INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA INPA … · diferentes tipos de Águas amazÔnicas lucas caetano de barros manaus, amazonas abril, 2017 . ii lucas caetano de barros isolamento,

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

DIVISÃO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E

BIOLOGIA EVOLUTIVA – DIGEN

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E MAPEAMENTO CROMOSSÔMICO DE

ELEMENTOS REPETITIVOS EM ESPÉCIES DA FAMÍLIA ANOSTOMIDAE

(OSTARIOPHYSI – CHARACIFORMES): ANÁLISE COMPARATIVA EM

DIFERENTES TIPOS DE ÁGUAS AMAZÔNICAS

LUCAS CAETANO DE BARROS

Manaus, Amazonas

Abril, 2017

ii

LUCAS CAETANO DE BARROS

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E MAPEAMENTO CROMOSSÔMICO DE

ELEMENTOS REPETITIVOS EM ESPÉCIES DA FAMÍLIA ANOSTOMIDAE

(OSTARIOPHYSI – CHARACIFORMES): ANÁLISE COMPARATIVA EM

DIFERENTES TIPOS DE ÁGUAS AMAZÔNICAS

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra.

Manaus, Amazonas

Abril, 2017

Tese apresentada ao Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutor

em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva.

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FICHA CATALOGRÁFICA

B277 Barros, Lucas Caetano de

Isolamento, caracterização e mapeamento cromossômico de elementos

repetitivos em espécies da família Anostomidae (Ostariophysi –

Characiformes): análise comparativa em diferentes tipos de águas

amazônicas / Lucas Caetano de Barros, ---XX Manaus: [s.n.], 2017.

94 f.: il.

Tese (doutorado) --- INPA, Manaus, 2017.

Orientadora: Eliana Feldberg

Área de Concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Aracu. 2. Evolução genômica. 3. Mapeamento cromossômico.

I. Título.

CDD 597.48

Sinopse:

Espécies de Anostomidae, conhecidas popularmente como aracus, foram estudadas

mediante análises de citogenética clássica (coloração convencional, detecção da

heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo), molecular (hibridização

fluorescente in situ de DNA repetitivo em tandem e disperso) e microdissecção do

cromossomo W de M. trifasciatus. Os resultados revelaram que as sequências

repetitivas têm um papel importante na carioevolução das espécies, principalmente

na evolução do sistema de cromossomos sexuais em M. trifasciatus e na origem dos

múltiplos sítios de DNA ribossomal 18S.

Palavras-chave: Aracu, sequências repetitivas, microdissecção, FISH, mapeamento

cromossômico.

iv

v

Dedico esta tese aos meus queridos pais Almerindo Xavier e Maria do

Perpétuo, pelo amor, confiança e por nunca terem desistido de mim.

Especialmente à minha esposa Tarses e à minha filha Clara.

vi

A realização deste estudo foi possível devido:

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), à Divisão de curso de Pós-

graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (DIGEN) e ao laboratório de Genética

Animal (LGA).

Aos financiamentos fornecidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudo e pela taxa de bancada (processo

140177/2013-2), durante a realização deste estudo.

Aos financiamentos fornecidos pelo projeto INCT/CNPq/FAPEAM 573976/2008-2 -

Centro de Estudos de Adaptações da Biota Aquática da Amazônia – ADAPTA e pelo

Pronex/FAPEAM/CNPq 003/2009- Processo: 653:2009 - Genômica comparativa de peixes

amazônicos frente a diferentes desafios ambientais.

Ao MCT/CNPq/MEC/CAPES/FNDCT – Ação Transversal/FAPs No 47/2010 - Rede de

pesquisa para ampliação do conhecimento sobre a biodiversidade de vertebrados da Amazônia

brasileira com aplicações sobre seu uso e conservação – Rede BioPHAM.

À Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP), Instituto de

Biociências, Departamento de Biologia, campus de Rio Claro, representada pela Prof. Dra.

Patricia Pasquali Parise Maltempi.

Ao laboratório de Citogenética, em especial ao aluno Diovani Piscor, sediado na

Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP), Instituto de Biociências,

Departamento de Biologia, campus de Rio Claro, onde as análises de microdissecção foram

realizadas.

vii

“Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também

sonhar, não apenas planejar, mas também acreditar’’.

Anatole France

Sonhe sempre...

viii

Agradecimentos

E aqui estou novamente, como é gratificante encerrar mais uma etapa em nossa vida, mais

uma parte do caminho trilhado e mais uma vez a certeza de que, sem a ajuda de tantas pessoas,

nada seria possível!!!

Primeiramente gostaria de agradecer à minha esposa Tarses Cristina de Carvalho Teixeira

Barros, pela audácia em largar tudo para viver um sonho que antes era só meu, mas um sonho que

se tornou nosso. Obrigado pelo seu amor, amizade, compreensão ao longo desses anos, e claro,

pela absurda paciência comigo, por último, mas não menos importante, agradeço por ter me

propocionado a melhor sensação do mundo, a de ser pai da nossa linda princesa Clara, sem

dúvida, ela é nossa razão de viver. Muito obrigado!

Fundamentalmente, obrigado aos meus queridos pais, Almerindo Xavier e Maria do

Perpétuo. Encerro mais uma etapa de minha vida acadêmica graças à perseverança, cuidado e

dedicação de vocês, pelas renúncias aos seus sonhos para que, muitas vezes, eu pudesse realizar

os meus.

À minha orientadora Dra. Eliana Feldberg, por ter me propocionado conhecer a Amazônia,

a maior biodiversidade de fauma e flora do planeta, como Biólogo, sinto-me realizado. Sou grato

pelos ensinamentos, oportunidades e confiança. Tenha certeza que a senhora será lembrada

sempre com muito carinho por toda vida.

Aos colegas do Laboratório LGA, meus sinceros agradecimentos, obrigado pelas

conversas, pela troca de conhecimentos, e pelos momentos de pura diversão, certamente serão

lembrandos com muito carinho Ramon, Leila, Kaká, Eduardo, Milena, Marajó, Patrick, Arlindo,

Alber.

Ao povo do condomínio Morada do Sol (Vila do chaves) que fez meus dias mais alegres,

obrigado pela diversão e amizade.

Ao Programa DIGEN, sempre disponivel para resolver todas as solicitacoes.

Ao CNPq pela bolsa concedida.

A FAPEAM pela concessao no Programa Pro-excelencia.

A Deus por permitir que eu tenha chegado ao fim de mais uma jornada repleta de desafios.

Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuiram direta ou indiretamente para que este

trabalho fosse realizado e concluído.

Meu Muito Obrigado!!!

ix

Resumo

Anostomidae abriga cerca de 145 espécies, distribuidas em 13 gêneros, conhecidas, na

região Norte, como aracus e nas demais regiões do Brasil, como piaus. No presente trabalho

foram analisados 90 espécimes desta família, representando as espécies Megaleporinus

trifasciatus (antigo Leporinus trifasciatus), Leporinus fasciatus, L. friderici, L. agassizi,

Laemolyta taeniata, Anostomoides laticeps, Rhytiodus microlepis e Shizodon fasciatus, coletadas

em cinco locais na Amazônia, com o objetivo de identificar como as modificações

cromossômicas/genômicas podem estar relacionadas com diferentes condições ambientais, como

os diferentes tipos de água que são encontrados nesta região. Para isso foram utilizadas técnicas

da citogenética clássica (Giemsa, Ag-RON, Bandeamento C), citogenética molecular

(Hibridização in situ fluorescente - FISH, cross-FISH e microdissecção do cromossomo W de M.

trifasciatus). No geral, os resultados não revelaram padrões associados aos diferentes biótopos,

tanto na análise intra-específica quanto interespecífica. Com relação à estrutura cariotípica, todas

as espécies são conservativas em relação a vários marcadores cromossômicos convencionais,

porém, diferenças significativas foram encontradas na distribuição da heterocromatina e do par

portador da região organizadora de nucléolo. O DNAr 18S apresentou sítios múltiplos,

evidenciados em vários pares cromossômicos em algumas espécies, enquanto o DNAr 5S foi

localizado em um único par cromossômico em todas as espécies. A hibridização cruzada (cross-

FISH) com sondas de M. trifasciatus (WMt), M. elongatus (WMe) e M. macrocephalus

(WMm)(espécies já analisadas) revelou que os genomas de M. trifasciatus, M. macrocephalus

(espécies com sistema ZZ/ZW) e M. elongatus (espécie com sistema Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2)

apresentam alto grau de similaridade, tanto na estrutura quanto na localização dos sítios de

hibridização. Entretanto, a hibridização cruzada desta sonda, no genoma de espécies do gênero

Leporinus, que não apresentam sistema de cromossomo sexual diferenciado, mostrou baixa

similaridade. Esta informação é de grande importância, uma vez que o acúmulo de sequências

repetitivas nas regiões ricas em genes pode refletir a diferenciação entre proto-sexuais, em

diferenciação para o par heteromórfico ZW. Os resultados obtidos neste estudo mostram que as

sequências repetitivas realmente possuem papel atuante na carioevolução dos anostomídeos,

principalmente na evolução do sistema de cromossomos sexuais em M. trifasciatus, M. elongatus

e M. macrocephalus e na origem dos múltiplos sítios de DNA ribossomal 18S em Rhytiodus

microlepis, Laemolyta taeniata, Schizodon fasciatus e Megaleporinus trifasciatus.

x

Abstract

The Anostomidae are a fish family composed about 145 species distributed in 13 genera. The

family is known in the North of Brazil as aracus and in other regions as piaus. In the present work

90 specimens of this family were analyzed, representing the species Megaleporinus trifasciatus

(former Leporinus trifasciatus), Leporinus fasciatus, L. friderici, L. agassizi, Laemolyta taeniata,

Anostomoides laticeps, Rhytiodus microlepis and Shizodon fasciatus. The samples were collected

in five different locations in the Amazon region with the objective of identifying how

chromosomal / genomic modifications can be related to different environmental conditions, such

as the different types of water found in this region. For this, classical (Giemsa, Ag-RON,

Bandeamento C) and molecular (fluorescence in situ hybridization - FISH, cross-FISH and

microdissection of the W chromosome of M. trifasciatus) cytogenetics techniques were used.

Overall, the results did not reveal patterns associated with the different biotopes, both in intra-

specific and interspecific analysis. Regarding the karyotype structure, all species are conservative

in relation to several conventional chromosome markers, however, significant differences were

found in the distribution of the heterochromatin and the carrier pair of the nucleolus organizer

region. 18S rDNA showed multiple sites, evidenced in several chromosome pairs in some species,

whereas 5S rDNA was located in a single chromosome pair in all species. Cross-hybridization

with M. trifasciatus (WMt), M. elongatus (WMe) and M. macrocephalus (WMm) probes (species

already analyzed) revealed that the genomes of M. trifasciatus, M. macrocephalus (With ZZ / ZW

system) and M. elongatus (species with system Z1Z1Z2Z2 / Z1W1Z2W2) present a high degree

of similarity both in the structure and in the location of the hybridization sites. However, cross-

hybridization of this probe in the genome of species of the genus Leporinus, which do not present

a differentiated sex chromosome system, showed low similarity. This information is of great

importance, since the accumulation of repetitive sequences in the gene rich regions may reflect the

differentiation between proto-sexual, in contrast with the heteromorphic pair ZW. The results

obtained in this study show that the repetitive sequences actually play an active role in the

anostomide carioevolution, especially in the evolution of the sex chromosome system in M.

trifasciatus, M. elongatus and M. macrocephalus and in the origin of the multiple sites of 18S

ribosomal DNA in Rhytiodus microlepis, Laemolyta taeniata, Schizodon fasciatus and

Megaleporinus trifasciatus.

xi

SUMÁRIO

1. Introdução Geral..............................................................................................................................1

1.1 Bacia amazônica e a influência dos tipos de água na ictiofauna......................................................1

1.2 Família Anostomidae........................................................................................................................3

2. Objetivos..........................................................................................................................................11

2.1 Objetivo geral.................................................................................................................................11

2.2 Objetivos específicos......................................................................................................................11

3. Material e Métodos.........................................................................................................................12

3.1 Material...........................................................................................................................................12

3.2 Métodos..........................................................................................................................................17

3.2.1 Indução de Mitoses......................................................................................................................17

3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos..........................................................................................17

3.2.3 Caracterização das Regiões Organizadors de Nucléolo (Ag-RON)............................................18

3.2.4 Caracterização do padrão heterocromático (Bandamento C)......................................................18

3.2.5 Extração de DNA........................................................................................................................18

3.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction)...........................19

3.2.7 Microdissecção cromossômica e amplificação de DNA.............................................................20

3.2.8 Hibridização Fluorescente in situ (FISH) – Microdissecção.......................................................21

3.2.9 Hibridização Fluorescente in situ (FISH)....................................................................................21

3.2.10 Tratamento das lâminas.............................................................................................................22

3.2.10.1 Solução de hibridação.............................................................................................................23

3.2.10.2 Hibridação.............................................................................................................................23

3.2.10.3 Lavagens.................................................................................................................................23

3.2.10.4 Detecção.................................................................................................................................23

3.2.10.5 Montagem das lâminas...........................................................................................................24

3.2.10.6 Análise dos Resultados...........................................................................................................24

4. Resultados e Discussão...................................................................................................................25

xii

4.1 Artigo I - Mapeamento de genes ribossômicos 45S e 5S em cromossomos de espécies de peixes

Anostomidae (Ostariophysi, Characiformes) de diferentes tipos de água da Amazônia. (2015)

Hydrobiologia.......................................................................................................................................26

4.1.1Resumo…………………………………………………...……………………………………..28

4.1.2Introdução……………………………………………………………...……………...……...…29

4.1.3 Material e Métodos………………………………………………...…………………………...31

4.1.4 Resultados…………………………………………………………………...……………..…...35

4.1.5 Discussão……………………………………………………………………………...……..…41

4.2 - Artigo II - Microdissecção cromossômica e análises evolutivas dos cromossomos sexuais em

espécies de Megaleporinus (Teleostei, Characiformes).......................................................................46

4.2.1Resumo……………………………………………………...…………………………..……....47

4.2.2Introdução…………………………………………………………………...………...………...48

4.2.3Material e Métodos………………………………………………………………………..…….50

4.2.4 Resultados……………………………………………………………………………..…...…...51

4.2.5 Discussão……………………………………………………………………………….....…....56

4.3 - Artigo III - Mapeamento cromossômico de elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3 em oito

espécies da Família Anostomidae (Characiformes), e sua interação entre os segmentos

heterocromáticos e o cromossomo sexual W em espécies Amazômicas……………………….……60

4.3.1Resumo…………………………………………………………………...……………..………61

4.3.2Introdução………………………………………………………………………....………….....62

4.3.3 Material e Métodos……………………………………………………………………….....….64

4.3.4 Resultados………………………………………………………………………….........……...65

4.3.5 Discussão………………………………………………………………………………...…..…74

5. Conclusão………………………………………….…………………………………………..….70

6. Perspectivas ……………………………………………………………………………………....80

7. Referências Bibliográficas……………………………………………………………………….81

xiii

Lista de figuras

Introdução

Figura 1: Mapa indicando os locais onde serão realizadas as coletas............................................13

Figura 2: Espécimes de Leporinus e Megaleporinus: a) M. trifasciatus; b) L. fasciatus; c) L.

friderici; d) L. agassizi. A barra representa

3cm……………………………………………………………....………………………………...15

Figura 3: Espécimes de: a) Laemolyta taeniata; b) Anostomoides laticeps; c) Rhytiodus

microlepis; d) Schizodon fasciatus. A barra representa

3cm………………………………………………………………………………..…………….…16

Capítulo 1

Figura 1: Mapa mostrando os locais de coleta para as espécies de Anostomidae deste estudo.....33

Figura 2: Cariótipo das sete espécies de Anostomidae analisadas por bandamento C e RON......36

Figura 3: Cariótipo das sete espécies de Anostomidae analisadas por double FISH com sonda de

DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) e contra-coradas com DAPI........................................38

Figura 4: Metafase das sete espécies de Anostomidae analisadas por FISH com sonda telomérica

e contrastadas com DAPI.................................................................................................................40

Capítulo 2

Figura 1: Metafase de Megaleporinus trifasciatus (macho e fêmea) analisadas por FISH com

sonda W de M. trifasciatus (WMt) a-b, M. macrocephalus (WMm) c-d, e M. elongatus (WMe) e-

f, contrastadas com DAPI................................................................................................................53

xiv

Figura 2: Metafase de três espécies do gênero Leporinus e uma do gênero Prochilodus

analisadas por FISH com sonda W de M. trifasciatus (WMt) a-b-c-d-e-f-g-h, e sonda W de M.

macrocephalus (WMm) g-h, contrastadas com DAPI....................................................................55

Capítulo 3

Figura. 1 Metafase de Megaleporinus trifasciatus (a-b Catalão), L. fasciatus (c: rio Tapajós, d:

rio Negro, e: rio Uatumã, f: rio Purus), L. friderici (g: rio Tapajós, h: rio Purus), e L. uatumaensis

(i: rio Uatumã) analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com

DAPI................................................................................................................................................67

Figura. 2 Metafase de Leporinus. friderici (g: rio Tapajós, h: rio Purus), e L. uatumaensis (i: rio

Uatumã) analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com DAPI......................................................68

Figura. 3 Metafase de Anostomoides laticeps (a: rio Uatumã, b: rio Negro), S. fasciatus (c:

Catalão, d: rio Uatumã), Laemolyta taeniata (e: rio Uatumã e rio Negro) e R. microlepis (f

Catalão), analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com

DAPI................................................................................................................................................69


rio Negro, e: rio Uatumã, f: rio Purus), analisadas por sonda Rex3 e contrastadas com

DAPI................................................................................................................................................71

Figura. 5 Metafase de L. friderici (a: rio Tapajós, b: rio Purus) e L. uatumaensis (c: rio Uatumã),

analisadas por sonda Rex3 e contrastadas com DAPI.....................................................................72



Catalão), analisadas por sonda Rex3 e contrastadas com

DAPI................................................................................................................................................73

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Dados citogenéticos para família Anostomidae.............................................................08

Tabela 2: Relação das espécies analizadas neste estudo e número de indivíduos por local de

coleta………………………………………………………………………………………………14

Tabela 3: Primers para amplicação de DNA ribossomal nuclear para mapeamento em

cromossomos metafásicos................................................................................................................20

Capítulo 1

Tabela 1: Nome das espécies, locais de coleta, coordenadas geográficas, número de espécimes

utilizados na citogenética molecular e número de tombo............................................................... 34

1

1. Introdução

1.1. Bacia amazônica e a influência dos tipos de água na ictiofauna

A Amazônia apresenta a maior bacia hidrográfica do mundo, constituída por um

complexo sistema de drenagem, formado por cerca de sete mil tributários que deságuam no

Solimões-Amazonas, drenam sete países, correspondendo a quase 40% da América do Sul, com

uma área de aproximadamente 7.000.000 km² (Goulding et al. 2003). Os elevados índices de

chuva (2.200mm/ano) e a grande extensão de terras baixas são os fatores determinantes para que

300.000 km2

de margens, equivalente à 6% da Amazônia brasileira, sejam alagadas anualmente,

contribuindo para a heterogeneidade dos ambientes amazônicos (Goulding et al. 2003; Meirelles

Filho 2004).

