INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA - GCBEv Marcos Prado Lima Manaus - AM Maio de 2016 EFEITOS DAS MUDANÇAS CLIMÁTICAS SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E A FISIOLOGIA DO TAMBAQUI (Colossoma macropomum, Cuvier, 1818)
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS D A AMAZÔNIA - INPA ... · iii FICHA CATALOGRÁFICA SINOPSE O tambaqui, Colossoma macropomum, foi utilizado para investigar o efeito das mudanças
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA - GCBEv
Marcos Prado Lima
Manaus - AM Maio de 2016
EFEITOS DAS MUDANÇAS CLIMÁTICAS SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E
A FISIOLOGIA DO TAMBAQUI (Colossoma macropomum, Cuvier, 1818)
i
MARCOS PRADO LIMA
Orientador: Adalberto Luis Val
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva do
Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, como requisito para a
obtenção do título de Doutor em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus - AM Maio de 2016
EFEITOS DAS MUDANÇAS CLIMÁTICAS SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E
A FISIOLOGIA DO TAMBAQUI (Colossoma macropomum, Cuvier, 1818)
ii
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
SINOPSE O tambaqui, Colossoma macropomum, foi utilizado para investigar o efeito
das mudanças climáticas durante 150 dias de exposição aos cenários climáticos
B1, A1B e A2 previstos pelo IPCC para o ano 2100. Foram avaliados o perfil
transcricional, a ocorrência de danos ao DNA dos eritrócitos, diversos
parâmetros hematológicos e aspectos de regulação iônica. Os resultados
indicaram que as mudanças climáticas provocarão alterações na expressão de
diversos genes, assim como desequilíbrio em processos metabólicos vitais que
alteram a homeostase celular do tambaqui e podem colocar em risco a
L732e Prado-Lima, Marcos Efeitos das mudanças climáticas sobre a expressão gênica e a
fisiologia do tambaqui (Colossoma macropomum, Cuvier, 1818) / Marcos Prado Lima --- Manaus: [s.n.], 2016.
xvii, 152 f.: il., color. Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2016. Orientador: Adalberto Luis Val. Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva do INPA.
Ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do INPA, ligado
a Coordenação de Biodiversidade, onde este trabalho foi desenvolvido com
financiamento proporcionado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq - Proc. Nº 573976/2008-2) e pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM - Proc. No 3159/08), por meio do INCT-
ADAPTA (Centro de Adaptações da Biota Aquática da Amazônia).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudos durante a realização deste trabalho.
À Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA) pela liberação das
atividades como docente da instituição para cursar o doutorado.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado forças para superar os incontáveis obstáculos
enfrentados nessa longa caminhada. À Nossa Senhora Aparecida pelo amparo e
proteção durante os anos longe de casa.
À minha querida esposa, Gilcideya Prado, que me incentivou e me apoiou em
todos os momentos. Obrigado pela paciência, compreensão e ombro amigo desde o
mestrado! Sua presença ao meu lado foi fundamental para a concretização deste
sonho. Te amo!
À minha filha, Maria Clara, que veio ao mundo no momento mais crítico dessa
caminhada, mas trouxe um alento imensurável ao meu coração. Obrigado pelo seu
sorriso! Era dele que eu lembrava nos momentos mais difíceis que enfrentei nessa
fase final do doutorado.
Às minhas mães Fátima, Vicência e Maria Portela (in memorian) por todo o
apoio na busca dos meus sonhos. Durante todos esses anos longe de Santarém
vocês foram e continuam sendo minha referência, meu porto seguro.
Ao meu orientador, Adalberto Val, pela confiança no meu trabalho, pelos
conselhos e orientações recebidas ao longo dos últimos nove anos, desde o início
do mestrado. Sua disponibilidade em ler e reler meus textos, inclusive em finais de
semana e feriados, é um exemplo que demostra sua dedicação e amor pelo que faz.
Obrigado também por ter se tornado um exemplo, uma referência de quais valores
devem ser seguidos no mundo da ciência. Serei eternamente grato a você,
Adalberto!
À Dra. Vera Val pelo apoio, amizade e incentivo em diversos momentos dessa
jornada.
À Alzira Miranda e Fernanda Dragan pela colaboração e companheirismo
durante os vários meses de experimento nas futurísticas salas dos microcosmos. A
Daniel Fagundes e Renato Lemgruber pelo auxílio no sequenciamento.
À Lucas Canesin do Laboratório de Bioinformática e Biologia de Sistemas da
UNICAMP pelo auxílio com as análises de bioinformática.
Aos colegas da sala de doutorandos, especialmente Daiani Kochhann, Rafael
Duarte, Helen Sadauskas, Ramon Baptista, Jorge Sá e Derek Campos pelas
discussões científicas, conselhos e dicas em diversos momentos.
vii
Às minhas PIBICs preferidas, Jéssica Rany e Aldiane Passos, pela ajuda em
diversas etapas. À Susana Mota e Deney Araújo pela disponibilidade e auxílio em
vários momentos.
À Nazaré Paula (Naza) pela amizade, apoio e eficiência na resolução de
incontáveis problemas. Obrigado também pelos muitos conselhos diante dos
obstáculos enfrentados para se fazer ciência no meio da Amazônia.
À Raimunda Brandão, Claudinha Silva e Raquel Abecassiz pelo apoio no
setor administrativo do laboratório. Aos técnicos Reginaldo Oliveira e Rogério
Pereira pela disponibilidade em ajudar.
Aos colegas do Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do
INPA pelo companheirismo, amizade e pelas inúmeras discussões científicas (e não
científicas também) ao longo desses últimos nove anos. Aprendi muito com vocês!
A todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram para a
concretização deste sonho, inclusive aquelas que, infelizmente, tenha esquecido de
citar. Muito obrigado por tudo!
viii
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”
(Madre Teresa de Calcutá)
ix
RESUMO
Nos últimos anos o equilíbrio dos ecossistemas naturais do planeta tem sido afetado pelas mudanças climáticas resultantes do aumento de gases do efeito estufa, especialmente dióxido de carbono. De acordo com o Painel Internacional sobre Mudanças no Clima, o IPCC, até o ano 2100 haverá elevação na temperatura média em todo o planeta, o que aumenta o risco de perda de biodiversidade em regiões mais vulneráveis como a Amazônia. Os peixes, assim como outros animais ectotérmicos, não possuem a capacidade de controlar sua temperatura corporal, ficando então sujeitos a variações ambientais que podem inviabilizar processos metabólicos vitais, levando o organismo à morte. Assim, para compreender como o tambaqui e outros peixes amazônicos poderão reagir ao aumento nos níveis de CO2 e de temperatura, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos da exposição do tambaqui, uma espécie símbolo da Amazônia, aos principais cenários de mudanças climáticas previstos pelo IPCC para o ano 2100. Exemplares de tambaqui foram expostos durante 150 dias ao cenário atual e a três cenários climáticos B1, A1B e A2. Na primeira parte do estudo foram investigadas alterações na expressão gênica após 5 e 15 dias de exposição por meio da construção de oito bibliotecas de RNA-Seq, que foram sequenciadas em um sequenciador de nova geração SOLID 4. Os resultados obtidos possibilitaram a identificação de 32.512 genes do transcriptoma do tambaqui, sendo 236 e 209 diferencialmente expressos após 5 e 15 dias de exposição, respectivamente. O grande número de genes diferencialmente expressos identificados sugere que uma complexa combinação de genes está envolvida na resposta do tambaqui às mudanças climáticas, especialmente genes relacionados ao metabolismo energético, chaperonas, fatores de iniciação da transcrição e tradução e genes ribossomais. Na segunda parte do estudo foram investigadas a ocorrência de danos ao DNA de eritrócitos, diversos parâmetros hematológicos e aspectos de regulação iônica do tambaqui durante 150 dias de exposição. Os resultados revelaram aumento no número de quebras no DNA de eritrócitos após 30 dias de exposição, alterações em diversos parâmetros hematológicos, especialmente aqueles relacionados ao aumento no número de eritrócitos e um severo desbalanceamento na concentração de íons plasmáticos e na atividade das principais enzimas branquiais de regulação iônica. Dessa forma, concluímos que os três cenários de mudanças climáticas avaliados podem provocar graves desequilíbrios em processos metabólicos vitais que alteram a homeostase celular do tambaqui e podem colocar em risco a sobrevivência da espécie.
ABSTRACT In recent years, the balance of the natural ecosystems has been affected by
climate change resulting from a continuous increase of greenhouse gases, mainly carbon dioxide. According to the Intergovernmental Panel on Climate Change, the IPCC, there will be an increase in the temperature around the planet, which enhances the risk of biodiversity loss in vulnerable regions such as the Amazon. Fish, like other ectothermic animals, do not control their body temperature and will then be subject to environmental variations that can compromise vital metabolic processes, causing to death. Thus, to understand how Amazonian fish can respond to global climate change, this study aimed to evaluate the biological effects of exposure of tambaqui, an Amazonian important fish species, to major climate change scenarios foreseen by IPCC for the year 2100. Juveniles of tambaqui were exposed during 150 days to the current environmental situation and B1, A1B and A2 climate change scenarios. Firstly were investigated changes in gene expression profile after 5 and 15 days of exposure through the construction of eight RNA-Seq libraries, which were sequenced using a next generation sequencer SOLID 4. The obtained results enabled to identify 32,512 genes on the transcriptome of tambaqui, being 236 and 209 differentially expressed after 5 and 15 days of exposure, respectively. A large number of differentially expressed genes identified indicates that a complex combination of genes is involved in tambaqui's response to climate change, especially genes related to energy metabolism, chaperones, transcription initiation factors and translation and ribosomal genes. Secondly, we investigated the occurrence of DNA damage in erythrocytes, several hematological parameters and ion regulation of tambaqui during 150 days of exposure to the various climate change driven environmental scenarios. The results revealed the existence of DNA strand breaks in erythrocytes after 30 days of exposure, changes in several hematological parameters, particularly those related to increase of red blood cells to compensate the increased demand of oxygen to tissues, as well as a severe imbalance in the plasma ion concentrations and the activity of key ion regulation enzymes of the gills. Thus, we concluded that the exposure of tambaqui to the analyzed climate change driven environmental scenarios can result in severe imbalances of vital metabolic processes that impair cellular homeostasis and pose a greater health risk to the analyzed species. Keywords: Amazonia, global warming, differential expression, comet assay, hematology, ionic regulation.
