terapia reduce capacitatea antioxidanta in urina in cazul
soarecilor tineri, din lotul 3 (p=0,003311, Figura 3.2).
16
Urine total antioxidant capacity
0
5
10
15
20
25
30
Group 1 Group 2 Group 3
Experimental mice groups
TA
C (
mM
)
Treat 1
Treat 2
Untreat
Urine total antioxidant capacity
0
5
10
15
20
25
30
Group 1 Group 2 Group 3
Experimental mice groups
TA
C (
mM
)
Treated
Untreated
Figura 3.2. Capacitatea antioxidanta totala in urina soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16 zile cu spironolactona si enalapril (Treat 1), sau cu spironolactona, enalapril si vitamina E (Treat 1). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.
Am realizat un stiu de corelare a markerilor de stres oxidativ si a capacitatii antioxidante totale in
urina animalelor de experiment.
In grupurile 1 si 2 (cu varsta mare si intermediara) tratati cu spironolactona, enalapril si vitamina E
exista o corelatie negativa intre cei 2 parametrii (lot 1: r=-0,98144, p=0,030297; lot 2: r= -0,90968,
p= 0,032242). Aceasta indica tipul de mecanism de actiune al terapiei, respectiv scaderea stresului
oxidativ pare sa se datoreze cresterii capacitatii antioxidante totale. In cazul lotului de soareci tineri
(lotul 3), corelatia negativa se manifesta in cazul terapiei cu spironolactona si enalapril, fara
suplimentare cu vitamina E (r= -0,87611, p= 0,004963).
La loturile 1 si 3 corelatia intre cele doua marimi analizate este pozitiva (lotul 1 - terapie cu
enalapril si spironolactona, lotul 3 – terapie cu enalapril, spironolactona si vitamina E). Aceste
rezultate indica tipul de raspuns la stres oxidativ, respectiv cresterea stresului oxidativ dicteaza
cresterea capacitatii antioxidante.
3.3. Investigații genomice pentru evaluarea răspunsului la stres oxidativ în tesutul renal
Pentru a identifica profilul genic care caracterizeaza raspunsul la stres oxidativ in rinichiul
soarecilor Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu soarecii normali, am realizat un studiu genomic pe 84
17
gene relavante. Am aplicat metoda „pathway-focused PCR array”, care furnizeaza informatii
cantitative privind gradul de exprimare al genelor din panel (Tabel 1, Mouse Oxidative Stress and
Antioxidant Defense PCR Array, Qiagen). Determinarile au fost realizate pe rinichi de la un soarece
Cg-Lepob /WiscJ din lotul netratat, care a fost comparat cu profilul de exprimare genica al
rinichiului de la un soarece normal C57Black, cu varsta similara.
Table 1. Panelul de gene din kitul Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense PCR Array
asebia, care au o alela nula Scd1 sau soarecii la care a fost alterat locusul Scd1 prezinta un
fenotip “slavb”, cu consum crescut de energie si sensibilitate crescuta la insulina1,2.
Subexprimarea inregistrata in Scd1 in cazul soarecilor investigati in acest studiu poate fi
unul dintre factorii genici care determina fenotipul „slab”. Un nivel scazut de Scd1
protejeaza fata de perturbari metabolice, cum ar fi obezitatea si rezistenta la insulina.
1 Ntambi, J.M., et al. 2002. Loss of stearoyl-CoA desaturase-1 function protects mice against adiposity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11482-11486. 2 Maeda, K., et al. 2005. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell Metab. 1:107-119.
19
– Din punctul de vedere al stresului oxidativ, subexprimarea Scd1 poate fi asociata cu un grad
crescut de oxidare lipidica. In acelasi timp, subexprimarea Scd1 determina susceptibilitate
mai mare la procese inflamatorii, prin modificarea profilului lipidic3.
Lpo – lactoperoxidaza
– Este o haloperoxidaza care functioneaza ca un agent natural antibacterian, prin cataliza
oxidarii unor substraturi organice si anorganice de catre apa oxigenata
– Scaderea expresiei Lpo este asociata posibil unui profil scazut de stres oxidativ in rinichiul
investigat. Avand in vedere a lactoperoxidaza este constituent al granulelor neutrofilului, si
se exprima de asemenea de catre monocite/macrofage, este posibil ca subexprimarea genei
sa reflecte un infiltrat scazut de fagocite in cazul animalului studiat, comparativ cu profilul
genic al soarecelui normal.