Toda esta complexidade de habitats, junto com características geológicas, físicas,

químicas e biológicas contribuem para a inexistência de ambientes idênticos dentro desta bacia

(Val e Almeida-Val 1995). As diferenças dos rios amazônicos não se resumem apenas na

morfologia de seus cursos, mas também nas características físico-químicas de suas águas. Com

base nestes fatores, as águas amazônicas foram classificadas em "brancas", "pretas" e "claras"

(Sioli 1950). A idade geológica da calha do rio determina a sua coloração. As de formações

geologicas mais recentes, como os Andes, sao “brancas” (barrentas), as que vem de formacoes

mais antigas podem ser “escuras” ou “verde-azuladas” (Meirelles Filho 2004).

As águas brancas apresentam-se turvas, com coloração barrenta e baixa transparência, em

razão de carrearem uma grande quantidade de sedimentos resultantes dos processos de erosão da

Cordilheira dos Andes. Estes sedimentos conferem à água uma composição química rica em sais

minerais, com pH quase sempre próximo ao neutro (6, 5 a 7) e condutividade alta (Junk et al.

2011).

As águas pretas recebem este nome devido à coloração escura que suas águas possuem

quando em grande volume. A cor escura é devida à grande concentração de ácidos húmicos e

fúlvicos que se originam da decomposição incompleta, em condições de acidez, da matéria

orgânica das florestas que circundam os rios e dos processos edáficos existentes nos solos

amazônicos. Ainda não são conhecidos os fatores que causam a produção destes ácidos. A acidez

(pH entre 3,0 e 5,0) se deve à ausência de cálcio/magnésio e à pobreza de sais minerais (Junk et

al. 2011).

2

As águas claras que, como o próprio nome diz, apresentam maior transparência com

coloração verde claro. Apesar de possuírem certa heterogeneidade nos padrões físico-químicos

seu pH varia, de maneira geral, entre 4,5 e 7,0 e sua condutividade é relativamente baixa (Junk e

Piedade 2011).

Além dos diferentes tipos de água, a biota é adaptada aos pulsos de inundação, sendo este

o principal fator responsável pela existência, produtividade e interação da mesma que vive nas

áreas periodicamente alagadas (Junk e Furch 1993; Junk e Piedade 2011). Neste período, têm-se

dois ambientes distintos, decorrentes do tipo de água. As florestas alagadas por água branca,

ricas em sedimentos e nutrientes, conhecidas como várzea. Já, as florestas alagadas por água

preta, rica em ácidos húmicos e pobre em nutrientes, são conhecidas como igapós. Em ambos

ambientes ocorre alta diversidade de peixes, entretanto diferem em sua composição (Junk et al.

1997; Parolin et al. 2004).

Esta supressão de ambientes rompe a conectividade, confinando e isolando organismos

de muitas espécies (Worbes 1997). Os organismos aquáticos confinados a este ambiente

respondem diretamente às alterações na composição físico-química do meio. Os peixes

amazônicos desenvolveram um avançado conjunto de habilidades para manter a homeostase

orgânica quando expostos a diversas condições ambientais desfavoráveis, seja de origem natural

ou artificial (Slobodkin e Rapoport 1974).

As estratégias adaptativas desenvolvidas frente à pressão seletiva do ambiente pode ter

ajudado no processo de especiação dos peixes amazônicos, bem como nos diferentes padrões de

plasticidade que algumas espécies exibem (Wilkelski e Cooke 2006).

Um processo muito importante para os peixes na região amazômica é chamado de

migrações laterais, onde muitas espécies de peixes são submetidas a constantes mudanças físico-

químicas da água. Os peixes deixam os rios de água clara e preta com destino aos rios de água

branca (Goulding 1980). Posteriormente, retornam ao seu habitat original. Todavia, também

ocorrem desovas nos rios de águas consideradas pobres, como é o caso do rio Negro (Oliveira

2003). Esta alternância de ambientes permite que a ictiofauna seja exposta a diferentes níveis de

pH, concentrações de oxigênio dissolvido e outros fatores que divergem entre os diferentes tipos

de águas amazônicas. Desta forma, as espécies desenvolvem estratégias para vencer as

adversidades a que são submetidas. Porém, os processos que conferem esta adaptabilidade aos

peixes amazônicos ainda não estão elucidados.

3

1.2. Família Anostomidae

Anostomidae pertence à ordem Characiformes e é considerada uma das famílias mais

ricas em número de espécies de peixes Neotropicais, com 145 espécies válidas, distribuídas em

13 gêneros (Eschmeyer e Fong 2015; Ramirez et al. 2017), dos quais, 11 são endêmicos da

América do Sul, com representantes em todas as bacias hidrográficas brasileiras. Na região norte

são conhecidas popularmente como aracus e nas demais regiões do Brasil, como piaus (Géry

1977). Todos os gêneros de anostomídeos comportam duas ou mais espécies, exceto

Gnathodolus e Sinaptolaemus (monotípicos), e Leporinus que é o mais diversificado da família,

com cerca de 90 espécies (Garavello e Britski 2003; Fricke e Eschmeyer 2013), mesmo passando

por uma reclassificação taxonômica, dando origem ao gênero Megaleporinus, Leporinus

continua sendo o mais diversificado da família, agora com cerca de 80 espécies (Ramirez et al.

2017).

Esses peixes se distribuem pelas Américas Central e do Sul, sendo que na bacia

amazônica ocorre a sua maior diversidade (Santos e Zuanon 2008) e nos rios costeiros isolados

das Guianas, bacia do São Francisco e demais rios do litoral do nordeste do Brasil são menos

representados (Garavello e Britski 2003).

De todas as espécies, L. friderici (Bloch 1794) é a mais amplamente distribuída,

ocorrendo em quase todas as principais bacias hidrográficas da América do Sul (Albrecht e

Caramaschi 2003). Várias espécies, como L. macrocephalus, L. obtusidens e L. elongatus

representam um importante recurso pesqueiro para muitas comunidades sul-americanas (Martins

et al. 2003), hoje pertencem ao gênero Megaleporinus, com os nomes M. macrocephalus, M.

obtusidens e M. elongatus (Ramirez et al. 2017).

Os anostomídeos ocupam uma grande variedade de habitats e biótopos aquáticos,

incluindo lagos, corredeiras, áreas marginais dos grandes rios e córregos de floresta. Algumas

espécies, contudo, parecem ocorrer exclusivamente ou predominantemente em ambientes de

água branca, preta ou clara na bacia amazônica (Santos e Zuanon 2008).

A posição da boca é variável e muitas espécies desta família são conhecidas por se

alimentarem em posição inclinada (Géry 1977), por exemplo, L. friderici e L. elongatus (atual M.

elongatus) (Balassa et al. 2004). Adicionalmente, algumas espécies dos gêneros Leporinus e

Schizodon são conhecidas por fazerem migrações de desova tanto no sistema Paraná-Paraguai

(Godoy 1975) como no Amazonas e Orinoco (Goulding 1980).

4

As relações entre a família Anostomidae com outros Characiformes foram parcialmente

examinadas (Winterbotton 1980; Vari 1983). Estudos comparativos entre Anostomidae,

Chilodontidae, Prochilodontidae e Curimatidae sugerem que essas quatro famílias formam um

grupo monofilético denominado Anostomoidea, onde Anostomidae e Chilodontidae formam um

clado e Curimatidae e Prochilodontidae formam um segundo clado. Anostomidae e

Chilodontidae são unidas por 15 sinapomorfias (Vari 1983). Outras relações filogenéticas são

propostas, onde Ortí e Meyer (1997) consideram Anostomidae como grupo irmão de

Chilodontidae + Crenuchidae, enquanto Calcagnotto et al. (2005) a consideram como grupo

irmão de Prochilodontidae + Chilodontidae.

Ainda existem grandes lacunas de conhecimento básico, pois extensas áreas da bacia

amazônica ainda não foram sequer amostradas (Santos e Jégu 1996). Inventários feitos nos rios

da Amazônia, como Tocantins (Santos e Jégu 1989), Jamari (Santos 1991), Trombetas (Ferreira

1992) e Uatumã (Santos e Jégu 1996) indicam que o número médio de espécies de anostomídeos,

em cada um destes rios, oscila em torno de vinte, no entanto, com grande diferenciação quanto à

sua composição específica: entre os rios Tocantins e Uatumã, por exemplo, apenas sete espécies

foram comuns e entre o Uatumã e Jamari, apenas 12 (Santos e Jégu 1996).

Estes dados mostram que apesar da bacia amazônica ser formada por um sistema

hidrográfico contínuo, ela, na verdade, é formada por sub-bacias que encerram uma ictiofauna

diferenciada e com alto grau de endemismo. Esta distribuição descontínua e em forma de

mosaico dos anostomídeos pode estar associada tanto às diferentes características limnológicas

observadas entre os rios de água preta, branca ou clara (Sioli 1968; Junk e Piedade 2011), como

a eventos vicariantes ocorridos no passado, principalmente aqueles relacionados às glaciações e

que provocaram uma variação do nível do mar, com o consequente isolamento de populações,

submetidas a um intenso processo de especiação (Haffer 1982; Renno et al. 1990).

Os estudos citogenéticos em anostomídeos vêm sendo realizados desde a década de 70,

quando foram determinados o conteúdo de DNA e o número haploide (n=27) de Leporinus

striatus e de Anostomus anostomus (Hinegardner e Rosen 1972), e o 2n=54 para A. anostomus e

L. fasciatus (Ojima et al. 1976). Na década de 80, alguns citogeneticistas já concluiram que

tratava-se de um grupo de peixes estável sob o ponto de vista cariotípico, não ocorrendo variação

no número diploide de 54 cromossomos e no número fundamental de 108, com todos os

cromossomos do tipo metacêntrico (m) e submetacêntrico (sm) (Galetti et al. 1981a; 1984).

5

Na compilação dos dados cromossômicos de Anostomidae (Tabela 1) verifica-se que já

foi determinado o número diploide de 39 espécies em oito gêneros e esta estabilidade é

confirmada. Em relação à região organizadora do nucléolo (RON) a maioria das espécies

apresentou RON simples, entretanto sua posição no cariótipo tem se mostrado um bom marcador

espécie-específico, uma vez que, para cada espécie este marcador se encontra em um par

cromossômico diferente (Galetti et al. 1984). RONs múltiplas foram encontradas em L.

trifasciatus e L. friderici coletadas no rio Madeira e rio Paraná, respectivamente (Galetti et al.

1995b).

Entretanto, apesar da grande estabilidade cariotípica da família Anostomidae, diferentes

padrões de heterocromatina (Artoni et al. 1999) e cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW (Venere

et al. 2004) foram detectados. Também há relatos da ocorrência de cromossomos

supranumerários acrocêntricos e completamente heterocromáticos nas espécies L. friderici e

Leporinus sp. coletadas na bacia do rio Araguaia (Venere et al. 1999). Os padrões diferenciados

de heterocromatina provavelmente decorreram de inversões e/ou transposições (Galetti et al.

1991b).

Em relação ao heteromorfismo cromossômico sexual entre os anostomídeos, o sistema do

tipo ZZ/ZW já foi observado em sete espécies de Leporinus (hoje Megaleporinus) (L. elongatus,

hoje M. elongatus, L. obtusidens, hoje M. obtusidens, L. reinhardti, hoje M. reinhardti, L.

macrocephalus, hoje M. macrocephalus, L. trifasciatus, hoje M. trifasciatus, L. conirostris, hoje

M. conirostris e Leporinus sp2, hoje L. multimaculatus,), onde se notou íntima relação dos

cromossomos sexuais com heterocromatina constitutiva, sendo determinante para a diferenciação

do cromossomo W (Galetti e Foresti 1986). Estudos realizados em L. trifasciatus (hoje M.

trifasciatus) e Leporinus sp2 (hoje L. multimaculatus) do rio Araguaia demonstraram que os

cromossomos Z e W de Leporinus sp2 foram diferentes em sua morfologia e padrão de bandas,

quando comparados aos sexuais das demais espécies desse gênero (Venere et al. 2004).

Mapeamento do cromossomo W em espécies do gênero Leporinus (hoje apenas L.

friderici não passou para Megaleporinus), utilizando sequência de DNA altamente repetitivo

(LeSpe I), mostrou padrão de sinais diferenciados entre machos e fêmeas nas espécies com

cromossomos sexuais heteromórficos (L. elongatus, L. macrocephalus, L. obtusidens e L.

friderici), o que sugere que esta sequência seja relacionada com a diferenciação destes

cromossomos neste gênero (Marreta et al. 2012).

6

Já, a pintura cromossômica realizada a partir da sonda do W microdissectado,

comparando espécies de anostomídeos com e sem sistema de cromossomos sexual diferenciado

mostrou completa marcação em todos os cromossomos W nas fêmeas, e quase todos os

cromossomos Z nos machos, sugerindo uma origem comum dos cromossomos sexuais para as

três espécies (L. elongatus, L. macrocephalus e L. obtusidens). Entretanto, os autores acreditam

que este sistema de cromossomos em L. elongatus encontra-se em um estágio evolutivo

diferenciado em relação às demais espécies analisadas, uma vez que, sequências repetitivas

compartilhadas entre as espécies que possuem cromossomos sexuais Z e W, não são

compartilhadas nos cromossomos Z de L. elongatus. Por outro lado, nas espécies que não

apresentam este tipo de sistema sexual (L. friderici, L. striatus, L. lacustris, Schizodon borelii e

S. isognathus) não foi evidenciada nenhuma marcação (Parise-Maltempi et al. 2013).

Estudos que envolvem a organização genômica de sequências de DNA repetitivo LeSpe I

e LeSpe II foram realizados em oito espécies da família Anostomidae (L. elongatus, L.

macrocephalus, L. obtusidens, L. striatus, L. lacustris, L. friderici, Schizodon borellii e S.

isognathus). O elemento repetitivo LeSpe II foi encontrado em todas as espécies, independente

de apresentarem ou não cromossomos sexuais, sendo algumas destas regiões repetitivas ausentes

nas fêmeas de L. elongatus. Já, o elemento repetitivo LeSpe I produziu sinais positivos apenas

em L. elongatus, L. macrocephalus e L. obtusidens, ou seja, espécies que possuem cromossomos

sexuais diferenciados, sendo provavelmente responsável pela recente origem de um sistema de

cromossomo sexual múltiplo Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2 em L. elongatus (Parise-Maltempi et al. 2007;

Silva et al. 2012).

Estudo semelhante, utilizando sequências repetitivas nomeadas LeSma I, nas mesmas

espécies de anostomídeos citadas acima, com acréscimo da espécie Abramites hypselonotus,

detectou sinais que foram únicos para L. elongatus. Análise com Double-FISH, usando LeSma I

e DNAr 18S, mostrou co-localização com uma região organizadora do nucléolo (RON) em

machos e fêmeas de L. elongatus. Devido ao padrão de distribuição observado (dois sinais no

braço longo e um no braço curto em um par, e outro par, apresentando apenas um cluster no

braço curto) em L. elongatus, os autores comprovaram o sistema de cromossomos sexuais

múltiplos Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2. Assim, foi destacado o papel de DNA repetitivo, associado com

a RON, na diversificação de cariótipos das espécies pertencentes à família Anostomidae (Silva et

al. 2013).

7

Martins e Galetti (2001a), a partir de diferentes estudos em espécies de Leporinus,

demonstraram que locos situados em diferentes cromossomos do complemento possuíam

unidades repetitivas distintas de DNAr 5S, as quais representam dois tipos de arranjos

monoméricos: um menor, com monômeros de 200 pb, e outro maior, com monômeros de 900 pb.

Estas matrizes de DNAr 5S foram caracterizadas por sequências NTS distintas

(designadas NTS-I e NTS-II para os monómeros de 200 e 900 pb, respectivamente), contudo, as

suas sequências de codificação foram quase idênticas. Os genes RNAr 5S foram agrupados em

dois loci cromossômicos, um maior correspondente aos sítios NTS-I e um menor correspondente

aos sítios NTS-II. A sequência de NTS-I foi variável entre Leporinus spp., enquanto o NTS-II foi

conservado entre eles e até mesmo no gênero Schizodon. As diferentes matrizes de DNAr 5S

podem caracterizar duas subfamílias de genes RNAr 5S que têm evoluído independentemente no

genoma (Martins e Galetti 1999; 2000; 2001a).

Os NTS têm provado ser dinâmicos, provocando diferenças entre as espécies

relacionadas e até mesmo para o mesmo indivíduo. A alta variabilidade genética dos NTS apoia

seu uso como um marcador genético para estudos de populações que tem eventos recentes de

vicariância (Cronn et al. 1996; Ferreira et al. 2007).

Desta forma, a utilização de elementos repetitivos no mapeamento físico cromossômico

em espécies da família Anostomidae da bacia amazômica pode fornecer informações valiosas

para a compreensão evolutiva e estrutural destas sequências, bem como a identificação de

rearranjos, proporcionando uma melhor visão do genoma de suas espécies, do modo como este

genoma está organizado e como a sua evolução teria ocorrido. De fato, das cerca de 80 espécies

de anostomídeos descritas para a bacia amazômica, pouco se sabe a respeito da parte

genética/molecular, e as relações intra e interespecíficas, quando existentes resume-se quase

sempre, em número diploide e fórmula cariotípica, não ocorrendo a integração destes dados com

a parte filogeográfica, nem sua publicação em periódicos.

É notório que os anostomídeos constituem um grupo de grande interesse para ser

estudado na região amazômica, tanto do ponto de vista genético-evolutivo, como no sentido de

auxiliar os estudos sistemáticos do grupo, tendo em vista a grande diversidade de espécies e

ampla distribuição geográfica (Krichanã 1999) (Tabela 1).

8

Tabela. 1 Dados citogenéticos disponíveis na literatura para a família Anostomidae. n= número haploide, 2n= número diploide, fFC= fórmula

cariotípica, m= metacêntrico, sm= submetacêntrico, st= subtelocêntrico, RON= região organizadora de nucléolo, H. sexual= heteromorfismo sexual.