Tabela S4. Oligonucleotideos iniciadores e tipos de microssatélites encontrados nas
sequências de tambaqui.......................................................................................... 116
Capítulo III
Tabela 1. Principais genes diferencialmente expressos que responderam a
exposição do tambaqui aos cenários climáticos B1, A1B e A2............................... 124
xv
LISTA DE FIGURAS
Introdução
Figura 1. Diferentes cenários climáticos previstos pelo IPCC para o ano 2100. As
linhas sólidas representam tendências globais de aquecimento da superfície para os
cenários B1, A1B e A2, mostrados como continuações das simulações do século
XX. Os sombreamentos representam intervalos de desvio padrão das médias
anuais. A linha laranja simula a tendência de aquecimento caso as concentrações de
gás carbônico se mantenham constantes aos valores do ano 2000. As barras cinzas
a direita indicam a melhor estimativa (linha sólida dentro de cada barra) e a faixa
provável avaliada para seis cenários climáticos. Fonte: AR4, IPCC (2007)............. 19
Figura 2: Exemplar de Colossoma macropomum.................................................... 24
Capítulo I
Figura 1. Indicador de Dano Genético (GDI) em eritrócitos de tambaqui ao longo do
período experimental de exposição aos cenários climáticos controle, B1, A1B e A2. t Indica diferença significante em comparação ao cenário controle no mesmo tempo
de exposição (P<0.05). * Indica diferença significante em comparação ao tempo zero
Figura 3. Atividade da Na+/K+-ATPase nas brânquias de tambaqui ao longo do
período experimental de exposição aos cenários climáticos controle, B1, A1B e A2. t Indica diferença significante em comparação ao cenário controle no mesmo tempo
de exposição (P<0.05). * Indica diferença significante em comparação ao tempo zero
O aquecimento global, resultante principalmente do acúmulo de gases de
efeito estufa (GEE) na atmosfera, especialmente dióxido de carbono (CO2), metano
(CH4) e os óxidos nitrosos (N2O), representa uma grande ameaça ao planeta (IPCC,
2014). Diversos estudos comprovam que as mudanças climáticas já em curso
resultam em alterações nos padrões globais da vegetação e mudanças no uso da
terra (Hirota et al. 2011; Lapola et al. 2014), redução da biodiversidade mundial
(Ficke et al. 2007; Chown et al. 2010) e mudanças na composição atmosférica
(Walker e Steffen1997) em diversas regiões do planeta, inclusive no Brasil (Lapola et
al. 2014).
As primeiras evidências de modificações no clima do planeta surgiram ainda
na década de 1980 e, desde então, vêm despertando de forma crescente maior
interesse e preocupação tanto da comunidade científica quanto da população em
geral (Lima et al. 2011). Devido ao desconhecimento sobre os impactos de
alterações na estabilidade climática mundial, em 1988 a Organização das Nações
Unidas, por meio do Programa das Nações Unidas para o Meio Ambiente, e a
Organização Meteorológica Mundial, criaram o Painel Intergovernamental sobre
Mudanças Climáticas (Intergovernamental Panel on Climate Change - IPCC) com o
objetivo de avaliar as informações científicas, técnicas e socioeconômicas relevantes
para entender os riscos induzidos pelas mudanças climáticas na população humana,
bem como propor cenários de mudanças climáticas para o futuro (Marengo 2007).
A organização do IPCC, tal como seus cinco relatórios publicados em 1990,
1995, 2001, 2007 e 2014, baseia-se em três eixos principais: 1) compreensão dos
fatores humanos e naturais que causam as mudanças do clima; 2) impacto social e
ambiental das mudanças do clima, adaptação e vulnerabilidade; 3) busca de
medidas de mitigação e adaptação às mudanças climáticas. Os cientistas do IPCC
utilizam modelos matemáticos para simular os impactos das mudanças climáticas no
clima e nos ecossistemas em nível global e regional, especialmente relacionados a
alterações na concentração de GEE na atmosfera (Stéfanon et al. 2015). Dessa
forma, coube ao IPCC o importante papel de criar diferentes cenários climáticos
cientificamente embasados, utilizando indicadores de áreas como meteorologia,
climatologia, paleontologia, hidrologia, biologia e áreas afins para prever possíveis
19
trajetórias de desenvolvimento global a partir da emissão de diferentes níveis de
GEE na atmosfera (Viner et al. 1995; Moss et al. 2010).
Em seus últimos relatórios, publicados em 2007 (AR4) e 2014 (AR5), o IPCC
descreve vários avanços obtidos a partir da utilização de projeções de possíveis
cenários climáticos baseando-se na avaliação do impacto dos fatores humanos e
naturais nas mudanças climáticas, considerando diferentes níveis de emissão de
GEE (IPCC 2007; 2014). Cenários são estórias relevantes e cientificamente
embasadas sobre como o futuro pode se desdobrar, expressas na forma de palavras
e números, evidenciando incertezas e caminhos futuros. Portanto, não podem ser
considerados previsões, projeções ou recomendações (Raskinet al. 2005; IPCC
2007; 2014). Todos os 40 cenários previstos pelo AR4 para o ano 2100 têm origem
a partir de quatro grandes famílias de cenários (A1, A2, B1 e B2) caracterizadas
qualitativamente a partir de diferentes caminhos de desenvolvimento
socioeconômico e uso de combustíveis fósseis ou fontes de energia renováveis e
devem ser vistos como matéria-prima para o aprofundamento de estudos que visem
a elaboração de ações de mitigação de impactos e adaptação às mudanças
climáticas (IPCC 2007).
Figura 1. Diferentes cenários climáticos previstos pelo IPCC para o ano 2100. As linhas sólidas representam tendências globais de aquecimento da superfície para os cenários B1, A1B e A2, mostrados como continuações das simulações do século XX. Os sombreamentos representam intervalos de desvio padrão das médias anuais. A linha laranja simula a tendência de aquecimento caso as concentrações de gás carbônico se mantenham constantes aos valores do ano 2000. As barras cinzas a direita indicam a melhor estimativa (linha sólida dentro de cada barra) e a faixa provável avaliada para seis cenários climáticos. Fonte: AR4, IPCC (2007).
