INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS EVALUACIÓN DE BACTERIAS RIZOSFÉRICAS DE Jatropha curcas L. CONTRA Fusarium verticillioides Y Leptoglossus zonatus TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES PRESENTA HÉCTOR HERNÁNDEZ GUERRA YAUTEPEC, MORELOS, JULIO DE 2014
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
EVALUACIÓN DE BACTERIAS RIZOSFÉRICAS DE Jatropha curcas L.
CONTRA Fusarium verticillioides Y Leptoglossus zonatus
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
HÉCTOR HERNÁNDEZ GUERRA
YAUTEPEC, MORELOS, JULIO DE 2014
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y Laboratorio de Ecología
Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de
Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la
Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo y del Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez. Para la
realización de los estudios se contó con becas proporcionadas por el CONACyT (No.
480185) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaria de
Investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el
financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20121269, 20130490).
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo, Víctor Rogelio Castrejón Gómez por
permitirme ser parte de este proyecto de tesis, por sus enseñanzas, paciencia y apoyo en
todo momento.
Al Dr. Miguel Gerardo Velázquez del Valle por apoyarme y estar en disposición de
ayudarme, por sus enseñanzas y aportes al desarrollo de la tesis.
Al Dr. Rodolfo Figueroa Brito, Dr. Federico Castrejón y al Dr. Francisco Rodríguez
González por formar parte de mi comité tutorial, enseñanzas y aportes para el desarrollo
del trabajo de tesis.
A los Profesores de MAPE Dr. René Arzuffi, Dr. Roberto Montes, y la M. en C. Hilda
Elizabeth Moctezuma por sus enseñanzas impartidas dentro y fuera de las aulas.
A los administrativos del CeProBi, Lic. Elvia, Gabriel, Vanesa y todos aquellos que
siempre estuvieron con la disposición de ayudarme y que esto se prolongó durante toda
la Maestría.
DEDICATORIAS
A Dios por permitirme dar un paso más en mi formación académica y continuar este largo
camino de la vida.
A mi madre por darme todo su apoyo, cariño, amor y guiarme en este camino de la vida
con su paciencia y consejos.
A mi padre querido en paz descanse por enseñarme a trabajar de manera honrada y
esforzarme por todo aquello que vale en la vida.
A mis hermanos Jesús, Hugo y José Nicolás por su apoyo incondicional y a mi sobrina
Mariela.
A mis compañeros y amigos de la Maestría: Angel, Gustavo, José Miguel, Teresa, Valeria,
Erubiel, Humberto, Gilberto, Miguel y a los otros compañeros que hicieron también amena
esta estancia: Mari, Liliana, Cinthia, Monserrat, Itzel, Mitsu y demás personas especiales
que conocí dentro de la Maestría.
CONTENIDO
ÍNDICE DE CUADROS
I
ÍNDICE DE FIGURAS II
RESUMEN V
ABSTRACT VI
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA 3
2.1 Clasificación taxonómica, características morfológicas y centro de
origen de Jatropha curcas L.
3
2.2 Localización, importancia y principales usos de Jatropha curcas 4
2.3 Problemas de sanidad del cultivo de Jatropha curcas 6
2.4 Principales enfermedades fúngicas en el cultivo de Jatropha curcas 7
2.5 Fusarium verticillioides 9
2.5.1 Características morfológicas 10
2.5.2 Distribución y biología 10
2.5.3 Daños 11
2.6 Plagas 12
2.6.1 Taxonomía y distribución de Leptoglossus zonatus Dallas 13
2.6.2 Importancia económica y ecológica 15
2.6.3 Ciclo biológico 15
2.6.4 Daños 16
2.7 Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo de Jatropha curcas 16
2.7.1 Potencial de las bacterias rizosfericas como agentes de control
biológico
17
2.7.1.1 Bacillus subtilis 19
2.7.1.2 Bacillus mojavensis 19
2.7.1.3 Bacillus thuringiensis 20
2.7.1.4 Lysinibacillus sphaericus 21
2.8 Actividad antagonista de las bacterias rizosféricas 21
2.9 Actividad entomopatógena de las bacterias rizosféricas 24
3. OBJETIVOS 29
3.1 Objetivo general 29
3.2 Objetivos específicos 29
4. MATERIALES Y MÉTODOS 30
4.1 Material biológico 30
4.1.1 Cepas bacterianas 30
4.1.2 Cepa fúngica 30
4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus 30
4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus
sphaericus.
32
4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo 33
4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales para Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus
33
4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus
33
4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro 34
4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.
Cultivo bacteriano en agar nutritivo
34
4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.
Bacterias crecidas en caldo nutritivo
35
4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la
morfología hifal de Fusarium verticillioides mediante microscopia
óptica
35
4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus
zonatus
36
4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de
Leptoglossus zonatus
37
5. RESULTADOS 38
5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis,
Bacillus thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo
nutritivo
38
5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus
thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo
más extracto de levadura suplementado con sales
40
5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento
micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria
crecida en agar nutritivo)
42
5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento
micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria
crecida caldo nutritivo)
45
5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de
Fusarium verticillioides
49
5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus
55
5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de
Leptoglossus zonatus
55
6. DISCUSIÓN 56
7. CONCLUSIONES 61
8. LITERATURA CITADA 62
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L. 3
Cuadro 2. Reportes de hongos fitopatógenos que afectan a Jatropha curcas L. 8
Cuadro 3. Clasificación taxonómica de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg 9
Cuadro 4. Insectos plaga en el cultivo de Jatropha curcas L. 13
Cuadro 5. Clasificación taxonómica de Leptoglossus zonatus Dallas 14
Cuadro 6. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de fitopatógenos 24
Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles 25
Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar
nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
42
Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo
nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides
46
Cuadro10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo
nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides
46
Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus
55
I
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo
en condiciones de campo.