Espécie n 2n FC RO

N H. sexual Local Referências

Abramites hypselonotus 27 54 Amazônia Scheel 1973

Abramites hypselonotus 54 30m+ 22sm+2st Argentina Oliveira et al.1988; Fenocchio et

al. 2003 Abramites hypselonotus 54 54 m/sm 2 Tocantins/Araguaia/A

M

Martins et al. 2000

Anostomus anostomus 27 54 54 m/sm America do Sul Scheel 1973; Ojima et al. 1976

Anostomus anostomus 54 54 m/sm Amazônia Hinegardner e Rosen 1972

Anostomus anostomus 54 54 m/sm Amazônia Ojima et al. 1976

Anostomus anostomus 54 m/sm Aquarista/AM Cestari et al. 1990

Anostomus ternetzi 54 54 m/sm 2 Tocantins/Araguaia/A

M

Scheel 1973; Martins et al. 2000b

Laemolyta petiti 54 54 m/sm Rio Araguaia/MT Venere 1998

Laemolya taeniata 54 54 m/sm Rio Pitinga/AM Cabral et al. 1995

Leporellus vittatus 54 30m+ 24sm 2 Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981a

Leporinus acutidens 54 28m+26sm Argentina Fenocchio et al. 2003

Leporinus affinis 54 54 m/sm Amazônia Porto et al. 1992

Leporinus affinis 54 54 m/sm Tucuruí/PA Venere 1998

Leporinus amblyrhinchus 54 54 m/sm Três Marias/MG Venere e Galetti 1986b

Leporinus brunneus 54 54 m/sm Porto Velho/RO Venere e Galetti 1986a

Megaleporinus conirostris

(Antigo Leporinus conirostris)

54 52 m/sm 1st+

1st

2 Sáo Paulo Ramirez et al. 2017

Galetti et al. 1995a

Leporinus copelandii 54 26m+ 28sm Rio Ribeita/SP Galetti et al. 1984; Bertollo et al.

1986 Leporinus cylindriformes 54 54 m/sm Porto Velho/RO Venere e Galetti 1986b

Leporinus cylindriformes 54 26m+ 28sm Alto Paraguai/MT Arefjev 1990

Leporinus cylindriformes 54 54 m/sm Rio Pitinga/AM Cabral et al. 1995

Leporinus desmotes 54 54 m/sm 2 Tocantins Margarido e Galetti 2000

Megaleporinus elongatus

(Antigo Leporinus elongatus)

54 26m+ 27sm+ 1st Rio Mogi- Guaçu/SP Ramirez et al. 2017

Galetti et al. 1981b


Leporinus elongatus

54 53m+ 1st 2 ZZ/ZW São Paulo Ramirez et al. 2017

Molina et al. 1998

9

(Antigo Leporinus elongatus) 54 25m+28sm+ 1st 2 ZZ/ZW Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981b


(Antigo Leporinus elongatus)

54 54 m/sm 2 Z1Z1Z2Z2/Z1W

1Z2W2 Rio Mogi- Guaçu/SP Ramirez et al. 2017

Parise-Maltempi et al. 2007

Leporinus fasciatus 54 54 m/sm Rio Pitinga/AM Valentim et al.1996

Leporinus fasciatus 54 54 m/sm Rio Pitinga/AM Cabral et al. 1995

Leporinus friderici 54 32m+ 22sm 2 Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981a

Leporinus friderici 54 54 m/sm Rio Madeira/RO Galetti et al. 1991a; 1995b

Leporinus friderici 54 54 m/sm 1-5 Koehler et al. 1997

Leporinus granti 54 54 m/sm Rio Pitinga/AM Cabral et al. 1995

Leporinus aff. holostictus 27 54 m/sm Scheel 1973

Leporinus lacustris 54 30m+ 24sm ZZ/ZW Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981b

Megaleporinus macrocephalus

(Antigo Leporinus macrocephalus)

54 32m+ 21sm+ 1st 2 Rio São Francisco Ramirez et al. 2017

Galetti e Foresti 1987



54 54 m/sm ZZ/ZW Rio Miranda/MS Ramirez et al. 2017

Galetti 1984



54 54 m/sm ZZ/ZW Rio Miranda/MS Ramirez et al. 2017


Leporinus aff. lacustris 27 54 54 m/sm Amazônia Scheel 1973

Leporinus aff. maculatus 27 54 54 m/sm Amazônia Scheel 1973

Leporinus aff. maculatus 54 54 m/sm Médio Araguaia/MS Venere e Galetti 1996

Leporinus obtusidens 27 25m+ 28sm+ 1st 2 ZZ/ZW Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981a

Leporinus octofasciatus 54 32m+ 22sm Re Lobo/SP Galetti et al. 1981a

Leporinus ortomaculatus 54 54 m/sm Porto Velho/RO Venere e Galetti 1986a

Leporinus ortomaculatus 54 54 m/sm Cuiabá/MT Venere e Galetti 1986a

Leporinus ortomaculatus 54 54 m/sm Pocone/MT Venere e Galetti 1986a

Leporinus piau 54 32m+ 22sm Três Maria São

Francisco

Galetti et al. 1984

Megaleporinus striatus

Leporinus reinhardti

54 32m+ 21sm+ 1st ZZ/ZW Rio São Francisco Ramirez et al. 2017


10

(Antigo Leporinus striatus) 27 Rio Mogi- Guaçu/SP Hinegardner e Rosen 1972

Leporinus striatus 54 28m+ 26sm Rio Mogi- Guaçu/SP Galetti et al. 1981a

Leporinus taeniatus 54 34m+ 20sm Rio São Francisco/MG Galetti et al. 1984

Megaleporinus trifasciatus

Leporinus trifasciatus

54 53m+ sm+1st 2-5 ZZ/ZW Rodônia/RO Ramirez et al. 2017

Galetti et al. 1995a



54 22m+31sm+ 1st ZZ/ZW Rio Araguaia/AM Ramirez et al. 2017

Venere et al. 2004

Leporinus sp. 54 32m+ 21sm+1st ZZ/ZW Rio Miranda/MS Galetti e Foresti 1987

Pseudanos trimaculatus 54 54 m/sm 2 Tocantins/Araguaia/A

M

Martins et al. 2000b

Rhytiodus microlepis 54 54 m/sm Manaus/AM Bertollo et al. 1980

Rhytiodus microlepis 54 Rio Negro/AM Cabral et al. 1995

Rhytiodus microlepis 54 54 m/sm Lago Catalão/AM Cabral et al. 1995

Schizodon borelli 54 32m+22sm 2 Águas São Pedro/SP Galetti et al. 1984

Schizodon fasciatus 54 54 m/sm Rio Madeira/RO Venere e Galetti 1986b

Schizodon fasciatus 54 38m+15sm Lago Catalão/AM Valentim et al.1996

Schizodon fasciatus 54 54 m/sm Rio Solimões/AM Mestriner e Galetti 1987

Schizodon fasciatus 54 54 m/sm Rio Paraguai/MS Mestriner e Galetti 1987

Schizodon fasciatus 54 54 m/sm Amazônia Galetti et al. 1991b

Schizodon knerii 54 28m+ 26sm 2 Três Marias/MG Galetti et al. 1984

Schizodon nasutus 54 32m+ 22sm 2 Rio Mogi-Guaçu/SP Galetti et al. 1981a

Schizodon nasutus 54 32+22sm 2 Argentina Pastori et al. 1997

Schizodon platae 54 54 m/sm Argentina Fenocchio et al. 2003 Schizodon vittatus 54 54 m/sm 2 Mato Grosso/MT Martins e Galetti 1997

11

2. Objetivos

2.1.1. Objetivo geral

Identificar, em distintas espécies pertencentes à família Anostomidae, como as

modificações cromossômicas/genômicas podem estar relacionadas às diferentes condições

ambientais, fornecidas por distintos tipos de água na Amazônia.

2.1.2. Objetivos específicos

Estabelecer o padrão de localização física cromossômica de elementos repetitivos (DNAr

5S, 18S e Rex 1, 3, 6, telômero) em anostomídeos de diferentes tipos de águas, para verificar

possíveis correlações entre alterações na localização física cromossômica dos elementos

repetitivos e os diferentes habitats.

Inferir sobre possíveis eventos, que tenham levado à diferenciação do sistema sexual

ZZ/ZW em algumas espécies de Megaleporinus (Megaleporinus trifasciatus), por meio da sonda

do W microdissectado.

Comparar o mapeamento cromossômico das sequências repetitivas isoladas nas

diferentes espécies.

12

3. Material e Métodos

3.1. Material

No presente trabalho foram analisados 90 indivíduos de anostomídeos, coletados em

diferentes pontos da bacia amazônica, incluindo diferentes tipos de águas (Figura 1, 2, 3 e Tabela

2).

Figura 1. Mapa indicando os locais, onde foram realizadas as coletas.

13

Tabela 2: Relação das espécies analisadas, local de coleta e tipo da água, número de indivíduos por local de coleta e número do Voucher.

Espécie Local de Coleta/Tipo de água Coordenadas Número de indivíduos

Machos Fêmeas

VOUCHER da coleção


Rhytiodus microlepis

Schizodon fasciatus

Lago Catalão (confluência rios

Negro/Solimões)

Água misturada

3°08'49,7"S 59°54'04,7"W

INPA-ICT 053210

INPA-ICT 053211

INPA-ICT 053212

INPA-ICT 053213

INPA-ICT 053214

INPA-ICT 053215

INPA-ICT 053216

INPA-ICT 053217

INPA-ICT 053218

6 4

4 4

5 3

Leporinus friderici

Rio Purus

Água Branca

4°10'11,2"S 61°36'26,5"W

2 3

3 4 Leporinus fasciatus

Leporinus agassizi

Rio Uatumã

Água preta

2°34'38,6"S 58°08'42,8"W

1 3

Leporinus fasciatus 4 3

Leporinus uatumaensis 2 1

Laemolyta taeniata 2 2

Anostomoides laticeps 2 1

Schizodon fasciatus 3 2

Laemolyta taeniata Rio Negro

Água preta

2°39'05,9"S 60°54'36,8"W

3 3

Anostomiodes laticeps 2 1

Leporinus fasciatus 4 5

Leporinus fasciatus Rio Tapajós

Água clara

3°17'30,2"S 55°15'21,2"W 2 3

2 1 Leporinus friderici

14

Figura 2. Espécimes das espécies analisadas: a) Megaleporinus trifasciatus; b) Leporinus

fasciatus; c) Leporinus friderici; d) Leporinus agassizi; e) Leporinus uatumaensis. A barra

representa 3cm.

15

Figura 3. Espécimes de: a) Laemolyta taeniata; b) Anostomoides laticeps; c) Rhytiodus

microlepis; d) Shizodon fasciatus. A barra representa 3cm.

16

3.2. Métodos

3.2.1. Indução de Mitoses

Para se obter um maior número de células em metáfase utilizou-se a técnica de indução

de mitoses, descrita por Oliveira et al. (1988), na qual uma solução de fermento biológico é

aplicada nos espécimes. Esta solução, preparada com 0,3 g de fermento biológico comercial, 0,3

g de açúcar e 10 mL de água destilada foi mantida em estufa (46 °C) por um período de 15-20

minutos, e posteriormente injetada na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1mL para

cada 100 g de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento com solução de fermento

biológico foram colocados em aquários aerados por 24 horas.

3.2.2. Obtenção de cromossomos mitóticos

As preparações cromossômicas foram obtidas seguindo a metodologia descrita por

Bertollo et al. (1978), com algumas modificações, que consistiu em injetar intra-peritonealmente

uma solução de colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso do animal.

Após a injeção o peixe permaneceu em aquário aerado por 40 minutos. Em seguida, o mesmo foi

eutanasiado e a porção anterior do rim retirada e transferida para uma solução hipotônica de KCL

0,075 M (6-8 mL). O tecido foi divulsionado com o auxílio de uma seringa de vidro sem agulha e

com uma pipeta Pasteur, o sobrenadante (suspensão celular) foi transferido para um tubo de

centrífuga. A suspensão celular foi incubada em estufa a 37 °C por 30 minutos. Em seguida, o

material foi pré-fixado com 6 gotas de fixador Carnoy (3 metanol: 1 ácido acético) e

ressuspendido com cuidado. Deixou-se descansar por 5 minutos, adicionou-se fixador e

ressuspendeu. Centrifugou-se por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi desprezado, 6 mL

de fixador foi acrescentado e o material ressuspendido. Centrifugou-se por mais 10 minutos a

900 rpm, desprezou-se o sobrenadante e completou-se novamente para 6 mL de fixador,

repetindo essa lavagem por mais duas vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do

sobrenadante, 1,5 mL de fixador foram adicionados e o material ressuspendido. Essa suspensão

celular foi guardada em tubo “eppendorf” e mantida em freezer até a utilização.

Para a preparação das lâminas, as mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente

imersas em água destilada a 50 ºC, em banho-maria. Após cinco minutos, as lâminas foram

retiradas da água e a suspensão celular foi gotejada em diferentes regiões da lâmina. Estas foram

secas ao ar.

17

3.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RON)

A detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi realizada seguindo a

técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre as lâminas com a

suspensão celular foram adicionadas 2 gotas de uma solução coloidal de gelatina (2 g de gelatina

comercial sem sabor, dissolvida em 100 mL de água destilada, acrescida de 1 mL de ácido

fórmico) e, sobre cada gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de nitrato de Prata

(AgNO3) a 50%, agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com lamínula. A lâmina foi

colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, até adquirir uma coloração marrom

dourada, sendo em seguida lavada em água destilada.

3.2.4 Detecção da heterocromatina (Bandamento C)

Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica descrita por

Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a suspensão celular foram tratadas

em solução de HCl 0,2N a 45 °C, por 2 minutos e lavadas rapidamente em água destilada à

temperatura ambiente. Após secas, as lâminas foram incubadas por 1 minuto e 20 segundos em

solução de hidróxido de bário a 5%, a 42 °C, recém preparada e filtrada. A ação do hidróxido de

bário foi interrompida, imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N, lavada em

água destilada e deixada secar ao ar. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC

(cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho-maria a 60 °C, por 15

minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas várias vezes em água destilada e secas ao ar,

sendo posteriormente coradas com solução de Giemsa (diluída a 5% em tampão fosfato 0,06M e

pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas em água destilada e secas.

3.2.5. Extração de DNA

Para extração do DNA foi utilizado o tecido muscular. O protocolo de extração de DNA

foi o descrito por Sambrook e Russell (2001), com algumas modificações. O tampão de lise foi

Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1% de Estoup et al.

(1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente acrescentou-se: 15 μL de proteinase K (10

mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para a digestão do tecido.

A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol clorofórmio, álcool isoamílico e

cloroformio hidratado (500μL de cada um destes reagentes). Apos a lise, o DNA foi separado das

18

proteínas por precipitação salina juntamente com centrifugação a 14.000 rpm. O sobrenadante foi

entao precipitado com 600 μL de isopropanol 100%, também com o auxilio de centrifugacao. Ao

final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo do

tamanho do pellet (DNA precipitado) formado.

Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi

quantificado, por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão

(com tampão Tris-Borato- EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8%

e corado com brometo de etídio (EtBr – 0,5 g/mL). A visualização e análise do DNA no gel

foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um

transiluminador de luz ultravioleta (260 nM). Adicionalmente, quantificações em

espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare) foram realizadas.

3.2.6. Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction)

Elementos transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6, bem como as sequências teloméricas e os

DNAs ribossomais 18S e 5S foram amplificados por PCR e utilizados como sondas para

hibridização nos cromossomos metafásicos (Tabela.3). Os produtos de PCR foram verificados e

quantificados por comparação com o marcador Low Mass DNA Ladder (Invitrogen) em

eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado com GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500). A

visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100

(BioAgency), o qual possui acoplado um transiluminador de luz ultravioleta (260 nM).

Adicionalmente, quantificações em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare) foram

realizadas.

19

Tabela 3. Primers utilizados no mapeamento em cromossomos metafásicos.

Primers Sequência do primer (5’- 3’) Referência

DNAr 18S F 5’-CCGCTTTGGTGACTCTTGAT-3’ Gross et al. (2010)

DNAr 18S R 5’-CCGAGGACCTCACTAAACCA-3’ Gross et al. (2010)

DNAr 5S a 5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’ Martins e Galetti Jr. (1999)

DNAr 5S b 5’-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’ Martins e Galetti Jr. (1999)

Rex 1 F 5’-TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC-3’ Volff et al.( 2000)

Rex 1 R 5’- TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CTC-3’ Volff et al.( 2000)

Rex 3 F 5’-CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG-3’ Volff et al. (1999)

Rex 3 R 5’-TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT-3’ Volff et al. (1999)

Rex 6 F 5’-TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCA C-3’ Volff et al. (2001a)

Rex 6 R 5’-GGT CCT CTA CCA GAG GCC TGG G-3’ Volff et al. (2001a)

3.2.7. Microdissecção cromossômica e amplificação de DNA

A microdissecção foi realizada, utilizando um microscópio modelo Eppendorf

TransferMan NK 2 (Eppendorf) acoplado a um microscópio Zeiss Axiovert 40 CFL, com

agulhas de vidro feitas com um puxador Nikon e esterilizado por radiação UV. De 8-12

cromossomos foram colocados separadamente em 9µL de água ultrapura livre de DNAse e

amplificados, usando o GenomePlex Single Cell Whole Kit Genome Amplification (WGA4-

Sigma), seguindo o protocolo do fabricante. As lamínulas foram incubadas em solução de SDS

10% à temperatura ambiente por 1-60 dias. Após, as lamínulas foram lavadas com água destilada

autoclavada, e com a lamínula ainda úmida a suspensão cromossômica foi acondicionada sobre

estas. As lamínulas foram lavadas em solução de PBS 1x durante 1 minuto, e incubadas numa

solução de tripsina (35 mL de PBS 1x e 5 mL de tripsina) durante 30 segundos, lavou-se

novamente em PBS 1x e coradas com Giemsa a 1% em PBS (Yang 2009).

20

3.2.8. Hibridização in situ fluorescente (FISH) - Microdissecção

As sondas foram marcadas, utilizando o GenomePlex (WGA3 reamplification KIT-

Sigma), seguindo o protocolo do fabricante, exceto que a mistura de dNTPs do kit foi mudada

para uma mistura de ½ T de dNTPs e adicionou-se digoxigenina-11-dUTP (Roche) na reação.