20
O crescente aumento nas emissões de GEE, principalmente CO2, registrado
nas últimas décadas, relacionado à queima de combustíveis fósseis e mudanças no
uso da terra, tem sido o fator decisivo para o aquecimento global. Entre os anos de
1906 e 2005 houve um aumento de 0,74oC na temperatura média do planeta, esse
aumento pode, no entanto, chegar a 4,5oC até o ano de 2100. Outras consequências
decorrentes do aquecimento global têm sido registradas com maior frequência nos
últimos anos, como mudanças nos padrões de vento e chuvas, alterações de
correntes marítimas e intensificação da desertificação em determinadas regiões
(IPCC 2007).
Desde a revolução industrial até o ano de 2005, a concentração de CO2 na
atmosfera cresceu 33%, passando de 280 para 379 ppm, ritmo muito acima do que
foi registrado nos últimos 800 mil anos (180 a 300 ppm) (Brundtland et al. 2012;
IPCC 2007). De acordo com AR4, entre 1995 e 2005 o aumento médio de CO2 na
atmosfera foi de 1,9 ppm, podendo chegar entre 730 a 1020 ppm até 2100 (IPCC
2007). Caso os níveis atuais de emissões de CO2 continuem a crescer, a
temperatura no planeta pode ficar 4oC acima da registrada antes da revolução
industrial (Rockström et al. 2014).
Diversos estudos que analisaram os efeitos das mudanças climáticas indicam
que seus efeitos não serão homogêneos em diferentes regiões do planeta (Döll e
Zhang 2010; Stéfanon et al. 2015). Em decorrência da Cordilheira dos Andes e de
uma grande heterogeneidade climática, a América do Sul é uma das regiões mais
vulneráveis às mudanças climáticas (Grimm e Natori 2006; Hirota et al. 2011). De
acordo com o IPCC, depois da Polinésia, África, parte da Ásia e Caribe, a América
do Sul é considerada a parte do planeta que mais sofrerá com os efeitos das
mudanças no clima, que poderão resultar no aumento de eventos climáticos
extremos como alterações significativas da disponibilidade hídrica, salinização e
desertificação de áreas utilizadas para agricultura, riscos de inundação em áreas
costeiras baixas e deslocamento dos estoques pesqueiros (IPCC 2007). A
temperatura média da América do Sul sofrerá um aumento que poderá chegar a 6ºC,
produzindo efeitos catastróficos em diversas regiões do continente, porém o Brasil
sofrerá as alterações mais severas, especialmente nas regiões mais sensíveis às
mudanças climáticas como a Amazônia e a região Nordeste (Nobre et al. 2007;
Hirota et al. 2010).
21
1.2 – Mudanças climáticas na Amazônia
A bacia amazônica, formada pelo rio Amazonas e seus afluentes, escoa para
o mar entre 15 e 20% de toda a água doce do planeta (Salati e Vose 1984). No
período chuvoso estima-se que até 29% da área da bacia fique coberta por água em
razão de seus muitos rios, lagos e igarapés que atuam como uma fonte geradora de
calor e umidade que regula o regime de chuvas em ambos os hemisférios,
possuindo um papel vital no clima global (Castello et al. 2013; Cheng et al. 2013).
Dessa forma, as mudanças climáticas podem afetar substancialmente a região
amazônica e, consequentemente, alterar o clima global (Nobre et al. 2005; Castello
et al. 2013).
A região amazônica vem sofrendo nas últimas décadas uma crescente
pressão antrópica que tem provocado redução na sua cobertura vegetal como
consequência do desmatamento e de incêndios florestais que, somados ao
aquecimento global, ameaçam a estabilidade climática, ecológica e ambiental da
região (Nobre et al. 2007). A crescente fragmentação de habitats e ecossistemas,
como consequência do desmatamento, consiste não apenas em um fator aditivo ao
impacto das mudanças climáticas, mas sim em um fator multiplicador quando se
consideram também o estresse associado a essas mudanças (Marengo 2007).
Sendo assim, é difícil estimar a vulnerabilidade das espécies às mudanças
climáticas devido à escassez de informações cientificamente embasadas (Canhos et
al. 2007).
De acordo com vários cenários do IPCC, até o ano de 2100 a temperatura
média na Amazônia terá um aumento acima de 3ºC, o que aumentaria a chance de
perda da cobertura florestal em 40% em algumas regiões, elevando o risco de perda
de biodiversidade e aumentando a ocorrência de eventos climáticos extremos, como
a seca de 2005 (IPCC 2007; Nobre et al. 2007). A assombrosa velocidade com que
as mudanças no clima do planeta vêm ocorrendo nas últimas décadas, quando
comparadas àquelas dos processos naturais, consiste em uma ameaça real para
espécies da flora e da fauna amazônicas, colocando em perigo a região que possui
a maior biodiversidade do mundo, tendo como consequência um provável
“empobrecimento biológico” na região (Nobre et al. 2005; 2007).
Além das florestas, o clima mais seco que o atual em parte da Amazônia
afetará também o ambiente aquático que sofrerá profundas alterações, tanto pelas
mudanças na dinâmica do sistema hidrológico, quanto por alterações pontuais que
22
podem ter profundos efeitos sobre os ecossistemas e as comunidades de
organismos aquáticos (Portner e Farrell 2008; Gamito et al. 2013). Essas alterações
tornarão o solo e a atmosfera da Amazônia menos úmidos, aumentado a
evapotranspiração das plantas que terá efeitos tanto na redução do escoamento
superficial quanto na vazão dos rios, modificando ecossistemas e dificultando a
navegação em alguns períodos do ano (Döll e Zhang 2010; Liberato e Brito 2010).