31
Fig. 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una
temperatura de 28 ± 2 °C.
32
Fig. 3. Ninfa en vaso de plástico en laboratorio de Ecología Química de
Insectos del CEPROBI-IPN.
37
Fig. 4. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus
sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura
de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm
38
Fig. 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus
sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura
de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
39
Fig. 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en
medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con
sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a
150 rpm.
40
Fig. 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con
cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d)
12 h, (e) 16 h, (f) 20 h. (100X).
41
Fig. 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a) Testigo, (b)
Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.
43
Fig. 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
44
Fig. 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
44
Fig. 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
45
Fig. 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), 47
III
(c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
Fig. 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
48
Fig. 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días
48
Fig. 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase
exponencial (12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h).
Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
49
Fig. 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
50
Fig. 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
50
Fig. 18. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
Fig. 19. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo
dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
Fig. 20. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
52
Fig. 21. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
52
Fig. 22. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
53
IV
Fig. 23. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
53
Fig. 24. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (20X). (a)
thuringiensis (Bt) (Cuadro 7), ésta última representa el entomopatógeno de mayor
producción en el mundo, debido a su rápida acción y a la posibilidad de producirlo in vitro
25
en forma industrial. Las células esporuladas y cristales de Bt pueden producirse con
métodos convencionales haciéndolas competitivas en costo con relación a los insecticidas
químicos (Gallegos 2003).
Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles
Especie de Bacillus Insecto Daño Referencia
B. cereus,
Paenibacillus
Tylopili
Brahmina coriacea Se alimenta de
tubérculos de papa
Sharma et al. 2013
Lysinibacillus
sphaericus
Culex
quinquimafaciatus,
Blatella germanica,
spodoptera litura
Problemas a la
salud humana
Defoliador
Lozano et al. 2011
Nishiwaki et al. 2007
Bacillus thuringiensis Aedes aegypti Problemas a la
salud humana
Ochoa y
Arrivillaga 2009
El modo de acción de Bacillus thuringiensis depende de la actividad de la protoxina que
debe ser ingerida por el insecto susceptible, cuyo intestino posee un pH alcalino superior
a 9,5 lo cual es esencial para la disolución de las protoxinas, su activación se da gracias a
la proteólisis causada por las enzimas digestivas del insecto. La especificidad de la δ-
endotoxina a un tipo de insecto en particular implica la presencia de receptores celulares
específicos, la toxina se inserta de forma irreversible a la membrana plasmática de las
células intestinales creando poros o lesiones que conduce a una variación en la
permeabilidad celular, alterando el transporte de iones potasio destruyéndola, causando
26
así la disrupción de la integridad del intestino y la muerte del insecto en 24 a 48 horas
posteriores a la ingesta (Ibiza-Palacios et al. 2008).
La acción entomopatógena de Lysinibacillus sphaericus depende de factores como: dosis
de aplicación, ingestión de la toxina por la larva y velocidad de alimentación de la larva.
Desde que se descubrió L. sphaericus en 1965 como entomopatógeno de mosquitos
(Kellen et al. 1965), han surgido nuevos reportes que indican actividad en contra de otras
especies incluyendo efectos letales sobre huevecillos del nematodo Trichostrongus
colubriformis (Bone y Tinelli 1987). Lysinibacillus sphaericus no tiene efectos sobre otros
organismos que incluyan insectos benéficos, como por ejemplo las abejas. Ensayos de
campo han demostrado la ausencia de efectos sobre invertebrados no blanco de este
microorganismo como crustáceos, dípteros, langostinos y escarabajos, además de
algunos vertebrados acuáticos como renacuajos, en lugares donde se ha utilizado como
larvicida (Brown et al. 2004, Lacey 2007).
La proteína Mtx1 es tan tóxica como la proteína cristal y puede ser procesada en el
intestino por proteasas a derivados de 27 y 70 kDa siendo ambos fragmentos necesarios
para una total actividad de la toxina.
La toxina binaria comprende dos proteínas BinA (448 aminoacidos 42 kDa) y BinB (448
aminoacidos de 51 kDa) es depositada en forma de cristal paraesporal y su principal
característica es su alta toxicidad en mosquitos (Baumann et al. 1998, Hindley y Berry
1987). Esta toxina se forma en la fase exponencial y al inicio de la esporulación (Ahmed
et al. 1995). Las cepas bloqueadas en su estado inicial de esporulación no acumulan
cristales de la toxina (Charles et al.1988, El-Bendary et al. 2005). Su sitio de acción es el
intestino del insecto una vez ingerida la toxina ésta se solubiliza y activa uniéndose a las
27
células epiteliales del intestino ciego e intestino posterior en mosquitos de Culex. El
receptor es mediado por la toxina proteica BinB la cual puede ser ligada a distintas
regiones del intestino donde puede dañar los nervios y tejidos musculares (Davidson
1989, Oei et al. 1992).