As FISHs foram realizadas, utilizando o protocolo descrito por Rens et al. (1999; 2006)

com várias modificações. As lâminas com preparações cromossômicas foram tratadas com

RNAse (20 ng/μL) por 1 hora a 37 °C e desidratadas em uma série de etanol (70%, 90% e

100%). Os cromossomos foram desnaturados em formamida 70% em 2x citrato salino de sódio

(SSC) a 70 °C durante 2 minutos e desidratados em série de etanol gelada. 3 μl de sonda marcada

de L. trifasciatus foram acicionados em 12 μl de tampão de hibridação (7,5 μL de formamida, 1,5

μL de 20xSSC e 3 μL de sulfato de dextrano a 50%). Esta mistura foi desnaturada durante 10

minutos a 65 °C com pré-hibridização a 37 °C durante 1 hora, e aplicada em cada lâmina. A

hibridização foi realizada a 37 °C durante 15 horas para as mesmas espécies e com duas noites

para experiências de espécies cruzadas. As lavagens pós-hibridação foram realizadas em 50% de

formamida em 2xSSC duas vezes durante 5 minutos cada, seguido de 1xSSC duas vezes durante

5 minutos cada, e 4xSSC com 0,05% de Triton 100x (4XT) uma vez durante 4 minutos a 42 °C

para a mesma espécie e 45 °C para as espécies cruzadas. A detecção da sonda foi realizada

usando o anticorpo anti-digoxigenina-rodamina (Roche) durante 1 hora a 37 °C. Após a detecção,

as lâminas foram lavadas três vezes em 4XT durante 3 minutos cada a 42 °C e montadas em

meio de montagem Vectashield com 4',6- diamidino-2-fenilindole (DAPI; Vector). As imagens

foram capturadas e processadas utilizando o software DP Controller e uma câmara digital

(Olympus modelo D71) acoplada a um microscópio Olympus BX51.

3.2.9. Hibridização in situ fluorescente (FISH)

As sequências repetitivas DNAr 5S e 18S foram mapeadas conforme a técnica de

hidridização fluorescente in situ (FISH) descrita por Pinkel et al. (1986).

Tratamento das lâminas:

1º dia:

As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x durante 5 minutos em temperatura

ambiente, sendo posteriormente desidratadas em série alcoólica 70, 85 e 100%, 5 minutos cada e

21

secas ao ar. As lâminas foram incubadas em 90μl de RNAse (0,4% RNAse/2xSSC) a 37 °C por

1h em câmara úmida. Transcorrido este tempo, as lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC

por 5 minutos cada e em PBS 1x pelo mesmo tempo. Foram então fixadas em formaldeídeo 1%

em PBS 1x/50mM MgCl2, durante 10 minutos à temperatura ambiente; em seguida foram

lavadas em PBS 1x por 5 minutos, sendo então desidratadas em série alcoólica gelada (70, 85,

100 %) por 5 minutos cada. Simultaneamente à desidratação da lâmina em série alcoólica, a

solução de hibridização foi realizada com formamida 100% (concentração final 50%), sulfato de

dextrano 50%, 20xSSC (concentração final de 2xSSC), sondas marcadas e água milli-Q. Essa

reação foi desnaturada a 99 ºC por um período de 10 minutos, sendo passada imediatamente ao

gelo. O DNA cromossômico foi desnaturado com formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5

minutos e desidratado em etanol gelado 70, 85 e 100% por 5 minutos cada, secando ao ar. A

solução de hibridização foi colocada sobre a lâmina com os cromossomos desnaturados e

incubada em câmara úmida a 37 °C por cerca de 16 horas.

2º dia - detecção:

Após o tempo de hibridização, as lâminas foram lavadas em formamida 15% a 42 °C

durante 10 minutos e posteriormente lavadas em solução Tween 0,5%, por 5 minutos. Para

detecção do sinal, as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos e lavadas 2

vezes com Tween 0,5% em temperatura ambiente por 5 minutos cada. As lâminas foram

incubadas com os anticorpos específicos (antidigoxigenina e/ou avidina-FITC) por 60 minutos

em câmara úmida a 37 °C. Após este tempo, as lâminas foram lavadas 3 vezes com Tween 0,5%

temperatura ambiente por 5 minutos cada, desidratadas em série alcoólica gelada 70, 85 e 100%

durante 5 minutos cada e após secas foram montadas com antifade e DAPI, sendo cobertas com

lamínulas e analisadas em microscópio de Epifluorescência Olympus BX51.

3.2.10.Tratamento das lâminas

Tratou-se cada lâmina com 100μl de RNAse 40 μg/mL (0,4 μL de RNase 10 mg/mL e

99,6 μL de 2XSSC – cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M; pH 6,8) por 1 hora e 30

minutos em câmara úmida a 37 ºC. As lâminas foram lavadas duas vezes em 2xSSC durante 10

minutos cada. Desidratadas em série alcoólica 70%, 85% e 100% (etanol mantido no freezer)

22

durante 10 minutos cada. As lâminas foram mergulhadas em formamida 70% em 2xSSC por 5

minutos a 70 oC. O material foi desidratado em etanol 70%, 85% e 100% a -20 °C por 5 minutos

cada. Secou-se ao ar.

3.2.10.1 Solução de hibridização

No tubo Eppendorf com a sonda foi adicionado: 40 μL de formamida, 16 μL de sulfato de

dextrano 50% e 8 μL de 20xSSC. Aqueceu-se a 95 oC por 10 minutos e imediatamente ao gelo.

3.2.10.2. Hibridização

Colocou-se 80 μL da solucao de hibridização sobre a lamínula e inverteu-se a lâmina

sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material voltado para baixo em câmara

úmida (2xSSC) a 37 oC durante uma noite (aproximadamente 16 horas).

3.2.10.3.Lavagens

As lâminas foram lavadas em 2xSSC em temperatura ambiente apenas para retirar a

lamínula e escorreu-se bem a lâmina sem deixar secar. Lavou-se em formamida 50% por 15

minutos a 37 oC; em 2xSSC por 15 minutos a 37

oC; em 2xSSC por 15 minutos à temperatura

ambiente e por fim as lâminas foram lavadas em 4xSSC à temperatura ambiente.

3.2.10.4. Detecção

Sobre cada lâmina foram colocados 70 μL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M

de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Cobriu-se com lamínula e deixou-se por 40

minutos em câmara úmida com 2xSSC. Lavou-se em tampão de bloqueio (NaHCO3 1,26%;

citrato de sódio 0,018%; Triton 0,0386%; leite em pó desnatado 1%; diluido em água destilada

ajustando para pH 8,0) recém preparado a 42 oC por 5 minutos por 3 vezes. Após a lavagem,

colocou-se sobre cada lâmina 80 μL de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (2 μL de anti-

avidina estoque em 78 μL de tampao de bloqueio), cobriu-se com lamínula e manteve-se em

câmara úmida com 2xSSC a 37 oC por 30 minutos. Lavou-se em tampão de bloqueio por 3x (5

minutos cada) com agitação. Lavou-se em 4xSSC/Triton 2% por duas vezes (3 minutos cada com

agitação) e mais duas vezes em 4xSSC/Triton 0,2%. As lâminas foram secas em temperatura

ambiente.

23

3.2.10.5. Montagem das lâminas

A cada lâmina adicionou-se iodeto de propidio na proporcao de 25 μL de antifading com

1 μL de solucao de iodeto de propidio a 50 μL/mL.

3.2.10.6. Análise dos Resultados

Para cada indivíduo foram analisadas cerca de 30 metáfases. Para a captura das imagens

foi utilizado o software DP controler®

(Olympus). Os cromossomos foram recortados,

emparelhados e classificados de acordo com nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).

24

4. Resultados e Discussão

Os resultados e sua discussão estão sendo apresentados na forma de artigos científicos,

sendo um já publicado e os demais serão submetidos para publicação.

4.1 – Artigo I - Mapeamento de genes ribossômicos 45S e 5S em cromossomos de espécies

de peixes Anostomidae (Ostariophysi, Characiformes) de diferentes tipos de água da

Amazônia

4.2 – Artigo II - Microdissecção cromossômica e análise evolutiva dos cromossomos sexuais

em espécies de Megaleporinus (Teleostei, Characiformes)

4.3 – Artigo III - Mapeamento cromossômico de elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3

em espécies amazônicas (Anostomidae, Characiformes): sua interação com

heterocromatina

25

Capitulo I

Mapeamento de genes ribossômicos 45S e 5S em cromossomos de espécies de peixes

Anostomidae (Ostariophysi, Characiformes) de diferentes tipos de água da Amazônia

Lucas Caetano de Barros¹, Pedro Manoel Galetti Junior2, Eliana Feldberg¹

¹Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Programa de Pós-Graduação em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus, Amazonas,

Brazil. CEP: 69067-375.

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, 13565-905

-São Carlos, SP, Brazil.

26

27

RESUMO

Os peixes da família Anostomidae representam um dos mais importantes grupos da ictiofauna de

água doce da América do Sul, com espécies de alto valor econômico. A característica migratória

de algumas espécies, pelos diversos ambientes amazônicos, leva-os a águas com características

físico-químicas diferentes. Estudos citogenéticos sobre os anostomídeos demonstram que esses

peixes possuem número diploide e macroestrutura do cariótipo conservados. Assim, para

verificar se essa conservação ocorre também no nível genômico, o presente estudo objetivou um

mapeamento físico cromossômico comparativo, utilizando o DNAr 45S e 5S de sete espécies de

anostomídeos: Leporinus fasciatus, L. agassizi, L. friderici, L. trifasciatus (atual Megaleporinus

trifasciatus), Rhytiodus microlepis, Laemolyta taeniata e Schizodon fasciatus, coletados em

diferentes ambientes amazônicos. Os resultados obtidos corroboram a conservação da

macroestrutura do cariótipo. Entretanto, diferenças significativas foram encontradas na

distribuição da heterocromatina e no par portador da região organizadora do nucléolo, mas estas

diferenças não estiveram relacionadas aos tipos de água. O mapeamento de DNAr 45S e 5S por

FISH destacou, para quatro das sete espécies, mais de um par cromossômico com sitio 45S. O

DNAr 5S , embora presente em apenas um par de cromossomos, variou em sua localização no

cromossomo e em sua posição no cariótipo. Assim, embora a família Anostomidae tenha uma

macroestrutura cromossômica conservada, o uso de técnicas moleculares revelou a presença de

translocações cromossômicas durante a evolução desses peixes.

Palavras-chave: Citogenética, cromossomos, FISH, águas amazônicas

28

INTRODUÇÃO

Anostomidae é uma das famílias de peixes neotropicais mais ricas em espécies, entre os

Characiformes, com 145 espécies em 13 gêneros (Eschmeyer e Fong 2015), dos quais 10 são

endêmicos da América do Sul, com representantes em todas as bacias hidrográficas brasileiras

(Britski e Birindelli 2013). A maioria dos gêneros de Anostomidae contém duas ou mais

espécies, sendo o gênero Leporinus o mais especioso, com cerca de 94 espécies (Eschmeyer e

Fong 2015). Entretanto, Gnathodolus e Synaptolaemus são exceções, compreendendo somente

uma espécie cada. Esses peixes distribuem-se pelas Américas Central e do Sul, sendo que a bacia

amazônica detém a maior parte dessa variabilidade (Garavello e Britski 2003; Santos e Zuanon

2008).

A bacia amazônica é composta por um complexo sistema de drenagem que flui para o rio

Solimões-Amazonas, onde as margens são inundadas sazonalmente, contribuindo para uma

diversidade de habitats para a ictiofauna (Goulding et al. 2003). Além disso, as características

geológicas, físicas, químicas e biológicas também colaboram para a diversidade ambiental

observada, oferecendo diferentes biótopos nos quais a vida aquática desses grandes sistemas

fluviais se desenvolve (Junk e Furch 1993). Os rios amazônicos são diferentes na morfologia de

seus cursos e nas características físico-químicas de suas águas. Baseado nesses fatores, Sioli

(1950) subdividiu as águas amazônicas em ''branca'', ''preta'' e ''clara''.

Os anostomídeos vivem em uma grande diversidade de habitats, incluindo lagos,

corredeiras, áreas marginais de grandes rios e riachos florestais. Ao mesmo tempo, algumas

espécies da bacia amazônica parecem viver exclusivamente, ou principalmente, em ambientes de

água branca, preta ou clara (Santos e Zuanon 2008). Ictiofauna de rios amazônicos, como

Tocantins (Santos e Jégu 1989), Jamari (Santos 1991), Trombetas (Ferreira 1992) e Uatumã

(Santos e Jégu 1996) indicam que o número médio de anostomídeos oscila em torno de 20

espécies. No entanto, há uma grande diferença entre a composição das espécies em cada rio. Por

exemplo, os rios Tocantins e Uatumã possuem sete espécies em comum, enquanto os rios

Uatumã e Jamari têm 12 (Santos e Jégu 1996).

Esses dados demonstram que, embora a bacia amazônica seja formada por um sistema

hidrográfico contínuo, há um mosaico de distribuição de espécies de anostomídeos em suas sub-

bacias. Essa distribuição descontínua pode estar associada às diferentes características

limnológicas observadas nos rios de águas negras, brancas e claras (Junk e Piedade 2011) e/ou a

29

eventos vicariantes do passado, principalmente aqueles relacionados às variações eustática e

isostática do nível do mar, com o subsequente isolamento das populações exclusivamente em

água doce, seguida da especiação (Haffer 1982; Renno et al. 1990).

Estudos cariotípicos em peixes têm fornecido informações importantes sobre a

estabilidade e diferenciação cromossômica intra e interespecífica, sendo uma ferramenta

importante para auxiliar a compreender a evolução e explicar os padrões biogeográficos desses

organismos (Silva et al. 2012; Barros et al. 2015). Grandes avanços no estudo dos cromossomos

de peixes têm sido alcançados nas últimas duas décadas, com base na detecção de sequências

específicas de DNA nos cromossomas, seja ela de partes de cromossomos, cromossomos inteiros

ou mesmo de todo o DNA genômico, utilizando a técnica de hibridização fluorescente in situ

(FISH) (Guerra 2004; Nagamachi et al. 2013).

A maioria das informações sobre a organização genômica disponível para Anostomidae

está restrita a espécies da região sul do Brasil. Foi relatado que a macroestrutura do cariótipo é

muito conservada neste grupo de peixes, apesar de alterações da microestrutura relacionadas à

heterocromatina e à localização das regiões organizadoras de nucléolo entre as espécies (Martins

e Galetti 1999; 2000; 2001b; Aguilar e Galetti 2008). Não há evidência de ocorrência de

mecanismos Robertsonianos (fusões e/ou fissões cromossômicas) durante a diversificação destes

peixes.

Apesar de a detecção de sequências repetitivas de DNA por FISH ter se mostrado útil em

estudos de evolução cromossômica em peixes neotropicais (Jurka et al. 2011; Oliver e Greene

2011), pouco se sabe sobre a organização molecular dos cromossomos de Anostomidae. Quando

a abordagem envolveu citogenética molecular, as regiões genômicas estudadas foram

principalmente DNAr (Martins e Galetti 1999; 2000; 2001b; Ferreira et al. 2007; Aguilar e

Galetti 2008), além da pintura cromossômica e mapeamento de DNAs repetitivos destacando a

diferenciação dos cromossomos sexuais (Parise-Maltempi et al. 2007; 2013; Marreta et al. 2012;

Poltronieri et al. 2013; Splendore et al. 2013).

O DNA ribossômico é amplamente encontrado entre os eucariotos superiores e varia

entre as espécies sem uma relação direta com a complexidade do organismo ou com o tamanho

do genoma (Gregory 2005; Alves-Costa et al. 2006). O DNAr está organizado em dois grupos de

genes dispostos in tanden, com centenas de milhares de cópias. O maior conjunto in tanden

transcreve RNAr 5S (Long e Dawid 1980; Martins e Wasko 2004) e o menor conjunto in tanden

30

contém genes RNAr 45S, que são transcritos no 18S, 5.8S e 28S RNAr (Hillis e Dixon 1991;

Martins et al. 2011).

As sequências de DNAr são conservadas, mesmo entre táxons não relacionados, mas os

espaçadores não transcritos mostram grande variação no comprimento e na sequência de pares de

bases (Martins e Wasko 2004). Estas regiões têm uma organização flexível, variando em número

e posição entre as espécies e mesmo entre populações da mesma espécie (Mantovani et al. 2005;

Cabral-de Mello et al. 2011; Martins et al. 2011).

Embora diferentes classes de DNA repetitivo tenham sido utilizadas para entender a

estrutura do cariótipo dos anostomídeos, nenhuma metodologia que envolva a citogenética

molecular foi aplicada a esses peixes da região amazônica, com trabalhos prévios focados apenas

na descrição do cariótipo. Aqui, investigamos a organização genômica de algumas sequências

repetitivas em sete espécies de anostomídeos, coletadas em drenagens da bacia amazônica onde a

água tinha diferentes condições físico-químicas.

MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo analisou sete espécies de Anostomidae, coletadas na Amazônia Central

e Ocidental, em quatro locais com características distintas: água clara (rio Tapajós), água branca

(rio Purus), água preta (rio Uatumã) e água mista (lago Catalão) (Fig. 1). Espécimes de L.

fasciatus e L. friderici foram coletados em água branca e clara, e em água branca e preta,

respectivamente (Fig. 1), sob permissão do SISBIO No. 28095-1 para Eliana Feldberg. Todos os

espécimes foram anestesiados em óleo de cravo até a morte, os tecidos retirados e posteriormente

foram fixados e depositados na coleção de peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil (Tabela 1).

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais, utilizando o protocolo

de Bertollo et al. (1978). As regiões organizadoras de nucléolos ativas (Ag-RON) foram

detectadas com coloração com nitrato de Prata conforme Howell e Black (1980) e a detecção de

heterocromatina seguiu o protocolo descrito por Sumner (1972).

As sondas de DNAr 45S e 5S e de DNA telomérico (TTAGGG) foram obtidas a partir de

DNA de L. fasciatus, que foi extraído utilizando o protocolo fenol-clorofórmio (Sambrook e

Russell 2001). As sondas de DNAr foram amplificadas por reação em cadeia com polimerase

(PCR), utilizando os primers 18Sf (50-CCG CTG TGG TGA CTC TTG AT-30) e 18Sr (50 -

31

CCG AGGACC TCA CTA AAC CA- 30) (Gross et al. 2010), 5Sa (50-TAC GCC CGA TCT

CGT CCG ATC-3’) e 5Sb (5’- CAGGCT GGT ATC GCC GTA AGC-3’) (Martins e Galetti

1999) e os segmentos teloméricos (TTAGGG) 5 (Ijdo et al. 1991).