– Capacitatea scazuta de recrutare a leucocitelor in rinichi se reflecta si prin subexprimarea
Ccl5, care codifica pentru RANTES, chemokina care se adreseaza limfocitelor T .
Alte gene implicate in stresul oxidative care sunt subexprimate
– gene care codifica pentru surse de ROS: Nox1 si Nox 4 din familia NADPH-oxidazelor.
Subexprimarea Nox4 reduce stresul oxidativ local, dar poate afecta si functionalitatea
celulelor renale prin alterarea unor cai de semnalizare. Este de asemenea inhibata aldehid
oxidaza 1 (Aox1) care catalizeaza producerea de apa oxigenta si, in unele conditii, de anion
superoxide.
– gene care codifica pentru enzime antioxidante: Cat (catalaza) si Sod2 (superoxid
dismutaza, forma mitocondriala), Gpx2, Gpx4 si Gpx6 (glutation peroxidaze), Gclm
(glutamat-cistein ligaza care catalizeaza prima etapa in sinteza glutationului). In consecinta,
este scazuta capacitatea de protectie fata de stresul oxidativ prin afectarea unor enzime care
detoxifica apa oxigenata. Subexprimarea genelor care codifica pentru antioxidanti ar putea
reprezenta un defect de combatere a astresului oxidativ, dar s-ar putea datora si productiei
scazute de specii reactive de oxigen (ROS) in rinichiul soarecilor Cg-Lepob /WiscJ.
– gene care controleaza stresul oxidativ la lipide: Ucp3 – proteina mitocondriala de
decuplare a fosforilarii oxidative de sinteza de ATP. Subexprimarea Ucp3 creste
susceptibilitatea mitocondriei la stresul oxidativ mediat de lipde. Gradul de exprimare creste
atunci cand mitocondria se confrunta cu un exces de acizi grasi, proteina codificata de Ucp3
avand rolul de a exporta acizii grasi din mitocondrie.
3 Liu X, Strable MS, Ntambi JM. Stearoyl CoA Desaturase 1: Role in Cellular Inflammation and Stress. Adv Nutr, 2: 15-22, 2011.
20
– gene care controleaza fibrinoliza: Serpin1b (inhibitor de serin proteaze) care este
inhibitorul principal al activatorului de plasminogen tisular si al urokinazei, implicit
inhiband fibrinoliza. Valori scazute ale Serpinei1 conduc la degradarea fibrinei, scazand
astfel gradul de depunere al fibrinei in tesuturi in conditii inflamatorii. Rezultatele indica
faptul ca angiotensina II nu semnalizeaza sinteza Serpin1b, ceea ce scade riscul de
ateroscleroza.
Multitudinea de gene care sunt responsive la stres oxidativ, si a caror expresie este scazuta in
rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ (Tabelul 1, gene marcate cu albastru), corelat cu surse
importante de ROS care sunt supraexprimate, sugereaza un stres oxidative scazut in rinichiul
acestor soareci transgenici.
4. Diseminarea rezultatelor
4.1. Redactarea unui articol de tip review în domeniul proiectului
A fost elaborat articolul de tip review cu titlul "OXIDATIVE STRESS – A MATTER OF LIFE
AND DEATH IN DIABETIC NEPHROPATHY", autori Gina Manda, Alexandru-Ionel Checherita,
Maria Victoria Comanescu, Mihail Eugen Hinescu. Articolul a fost submis la revista “Mediators of
Inflammation” (factor de impact 2,417), in cadrul numarului special "Live or Die: Choice
Mechanisms in Stressed Cells” (nr. de identificare 604208). Al doilea manuscris, cu titlul "NEW
INSIGHTS OF DIABETIC NEPHROPATHY - A NEVER ENDING AND COMPLEX STORY" a
fost trimis la Chinese Medical Journal. (Numarul de identificare este "cmj_369_14").
Concluzii de etapa ale studiului ultrastructural
Inainte de a dispune de o colectie semnificativa de imagini pentru fiecare din loturi, se poate
identifica doar o tendinta de constituire a leziunilor, iar efectele interventie farmacologice nu pot fi
inca evaluate corect, inainte de a dispune de intreaga colectie de imagini.