La esferilicosina es producida por algunas cepas de L. sphaericus la cual muestra un
efecto sobre la cucaracha Blattella germanica y el gusano cortador del tabaco Spodoptera
litura (Nishiwaki et al. 2007). La esferilicosina es una proteína de 53 kDa producida en
medio de cultivo, miembro de la familia de las citolisinas, es un miembro de la familia de
las citolisinas y es capaz de producir poros de aproximadamente 35 nm de diámetro en
los eritrocitos.
La capa S es una estructura proteíca paracristalina sobre la superficie de muchas
bacterias compuesta por monómeros de glicoproteína. Sus funciones están envueltas en
la interacción entre la célula bacteriana y el ambiente, por ejemplo como capa protectora o
tamiz molecular en la adhesión de la célula y reconocimiento de receptores en el control
biológico (Sidhu y Olsen 1997). Esta capa ha sido encontrada en las especies del género
Bacillaceae. La capa S ha mostrado actividad tóxica contra el mosquito Culex
quinquefasciatus vector de la Filariasis (Lozano et al. 2011).
L. sphaericus requiere ser ingerida por el insecto para actuar y así desarrollar la infección
dentro de las larvas de los mosquitos. La evidencia principal con que se cuenta se basa
en histología. Por lo general las cepas afectan la membrana peritrófica del intestino medio
hasta que muere la larva. La mayoría de las larvas de dípteros se alimentan normalmente
de bacterias y algas. Las cepas específicas de L. sphaericus, al ser introducidas en
medios acuáticos, son ingeridas por las larvas. Una vez en el intestino medio, la bacteria
28
comienza a degradar las células de la membrana epitelial. Al mismo tiempo en que la
bacteria crece y esporula se produce una toxina que atraviesa la membrana epitelial de
las células sensibles que se encuentran en el lumen de la larva, lo que da lugar a la
intoxicación de las mismas. Después de la muerte de la larva, las células vegetativas de
L. sphaericus (junto con la flora normal del intestino) crecen hacia afuera de los tejidos
finos de la larva muerta. En consecuencia, la región posterior del intestino medio aparece
inflamada en las larvas infectadas, las que también llegan a manifestar temblores, lentitud
y no pueden mudar (Davidson et al. 1990).
En dípteros la inclusión cristalina denominada toxina binaria A y B es liberada en el
intestino en su fase larvaria y al ser solubilizada por el pH alcalino en el intestino medio,
ésta es activada por las proteasas causando deshidratación y muerte a los vectores.
Provoca daños al sistema nervioso y los tejidos musculares (Singh et al. 2004). En
cucarachas adultas la toxina esfericolisina afecta a los ganglios que son el sistema
nervioso de estos insectos (Nishiwaki et al. 2007).
29
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar la actividad de bacterias rizosféricas de Jatropha curcas contra Fusarium
verticillioides y Leptoglossus zonatus.
3.2 Objetivos específicos
Establecer las cinéticas de crecimiento de las bacterias rizosféricas Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus.
Evaluar el efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides.
Determinar el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium
verticillioides.
Evaluar la actividad tóxica de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus.
Evaluar el efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso
de Leptoglossus zonatus.
30
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Material biológico
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y en el Laboratorio de
Ecología Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN).
4.1.1 Cepas bacterianas
La cepas de las bacterias Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus fueron provistas por la colección de hongos y bacterias del
Laboratorio de Fitopatología del CEPROBI. Las bacterias fueron conservadas en medio
agar nutritivo (AN) a una temperatura de 4 °C. Posteriormente se realizaron resiembras
periódicas.
4.1.2 Cepa fúngica
La cepa de Fusarium verticillioides fue provista de la colección de hongos del Laboratorio
de Fitopatología del CEPROBI. El hongo fue resembrado en medio Papa Dextrosa Agar
(PDA). Posteriormente se realizaron resiembras periódicas para conservar la cepa a una
temperatura de 28 ± 2 °C.
4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus
Las ninfas y adultos de Leptoglossus zonatus fueron colectados manualmente en un
cultivo de sorgo ubicado en la colonia Diego Ruíz, municipio de Yautepec, Morelos
(18°49´22.85 N y 99°06´13.68 O) (Fig. 1) y de una plantación experimental de piñón
mexicano en el CeProBi-IPN (18°49´45.48 N y 99°05´35.73 O). Los insectos colectados
fueron depositados en jaulas de acrílico (27 x 23 x 25 cm) cuyas entradas estuvieron
31
cubiertas con tela de organza y se llevaron al Laboratorio de Ecología Química del Centro
de Desarrollo de Productos Bióticos del I. P. N.
En el laboratorio tanto los adultos como las ninfas se alimentaron con vainas tiernas de
frijol (ejote) y elote (Grimm 1999) y se les adicionó miel diluida en agua al 10 % en tubos
Eppendorf perforados en la base para que los insectos se alimentaran. Todos los días se
revisaron las jaulas con la finalidad de eliminar el material vegetal descompuesto y los
desechos producidos por los insectos. El alimento se cambió cada tercer día, el pie de
cría se mantuvo de forma permanente para tener los diferentes estados ninfales y adultos
para asegurar su conservación en condiciones de laboratorio.