Os produtos DNAr 45S e PCR telomérico foram marcados com digoxigenina-11-dUTP

(Dig Nick Translation mix, Roche), enquanto o DNAr 5S foi corado com biotina-14-dATP

(Biotin Nick Translation mix, Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. Para detectar e

amplificar o sinal da sonda foram utilizados os anticorpos avidina-FITC (Sigma-Aldrich), anti-

avidina biotinilada (Sigma-Aldrich) e anti-digoxigenina-rodamina (Roche). A hibridização

homóloga e heteróloga foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986)

em condições elevadas de estringencia, 77% (2,5 ng /μl de sonda DNAr 18S, DNAr 5S ou sondas

teloméricas, formamida a 50%, sulfato de dextrano a 10% e SSC 29 a 37 °C durante 18 h). Os

cromossomas foram contra-corados com DAPI (2 mg / ml) num meio Vecta Shield (Vector).

Os cromossomos foram analisados em um microscópio de epifluorescência Olympus

BX51 e as imagens foram obtidas com uma câmera digital montada (Olympus DP71), utilizando

o software Image-Pro MC 6.3. As metáfases foram processadas no software Adobe Photoshop

CC e os cromossomos medidos no software Image-Pro-Plus®. Os cromossomos foram

classificados de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).

32

Figura. 1 Mapa mostrando os locais de coleta para as espécies de Anostomidae deste

estudo.

33

Tabela I. Espécies, locais de coleta, coordenadas geográficas, número de espécimes utilizados na citogenética molecular e número de tombo

Espécies Locais Localização Geográfica

(GPS)

Nº espécimes

Macho Fêmea

Nº tombo


Lago Catalão

confluência

Negro/Solimões

3°08'49.7"S

59°54'04.7"W

2 2 INPA 11641, INPA 11650, INPA 11653, INPA

11658

Rhytiodus microlepis 4 2 INPA 11629, INPA 11630, INPA 11632, INPA

11634, INPA 11635, INPA 11636

Schizodon fasciatus 2 3 INPA 11631, INPA 11633, INPA 11654, INPA

11655, INPA 11649

Leporinus friderici

Rio Purus

4°10'11.2"S

61°36'26.5"W

2 2 INPA 795, INPA796, INPA 797, INPA798

Leporinus fasciatus

3 4 INPA 2433, INPA 2434, INPA 2498, INPA 2500,

INPA 2557, INPA 2565, INPA 3340

Leporinus agassizi

Rio Uatumã

2°34'38.6"S

58°08'42.8"W

1 3 INPA 3309, INPA 3345, INPA 3371, INPA 3394

Laemolyta taeniata 2 2 INPA 2423, INPA 3486, INPA 2424, INPA 3488

Leporinus fasciatus

Leporinus friderici

Rio Tapajós

3°17'30.2"S

55°15'21.2"W

2

3

INPA 1150, INPA 1151, INPA 1208, INPA 1206,

INPA 1150

2 1 INPA 1207, INPA 1208, INPA 1206

34

RESULTADOS

As sete espécies apresentaram um número diploide de 54 cromossomos metacêntricos (m) e

submetacêntricos (sm), número fundamental (NF) de 108 e presença de sistema cromossômico

sexual do tipo ZZ/ZW em L. trifasciatus (atual Megaleporinus trifasciatus), onde o cromossomo W

foi subtelocêntrico (st) e o maior do complemento (Fig. 2). A região organizadora de nucléolo (Ag-

RON) esteve presente em apenas um par cromossômico, localizado em posição terminal em todas as

espécies estudadas, sendo que em três espécies foi encontrada nos braços curtos e nas quatro

espécies restantes nos braços longos. No entanto, sua localização no cariótipo variou entre os

maiores pares metacêntricos (detalhe na Figura 2).

Quanto ao padrão de banda C, os blocos heterocromáticos estiveram presentes

preferencialmente nos centrômeros, mas também blocos biteloméricos em L. fasciatus, Rhytiodus

microlepis, Laemolyta taeniata, Schizodon fasciatus e L. trifasciatus (atual Megaleporinus

trifasciatus), enquanto L. agassizi e L. friderici mostraram principalmente blocos centroméricos. O

cromossomos sexual W de L. trifasciatus apresenta um grande bloco heterocromático que se estende

por todo o braço longo e o cromossomo Z tem heterocromatina destacada apenas na região terminal

do braço longo (Figura 2).

35

Figura. 2 Cariótipo das sete espécies de Anostomidae analisadas por bandamento C e Ag-RON.

36

As análises de FISH mostraram que os sinais de DNAr 45S são coincidentes com os locais Ag-

RON nas sete espécies estudadas. No entanto, em R. microlepis e L. trifasciatus (atual Megaleporinus

trifasciatus), a sonda FISH também marcou um e dois pares de cromossomos adicionais,

respectivamente, bem como vários em S. fasciatus (Figura 3). Double FISH, utilizando sondas de

DNAr 45S e 5S revelou apenas um par de cromossomos portadores de RNAr 5S em todas as sete

espécies. Os sítios de DNAr 5S estiveram presentes no braço curto de tais cromossomos, mostrando

sintenia com o sítio 45S em três espécies (Figura 3).

37

Figura. 3 Cariótipo das sete espécies de Anostomidae analisadas por double FISH com sonda de

DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) e contra-coradas com DAPI.

38

Nas duas espécies coletadas em mais de um ambiente, ou seja, L. friderici (água branca e

clara) e L. fasciatus (água clara e preta), não houve diferenças nos marcadores cromossômicos.

A análise utilizando sonda telomérica revelou sinais de hibridização apenas nos telômeros das

sete espécies, apresentando uma ligeira duplicação deste local em um par cromossômico de L.

fasciatus, L. friderici e L. taeniata (Figura 4).

39

Figura. 4 Metáfase, das sete espécies de Anostomidae, analisadas por FISH com sonda

telomérica e contrastadas com DAPI.

40

DISCUSSÃO

Todas as espécies de Anostomidae analisadas no presente estudo apresentaram

macroestrutura conservada do cariótipo como já descrita para a família, ou seja, 2n = 54

cromossomos meta- e submetacêntricos (Martins et al. 2011), independentemente do tipo de água

(clara, branca ou preta), onde foram coletadas. Entretanto, embora a macroestrutura

cromossômica dos anostomídeos seja conservada, algumas características cromossômicas não são

compartilhadas por todos os representantes da família (Krinski e Miyazawa 2013).

Um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW, por exemplo, que só foi relatado em

algumas espécies do gênero Leporinus (Parise-Maltempi et al. 2013). A detecção deste sistema

em L. trifasciatus (hoje Megaleporinus trifasciatus, Ramirez et al. 2017) no presente trabalho

corrobora resultados anteriores (Parise-Maltempi et al. 2013), mostrando o cromossomo W quase

completamente heterocromático. Existem algumas teorias distintas sobre as origens dos

cromossomos sexuais e as mais aceitas, para os diferentes grupos de organismos, são a

degradação parcial ou total do cromossomo sexual específico (Ohno 1967) e a diferenciação de

um par autossômico (Muller 1964).

Existem dois mecanismos principais que podem levar à diferenciação dos pares

autossômicos. O primeiro sugere o envolvimento de rearranjos de cromossomos com o

consequente heteromorfismo (Charles- worth et al. 1994). Como exemplo de tal mecanismo, na

família Parodontidae, um evento de inversão reorganizou os DNAs repetitivos terminais para a

região proximal dos cromossomos proto-sexuais e estes locais foram amplificados nos braços

curtos cromossômicos, levando à diferenciação do cromossoma W (Schemberger et al. 2011).

No presente estudo, nenhum sitio intersticial foi detectado com sonda telomérica em L.

trifasciatus (hoje Megaleporinus trifasciatus), o que poderia corroborar a presença de rearranjos

de fusão e/ou inversões cromossômicas na origem do cromossomo W, o qual apresenta o dobro

do tamanho do cromossomo Z. Segundo Carvalho et al. (2012), sítios teloméricos intersticiais

(ITS) podem ser perdidos durante processos de erosão molecular. O fato de que todas as espécies

da família Anostomidae apresentam os mesmos número e fórmula cromossômica também sugere

a ausência de rearranjos cromossômicos na origem do cromossomo W.

O segundo mecanismo proposto para a diferenciação de pares autossômicos em pares

sexuais supõe a redução gradual da ocorrência de recombinação (Brooks 1988). Algumas

pesquisas mostram que a recombinação é notavelmente reduzida, quando há inserções de

elementos transponíveis no genoma, uma vez que as regiões eucromáticas se tornam

heterocromáticas para evitar a amplificação de tais elementos (Steinemann e Steineman 2005). É

possível, então, que a supressão da recombinação entre os cromossomos proto-sexuais de L.

41

trifasciatus (hoje Megaleporinus trifasciatus) tenha proporcionado um acúmulo de

heterocromatina no cromossomo W, como uma estratégia de defesa contra elementos invasivos,

frequentes em regiões genômicas não recombinantes (Caputo et al. 2011). Assim, acreditamos

que o cromossomo W tem aumentado sensivelmente o seu tamanho devido ao acúmulo de

heterocromatina cis (Feldberg et al. 1987), resultando na gradual degradação da atividade

genética, tendo como consequência, a diferenciação do sistema de cromossomas sexuais ZZ/ZW.

Como os peixes apresentam uma grande variedade de sistemas de cromossomos sexuais,

eles são modelos favoráveis para investigar a gênese desse mecanismo, como é apresentado em

espécies de L. anastomida, L. macrocephalus, L. obtusidens e L. elongatus (Silva et al. 2012;

Parise-Maltempi et al. 2013). Estas três últimas foram incluidas no novo gênero Megaleporinus,

passaram a se chamar, Megaleporinus macrocephalus, M. obtusidens e M. elongatus (Ramirez et

al. 2017).

Considerando o padrão de distribuição das regiões organizadoras de nucléolos, os

anostomídeos têm sido caracterizados pela presença de um par cromossômico portador de

nucléolos (Margarido e Galetti 2000; Pereira et al. 2002; Krinski e Miyazawa 2013). No entanto,

a posição da RON é variável no cromossomo (braço curto, braço longo, terminal ou intersticial),

como sua localização no cariótipo, como observado no presente estudo. Estudos anteriores

relataram alto nível de variação nos sítios Ag-RON entre as diferentes espécies (Galetti et al.

1991a; b; Martins e Galetti 1999; Margarido e Galetti 2000; Pereira et al. 2002; Krinski e

Miyazawa 2013). Essas variações foram atribuídas a rearranjos cromossômicos como

translocações, duplicações e/ou inversões e foram consideradas marcadores citológicos muito

úteis para estudo taxonômico da família (Martins e Galetti 1998; Molina e Galetti 2007).

Um aspecto interessante das regiões organizadoras de nucléolos nos anostomídeos é a

forte relação com a heterocromatina, que coincide ou é adjacente aos sítios de RON. De acordo

com Martins e Galetti (2001a), a heterocromatina pode estar facilitando os rearranjos

cromossômicos. As sete espécies aqui analisadas, representando quatro gêneros de Anostomidae,

apresentaram blocos heterocromáticos distribuídos ao longo das regiões terminal e centromérica,

às vezes com blocos que se estendem para as regiões proximais de ambos os braços. Foi sugerido

que essa relação poderia causar o silenciamento de genes vizinhos de forma aleatória e variável

(Schade-Bartu- Siak et al. 2005).

O padrão heterocromático em Anostomidae é um pouco variável. Galetti et al. (1991a)

relataram que a heterocromatina em Leporinus piau é bastante reduzida, especialmente na região

centromérica. Como tal padrão foi encontrado para outras espécies de Leporinus, este parece

representar uma característica derivada dentro deste gênero. No entanto, grandes blocos

42

heterocromáticos também podem ser encontrados em espécies de Leporinus (Pereira et al. 2002),

contrariando os resultados acima.

No presente estudo, os blocos heterocromáticos foram encontrados principalmente nas

regiões subteloméricas e na região do centrômero, similarmente ao padrão observado em L.

fasciatus da bacia amazônica (Krichanã 1999), L. desmotes do Rio Tocantins (Margarido e

Galetti 2000) e L. striatus da bacia do alto Paraguai (Krinski e Miyazawa 2013).

Os dados disponíveis sugerem fortemente que o padrão da heterocromatina é conservado

neste gênero (Galetti 1991a; b; Krichanã 1999; Margarido e Galetti 2000; Pereira et al. 2002;

Krinski e Miyazawa 2013). No entanto, embora a quantidade de heterocromatina pareça ser

relativamente constante entre as espécies de Leporinus, a análise de espécies amazônicas revelou

ligeiras diferenças relacionadas à sua associação com os sítios 45S e 5S.

As espécies de anostomídeos geralmente apresentam apenas um par cromossômico

portador da Ag-RON, também confirmado por experimentos de FISH, usando a sonda de DNAr

45S (Martins e Galetti 1999). O mesmo foi encontrado para a maioria das espécies até agora

investigadas, com exceção de L. trifasciatus (hoje Megaleporinus trifasciatus), L. taeniata, R.

microlepis e S. fasciatus que parecem ter mais de um par cromossômico marcado pela sonda 45S.

De fato, o polimorfismo relacionado com o número e a posição do DNAr 45S já foi relatado para

L. friderici e L. trifasciatus (Galetti et al. 1991a; 1995a; b).

No entanto, nossos resultados com as quatro espécies acima citadas, ainda exigem

confirmação por análises complementares para excluir possíveis artefatos técnicos e confirmar a

expansão dos sítios de DNAr, nessas espécies. Podemos considerar que, nessas espécies onde há

uma ampla distribuição de sequências de DNAr 45S, este sítio pode estar associado com

pseudogenes e apenas um par de cromossomos é o organizador nucleolar. Outro marcador

interessante para a família é o DNAr 5S, embora as sete espécies estudadas apresentassem um

único par portador deste sítio, a localização deste agrupamento genético variou entre as espécies.

O mapeamento do gene DNAr 5S em várias espécies de peixes indicou que estes locais

são comumente posicionados nos segmentos intersticiais dos cromossomos. Este padrão foi

observado em algumas espécies de Anostomidae, Salmonidae (Fujiwara et al. 1998),

Parodontidae (Vicente et al. 2001), Erythrinidae (Hoplias malabaricus) (Born e Bertollo 2000) e

Cichlidae (Oreocromis niloticus) (Martins et al. 2000). Tal padrão de posição parece não ser

aleatório e a posição intersticial dos genes DNAr 5S pode oferecer alguma vantagem em relação

à organização desses genes no genoma de vertebrados (Martins e Galetti 1999).

De acordo com Martins e Galetti (1999; 2000; 2001a), os genes DNAr 5S são geralmente

encontrados em dois loci cromossômicos. A presença de dois sítios de DNAr 5S aparentemente é

43

conservada durante a diversificação do cariótipo dos anostomídeos e os cromossomos

homeólogos levam esses locais, que foram detectados em várias espécies de Leporinus,

Schizodon e Leporellus (Martins e Galetti 1999; 2000; 2001a; Aguilar e Galetti 2008). Além

disso, esses dois loci parecem estar também localizados em cromossomos homeólogos nos

gêneros Parodon (Parodontidae) (Vicente et al. 2001; Centofante et al. 2002) e Prochilodus

(Prochilodonidae) (Hatanaka et al. 2002), sugerindo uma conservação evolutiva desta

característica entre as diferentes famílias.

Nas espécies amazônicas estudadas, apenas um par cromossômico com DNAr 5S também

foi observado, embora a localização deste agrupamento genético tenha variado entre as espécies.

Além disso, a sintenia entre os sítios DNAr 5S e 45S observada nas espécies L. trifasciatus (hoje

Megaleporinus trifasciatus), S. fasciatus e L. taeniata é uma novidade para espécies de

Anostomidae, embora já tenha sido descrita para algumas espécies do gênero Prochilodus (Vicari

et al. 2006; Terencio et al. 2012), para Salmo salar (Pendás et al. 1994), Triportheus nematurus

(Diniz et al. 2009) e Pimelodus britskii (Moraes-Neto et al. 2011).

Em Characiformes neotropicais, os clusters de DNAr 5S e 45S, geralmente são

localizados em diferentes pares de cromossomos, sugerindo que esta poderia ser uma

característica comum para esses genes em genomas de peixes (Martins e Galetti 1999; 2000;

2001a; b). Martins (2007) propõe que a sintenia entre os DNAr 45S e 5S poderia facilitar quebras

cromossômicas e danos à função gênica. Entretanto, em Leporinus, esta característica não

mostrou nenhuma correlação com modificações do cariótipo, tendo em vista a estabilidade

macroscópica do cromossomo encontrada neste gênero. Nesse sentido, a falta de evidência de

alterações cariotípicas importantes também foi ressaltada pelo mapeamento cromossômico de

sequências teloméricas. Estas sequências são altamente conservadas entre eucariotos (Meyne et

al. 1989) e sua identificação por FISH pode fornecer informações úteis sobre alterações

cromossômicas durante a evolução.

De fato, nenhuma sequência telomérica interna (ITS) foi detectada nas espécies

analisadas, indicando que rearranjos cromossômicos, como eventos de fusão e fissão, não

ocorreram. Assim, no presente estudo, verificou-se que uma macroestrutura de cariótipo comum

de 2n=54 cromossomos meta- e submetacêntricos é compartilhada pelas sete espécies de

Anostomidae, além de um sistema de cromossomo sexual ZZ/ZW em L. trifasciatus (hoje

Megaleporinus trifasciatus) e algumas alterações da microestrutura do cariótipo, que promovem

alterações evolutivas e diversificação entre as espécies. A falta de associação entre o padrão de

cariótipo e o habitat do peixe (cor da água) não suporta uma suposta hipótese de especiação

ecológica ou a assinatura cromossômica não pôde ser detectada ainda.

44

Como alterações cromossômicas menores estão presentes no complemento cromossômico

dos anostomídeos, ainda temos uma questão aberta para a citogenética molecular, que poderia no

futuro entender melhor a evolução cromossômica deste grupo de peixes, na Amazônia.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Jansen A. Zuanon pela identificação dos espécimes. Este estudo

contou com o apoio das agências brasileiras: Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento

Tecnológico (CNPq-LCB), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/PPG em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva (INPA/GCBEv), FAPEAM (PRONEX - FAPEAM/CNPq

003/2009), Centro de Estudos de Adaptação a alterações ambientais na Amazônia (INCT –

ADAPTA/FAPEAM/CNPq 573976/2008-2), e Edital MCT/CNPq/MEC/CAPES/FNDCT-Acao

Transversal/FAPs nº 47/2010 (Rede BioPHAM).