1.3 – Peixes expostos às mudanças climáticas
Diversas alterações em ambientes aquáticos relacionadas com variações
climáticas têm sido descritas nas últimas décadas, indicando que esses
ecossistemas são extremamente sensíveis e vulneráveis às mudanças climáticas
globais (Richardson e Poloczanska 2008). Vários impactos têm sido documentados
em todos os níveis da organização biológica que vão desde alterações na expressão
de genes (Clark et al. 2011); passando por modificações fisiológicas (Del Toro-Silva
et al. 2008), esqueléticas (Booth et al. 2014; Lopes 2016) e comportamentais
(Abrahams et al. 2007); até alterações na composição de assembleias (Ter Hofstede
e Rijnsdorp 2011) e na distribuição geográfica de peixes (Perry et al. 2005).
A elevação da temperatura atmosférica gera efeitos também no ambiente
aquático por meio do aumento na temperatura dos corpos d’água. De uma maneira
geral, em virtude de uma menor capacidade de armazenamento de calor, os corpos
d’água mais rasos tendem a apresentar temperaturas máximas e mínimas mais
acentuadas em comparação com aqueles mais profundos (Talling2001).
Considerando que a solubilidade do oxigênio é inversamente proporcional a
temperatura, ou seja, quando a temperatura da água aumenta, a concentração de
oxigênio dissolvido diminui, podendo resultar em um estresse adicional causado pela
hipóxia, justamente no momento em que as demandas metabólicas dos peixes se
elevam para superar o desafio ambiental (Talling 2001; Abrahams et al. 2007).
Consequentemente, a interação desses dois parâmetros físico-químicos
(temperatura e concentração de oxigênio) pode colocar em risco a sobrevivência de
um organismo devido ao comprometimento de suas atividades biológicas vitais (Del
Toro-Silva et al. 2008; Blair et al. 2013).
Apesar dos peixes de água doce serem ectotérmicos, ou seja, não
conseguirem regular fisiologicamente sua temperatura corporal, que geralmente é
muito próxima a temperatura do ambiente onde vivem, os peixes podem se deslocar
23
vertical ou horizontalmente na coluna d’água para zonas com maior conforto térmico
(Clarke 2003; Ficke et al. 2007). Essa estratégia comportamental permite superar
variações térmicas em seus habitats decorrentes de mudanças rápidas na energia
solar, movimentos anormais da água e eventos de precipitação rápida (Long et al.
2012). Porém, essa estratégia acaba sendo limitada à gama de temperaturas
disponíveis no ambiente aquático e, consequentemente, devido as reações
fisiológicas variarem de acordo com a temperatura corporal, as mudanças climáticas
podem comprometer processos básicos como alimentação, crescimento,
comportamento, reprodução e a capacidade de manter a homeostase interna (Ficke
et al. 2007; Somero 2010).
Para a compreensão dos efeitos das mudanças climáticas sobre os peixes da
Amazônia é necessário considerar diversos fatores que vão além das características
da espécie em estudo, como a interação com outras espécies, a capacidade
adaptativa, distribuição geográfica e ocorrência nos diferentes ecossistemas. Por
exemplo, espécies com distribuição restrita a algumas regiões da bacia são mais
vulneráveis às mudanças climáticas do que aquelas com distribuição mais ampla
(Val e Almeida-Val 2008). Outra característica importante que deve ser considerada
é a aclimatação térmica, que consiste numa estratégia de ajuste fisiológico em que o
organismo é capaz de sintetizar determinadas proteínas que conferem maior
resistência a variações de temperatura como as chaperonas ou HSPs (heat shock
proteins) (Basu et al. 2002; Hofmann 2005; Somero 2010).
Contudo, para responder as modificações ambientais geradas a partir do
aumento na temperatura da água e nas alterações de gases dissolvidos,
especialmente CO2 e oxigênio, os peixes podem adotar diversas estratégias como
nadar para regiões com temperaturas mais baixas ou com maior disponibilidade de
oxigênio, manter-se na coluna d’água onde for metabolicamente mais conveniente
ou, até mesmo, fazer uso de algum tipo de respiração acessória (Oliveira 2003;
Nowickiet al. 2012). Porém, quando essas estratégias não forem suficientes, os
organismos podem desencadear um conjunto de respostas bioquímicas e
moleculares com o objetivo de compensar esses efeitos e garantir a sobrevivência
mesmo sob estresse.
24
1.4 – O tambaqui
O tambaqui (Colossoma macropomum, Cuvier 1818), figura 2, é o maior
caraciforme da bacia amazônica (Goulding 1980, 1993), sendo endêmico desta
região e amplamente distribuído nos principais rios da bacia, onde pode alcançar
mais de um metro de comprimento e 30 kg de peso (Goulding 1993; Araújo-Lima e
Goulding 1998). Na natureza o tambaqui é onívoro, alimentando-se basicamente de
frutas e sementes durante o período chuvoso e zooplancton e insetos na estação
seca (Araújo-Lima e Goulding 1998). Apresenta comportamento migratório quando
se desloca para os rios de águas brancas em períodos de chuvas intensas em
busca de ambientes de várzea, considerados ideais para reprodução devido a sua
grande produtividade e disponibilidade de habitats que se tornam áreas de refúgio e
proteção para a espécie (Lima e Araujo-Lima 2004).