Figura 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo en condiciones de campo.
32
Para su apareamiento se colocaron parejas de machos y hembras en jaulas de vidrio de
15x15x15 cm. Las hembras que lograron aparearse se aislaron en otras jaulas similares a
las descritas para la obtención de los huevecillos, los cuales se contaron y separaron en
jaulas similares hasta la emergencia de las ninfas. Las ninfas obtenidas se separaron de
acuerdo a su estado de desarrollo y se alimentaron como se describió anteriormente
hasta que alcanzaron el grado de desarrollo deseado (ninfa 4) para realizar los
bioensayos. La limpieza de las jaulas fue la misma que en el caso de los insectos
colectados en campo (Fig. 2).
4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus
mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus.
Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa
bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio
agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C.
Figura 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una temperatura de 28 ± 2 °C.
33
4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo
Para conocer las fases de crecimiento bacteriano se procedió a preparar un inóculo de la
forma mencionada en el punto anterior y se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular un
total de 18 matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo (8 g/ L). El cultivo bacteriano
se dejó crecer durante 32 h en agitación a 150 rpm a 28 ± 2°C. Se tomaron muestras de
1 mL del cultivo bacteriano cada cuatro horas de dos matraces y se llevaron al
espectrofotómetro (Shimadzu UV-160) en donde se midió la absorbancia a una densidad
óptica a 590 nm. Con los datos obtenidos se realizaron las gráficas de cinética de
crecimiento en SigmaPlot versión 11.0 (2008).
4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura suplementado con
sales para Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
A partir del inóculo en medio caldo nutritivo de B. thuringiensis y L. sphaericus
mencionado en el punto 4.2 se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular cada uno de los
matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo más extracto de levadura (0.05 % o 0.5
g/L) y suplementado con sales (CaCl 7 X10 -4M, MnCl 5X10-5 M y MgCl 10-3 M) (Dussán
2002). El cultivo bacteriano se dejó crecer durante 32 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C, la toma de muestras y elaboración de graficas de la cinética de
crecimiento se realizaron de igual forma que en el punto anterior.
4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
La observación de los cristales se realizó mediante la técnica de tinción simple con cristal
violeta al 0.5 % para lo cual se tomaron alícuotas de 100 µL y se colocaron sobre un
portaobjetos, posteriormente se colocó una gota de cristal violeta y se dejó por un minuto
para después lavar con agua corriente hasta que no quedaran restos de colorante (Boone
34
et al. 2001). Las muestras se tomaron cada cuatro horas a partir de las ocho horas hasta
las 20 horas de crecimiento bacteriano en los medios de cultivo ya mencionados en los
puntos 4.2.1 y 4.2.2. Las muestras se llevaron al laboratorio de microscopia óptica
ubicado en el CEPROBI para realizar la toma de fotografías digitales en un Microscopio
Óptico Nikon Eclipse 80i (Japón), el cual cuenta con cabezal y zoom digital de 4X, con
cámara de video, controlador e interfase acoplada a PC (Data image DS33, Japón) con un
acercamiento de 100X.
4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro
4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Cultivo
bacteriano en agar nutritivo
Las pruebas de antagonismo se realizaron utilizando el método dual en cajas Petri con
agar nutritivo, mediante una asada de cultivo bacteriano se inocularon cuatro puntos
equidistantes, esparciéndolas en un área de 1 cm2 de cada punto del borde de la caja y
en el centro se colocó un disco de 5 mm de diámetro del hongo fitopatógeno F.
verticillioides. El testigo constó solo de un disco de 5 mm del hongo en medio agar
nutritivo. El experimento se incubó a una temperatura de 28 ± 2 °C hasta que el testigo
llenó la caja con micelio. El diámetro de la colonia fue medido empleando un vernier
digital. Con las medidas obtenidas se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento
micelial mediante la ecuación descrita por Gou et al. (2006):
Porcentaje de inhibición micelial= 1 – (Da /Db) X 100
En donde:
Da: Diámetro de la zona de crecimiento micelial de los tratamientos.
Db: Diámetro de la zona de crecimiento micelial del testigo.
35
Se realizaron 5 repeticiones por tratamiento en un diseño completamente al azar y el
experimento se replicó tres veces.
4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Bacterias
crecidas en caldo nutritivo
Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa
bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio
agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C. Posteriormente se tomó una alícuota de 0.5 mL de cada cultivo
bacteriano para inocular ocho matraces de 50 mL de caldo nutritivo, cuatro de ellos fueron
incubados en agitación a 150 rpm a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 12 horas y los
otros cuatro fueron incubados durante 24 horas de la misma manera. Utilizando el mismo
método dual mencionado en el punto anterior en cajas Petri con medio AN se utilizó una
micropipeta para colocar cuatro gotas del cultivo bacteriano, cada una de ellas de 5 µL de
la bacteria y en el centro se colocó un disco de 5 mm del hongo F. verticillioides. El testigo
constó solo de un disco de 5 mm del hongo fitopatógeno colocado en el centro de caja
Petri con medio AN. Las cajas Petri se incubaron hasta que el testigo llenó la caja con
micelio a 28 ± 2 °C. Los datos de diámetro micelial al igual que el porcentaje de inhibición
de crecimiento micelial fueron obtenidos de la forma ya mencionada en el punto anterior.