45

Capitulo II

Microdissecção cromossômica e análise evolutiva dos cromossomos sexuais em espécies de

Megaleporinus (Teleostei, Characiformes)

Lucas Caetano de Barros¹, Diovani Piscor2, Patricia Pasquali Parise-Maltempi

2, Eliana

Feldberg¹

¹Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Divisão do curso de Pós-Graduação em

Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus,

Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375. Phone: +559236433606. Fax +559236433344. E-mail:

[email protected]

2Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociencias,

Departamento de Biologia. Av. 24A, 1515, Bela Vista, Rio Claro, São Paulo, Brazil. CEP:

13506-900. Phone: +1935264148 Fax: +1935264135.

mailto:[email protected]

46

RESUMO

Em Anostomidae, apenas em algumas espécies de Megaleporinus foi evidenciado um sistema de

cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW e Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2, o que torna este gênero um modelo

interessante para estudo de cromossomos sexuais. O objetivo deste estudo foi isolar o

cromossomo W de Megaleporinus trifasciatus, ultilizando a microdissecção cromossômica para

confecção de sonda (WLt), seguida da pintura cromossômica. Hibridização cruzada (cross-FISH),

com sondas já existentes de M. macrocephalus (WMm) e M. elongatus (WMe) foram utilizadas

em outras espécies de Leporinus e em Semaprochilodus taeniurus, clado próximo de

Anostomidae. A sonda WMt em metáfase de fêmeas da própria espécie (M. trifasciatus)

evidenciou o braço longo do cromossomo W todo marcado e uma pequena marcação distal no

braço longo do cromossomo Z. Em machos, a marcação esteve presente no braço longo de ambos

cromossomos Z. A hibridização com as sondas WMe e WMm em fêmeas de M. trifasciatus

mostrou um padrão semelhante ao encontrado com a sonda WMt. As sondas WMt e WMm em

indivíduos machos e fêmeas das espécies Leporinus friderici e L. fasciatus não marcou nenhum

cromossomo do complemento. O mesmo resultado foi encontrado quando aplicamos estas duas

sondas em Semaprochilodus taeniurus (ZZ/ZW). As sondas WMt, WMm e WMe evidenciaram

grande similaridade entre as espécies do gênero Megaleporinus, que apresentam sistema sexual

ZZ/ZW, com pequenas alterações quando comparadas isoladamente. Entretanto, apesar da

proximidade filogenética entre as espécies e entre as famílias, as espécies que apresentam sistema

de cromossomos sexuais diferenciados possuem uma dinâmica evolutiva própria.

Palavras-chave: Cromossomos sexuais, microdissecção, cross-FISH

47

INTRODUÇÃO

Ramirez et al. (2017), em sua mais recente revisão do gênero Leporinus, separou parte de

suas espécies, aquelas que apresentam sistema de cromossomos sexuais diferenciados, em um

novo gênero, Megaleporinus: M. obtusidens, M. reinhardti, M. macrocephalus, M. trifasciatus,

M. conirostris com sistema ZZ/ZW (Venere et al. 2004) e múltiplo do tipo

Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2 em M. elongatus(Parise-Maltempi et al. 2007; 2013). Leporinus sp.

(hoje Leporinus multimaculatus) também apresenta ZZ/ZW

O sistema de cromossomos sexuais múltiplos tem uma íntima relação com

heterocromatina constitutiva, sendo determinante para a diferenciação do cromossomo W (Parise-

Maltempi et al. 2007; 2013). Nestas espécies, o cromossomo W é um subtelocêntrico grande e

quase totalmente heterocromático. Já, o cromossomo Z tem apenas um terço distal do braço longo

heterocromático (Parise-Maltempi 2007).

Estudos realizados em M. trifasciatus e Leporinus multimaculatus demonstraram que os

cromossomos Z e W de da última espécie foram diferentes em sua morfologia e no padrão de

bandas, quando comparados aos sexuais das demais espécies, levando os autores a acreditar que

os cromossomos sexuais de Leporinus multimaculatus ainda se encontram em um estágio inicial

de diferenciação (Venere et al. 2004).

Mapeamento do cromossomo W em espécies do gênero Megaleporinus com

cromossomos sexuais heteromórficos (M. elongatus, M. macrocephalus, M. Obtusidens),

utilizando uma sequência de DNA altamente repetitivo (LeSpe I), mostrou sinais diferenciados

entre machos e fêmeas, sugerindo que esta sequência seja relacionada com a diferenciação deste

cromossomo (Marreta et al. 2012).

Um outro estudo em anostomídeos, utilizando a pintura cromossômica a partir da sonda

do W microdissectado, comparou espécies com e sem sistema de cromossomos sexuais

diferenciados, o que evidenciou completa marcação dos Ws nas fêmeas, e de quase todos os Zs

nos machos, sugerindo uma origem comum dos cromossomos sexuais pelo menos para três

espécies: M. elongatus, M. macrocephalus e M. obtusidens. Entretanto, os autores acreditam que

o sistema de cromossomos sexuais em M. elongatus encontra-se em um estágio evolutivo

diferenciado em relação às demais espécies. Isto porque, M. elongatus não compartilha as

mesmas sequências repetitivas das espécies que possuem cromossomos sexuais Z e W. Já, a

aplicação da sonda do W microdissectado nas espécies que não apresentam cromossomos sexuais

diferenciados (L. friderici, L. striatus, L. lacustris, Schizodon borelii e S. isognathus) não

evidenciou nenhuma marcação (Parise-Maltempi et al. 2013).

A técnica de pintura cromossômica tipicamente envolve o uso de sondas cromossomo-

48

específicas em experimentos de hibridização in situ fluorescente (FISH) no genoma da espécie

alvo ou em outras espécies (Cross-FISH) (Ferguson-Smith et al. 1998). Nesses estudos, sondas

foram obtidas por microdissecção cromossômica e mostraram-se ferramentas úteis para análises

moleculares e testes de homeologia de cromossomos sexuais ou supranumerários (Liu et al.

2002; Yi et al. 2003).

A hipótese de acúmulo de elementos repetitivos, como a principal via de diferenciação

dos cromossomos sexuais em Anostomidae é amplamente aceita (Nakayama et al. 1994).

Segundo Silva et al. (2013), os elementos repetitivos são diferentes entre algumas espécies e eles,

provavelmente, foram responsáveis pela origem recente de um sistema cromossômico sexual

múltiplo do tipo Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2 em M. elongatus (Parise-Maltempi et al. 2007). No

entanto, se o aumento de segmentos heterocromáticos pelo acúmulo de DNA repetitivo é a causa

ou a consequência da origem dos cromossomos sexuais, ainda não está claro e o entendimento da

evolução deste sistema de cromossomos sexuais em Megaleporinus e Leporinus continua

incipiente.

Entre as espécies de Anostomidae que ocorrem na Amazônia, até agora, apenas M.

trifasciatus apresentou um sistema sexual heteromórfico do tipo ZZ/ZW. Assim, o objetivo do

presente trabalho foi utilizar sondas específicas, obtidas pela microdissecção manual do W e

hibridização in situ fluorescente cruzada (cross-FISH), para verificar a similaridade da sequência

do W de M. trifasciatus com a demais espécies que não apresentam cromossomos sexuais

diferenciados. Ainda, com sondas obtidas de outras espécies com sistema ZZ/ZW verificar a

similaridade entre os diferentes Ws. Deste modo, o presente trabalho acrescenta mais uma sonda

de cromossomo W, para ser aplicada no estudo da evolução dos sistemas de determinação

cromossômica de sexo em Anostomidae.

MATERIAL E MÉTODOS

No presente estudo foram utilizadas sondas pré-existentes de Megaleporinus

macrocephalus (antigo Leporinus macrocephalus), coletada no rio Paraguai-MT e de M.

elongatus (antigo Leporinus elongatus), coletada no rio Mogi-Guaçu, Pirassumunga-SP, e foi

obtida sonda do W de Megaleporinus trifasciatus (antigo Leporinus trifasciatus), coletada na

região de confluência entre os rios Negro e Solimões –AM. Estas sondas foram mapeadas sobre

sua própria espécie, uma sobre a outra, sobre espécies que não possuem cromossomos sexuais

diferenciados e sobre Semaprochilodus taeniurus (Prochilodontidae), que tem um sistema

ZZ/ZW, coletada na região de confluência entre os rios Negro e Solimões – AM.

Os exemplares de Megaleporinus trifasciatus (15 machos e 5 fêmeas) foram coletados na

49

região de confluência dos rios Negro e Solimões – AM; L. fasciatus (5 machos e 2 fêmeas) e L.

friderici (4 machos e 3 fêmeas) foram coletadas na bacia do rio Tapajós – PA, sob a licença do

SISBIO No. 28.095-1 para Eliana Feldberg.

Os indivíduos foram eutanasiados com óleo de cravo e os cromossomos mitóticos foram

obtidos a partir de células renais, segundo protocolo de Bertollo et al. (2015). Os peixes foram

numerados, identificados, fixados e depositados na coleção de peixes do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia (INPA), sob os números: INPA-ICT 053210, INPA-ICT 053211, INPA-

ICT 053212, INPA-ICT 053213, INPA-ICT 053214, INPA-ICT 053215, INPA-ICT 053216,

INPA-ICT 053217, INPA-ICT 053218.

Microdissecção cromossômica e amplificação de DNA

A microdissecção foi realizada, utilizando um microscópio modelo Eppendorf

TransferMan NK 2 (Eppendorf) acoplado a um microscópio Zeiss Axiovert 40 CFL, com agulhas

de vidro feitas com um puxador Nikon e esterilizado por radiação UV. De 8-12 cromossomos

foram colocados separadamente em 9µL de água ultrapura DNAse-free e foram então

amplificados usando o GenomePlex Single Cell Whole Kit Genome Amplification (WGA4-

Sigma), seguindo o protocolo do fabricante.

As lamínulas foram incubadas em solução de SDS 10% a temperatura ambiente por 60

dias. Após, as lamínulas foram lavadas com água destilada autoclavada, e com a lamínula ainda

úmida a suspensão cromossômica foi acondicionada sobre estas. As lamínulas foram lavadas em

solução de PBS 1x durante 1 minuto, e incubadas numa solução de tripsina (35 mL de PBS 1x e 5

mL de tripsina) durante 30 segundos, lavadas novamente em PBS 1x e coradas com Giemsa a 1%

em PBS (Yang 2009).

Hibridização in situ fluorescente (FISH)

As sondas foram marcadas com o GenomePlex (WGA3 reamplification KIT-Sigma),

seguindo o protocolo do fabricante, exceto que a mistura de dNTPs do kit foi mudada para uma

mistura de ½ T de dNTPs e adicionando digoxigenina-11-dUTP (Roche) na reação.

A FISH foi realizada segundo o protocolo descrito por Rens et al. (1999; 2006) com

várias modificações. As lâminas com preparações citogenéticas foram tratadas com RNAse (20

ng/μL) por 1 hora a 37 °C e desidratadas em uma série de etanol (70%, 90% e 100%). Os

cromossomos foram desnaturados em formamida 70% em 2x citrato salino de sódio (SSC) a 70

°C durante 2 minutos e desidratados em série de etanol gelada. 3 μl de sonda marcada de L.

trifasciatus foram acicionados em 12 μL de tampão de hibridação (7,5 μL de formamida, 1,5 μL

50

de 20xSSC e 3 μL de sulfato de dextrano a 50%). Esta mistura foi desnaturada durante 10

minutos a 65 °C com pré-hibridação a 37 °C durante 1 hora, e aplicada em cada lâmina. A

hibridização foi realizada a 37 °C durante 15 horas para as mesmas espécies e com duas noites

para experiências de espécies cruzadas. As lavagens pós-hibridização foram realizadas em 50%

de formamida em 2xSSC duas vezes durante 5 minutos cada, seguido de 1xSSC duas vezes

durante 5 minutos cada, e 4xSSC com 0,05% de Triton 100x (4XT) uma vez durante 4 minutos a

42 °C para a mesma espécie e 45 °C para as espécies cruzadas. A detecção da sonda foi realizada

usando o anticorpo anti-digoxigenina-rodamina (Roche) durante 1 hora a 37 °C. Após a detecção,

as lâminas foram lavadas três vezes em 4XT durante 3 minutos cada a 42 °C e montadas em meio

de montagem Vectashield com 4',6- diamidino-2-fenilindole (DAPI; Vector).

As imagens foram capturadas e processadas, utilizando o software DP Controller e uma

câmara digital (Olympus modelo D71) acoplada a um microscópio Olympus BX51.

RESULTADOS

FISH com a sonda W de Megaleporinus trifasciatus (WMt)

A sonda WMt em metáfases de fêmeas da própria espécie (Megaleporinus trifasciatus)

evidenciou o braço longo do cromossomo W todo marcado e uma pequena marcação distal no

braço longo do cromossomo Z (Figura 1a). Em indivíduos machos de M. trifasciatus a mesma

marcação distal no braço longo do cromossomo Z foi evidenciada (Figura 1b).

A hibridização, utilizando as sondas W de Megaleporinus elongatus (WMe) e de

Megaleporinus macrocephalus (WMm), em fêmeas de M. trifasciatus mostrou um padrão

semelhante ao encontrado pela sonda homóloga (WMt) (braço longo do cromossomo W todo

marcado e uma pequena marcação no braço longo do cromossomo Z) (Figura 1c, e). Nos

indivíduos machos de M. trifasciatus estas sondas (WMe e WMm) também mostraram sinais

similares aos da sonda WMt (Figura 1d, f).

51

Figura. 1 Metafases de Megaleporinus trifasciatus analisadas por cross-FISH com sonda WMt,

WMm e WMe e contracoradas com DAPI.

52

A aplicação das sondas WMt e WMm em indivíduos machos e fêmeas das espécies L.

friderici e L. fasciatus não marcou nenhum cromossomo do complemento (Figura 2 c, d, e,

f). O mesmo resultado foi encontrado quando aplicamos estas duas sondas em

Semaprochilodus taeniurus (ZZ/ZW) pertencente à família Prochilodontidae, grupo-irmão

de Anostomidae (Figura 2 g, h).

53

Figura. 2 Metafase de Megaleporinus trifasciatus (a-b), L. fasciatus (c-d), L. friderici (e-f)

e Semaprochilodus taeniurus (g-h) analisadas por cross-FISH com sonda WMt, WMm e

WMe e contrastadas com DAPI.

54

DISCUSSÃO

A evolução de cromossomos sexuais em peixes tem sido discutida extensamente e vem

sendo sugerido que os diferentes sistemas são resultado de rearranjos estruturais, como

inversões, translocações, duplicações e mesmo adição de heterocromatina (Ayling e Griffin

2002). Entretanto, cromossomos sexuais diferenciados apresentam uma distribuição muito

peculiar entre as espécies de peixes. O mesmo sistema pode ser encontrado em todas as espécies

de um grupo, como é o caso do sistema ZZ/ZW que é encontrado em todas as espécies de

Triportheus (Artoni 1999) e o sistema ZZ/ZW descrito em 10 espécies do novo gênero

Megaleporinus, criado a partir de Leporinus para abrigar as espécies com sistema de

cromossomos sexuais diferenciados e também o sistema múltiplo Z1Z

1Z

2Z

2/Z

1W

1Z

2W

2 (Parise-

Maltempi et al 2007; Ramirez et al. 2017).

A maioria das ocorrências, no entanto, é esporádica, como em Semaprochilodus

taeniurus, onde cromossomos sexuais diferenciados estão presentes apenas nesta espécie

(Feldberg et al. 1987; Terencio et al. 2013). O aspecto mais interessante da distribuição de

sistemas de cromossomo sexual em peixes é que nessas ocorrências esporádicas, sistemas

diferentes, por exemplo heterogeneidade masculina e feminina, sistemas simples e múltiplos,

podem ser encontrados em espécies do mesmo gênero, estreitamente relacionadas, ou em

diferentes populações da mesma espécie. Tal é o caso de Eigenmannia (Almeida-Toledo e

Foresti 2001) e de Hoplias (Bertollo et al. 2000). Ainda, podem ser encontrados cromossomos

sexuais em estágios iniciais de diferenciação (Venere et al. 2004; Parise-Maltempi et al. 2013).

Nas espécies de Leporinus e Megaleporinus, o cromossomo W é facilmente reconhecido,

por ser o maior cromossomo do complemento, com grande acúmulo de heterocromatina (Galetti

et al. 1981; Venere et al. 2004; Parise-Maltempi et al. 2007).

Devido à morfologia muito similar dos cromossomos sexuais encontrados nas espécies

de Leporinus e Megaleporinus, uma hipótese sugerida foi que eles teriam uma origem comum, a

partir do acúmulo de heterocromatina, como o primeiro passo da diferenciação (Galetti e Foresti

1986). É fato que, quando as sondas de W obtidas de M. trifasciatus, M. elongatus, M.

macrocephalus e M. obtusidens são cruzadas, elas apresentam grande similaridade de

sequências com os outros cromossomos W, reforçando a hipótese de que o sistema sexual

encontrado em espécies de Megaleporinus (antigos Leporinus) tiveram uma origem comum

(Parise-maltempi et al. 2013). Entretanto, o cromossomo W de Leporinus multimaculatus

(antigo Leporinus sp2) foi uma exceção, onde o cromossomo W apresenta um ganho

diferenciado de novos blocos de heterocromatina. O aparecimento destes blocos

heterocromáticos no W sugerem fortemente a presença de um tipo diferente de cromatina, sem

55

homologia com cromossomo Z, sendo ambos cromossomos (Z e W) similares aos autossomos,

sugerindo uma origem independente nesta espécie (Verene et al. 2004).

Um fato a ser observado em nossos resultados é que a sonda do cromossomo W de M.

trifasciatus (WMt) marca apenas o braço longo no cromossomo W e um pequeno sítio no

cromossomo Z. O mesmo padrão ocorre, quando utilizamos as sondas WMe e WMm na espécie

M. trifasciatus, porém, o padrão de marcação da sonda WMe apresenta uma configuração

diferenciada em relação as demais sondas, sendo que, ambas evidenciando a marcação do

cromossomo Z em machos.

Outros resultados foram encontrados, utilizando a sonda WMe contra cromossomos de

fêmeas M. elongatus, M. macrocephalus e M. obtusidens pintando todo o cromossomo W de

ambas as espécies, bem como uma grande parte do cromossomo Z em M. macrocephalus. Em

indivíduos machos de M. macrocephalus, a sonda WMe marcou quase todo os dois

cromossomos Z, em machos de M. obtusidens foram observados sinais na região subtelomérica

(Parise-maltempi et al. 2013). Megaleporinus trifasciatus possui uma diversificação mais antiga

do ancestral comum com as demais espécies que apresentam sistema de cromossomo sexual

diferenciado, exceto M. muyscorum, sendo assim, todas as outras espécies têm um ancestral

comum mais recente entre si, do que com L. trifasciatus (Ramirez et al. 2016; 2017). Neste

trabalho, observamos que existem regiões específicas e diferenciadas no sistema de

cromossomos sexuais de M. trifasciatus, quando comparamos com as demais espécies

analizadas com a mesma técnica e sondas. Assim, fica evidente que este sistema sexual

encontra-se em um estágio disjunto de diferenciação daqueles das outras espécies de

Megaleporinus, o que nos leva a sugerir tempos evolutivos diferentes na diferenciação do

sistema de cromossomos sexuais neste novo gênero. Parise-Maltempi et al. (2007) descreveram

a presença de um novo sistema múltiplo de cromossomos sexuais em M. elongatus (antigo L.

elongatus), o que reforça a ideia acima mencionada de tempos evolutivos diferentes dos

cromossomos sexuais em Megaleporinus.