Pentru aceasta etapa s-au observat: o mare variabilitate inter-individuala in ceea ce priveste
dezvoltarea spontana a leziunilor si diferente, acolo unde leziunile s-au instalat, in prezenta unui
tratament, distributia leziunilor decelabile ultrastructural este neuniforma si inegala. Exista spre
exemplu, sectiuni ultrastructurale in care apar leziuni la nivelul unui singur glomerul, care se
gaseste la mica distanta de alti doi glomerului cu aspect ultrastructural normal.
Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica amplitudine, si, pe esantioanele studiate,
neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara continuarea colectarii de imagini pentru a
identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in termeni ultratstructurali.
Concluzii ale examenului histopatologic
Aspectul histopatologic in loturile si subloturile studiate este de nefropatie diabetica moderata si
este similar intre acestea, neputandu-se decela diferente notabile morfologice la coloratia uzuala
21
hematoxilin-eozina si coloratia speciala PAS. Modificarile histopatologice identificate sunt
reprezentate de scleroza mesangiala usoara-moderata si hipercelularitate mesangiala (prezenta de 3
celule mesangiale in majoritatea spatiilor mesangiale hipercelulare). Nu se observa hialinizare
arteriolara sau alte leziuni vasculare si nici ingrosarea membranei bazale ale tubilor renali.
Concluzii privind activitatea oxidativa şi răspunsul la stres oxidativ, în ţesutul renal
La loturile 1 si 3 corelatia intre cele doua marimi analizate este pozitiva (lotul 1 - terapie cu
enalapril si spironolactona, lotul 3 – terapie cu enalapril, spironolactona si vitamina E). Aceste
rezultate indica tipul de raspuns la stres oxidativ, respectiv cresterea stresului oxidativ dicteaza
cresterea capacitatii antioxidante.
Concluziile studiului genomic
Investigatia genomica la nivelul genelor relevante pentru stresul oxidativ a relevat unele
particularitati ale rinichiului soarecilor, comparativ cu soareci C57Black normali.
Productia de ROS la nivelul rinichiului soarecelui pare sa fie redusa in comparatie cu
soarecele normal, intrucat surse majore de ROS in rinichi, cum ar fi Nox 4, sunt subexprimate. In
acelasi timp, remarcam ca sisteme antioxidante majore sunt de asemenea subexprimate. Remarcam
faptul ca activitatea antioxidanta a glutationului pare sa fie inhibata, prin subexprimarea unei
enzime cheie in sinteza tripeptidului, si prin inhibarea a 3 glutationperoxidaze. Subexpimarea unor
gene importante pentru sistemul antioxidant s-ar putea sa fie consecinta gradului scazut de stres
oxidativ in rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ. Alternativ, este posibil sa reprezinte un defect de
combatere a stresului oxidativ, si sa influenteze de asemenea negativ semnalizarea redox
intracelulara. Prin evaluarea markerilor de stres oxidativ in rinichiul soarecilor Cg-Lepob /WiscJ,
comparativ cu animale normale, se va putea clarifica statusul oxidativ al rinichilor animalelor
transgenice studiate, ceea ce va clarifica cauza subexprimarii antioxidantilor endogeni.
Au fost evidentiate perturbari la nivelul metabolismului lipidic. Am evidentiat
subexprimarea genei Scd1 care determina scaderea sintezei de acizi grasi nesaturati si cresterea
susceptibilitatii la peroxidare lipidica. Perturbarea este adancita prin subexprimarea apolipoproteinei
E, care mediaza legarea, internalizarea si catabolizarea lipoproteinelor. Prin subexprimarea genei
Ucp3 scade capacitatea mitocondriilor de a controla fluxul de acizi grasi.
Supraexprimarea genei care codifica pentru cicloxigenaza, de asemenea implicata in
metabolismul lipidic, indica existenta unui proces inflamator activ in rinichiul soarecilor Cg-Lepob
/WiscJ. Profilul genic sugereaza insa ca acesta nu pare sa fie asociat cu recrutare crescuta de
leucocite pro-inflamatoare (fagocite si limfocite T). In plus, subexprimarea genei Serpin 1
sugereaza faptul ca procesul inflamator nu este insotit de depunere crescuta de fibrina.