4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de
Fusarium verticillioides mediante microscopia óptica
Después de realizar las pruebas de antagonismo mediante la técnica de cultivo dual
descrita en el punto anterior, se cortó un disco de aproximadamente 5 mm de diámetro de
la zona de inhibición entre el hongo y la bacteria, este disco fue colocado sobre un
36
portaobjetos. Posteriormente, se realizó una tinción con azul de algodón a una proporción
de 0.5 g / 100 mL de lactofenol y se le colocó un cubreobjetos, de igual forma se colocó
un disco del hongo sin tratamiento para contrastar las diferencias morfológicas. Una vez
preparada la muestra, ésta se llevó al laboratorio de microscopia óptica del CEPROBI
para realizar la toma de fotografías digitales en el Microscopio Óptico Nikon Eclipse
80i (Japón) con un acercamiento de 20 y 40X.
4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus zonatus
Las ninfas en su cuarto estadio se colocaron en forma individual dentro de vasos de
plástico del número 4 sin alimento por cuatro horas previo a los bioensayos.
Posteriormente, se les colocó un tubo Eppendorf perforado en la base, en el cual se
depositó 1 mL de la bacteria según correspondiera, crecida en caldo nutritivo más extracto
de levadura suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) durante 16 horas, más dos
granos de elotes que fueron cambiados cada dos días (Fig. 3). El número de ninfas por
tratamiento fue de 30. En las ninfas testigo se añadió 1 mL de caldo nutritivo sin la
bacteria. La evaluación de la mortalidad se realizó cada 24 horas durante los cinco días
posteriores de iniciado el experimento. Las observaciones preliminares permitieron
determinar que la duración de este estado ninfal es de cinco días.
37
El efecto de Bacillus thuringiensis y L. sphaericus sobre la mortalidad de L. zonatus fue
analizado usando la prueba estadística Chi cuadrada con el programa estadístico
SigmaPlot versión 11.0 (2008).
4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus
Siguiendo la misma metodología mencionada en el punto 4.6 se tomaron datos de peso
del cuarto y quinto estado ninfal de L. zonatus, además se determinó si había algún
cambio morfológico o retraso en el ciclo biológico.
El efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de L. zonatus
fue analizado usando la prueba estadística ANOVA de una vía (P=0.349) con el
programa estadístico SigmaPlot versión 11.0 (2008).
Figura 3. Ninfa en vaso de plástico en el
laboratorio de Ecología Química de
Insectos del CEPROBI-IPN.
38
5. RESULTADOS
5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus
thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo.
Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de bacterias rizosféricas para conocer las
diferentes fases de crecimiento de cada una de estas cepas bacterianas y determinar la
producción de metabolitos primarios y secundarios, se menciona el tiempo en el que
alcanzan cada una de estas fases de crecimiento en medio caldo nutritivo.
B. subtilis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero a cuatro
horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 16 horas, la fase estacionaria va de las 16
hasta las 24 horas, su fase de declinación va de las 24 horas en adelante (Fig. 4a).
Bacillus mojavensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero
a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va
de las 16 hasta las 28 horas, su fase de declinación va de las 28 horas en adelante (Fig.
4b).
Figura 4. Cinética de crecimiento de Bacillus subtilis (a) y Bacillus mojavensis (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
b
a b
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
a
b
39
Bacillus thuringiensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las
cero a las cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 12 horas, la fase
estacionaria va de las 12 hasta las 25 horas, su fase de declinación va de las 25 horas en
adelante (Fig. 5a).
Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las
cero a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 13 horas, la fase estacionaria va
de los 13 a las 24 horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 5b).
Figura 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
a b
40
5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus thuringiensis y
Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales
Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de los B. thuringiensis y L. sphaericus para
conocer la fases crecimiento y observación de producción de cristales. Bacillus
thuringiensis inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas, la fase
logarítmica va de las cuatro a las 13 horas, la fase estacionaria va de las 13 hasta las 26
horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 6a).
Lysinibacillus sphaericus inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas,
la fase logarítmica o exponencial va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va
de las 16 hasta las 32 horas, su fase de declinación va de las 32 horas en adelante (Fig.
6b).
Figura 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
a
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
a b
41
La producción de cristales en ambas bacterias fue observada en la fase logarítmica, se
apreció una fuerte tinción con cristal violeta en las células bacterianas en la hora 16 de
crecimiento de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus (Fig. 7).
d
a b
f
c
d e
Figura 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con
cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d) 12 h, (e) 16
h, (f) 20 h. (100X).
42
5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de
Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida en agar nutritivo)
El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para
impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La
inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el
crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie
total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias rizosféricas en
cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides, fue Lysinibacillus sphaericus el que
causó mayor porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (Cuadro 8). Además se
observó que en algunos de los tratamientos el micelio cambió de color con respecto al
testigo (Fig. 8).
Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
ANOVA de una vía, con una F= 199.65; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
43
B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 50 % (Cuadro 8).