As sondas WMt e WMm nas espécies L. friderici, L. fasciatus (sem cromossomos

sexuais diferenciados), Semaprochilodus taeniurus (ZZ/ZW), descartam a hipótese de

cromossomos sexuais em estágios iniciais de deferenciação ou que pudessem estar

compartilhando sequências do W de M. trifasciatus ou de M. macrocephalus. Resultado similar

foi observado por Parise-Maltempi et al. (2013), quando utilizaram sequências WLm ou WLe

(hoje WMm e WMe) nas espécies: Leporinus friderici, L. striatus, L. lacustris, Schizodon

borelii e S. isognathus, ou seja não encontraram cromossomos que compartilhassem tais

sequências. Os autores acreditam que esses cromossomos sexuais poderiam ter se originado dos

56

mesmos autossomos, mas em uma dinâmica evolutiva própria.

Nós autores deste trabalho, acreditamos que independente da criação desse novo gênero

Megaleporinus, a relação entre as espécies que antes faziam parte de Leporinus, exista uma forte

relação do surgimento deste sistema de cromossomo sexual em Leporinus e Megaleporinus.

Considerando que, dentro de Anostomidae, Leporinus é o que apresenta o maior número de

espécies (Britski e Birindelli 2013), com menos da metade delas analisadas citogeneticamente, e

pelo menos um tipo de sistemas de cromossomos sexuais diferenciados ZZ/ZW (Venere et al.

2004), existe há necessidade de novos estudos citogenéticos, para revelar a real diversidade

cromossômica para Leporinus. Ramirez et al. (2017) com base em características morfológicas,

citogenéticas e moleculares criaram um novo gênero Megaleporinus, onde muitas espécies que

pertenciam a Leporinus foram incluidas neste novo gênero, incluido a grande maiorida das

espécies que apresentam sistema de cromossomo sexual diferenciado ZZ/ZW e

Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2 (Galetti et al. 1984; Parise-Maltempi et al. 2007).

A microdissecção cromossômica aliada à pintura cromossômica formam uma poderosa

ferramenta nos estudos citogenéticos, onde é possível delinear regiões cromossômicas

homeólogas entre espécies estreitamente relacionadas e também distantes (Nanda et al. 2011).

Diante dos diferentes mecanismos de determinação de sexo em peixes, o sistema cromossômico

sexual em Leporinus e Megaleporinus parece ser conservado e ter derivado de um ancestral

comum. Provavelmente, os cromossomos sexuais são diferentes, mas os diferentes

cromossomos W poderiam ter sido invadidos com as mesmas sequências repetitivas.

Os resultados aqui apresentados, utilizando Leporinus e Megaleporinus como modelo,

reforçam a hipótese de que os cromossomos sexuais ZW destes gêneros são encontrados apenas

em espécies estreitamente relacionadas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Jansen A. Zuanon por identificar os espécimes. À Dra. Patricia

Parise-Maltempi por ceder o laboratório para as análises de microdissecção. Ao Dr. Diovani

Piscor por ter auxiliado na técnica de microdissecção. Este estudo contou com o apoio das

agências brasileiras: Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (CNPq-

LCB), do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva (INPA/DIGEN), FAPEAM (PRONEX - FAPEAM/CNPq 003/2009), Centro de

Estudos de Adaptação a alterações ambientais na Amazônia (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq

573976/2008-2), e Edital MCT/CNPq/MEC/CAPES/FNDCT-Acao Transversal/FAPs nº

47/2010 (Rede BioPHAM).

57

CAPITULO III

Mapeamento cromossômico de elementos transponíveis Rex1 e Rex3 em oito espécies da

Família Anostomidae (Characiformes): sua interação com heterocromatina

Lucas Caetano de Barros¹, Eliana Feldberg¹

¹Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Programa de Pós-Graduação em

Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Av. André Araújo, 2936, Petrópolis, Manaus,

Amazonas, Brazil. CEP: 69067-375. Phone: +559236433606. Fax +559236433344. E-mail:

[email protected]

mailto:[email protected]

58

RESUMO

Os elementos transponíveis (ETs) têm o potencial de produzir mudanças nos genomas de seus

hospedeiros, atuando como um dispositivo evolutivo capaz de gerar uma coleção de novas

sequências reguladoras e codificadoras. Neste cenário, composto pelos ETs, a família

Anostomidae se apresenta como um modelo interessante para estudo destes elementos, uma vez

que, suas espécies apresentam grandes segmentos heterocromáticos, existindo aqueles

relacionados a cromossomos sexuais, os quais são restritos a algumas espécies de Leporinus e

Megaleporinus e os relacionados aos autossomos. Assim, o mapeamento cromossômico dos

elementos retrotransponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 foi realizado em oito espécies de Anostomidae,

com o objetivo de entender a organização genômica de ET relacionada com heterocromatina e

com o sistema de cromosomos sexuais ZW de M. trifasciatus. Os elementos Rex1 e Rex3

apresentaram diferentes padrões de hibridização, enquanto o elemento Rex6 não foi identificado

no genoma de nenhuma das espécies. As oito espécies apresentaram clusters de Rex1 nas regiões

terminais mas, sinais foram dispersos em todo o cromossomo. Leporinus fasciatus e Rhythiodus

microlepis apresentaram marcações pericentroméricas. Os sinais de Rex3 foram encontrados

principalmente em posição terminal em quase todos os cromossomos de todas as espécies. No

cromossomo W de M. trifasciatus o sinal de Rex1 e Rex3 foram evidenciados em todo braço

longo. Esses resultados sugerem diferentes níveis de atividade dos ETs, durante a evolução das

espécies analisadas. Apesar da clara e conservada macroestrutura cromossômica em

Anostomidae, muitas vezes discutida, nossos resultados mostram variações nos padrões de

hibridização, particularmente entre as espécies com padrões específicos em seus cromossomos

sexuais e espécies sem esse sistema diferenciado.

Palavras-chave: Elementos transponíveis, FISH, sequências repetitivas, cromossomo sexual

59

INTRODUÇÃO

Os Elementos transponíveis (ETs) são capazes de desempenhar papéis importantes na

evolução do genoma (Kidwell e Lisch 2000; Ozouf-Costaz et al. 2004), agindo como um

importante indutor evolutivo, gerando uma gama de novas regiões regulatórias e sequências

codificantes (Volff 2006; Bourque et al. 2008). O número de suas cópias pode aumentar

rapidamente por retrotransposição e servir como substrato para recombinações homólogas, em

várias categorias de rearranjos de DNA, incluindo deleções, inversões, translocações,

duplicações e amplificações (Ozouf-Costaz et al. 2004; Grabundzija et al. 2016). O

conhecimento da origem e função desses elementos e de seu papel na estrutura e organização

dos cromossomos, no genoma dos peixes teleósteos, ainda é escasso e fragmentado (Ferreira et

al. 2011).

Os ETs podem alterar ou interromper a expressão de genes, promovendo a variação

populacional (Akagi et al. 2008) e, possivelmente, uma adaptação rápida (Stapley et al. 2015).

Eles têm o potencial de gerar biodiversidade, transições evolutivas por mutações e domesticação

molecular (Blass et al. 2012). O potencial evolutivo da variação derivada de ETs tem sido

postulado como a hipótese epi-transposon e, de acordo com esta hipótese, mecanismos de

regulação epigenética (interferência de RNA, metilação do DNA e modificações de histonas)

suprimem a mobilização do ET. No entanto, o estresse fisiológico, induzido pela mudança

climática ou invasão de novos habitats, interrompe a regulação epigenética e desencadeia a

atividade de ETs (Zeh et al. 2009), sendo esta fortemente influenciada por fatores ambientais e

ecológicos. De fato, os eventos de especiação muitas vezes se correlacionam com a expansão de

novas famílias de ET (Jurka et al. 2011; Oliver e Greene 2011), sugerindo que ETs podem servir

como força motora para a adaptação, diversificação e especiação, gerando diversidade genômica

estrutural entre populações (Rebollo et al. 2012).

Eventualmente, ETs podem ser transferidos entre espécies isoladas reprodutivamente,

pela transferência horizontal, independente da clássica herança de pais para prole, e também

desempenha papel importante na diversidade genômica entre espécies (Schaack et al. 2010).

Duas classes de elementos transponíveis (ETs) são reconhecidas entre vertebrados:

retrotransposons e transposons. A primeira classe, os retrotransposons, se move através do

genoma pela ação da transcriptase reversa, uma enzima que pode promover a síntese de uma

cadeia de DNA a partir de um iniciador de RNA. A segunda classe, os transposons, inclui todos

os que são transpostos diretamente de DNA para DNA, sem outra molécula intermediária (Levin

e Moran 2011). Os retrotransposons podem ser agrupados de acordo com a presença ou ausência

de longas repetições terminais (LTR long terminal repeats). As LTRs são necessárias para a

60

transcrição e integração do cDNA, depois da transcrição reversa, sendo que são encontradas na

sequência dos LTRs, domínios para proteinase, integrase, transcriptase reversa e RNAse. Os

retrotransposons não-LTRs utilizam promotores internos para a sua transposição e codificam

uma transcriptase reversa e uma RNAse, sendo também conhecidos como LINES (long

interspersed elements) ou retrotransposons TP (target-primed). Além disso, dentro da categoria

dos não-LTRs, existem também os SINES (short interspersed nucleotide elements), que não

codificam a maquinaria enzimática necessária para a transposição, mas obtém esta

provavelmente por meio dos elementos LINES (Böhne et al. 2008).

Os peixes contêm todos os tipos conhecidos de elementos transponíveis em seu genoma

(Volff et al. 2003), sendo que alguns deles foram mapeados ao nível dos cromossomas. Volff et

al. (2001a) descrevem alguns dos elementos transponíveis da classe dos retrotransposons (LTR)

mais estudados em peixes (Tyt/Gypsy, Ty1/copy, DIRS1 e o BEL). Esses retrotransposons

descritos acima incorporam até 10 elementos que apresentam dados em relação à localização em

cromossomos de peixes. Entre estes estão os elementos Rex (Rex1, Rex3 e Rex6), que são

elementos retrotransponíveis, caracterizados pela primeira vez no genoma do peixe Xiphophorus

maculatus e parece ser o mais abundante em diferentes teleósteos (Volff et al. 2001b).

Em Characiformes, pouco é conhecido sobre a organização do retrotransposon Rex,

sendo que para a família Anostomidae, os dados disponíveis são apenas de seis espécies de

Leporinus e Megaleporinus (M. elongatus antigo L. elongatus, M. macrocephalus antigo L.

macrocephalus, M. obtusidens antigo L. obtusidens, L. friderici, L. lacustris, L. striatus) (Borba

et al. 2013).

Estudos em outros peixes apresentaram uma diversidade de padrões de distribuição para

esses elementos, como em Erythrinidae (Cioffi et al. 2010a), Cichlidae (Mazzuchelli e Martins

2009; Gross et al. 2009; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2013), Tetraodontidae (Bouneau et

al. 2003) e Loricariidae (Ferreira et al. 2011). Valente et al. (2011) mapearam os retroelementos

Rex1, Rex3 e Rex6 em oito espécies de ciclídeos e notaram uma deposição desses elementos na

região pericentromérica dos cromossomos. Outros estudos mostram também a preferência

desses retroelementos pelas regiões heterocromáticas (da Silva et al. 2002; Fischer et al. 2004),

regiões que normalmente podem acumular mais mutações sem sofrer grandes consequências.

Acredita-se que estes elementos transponíveis e retrotransponíveis estão envolvidos com

a diferenciação cromossômica sexual em alguns grupos, tais como Cyprinodontiformes (Volff et

al. 2000; Böhne et al. 2012) e Characiformes (Marreta et al. 2012; Terencio et al. 2012). Em

Semaprochilodus taeniurus, Terencio et al. (2012) observaram um aumento significativo no

61

tamanho do cromossomo W, devido o acúmulo de sequências repetidas de DNA, nas quais foi

encontrado Rex1.

Borba et al. (2013) analisaram três espécies de Leporinus, L. friderici, L. lacustris e L.

striatus e três espécies de Leporinus, L. elongatus, L. macrocephalus, L. obtusidens, (atuais M.

elongatus, M. macrocephalus, M. obtusidens) que apresentam sistema de cromossomos sexuais

do tipo ZZ/ZW, e evidenciaram marcações terminais e intersticiais nos braços longos do

cromossomo W, utilizando sondas Rex1 e Rex3. Os autores relatam que o padrão de distribuição

de elementos transponíveis não é aleatório e está relacionado com as características específicas

dos diferentes sitios no genoma. Hoje, sabe-se que L. elongatus (atual M. elongatus) apresenta

um sistema de cromossomos sexuais multiplo (Parise-Maltempi et al. 2007).

Assim, informações sobre o mapeamento físico cromossômico torna-se indispensável

para se conhecer a diversidade genética destes retroelementos e análises comparativas, entre

espécies são de particular interesse para o entendimento da dinâmica dos retroelementos na

evolução genômica dos anostomídeos amazômicos. No presente trabalho avaliamos a

organização genômica dos retrotransposons não-LTR Rex1, Rex3 e Rex6 em oito espécies de

anostomídeos, por meio do mapeamento físico cromossômico, o que permitiu o entendimento de

como estes retroelementos se comportam no genoma deste grupo de peixes.

MATERIAL E MÉTODOS

No presente estudo foram analisados 86 exemplares (machos e fêmeas), de 8 espécies de

Anostomidae, coletados na região amazônica (Figura 1 pag.16), sob a licença cedida pelo

SISBIO No. 28.095-1 para Eliana Feldberg.

Os indivíduos foram anestesiados em óleo de cravo e, então, os cromossomas mitóticos

foram obtidos a partir de células renais, segundo protocolo de Bertollo et al. (1978). Os peixes

foram numerados, identificados, fixados e depositados na coleção de peixes do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sob os números: INPA-ICT 053210, INPA-ICT

053211, INPA-ICT 053212, INPA-ICT 053213, INPA-ICT 053214, INPA-ICT 053215, INPA-

ICT 053216, INPA-ICT 053217, INPA-ICT 053218.

O DNA total foi extraído do tecido muscular, utilizando o protocolo de fenol-

clorofórmio descrito por Sambrook et al. (1989) e quantificado em espectrofotômetro NanoVue

Plus (GE Healthcare). A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada, utilizando os

primers RTX1-F1 (5’-TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC-3’) e RTX1-R1 (5’- TCC CTC

AGC AGA AAG AGT CTG CTC-3’) para amplificacao do segmento que corresponde ao gene

da transcriptase reversa do Rex1 (Volff et al. 2000); os primers RTX3-F3 (5’-CGG TGA YAA

62

AGG GCA GCC CTG-3’) e RTX3-R3 (5’-TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT-3’) para

amplificar a região que codifica o gene da transcriptase reversa do retrotransposon Rex3 (Volff

et al. 1999); e os primers Rex6-Medf1 (5’-TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCA C-3’) e

Rex6-Medr2 (5’-GGT CCT CTA CCA GAG GCC TGG G-3’) para amplificar a parte C-

terminal da endonuclease do retrotransposon Rex6 (Volff et al. 2001a).

As reacoes de PCR foram realizadas em um volume final de 25 μL contendo DNA

genômico (200 ng), tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, Taq DNA polimerase (5 U/μL), dNTPs

(1 mM), par de primers (5 mM), e água Milli- Q. Os perfis das reações para o Rex1, Rex3, e

Rex6 incluem os seguintes passos: 95 °C por 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 1 min, 55 °C por 40

s, e 72 °C por 2 min; seguidos por uma extensão final de 72 °C por 5 min. Os produtos de PCR

foram checados em gel de agarose 1,7%, quantificados em espectrofotômetro NanoVue Plus

(GE Healthcare) e utilizados como sondas para a FISH. As imagens foram capturadas e

processadas, utilizando o software DP Controller e uma câmara digital (Olympus modelo D71)

acoplada a um microscópio Olympus BX51.

RESULTADOS

Mapeamento cromossômico do elemento Rex1

A análise de hibridização in situ fluorescente (FISH), utilizando os fragmentos de PCR

do elemento Rex1 como sonda, detectou blocos conspícuos, com variação no número de

cromossomos marcados e na posição dos blocos sobre os mesmos, nas 8 espécies analisadas

(Figuras 1, 2 e 3).

A maioria dos aglomerados estiveram dispersos em quase todos os cromossomos, em

posição terminal, independente do sexo do peixe e do tipo de água, de onde foi coletado (preta,

branca, clara), exceto L. fasciatus (Figura 1c) e R. microlepis (Figura 3 f), que apresentaram

marcações pericentroméricas.

Algumas espécies M. trifasciatus (Figura 1a-b), L. fasciatus (Figura 1d,e), L.

uatumaensis (Figura 2 c), A. laticeps (Figura 3a-b) e Laemolyta taeniata (Figura 3 e-f)

apresentaram três tipos de marcações: telomérica, centromérica e pericentromérica.

Em um pequeno grupo de cromossomos das espécies L. fasciatus, L. friderici, L.

uatumaensis e S. fasciatus não foi evidenciada nenhuma marcação pela sonda Rex 1 (Figura 1, 2

e 3).

Nos cromossomas sexuais W e Z de M. trifasciatus foram evidenciadas marcações por

todo o braço longo (Figura 1a-b).

63

O menor número de cromossomos marcados foi visto em L. friderici e L. uatumaensis

(Figura 2) e o maior número de marcações foi visto em M. trifasciatus L. fasciatus (Figura 1), A.

laticeps, R. microlepis e S. fasciatus (Figura 3), respectivamente.

64


rio Negro, e: rio Uatumã, f: rio Purus), L. friderici (g: rio Tapajós, h: rio Purus), e L.

uatumaensis (i: rio Uatumã) analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com DAPI.

65

Figura. 2 Metafase de Leporinus. friderici (g: rio Tapajós, h: rio Purus), e L. uatumaensis (i:

rio Uatumã) analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com DAPI.

66



Catalão), analisadas por sonda Rex1 e contrastadas com DAPI.