Figura 2: Exemplar de Colossoma macropomum. Foto: Maria de Nazaré Paula da Silva.
O sabor agradável e as características nutricionais de sua carne são
responsáveis pela ampla aceitação do tambaqui como fonte alimentar para a
população amazônica e de outras regiões do país, levando a um crescente esforço
de pesca das populações naturais (Araújo-Lima e Goulding 1998). Na década de
1970 o tambaqui correspondia a 45% da quantidade de peixe desembarcado no
mercado municipal de Manaus (Graef 1996), o que contribuiu fortemente para a
inclusão da espécie na lista oficial de espécies protegidas durante o defeso (IBAMA
2003).
Do ponto de vista fisiológico, diversos estudos mostram que o tambaqui é
uma espécie extremamente plástica, podendo adaptar-se a mudanças ambientais
por meio de ajustes metabólicos que combinam mudanças anatômicas com ajustes
hematológicos e de regulação da expressão gênica (Saint-Paul 1984; Val e Almeida-
2 cm
25
Val 1995). A principal modificação anatômica que ocorre no tambaqui, quando
submetido a baixas concentrações de oxigênio dissolvido, é a expansão do lábio
inferior que, apesar de não estar envolvido diretamente na troca gasosa, auxilia na
tomada da água próximo a superfície, aumentando assim o aporte de oxigênio para
as brânquias, ao mesmo tempo em que reduz os níveis intraeritrocitários de ATP e
GTP para amenizar os efeitos negativos provocados pela baixa concentração de
oxigênio dissolvido na água (Val e Almeida-Val 1995).
Devido à importância econômica do tambaqui para a região amazônica, os
programas para sua conservação e seu potencial para o desenvolvimento da
aquicultura, a espécie se tornou o peixe símbolo da Amazônia (Araújo-Lima e
Goulding 1998). Entretanto, a falta de informações relacionadas à adaptação de
peixes da Amazônia às mudanças climáticas globais, especialmente ao aumento da
temperatura e de CO2, deixa esses organismos e a Amazônia como um todo
altamente vulneráveis às variações ambientais. Tal fato pode ter consequências
graves para o meio ambiente, pois informações cientificamente embasadas são
fundamentais para a implementação de medidas mitigadoras por parte do poder
público.
26
2 – OBJETIVOS
2.1 – Objetivo geral
Avaliar os efeitos biológicos da exposição do tambaqui (Colossoma
macropomum) aos principais cenários de mudanças climáticas previstos pelo IPCC
para o ano 2100.
2.2 – Objetivos específicos
a) Avaliar o efeito da exposição do tambaqui aos cenários climáticos B1, A1B
e A2 previstos pelo IPCC para o ano 2100 sobre quinze parâmetros metabólicos e
fisiológicos.
b) Identificar alterações no transcriptoma do tambaqui relacionadas a
exposição aos cenários climáticos B1, A1B e A2 previstos pelo IPCC para o ano
2100.
c) Identificar e caracterizar potenciais genes relacionados aos ajustes
metabólicos e fisiológicos do tambaqui submetido aos cenários climáticos B1, A1B e
A2 previstos pelo IPCC para o ano 2100.
27
3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho buscou investigar os principais efeitos biológicos da
exposição do tambaqui aos principais cenários de mudanças climáticas previstos
pelo IPCC para o ano 2100. Os resultados obtidos estão apresentados na forma de
artigos científicos, conforme descrito abaixo:
Capítulo I: Efeitos de três cenários de mudanças climáticas sobre danos ao DNA,
hematologia e enzimas branquiais Na+/K+-ATPase e H+-ATPase no
peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum). Este capítulo
refere-se ao objetivo específico a.
Capítulo II: Caracterização transcriptômica do tambaqui (Colossoma macropomum,
Cuvier, 1818) exposto a três cenários de mudanças climáticas. Este
capítulo refere-se aos objetivos específicos b e c.
Capítulo III: Da Genética à Fisiologia: uma abordagem integrativa sobre a exposição
do tambaqui (Colossoma macropomum) aos principais cenários de
mudanças climáticas previstos pelo IPCC. Este capítulo faz uma
integração entre os objetivos específicos a, b e c.
28
Capítulo 1 ____________________________________________________________________ Prado-Lima, M.; Duarte, R.M. & Val, A.L. Effects of three climate change scenarios on DNA damage, hematology, and branchial Na+/K+-ATPase and H+-ATPase in the Amazonian fish tambaqui (Colossoma macropomum). Manuscrito formatado para Comparative Biochemistry and Physiology - Part A.
29
Abstract
Climate change-driven effects are likely to disturb all ecosystems around the world, especially those more sensible as Amazonia. Although Amazonia basin harbors a significant portion of Earth’s biodiversity, as well as the highest diversity of freshwater fishes in the world, there have been relatively few studies of Amazonian organisms, such as tambaqui, related to climate change. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of long-term exposure (150 days) to B1, A1B and A2 climate scenarios foreseen by the IPCC on DNA damage of erythrocytes, hematology, plasma ion composition and Na+/K+-ATPase and H+-ATPase branchial ion regulation enzymes in the freshwater fish tambaqui. The results showed a significant increase on DNA strand breaks on erythrocytes of tambaqui after 30 days of exposure to the selected experimental scenarios. Increases in hematocrit, hemoglobin and red blood cells between 30 to 150 days of exposure, indicating a swelling of red blood cells of fish, were also observed. Plasma levels of monovalent ions Na+, K+, and Cl- was slightly affected, whereas the concentration of divalent ions Ca2+ and Mg2+ were reduced in animals exposed to all three analyzed climate scenarios. An apparent inhibition of both Na+/K+-ATPase and H+-ATPase activity, which may affect the internal ionic homeostasis of fish, was observed. Overall, the exposure of tambaqui to the three selected climate change scenarios promote an increase of DNA strand breaks in erythrocytes and severe changes in hematological parameters, plasmatic ion composition and branchial activity of Na+/K+-ATPase and H+-ATPase of tambaqui.