El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto algodonoso y
de color blanquecino en el centro y en menor intensidad hacia los bordes. El testigo
presentó un crecimiento radial micelial y con un color blanquecino y algodonoso uniforme
(Fig. 8).
B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 54 %
(Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto
algodonoso en el centro y menos en su periferia, el color del micelio fue más blanquecino
que el testigo (Fig. 9).
a b
Figura 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.
durante siete días.
44
B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 26
% (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con
aspecto algodonoso en el centro y un poco menos en su periferia y menos denso, el color
fue más blanquecino al del testigo (Fig. 10).
Figura 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides
(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2
°C durante siete días.
b
a
Figura 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium
verticillioides (a) Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
b
a
45
Lysinibacillus sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides
del 55 % (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma radial, con
aspecto algodonoso y con una amplia distancia entre la bacteria y con un color
ligeramente menos intenso que el testigo (Fig. 11).
5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de
Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida caldo nutritivo)
El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para
impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La
inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el
crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie
total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias probadas en
cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides fueron Bacillus mojavensis, Bacillus
subtilis y Lysinibacillus sphaericus los que causaron el mayor porcentaje de inhibición de
Figura 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides
(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante
siete días.
b
a
46
crecimiento micelial a las 12 y 24 horas sin presentar diferencia significativa entre ellos
(Cuadros 9 y 10). Además se observó que en algunos de los tratamientos el micelio
cambió de color con respecto al testigo.
Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
ANOVA de una vía, con una F= 81.021; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
Cuadro 10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
ANOVA de una vía, con una F= 144.25; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
47
B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 38.5 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 44.2 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada y sin espaciamiento entre este y el crecimiento bacteriano, sin
embargo en el tratamiento de 12 horas el micelio se observó más algodonoso que
tratamiento 24 horas, mientras que el color del micelio fue más blanquecino en ambos
tratamientos y similar al del testigo (Fig. 12).
B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 40.4 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 43 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada irregular y sin margen de limitación entre el crecimiento bacteriano,
sin embargo en el tratamiento de 24 horas el micelio se observó más algodonoso que el
Figura 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), (c)
Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante
siete días.
a
c
b
48
tratamiento a las 12 horas, mientras que el color del micelio fue blanquecino en ambos
casos muy similares al del testigo (Fig. 13).
B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 27.4 % en
el tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 28.4 % en el tratamiento
de cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos
tratamientos fue de forma casi radial sin espaciamiento entre este y el crecimiento
bacteriano, el aspecto poco algodonoso fue el mismo para ambos casos, mientras que el
color blanquecino de los tratamientos fue similar al del testigo (Fig. 14).
Figura 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12
h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±
2 °C durante siete días.
c b a
Figura 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12
h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±
2 °C durante siete días.
c b a
49
L. sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 39.6 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 41.4 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada, en el tratamiento de 12 horas se observó que el micelio invadió
parte del cultivo bacteriano, el aspecto algodonoso fue el mismo para ambos casos,
mientras que el color blanquecino del micelio de los tratamientos fue muy similar al del
testigo (Fig. 15).
5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium
verticillioides
El efecto de los bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de F. verticillioides fue
observada a los siete y 14 días, mostrando que todos los tratamientos causaron
aparentes anormalidades en hinchamientos, rugosidad y cambio en el contenido celular
con respecto a las hifas del testigo.
Figura 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28
± 2 °C durante siete días.
c b a
50
B. subtilis provocó anormalidades en las hifas a partir de los siete días, algunas de las
observaciones fueron aparentes hinchamientos y un crecimiento rugoso (Fig. 16), a los 14
días se observó micelio con aparente pérdida de contenido celular e hifas menos
hinchadas (Fig. 17).
b a
Figura 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
B. mojavensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los
siete días se observó aparentemente un mayor grosor y crecimiento ligeramente rugoso
(Fig. 18), a los 14 días se observaron hifas con septos más cortos aparentemente y de
mayor grosor, además de una tinción no uniforme que podría indicar pérdida de contenido
celular (Fig. 19).
Figura 18. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 19. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
a b
52
B. thuringiensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de
los siete días las observaciones fueron aparentemente septos más cortos, con un mayor
grosor y un crecimiento ligeramente rugoso (Fig. 20), a los 14 días se observaron hifas
aparentemente sin engrosamiento, ligeramente rugosas y sin pérdida de contenido celular
(Fig. 21).
b a
Figura 20. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
Figura 21. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
a b
53
L. sphaericus provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los
siete días las observaciones fueron aparente engrosamiento de los septos y con
hinchamientos en la parte central de cada septo, un crecimiento rugoso y con aparente
pérdida de contenido celular (Fig. 22), a los 14 días se observan hifas con una fuerte
deformación, sin septos definidos y con una mayor pérdida de contenido celular (Fig. 23).
b a
Figura 22. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 23. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
54
De forma general, las observaciones de la morfología hifal de F. verticillioides a los 14
días de incubación por efecto de todas las bacterias rizosféricas estudiadas se muestra en
la Fig. 24. En la que se aprecia una gran cantidad de hifas con anormalidades causadas
por las bacterias rizosféricas tales como aparentes hinchamientos, rugosidad y una tinción
no uniforme que puede deberse a una pérdida en el contenido celular.