67


A FISH, utilizando os fragmentos de PCR do elemento Rex3 como sonda, detectou um

padrão de mapeamento similar em todas as espécies (Figura 4, 5 e 6). Os aglomerados de ET

estiveram presentes nas regiões terminais de quase todos os cromossomos, e alguns estiveram

dispersos nos braços curtos e longos, independente do sexo e do tipo de água.

Também foi observado um pequeno grupo de cromossomos não marcados pela sonda, nas

espécies L. fasciatus (Figura 4 d), L. friderici (Figura 5 a-b) e S. fasciatus (Figura 6 d).

Em M. trifasciatus, os cromossomos sexuais W e Z apresentaram sinais em posição

terminal e em regiões intersticiais do braço longo (Figura 4 a-b).

O menor número de cromossomos marcados foi em L. friderici da água clara (Figura 5 a)

e o maior número de marcações foi em Laemolyta taeniata (Figura 6 e), A. laticeps (Figura 6 a) e

S. fasciatus (Figura 6 c) respectivamente.

68

Figura. 4 Metafase de Megaleporinus trifasciatus (a-b Catalão), L. fasciatus (c: rio

Tapajós, d: rio Negro, e: rio Uatumã, f: rio Purus), analisadas por sonda Rex3 e

contrastadas com DAPI.

69

Figura. 5 Metafase de L. friderici (a: rio Tapajós, b: rio Purus) e L. uatumaensis (c:

rio Uatumã), analisadas por sonda Rex3 e contrastadas com DAPI.

70



Catalão), analisadas por sonda Rex3 e contrastadas com DAPI.

71


A FISH, utilizando os fragmentos de PCR do elemento Rex6 como sonda, não detectou

nenhum sinal em nenhuma das espécies.

DISCUSSÃO

No nível mais básico de investigação, a porcentagem de elementos transponíveis (ETs)

no genoma de vertebrados pode variar de 6 a 60%, sendo que os principais tipos de ET já

descritos em eucariotos, estão presentes nos peixes (Chalopin et al. 2014, Sotero-Caio et al.

2017).

Sabe-se que os ETs podem se acumular em regiões distantes de genes (tais como em

heterocromatina ou regiões intergênicas) ou perto de genes (Kidwell 2005). Geralmente, esse

padrão de distribuição não é aleatório e parece ter alguma relação com características

específicas de sub-regiões dos genomas hospedeiros (Kidwell e Lisch 2000).

No presente estudo, as oito espécies (Tabela 1 pag. 17 ) apresentaram sinais de

hibridização com clusters de Rex1 e Rex3 compartimentalizados, mas também, pode-se

distinguir clusters em regiões terminais e/ou centroméricas. Estes padrões já foram observados

em espécies de Bryconinae (Silva 2012), de Erythrinidae (Cioffi et al. 2010b), de

Sternopygidae (Sene 2011), de Artedidraconidae (Ozouf-Costaz et al. 2004), Loricariidae

(Ferreira et al. 2011), Pimelodidae (Matoso et al. 2005) e Tetraodontidae (Fischer et al. 2004),

exceto em espécies da família Cichlidae, onde os elementos Rex estiveram distribuídos nas

regiões pericentroméricas (Mazzuchelli e Martins 2009; Schneider et al. 2013).

Borba et al. (2013) verificaram que sequências de Rex1 e Rex3 em espécies de

anostomídeos, que geraram sequências de 456-500 pares de bases e 411-429 pares de bases,

respectivamente, foram semelhantes às de outros grupos de peixes, incluindo peixes da

Antártica (Ozouf-Costaz et al. 2004) e ciclídeos (Teixeira et al. 2009). Isso foi confirmado pela

análise BLASTn, onde as sequências Rex1 e Rex3 compartilharam alta similaridade com as de

outros grupos de peixes, o que demonstra que esses elementos são conservados.

O movimento e acúmulo de ETs têm uma grande influência nos genomas, e está claro

que eles fazem parte do conjunto de ferramentas reguladoras, que desempenham papéis

importantes no controle da expressão gênica (Brookfield 2005; Slotkin e Martienssen 2007),

causando, em alguns casos, perda ou ganho de sequências e rearranjos cromossômicos

(Biémont e Vieira 2006).

A correlação entre rearranjo cromossômico e atividade do retrotransposon foi relatada

por Ozouf-Costaz et al. (2004), em espécies de Notothenioidae. Assim, as diferenças nos locais

72

de hibridização de Rex1, nas oito espécies aqui analisadas, podem estar relacionadas com

pequenos rearranjos em regiões específicas dos seus genomas. Considerando que as regiões

organizadoras do nucléolo (RONs) em anostomídeos apresentam grande variação quanto à

posição no cromossomo e localização no cariótipo, variações atribuídas a rearranjos

cromossômicos como translocações, duplicações e/ou inversões Barros et al. (2015), é possível

que o movimento deste marcador pode ter sido facilitado por elementos transponíveis.

Inclusive na geração de múltiplos DNAr 18S encontrados em Rhytiodus microlepis, Laemolyta

fasciatus, Megaleporinus trifasciatus e principalmente Schizodon fasciatus (Barros et al.

2015).

O mesmo padrão de sinais múltiplos de DNAr 18S foi observado em ciclídeos

(Schneider et al. 2013), em Symphysodon aequifasciatus (Gross et al. 2010), e em

Oreochromis niloticus (Nakajima et al. 2012), que verificaram que os genes RNAr 18S no

genoma estavam sempre cercados por ETs, sugerindo que tais elementos estariam agindo na

dispersão de cópias de 18S, gerando maior variabilidade no número de clusters.

Silva et al. (2016) descrevem a disseminação do DNAr 5S no genoma de Gymnotus

mamiraua, também como influência de elementos transponíveis. Kapitonov e Jurka (2003)

sugeriram que as sequências DNAr 5S sofrem pseudogeneização e perdem sua funcionalidade.

Este pseudo-gene poderia ser infectado por um retrotransposon e ganhar uma mutação no seu

local de terminação transcricional, criando uma estrutura híbrida e complexa com parte do gene

5S/pseudogene e parte do transposon, gerando um SINE.

Muitos estudos em Anostomidae têm destacado a correlação entre regiões

heterocromáticas e sequências repetitivas (Parise-Maltempi et al. 2007; Marreta et al. 2012;

Silva et al. 2013; Barros et al. 2015), uma vez que, muitas delas foram isoladas de segmentos

heterocromáticos, principalmente as presentes no cromossomo W, em espécies de Leporinus e

Megaleporinus, e em regiões Ag-RON (Nakayama et al. 1994; Silva et al. 2013).

Das oitos espécies aqui investigadas, seis (M. trifasciatus, L. fasciatus, L. friderici,

Laemolyta taeniata, Rhythiodus microlepis e Schizodon fasciatus) tiveram seu padrão

heterocromático descrito, onde foram evidenciados grandes blocos de heterocromatina. Em M.

trifasciatus, que tem o sistema de cromossomo sexual ZW, o braço longo do cromossomo W é

totalmente heterocromático e duas vezes maior que o cromossomo Z, que também apresenta o

braço longo heterocromáticoo (Barros et al. 2015).

Numa análise comparativa, observa-se um acúmulo de Rex1 e Rex3, principalmente em

regiões heterocromáticas mas, pequenos sinais também foram detectados em regiões

eucromáticas. Outros estudos sugerem que elementos transponíveis podem se acumular em

73

segmentos eucromáticos, como os encontrados em Drosophila melanogaster, onde 3,8% do

genoma eucromático compreende elementos transponíveis (Busseau et al. 1994).

Schneider et al. (2013) sugerem duas hipóteses para o surgimento de ETs em regiões

eucromáticas: i) a distribuição cromossômica destes ETs pode ser conduzida por mecanismos

evolutivos e sua evolução pode ser diferente de outras sequências repetitivas, comumente

presentes na heterocromatina; ii) estes ETs poderiam ter adquirido conhecimentos estruturais,

sendo que, suas funções e seu movimento para regiões eucromáticas poderiam trazer vantagem

para o genoma, mantidos de acordo com mecanismos neutros.

Existe uma associação de cariótipos reorganizados com regiões que podem abrigar

clusters dispersos de elementos Rex. Embora ETs tenham sido associados com rearranjos de

cariótipo (Lim e Simmons, 1994; Dimitri et al. 1997), mudanças no genoma poderiam eliminar

os elementos Rex das áreas eucromáticas intersticiais e levar ao seu acúmulo em regiões

heterocromáticas. Este padrão foi observado nas espécies Heros efasciatus e Symphysodon

spp., pertencentes a grupos com cariótipo rearranjado, onde os elementos Rex estão agrupados

em áreas heterocromáticas (Gross et al. 2009; Valente et al. 2010).

A distribuição do elemento Rex3 foi semelhante à do Rex1 para as oito espécies. Este

padrão semelhante sugere a compartimentalização de sequências em posições

preferencialmente terminais dos cromossomas nestas espécies. É provável, que mecanismos

evolutivos semelhantes respondam pela distribuição desses elementos em espécies da família

Anostomidae e em outras famílias de peixes, como Cichlidae (Valente et al. 2011).

Analisando nossos dados, cruzando as sondas Rex1 e Rex3 com diferentes tipos de

águas da região amazônica (preta, branca e clara), verificamos que em alguns casos específicos

como apresentado pela espécie L. fasciatus, na qual, foi observada uma abundância de

repetições do retroelemento Rex1 foi maior nas amostras provenientes de água preta dos rios

Negro e Uatumã, respectivamente. Outra espécie que chamou atenção foi L. friderici, onde a

sonda Rex3 evidenciou grande número de marcações nos indivíduos vindos de água branca, do

rio Purus. Santos et al. (2016) analisando a variação citogenética de elementos repetitivos e

retroelementos Rex3 em Hoplias malabaricus de rios de águas brancas, negras e claras da bacia

amazônica, observaram uma abundância de repetições deste retroelemento nos indivíduos

provenientes da água branca. Por outro lado, o padrão visualizado nos cariótipos dos

indivíduos de água clara e negra foi interpretado como sendo disperso. Os autores concluiram

que, as diferenças observadas em Hoplias malabaricus podem refletir um mecanismo fino de

modelagem citogenética e, possivelmente, representa uma assinatura de processos de adaptação

local em andamento.

74

Gross et al. (2012) compararam o elemento retrotranponível Rex3 em cinco espécies de

ciclídeos, duas espécies de Semaprochilodus e uma espécie de Hoplosternum de diferentes

ambientes amazônicos, onde foi evidenciado uma notável variação das marcações Rex3 entre

os diferentes tipos de água (preta, branca e clara).

Não foi evidenciada nenhuma marcação, utilizando a sonda Rex6 nas espécies em

estudo. A perda do elemento Rex6 tem sido relatada em peixes da Antártida (Ozouf-Costaz et

al. 2004). O mesmo processo pode ter ocorrido em espécies de Leporinus e Megaleporinus

(Borba et al. 2013) e também nas espécies analisadas no presente estudo, não apenas de

Leporinus, mas estendendo-se a espécies de outros quatro gêneros (Rhythiodus, Laemolyta,

Schizodon e Anostomoides), dentro de Anostomidae. Entretanto, a sequência Rex6 foi obtida, o

que sugere uma possível perda desta sequência por processos moleculares ou sua presença não

ter sido detectada pela FISH por ser muito pequena. Schneider et al. (2013) encontraram fato

semelhante em espécies da família Cichlidae.

A presença de sinais específicos para elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3 no

cromossomo W de M. trifasciatus evidencia sua participação na formação deste sistema,

presente em espécies de Leporinus e Megaleporinus. A hipótese do acúmulo de ETs como o

principal indutor da diferenciação de cromossomos sexuais em Anostomidae é amplamente

aceita (Nakayama et al. 1994; Parise-Maltempi et al. 2013), estendendo-se a outros grupos de

peixe (Ozouf-Costaz et al. 2004; Terencio et al. 2012). Porém, em M. elongatus (antigo L.

elongatus), que apresenta um sistema de cromossomo sexual múltiplo de origem recente

(Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2) foi proposto que os elementos repetitivos são diferentes (Silva et al.

2013; Parise-Maltempi et al. 2013).

Outros trabalhos apresentam resultado semelhandte, p.e. Ozouf-Costaz et al. (2004)

identificaram sinais de hibridização de elementos Rex3 em uma posição intersticial no braço

curto do cromossomo Y de Chionodraco hamatus (Channichthyidae). Terencio et al. (2012),

em sua análise do elemento Rex1 de Semaprochilodus taeniurus, verificaram uma distribuição

compartimentalizada em alguns cromossomos, com sinais de hibridização nas regiões

centromérica e telomérica, tanto em machos quanto em fêmeas e o cromossomo W apresentou

sinais evidentes ao longo de todo o seu comprimento.

A presença dos elementos Rex1 e Rex3 no cromossomo W de Megaleporinus

trifasciatus pode estar relacionada à supressão da recombinação, durante o processo de

diferenciação do cromossomo sexual, devido principalmente a um aumento dos segmentos

heterocromáticos com acúmulo de elementos repetitivos, como discutimos anteriormente.

75

Um aumento dos segmentos heterocromáticos devido à diferenciação do cromossomo

W em espécies de Leporinus (agora Megaleporinus) foi proposto por Galetti e Foresti (1986).

Esses pesquisadores sugeriram que a concentração de heterocromatina teve um papel

específico na diferenciação de cromossomos sexuais, indicando assim uma origem comum do

sistema sexual cromossômico encontrado em diferentes espécies deste gênero. Estudos

recentes têm apoiado esta hipótese, baseada em sequências repetitivas relacionadas ao

cromossomo W (Parise-Maltempi et al. 2007; Marreta et al. 2012; Silva et al. 2013), onde,

essas sequências estão relacionadas estritamente com espécies que apresentam cromossomos

sexuais diferenciados (ZZ/ZW). Outro estudo demonstrou homeologia entre os cromossomos

W de espécies de Leporinus e Megaleporinus, o que apóia a hipótese de uma origem comum

para este sistema de cromossomos sexuais nos gêneros (Parise-Maltempi et al. 2013).

Em nosso estudo, o padrão de distribuição de Rex1 e Rex3 nos cromossomos sexuais de

M. trifasciatus, também apóia a hipótese de uma origem comum do cromossomo W em

espécies de Leporinus e Megaleporinus. Contudo, acreditamos, que o sistema de cromossomo

sexual de M. trifasciatus encontra-se em um estágio evolutivo diferenciado das demais

espécies do gênero, que apresentam o sistema ZZ/ZW. Esta hipótese é apoiada também nos

trabalhos de Parise-Maltempi et al. (2007; 2013), Borba et al. (2015), nos quais o padrão de

sinais, para diferentes sondas, são divergentes entre os cromossomos W. Ramirez et al. (2016)

apresentaram uma filogenia para Leporinus, com base em dois marcadores mitocondriais

(CO1, Cytb) e três nucleares (Myh6, RAG1, RAG2), evidenciando que o gênero tem um clado

monofilético em relação às espécies que apresentam sistema de cromosssomos sexuais

diferenciados, onde M. trifasciatus (antigo L. trifasciatus) é a espécie basal. Ramirez et al.

(2017), publicaram um novo trabalho com base em características, morfológicas, citogenéticas

e moleculares, a qual, L. trifasciatus (atual Megaleporinus trifasciatus), continua na base da

filogenia, ficando atrás de M. muyscorum.

Embora as informações disponíveis sobre a organização estrutural, evolução e

comportamento funcional dos ETs no genoma dos peixes ainda estejam muito fragmentadas e

restritas a poucas espécies, os dados deste trabalho podem ser vistos como mais uma

contribuição para o entendimento destes elementos, em peixes da Amazônia.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Jansen A. Zuanon por identificar os espécimes. Este estudo

contou com o apoio das agências brasileiras: Conselho Nacional de Pesquisa e

Desenvolvimento Tecnológico (CNPq-LCB), do Instituto Nacional de Pesquisas da

76

Amazônia/Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (INPA/DIGEN), FAPEAM (PRONEX

- FAPEAM/CNPq 003/2009), Centro de Estudos de Adaptação a alterações ambientais na

Amazônia (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq 573976/2008-2), e Edital

MCT/CNPq/MEC/CAPES/FNDCT-Acao Transversal/FAPs nº 47/2010 (Rede BioPHAM).

5. CONCLUSÕES:

As análises citogenômicas empregadas neste estudo, em oito espécies de anostomídeos,

não revelaram diferenças genéticas entre indivíduos de uma mesma espécie provenientes dos

diferentes tipos de água amostrados. Este resultado pode ser reflexo do comportamento e ciclo

de vida destes peixes, sendo que, algumas espécies realizam ciclos de migração.

Apesar das oito espécies de anostomídeos apresentarem 2n=54 cromossomos,

características cromossômicas distintas foram evidenciadas em cada espécie.

As análises de citogenética clássica corroboraram parcialmente os dados encontrados

em estudos anteriores, diferindo somente nos pares portadores das regiões organizadoras de

nucléolo (RON).

Múltiplos sítios de DNA ribossomal 18S, foram evidenciados nas espécies, Rhytiodus

microlepis, Laemolyta taeniata, Megaleporinus trifasciatus e principalmente em Schizodon

fasciatus, podendo tratar-se de pseudogenes ou sequências repetitivas originadas deste gene,

transpostas por retrotransponsons, sendo um processo natural de nascimento e morte de

sequencias repetitivas no genoma.

Os genomas das oitos espécies apresentam grande quantidade de sequências repetitivas,

dentre elas retrotransposons, os quais estão envolvidos na dinâmica evolutiva neste grupo de

peixes.

As sequências repetitivas estão envolvidas na evolução do sistema de cromossomos

sexuais ZZ/ZW em M. trifasciatus, uma vez que, a microdissecção do cromossomo W revelou

alta densidade de sinais destas sequências neste cromossomo.

O heteromorfismo do cromossomo W se deu por acúmulo de heterocromatina,

provavelmente originada como mecanismo de defesa contra elementos invasivos, tais como

retrotransposons identificados neste cromossomo.

77

6. PERSPECTIVAS

Avanços significativos foram alcançados no entendimento da organização genômica de

algumas espécies da família Anostomidae, entretanto, alguns aspectos importantes ainda

precisam ser investigados, como:

A investigação do DNAr 18S permitirá traçar um panorama melhor a respeito da

evolução dessa sequência nesta família, principalmente se a infecção por um elemento de

transposição, envolvido com a família ribossamal, interfere na dinâmica dessa sequência.

O sequenciamento de última geração (next generation) dos cromossomos sexuais Z e

W para revelar a composição genômica destes cromossomos, bem como a identificação dos

genes envolvidos na determinação sexual nesta espécie.

78

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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