Keywords: global warming, Amazonia, DNA damage, ion composition
30
Introduction
The human society and the equilibrium of natural ecosystems have been
affected by climate changes caused especially by man (IPCC, 2014). To understand
the regional and global effects elicited by climate change and to provide information
for the development of adaptation and mitigation strategies, the scientists create
various climate scenarios based on the intensity of human activities causing
environmental degradation (Moss et al., 2010). Scenarios are plausible and relevant
descriptions about how the future might be, based on potential discharges of
greenhouse gases and aerosols into Earth’s atmosphere (Raskin et al., 2005).
According to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on
Climate Change (IPCC), three main scenarios of climate are foreseen for the year
2100: B1 (mild), A1B (intermediate) and A2 (extreme). These situations may vary
according to population growth, socioeconomic development and the use of fossil
fuels or renewable energy (IPCC, 2007).
Several studies have investigated the impact of climate change on water
ecosystems, specially increases of water temperatures (Brian et al., 2008; Booth et
al., 2014), changes in levels of dissolved gases (Miller et al., 2013; Dennis et al.,
2015), alterations of water flow regimes (Dall et al., 2010), and changes in
assemblage composition of fish (Last et al., 2011; Ter Hofstede et al., 2011;
Pletterbauer et al., 2014). The climate scenarios foreseen by the IPCC have been
used to preview responses of the marine and freshwater ecosystems to
environmental changes. The obtained results suggest that climate change will cause
severe disturbances such as impairing the distribution of species and fishery in
various countries (Brander, 2007; Last et al., 2011; Sharma et al., 2011).
Amazonia harbors the richest biodiversity on Earth with species that are still
unknown to the scientific community (Castello et al., 2013; Cheng et al., 2013). It is
also a massive source of heat and moisture in the tropics and has a crucial role in the
global climate system (Salazar and Nobre, 2010). Despite this, in last century it has
been subject to increasing anthropogenic environmental pressures, such as fires,
deforestation and growth of urban centers, occurring in connection with those
changes resulting from global warming (Nobre et al., 2007; Cheng et al., 2013).
Climate change substantially affects the Amazon region, which in turn is expected to
increase the risk of biodiversity loss considerably. Additionally, the hydrological cycle
of the Amazon rivers that is a major driving force of biological interactions have
31
experienced severe perturbations likely due climate change-driven processes, such
as the increase in temperature, changes in solar heat, and higher evapotranspiration
of plants (Roessig et al., 2004; Castello et al., 2013).
Climate change is considered foremost threats to aquatic ecosystems (Sala et
al., 2000). In both, marine and freshwater ecosystems, the climate change is
expected to modify various vital traits of aquatic organisms, such as growth,
metabolism, reproduction, species distribution, and even ecosystem structure (Ficke
et al., 2007; Brierley and Kingsford, 2009). The fishes are sensitive to environmental
modifications triggered by climate change due mainly to increases in water
temperature and variations in the concentrations of dissolved gases, especially
oxygen and carbon dioxide (CO2) (Ficke et al., 2007). Water temperature above of
thermal tolerance limit is known to cause many physiological changes in several fish
species, such as increased Na+/K+-ATPase activity in gills of Atlantic cod (Gadus
morhua) (Kreiss et al., 2015), DNA damage in goldfish (Carassius auratus) (Anitha et
al., 2000), modifications on gene expression in channel catfish (Ictalurus punctatus)
(Liu et al., 2013), metabolic alterations in Paralichthys lethostigma (Del Toro-Silva et
al., 2008), decreased growth rate in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Blair et
al., 2013) and increased mortality of cardinal tetra (Paracheirodon axelrodi) (Fé et al.
2013). The short-term exposure to increased PCO2 in water have also been shown to
cause physiological disturbances in salmonids, as hyperventilation (Janson and
profiles or gene co-occurrences across multiple genomes, text mining, experiments,
and other databases with the highest confidence scores (0.9) allowed by the STRING
schemes.
Identification of SSR motifs
To identify all repetitive elements in the assembled contigs from tambaqui, all
sequences were searched for SSR motifs using the Msatcommander software (v.
0.8.2, with default settings). To be considered a dinucleotide SSR, the sequence
must have a minimum of six repeats. All other types of SSRs should have a minimum
of five repetitions. To be considered a compound SSR, the interruption between two
neighboring SSRs cannot surpass 100 nucleotides. The Primer3 software [31] was
used to design PCR primers for flanking all identified SSR motifs.
Results
To characterize the transcriptional responses of genes affected by climate
change in tambaqui, eight RNA-Seq libraries were built after five and fifteen days of
exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios. A total of 776,301,503 reads
were sequenced, with an average of 97 million of reads per library (Table 2). Each
raw read was sequenced from one end, and the length was 50 bp. After filtering to
remove adaptors and low-quality sequences, we obtained a total of 116,176,912
trimmed reads. After clustering and de novo assembly, 54,206 contigs of high quality,
showing lengths ranging from 74 to 1,094 bp were generated. The redundant and
ribosomal protein sequences were excluded, and 32,512 genes were identified
based on comparison with the D. rerio database. The raw reads generated in this
study have been deposited in the National Center for Biotechnology Sequence Read
Archive (NCBI-SRA) database (SRP062336).