Figura 24. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (20X). (a) Testigo, (b) Bacillus subtilis, (c) Bacillus mojavensis, (d) Bacillus thuringiensis, (e) Lysinibacillus sphaericus. Incubación a una temperatura de 28 ± 2 °C.
e d
c
a
b a
55
5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad de Leptoglossus zonatus
La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto
sobre la mortalidad de la ninfa 4 de L. zonatus, de acuerdo al análisis estadístico no hay
diferencia significativa entre los tratamientos y el testigo como se muestra en el Cuadro
11.
5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus
La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto
sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de L. zonatus. De acuerdo a la comparación de pesos
por grupo de ninfas con los tratamientos y el testigo no hubo diferencias significativas
(Cuadro 11).
Además, se dió seguimiento del ciclo de vida de las ninfas hasta su estado adulto. Éstas
continuaron mudando hasta su estado adulto y se reprodujeron generando huevecillos
fértiles.
Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus
Tratamiento €Mortalidad (%) ¥Peso N4 a N5 (mg)
ANOVA
Testigo 33.33 a 50.168 ± 18.807 a
Bacillus thuringiensis 46.66 a 42.612 ± 12.048 a
Lysinibacillus sphaericus 36.66 a 44.021 ± 17.212 a
€ Chi cuadrada. ¥ ANOVA de una vía, con una F= 1.075; g.l. 2, 30; P = 0.349. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras iguales en la misma columna indican que no hay diferencias significativas.
56
6. DISCUSIÓN
Se obtuvieron las diferentes fases de crecimiento de las bacterias rizosféricas (Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus) en medio
caldo nutritivo. Diversos metabolitos son producidos en cada una de las fases de
crecimiento y probablemente están relacionados al control de fitopatógenos e insectos
plaga. Además, se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de las bacterias Bacillus
thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) y se determinó que estas bacterias
producen una gran cantidad de cristales proteicos (toxinas) en su fase logarítmica.
Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que B. subtilis, B. mojavensis, B.
thuringiensis y L. sphaericus tienen actividad antagonista contra el hongo Fusarium
verticillioides. Estas especies bacterianas inhibieron el crecimiento micelial y afectaron la
morfología hifal de este hongo fitopatógeno. Se ha demostrado que las semillas de J.
curcas son propensas al ataque de diversos hongos fitopatógenos durante su
almacenamiento, que ocasionan degradación de los ácidos grasos, proteínas y por lo
tanto pérdida de la calidad de las semillas. En particular, F. verticillioides se ha reportado
que disminuye la cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de
las semillas (Worang et al. 2008, Dharmaputra et al. 2009). Es importante disponer de
antagonistas bacterianos para el manejo de F. verticillioides, en trabajos previos se
demostró que diversas rizobacterias son antagonistas de varios géneros de hongos
fitopatógenos tales como Curvularia, Fusarium, Rizoctonia, entre otros (Liu et al. 2007,
Mojíca-Marín et al. 2009, Bacon et al. 2012, Kadyan 2013). En particular, en la rizosfera
57
de J. curcas se han aislado bacterias del género Enterobacter que producen sideróforos
(Kumar et al. 2011).
Cabe señalar, que las cepas empleadas en esta investigación fueron obtenidas de la
rizosfera de J. curcas en una plantación de Morelos, México. Trabajos previos
demostraron que B. subtilis, B. mojavensis y B. thuringiensis tienen un efecto antifúngico
in vitro en la inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos como Fusarium
equiseti y Curvularia lunata, además se realizaron trabajos para conocer algunos de los
mecanismos de acción dentro de su actividad antagonista, algunos de estos fueron
producción de sideróforos, ácido cianhídrico, enzimas líticas, compuestos difusibles y
volátiles (Toledo 2013).
En algunos estudios realizados en la India se aisló B. subtilis de la rizosfera de J. curcas
y se demostró que en condiciones de campo inhibió al hongo fitopatógeno Lasiodiplodia
theobromae (Latha et al. 2011). Por otra parte, se conoce que B. mojavensis produce
proteasas, sideróforos y compuestos volátiles que inhiben el crecimiento micelial de F.
verticillioides (Bacon y Hinton 2002, Bacon et al. 2012). B. mojavensis posee un
mecanismo antagonista complejo aún no conocido por completo, donde además de
producir los compuestos mencionados anteriormente se relaciona la producción de
surfactinas con la actividad antifúngica de este microorganismo (Bacon et al. 2012).
En el presente estudio se evaluó el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología
hifal de F. verticillioides. En base a los estudios de microscopía realizados, se observó
que la morfología de las hifas fue afectada aparentemente en grosor, hinchamientos,
rugosidad y probablemente salida de material celular debido a que se observaron algunas
hifas prácticamente vacías. Trabajos realizados con bacterias rizosféricas han
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demostrado tener efecto en la morfología de C. lunata (Basha y Ulaganathan 2002). En
este trabajo se demostró que Bacillus sp. presentó actividad antagonista contra el hongo
F. verticillioides y que afecta en diferentes grados de daño a su morfología hifal.
Bacillus thuringiensis que también inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides
produce enzimas líticas como proteasas y quitinasas, además de tener la capacidad de
producir compuestos volátiles (Toledo 2013), lo que le proporciona una actividad
antagonista contra algunos hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani y Fusarium
oxysporum (Mojíca-Marín et al. 2009, Reyes-Ramírez et al. 2004, Gomaa 2012). Por otro
lado, esta bacteria ha sido ampliamente utilizada en el control de plagas insectiles debido
a la presencia de genes cry que se relacionan con la producción de cristales y que
particularmente le permiten tener un efecto entomopatógeno (Carreras 2011). De igual
forma se ha demostrado una actividad entomopatógena por un mecanismo similar para L.
sphaericus. En este estudio se observó la presencia de cristales proteicos mediante las
tinciones realizadas.
Reportes anteriores mencionaron que esta especie de bacteria producen sideróforos
(Kadyan et al. 2013). Además de tener la capacidad de producir toxinas que provocan un
efecto entomopatógeno en contra de algunos insectos del orden Diptera, Lepidoptera y
Blattodea (Singh et al. 1999, Centinkaya et al. 2002, Nishiwaki et al. 2007). Este el primer
trabajo en evaluar la actividad entomopatógena de las bacterias B. thuringensis y L.
sphaericus sobre un insecto del orden Hemíptera en este caso particular sobre L. zonatus,
ya que hasta la fecha no existen reportes de trabajos realizados de bacterias
entomopatógenas contra hemípteros.
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En este trabajo se realizaron pruebas para determinar si las bacterias B. thuringiensis y L.
sphaericus presentan actividad entomopatógena sobre L. zonatus, ya que se ha
demostrado en diversos estudios para especies de insectos de diferente orden que estas
bacterias son capaces de producir toxinas en forma de cristal, por lo que se realizaron
cinéticas de crecimiento en medio específico para la producción de cristales y que tienen
efecto sobre especies de insectos de diversos ordenes tales como Lepidoptera, Diptera y
Coleoptera. Sin embargo, cabe mencionar que no hay una metodología establecida para
aplicaciones de bacterias entomopatógenas contra insectos hemípteros.
En la literatura no existen estudios que reporten el control de chinches mediante la
aplicación de Bacillus thuringiensis. Se considera que las chinches son insectos
chupadores que se alimentan con fluidos internos de los tejidos de las plantas por lo que
las proteínas insecticidas de B. thuringiensis no interaccionan con su tracto digestivo. Sin
embargo, recientemente se ha logrado expresar en plantas transgénicas de algodón, una
proteína insecticida de 35 kDa de B. thuringiensis la cual afecta la sobrevivencia y el
desarrollo de la chinche Lygus hesperus (Baum et al. 2012). Lo anterior significa que
pueden existir proteínas insecticidas contra chinches pero se tiene que investigar la
manera para que estas proteínas puedan interaccionar con el tracto digestivo de las
chinches.
Otra de las razones por las cuales no se obtuvo efecto podría ser porque la mayoría de
las bacterias entomopatógenas invaden a sus hospederos al ser ingeridas las esporas
proteicas tóxicas, éstas se insertan en las membranas del intestino medio, aumentando la
conductividad del potasio de las membranas apicales de las células columnares en donde
se lleva a cabo la ruptura de los gradientes eléctricos de potasio y aumentando el pH. En
la mayoría de los estudios sobre esta actividad entomopatógena de las bacterias han
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sido probadas sobre insectos con un tipo de metamorfosis completa u holometábola,
corroborándose su efectividad en la etapa larval. Sin embargo, el sistema digestivo de los
hemípteros es inusual entre los insectos en diferentes aspectos: ciertas enzimas
digestivas hidrolíticas, tales como la tripsina, están ausentes además de que el intestino
medio carece de membrana peritrófica. Estas características reflejan el tipo de dieta
líquida y el modo de alimentación por absorción sujeto a restricciones evolutivas y que se
ve reflejada en la diferencia de dieta, modo de alimentación, biología y bioquímica
digestiva de insectos masticadores de hojas y los hemípteros que se alimentan de fluidos
(Stockhoff y Conlan 2003). Por lo tanto es importante incursionar en trabajos posteriores
en buscar la forma de proporcionarles las bacterias a estos insectos de una manera
efectiva.
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7. CONCLUSIONES
Se establecieron las cinéticas y se determinaron las fases de crecimiento de las
bacterias rizosféricas B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus.
Las bacterias rizosféricas estudiadas inhibieron el crecimiento micelial de F.
verticillioides; el mayor efecto lo causaron B. subtilis, B. mojavensis y L.
sphaericus.
Todas las bacterias rizosféricas afectaron la morfología de las hifas de F.
verticillioides caracterizada por formas anormales, aparente ensanchamiento y
rugosidad.
Las bacterias rizosféricas presentaron actividad antagonista contra F. verticillioides
con independencia del medio de cultivo empleado y de las fases de crecimiento
probadas.
B. thuringiensis y L. sphaericus no afectaron la mortalidad ni el peso de L.
zonatus.
En general, las bacterias rizosféricas evidenciaron actividad antagonista contra F.
verticillioides y no tuvieron actividad entomopatógena contra L. zonatus.
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8. LITERATURA CITADA
Achten WM, Verchot JL, Franken YJ, Mathijs E, Singh VP, Aerts R, Muys B. 2008.
Jatropha bio-diesel production and use. Biomass and Bioenergy. 32:1063-