67
Table 2. Overview of the RNA-Seq reads acquired from tambaqui after five and
fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios.
Scenario Total
Reads Trimmed
reads
All uniquely mapped reads to Danio rerio genes
Uniquely mapped reads to
Danio rerio exons
5 days
Control 83.673.651 16.996.336 4.280.731 1.031.276
B1 116.529.116 16.594.828 4.543.412 752.684
A1B 96.692.812 16.531.446 4.082.882 1.035.552
A2 79.983.888 17.909.708 4.344.590 1.179.861
15 days
Control 93.479.183 19.706.164 4.785.282 1.301.147
B1 98.635.208 16.328.332 3.946.647 1.090.509
A1B 112.023.018 13.701.912 3.659.181 723.738
A2 95.284.627 15.404.522 3.931.801 953.959
Total 776.301.503 133.173.248 33.574.526 8.068.726
Considering only those genes with a p-value ≤0.05 and a ≥2-fold change in
expression across the control and treated libraries, we identified a total of 236 and
209 differentially expressed genes after five and fifteen days, respectively, of
exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios (Fig 1). After five days, 104, 114
and 116 up-regulated genes were observed in animals exposed to the B1, A1B and
A2 climate scenarios, respectively. The corresponding numbers of down-regulated
genes were 132, 124 and 120, respectively. After fifteen days, 61, 78 and 69 up-
regulated genes were identified in animals exposed to B1, A1B and A2, respectively.
The corresponding numbers of down-regulated genes were 149, 133 and 138,
respectively. A complete list of the differentially expressed genes, including the level
of expression, can be found in the Supplementary material (S1 and S2 Tables).
68
Figure 1. Comparison of the number and direction of differentially expressed
transcripts identified in tambaqui after five and fifteen days of exposure to different
climate scenarios. The bar chart shows the number of differentially expressed
transcripts identified after five days (left bars) and fifteen days (right bars) under the
B1, A1B and A2 climate scenarios. Positive and negative values on the Y-axis
represent the number of up-regulated and down-regulated transcripts, respectively.
The list of differentially expressed genes showed several genes that play roles
in energy production, protein folding and maintaining cellular homeostasis, among
other functions. Genes encoding aldolases (aldoaa, aldoab and aldocb), enolases
(eno1, eno3), lactate dehydrogenase (ldha), pyruvate kinase (pkmb), cytochrome c
oxidase (cox5bs, cox4i2, cox8b) and chaperones such as Hsp40 (Dnaja2, Dnajc7)
and Hsp90 (hsp90aa1.1 and hsp90aa1.2) and genes responsible for protein folding
(such as hmgb1a and pfdn2) were identified. The main genes responsible for the
adaptation of tambaqui to climate change were grouped according to the current
literature, metabolic routes and the GO database (Table 3).
69
Table 3. Tambaqui genes1 affected by exposure to climate change scenarios.
Gene symbol Gene name Gene Ontology2
dnaja23 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 2
response to temperature stimulus (BP) heat shock protein binding (MF)
dnajc73 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 7
response to temperature stimulus (BP) heat shock protein binding (MF)
hmgb1a5 high mobility group box 1a response to temperature stimulus (BP)
chromatin remodeling (BP)
hsp90aa1.13 heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A member
1, tandem duplicate 1
chaperone-mediated protein (BP) complex assembly (BP)
hsp90aa1.24 heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A member
1, tandem duplicate 2
chaperone-mediated protein (BP) complex assembly (BP)
pfdn25 prefoldin subunit 2 protein folding (BP)
unfolded protein binding (MF)
1Genes selected based on the stress response using Blast X and the scientific literature. 2Functional annotation associated with the Danio rerio database. Gene ontology (GO) categories: biological process (BP) and molecular function (MF). 3Gene showing differential expression only after five days of exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios. 4Gene showing differential expression only after fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios. 5Gene showing differential expression after both five and fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios.
The GO database was used to categorize the differentially expressed genes
identified only under the A2 scenario after five and fifteen days of exposure. The A2
scenario was chosen because it was the most extreme scenario considered in the
present study. Among all the genes identified, 241 were successfully categorized, 82
of which were up-regulated, while 159 were down-regulated. Analysis of the GO term
distribution of the up-regulated genes at five days revealed 235 terms (MF: 48, BP:
138 and CC: 49) (Fig 2), while there were 263 terms associated with down-regulated
genes (MF: 118, BP: 91 and CC: 54) (Fig 3). The GO analysis using the fifteen-day
library revealed 257 terms for the up-regulated genes (MF: 25, BP: 194 and CC: 38)
(Fig 4) and 180 terms for the down-regulated genes (MF: 83, BP: 23 and CC: 74)
(Fig 5). For three broad categories (MF, BP and CC), four pie chart graphs were
generated: two containing the corresponding top 20 terms linked to up-regulated
genes after five and fifteen days and another two containing the top 20 terms linked
to down-regulated genes identified after five and fifteen days under the A2 climate
70
scenario. In both cases, the top 20 terms were those with the highest percentage of
representation within each of the three general categories. The terms other than the
top 20, with low percentages, usually ranging from 1 to 2% of the total
representation, were grouped and are also represented in the pie chart.
71
72
Figure 2. Pie chart of the top 20 GO terms associated with up-regulated genes
identified in tambaqui after five days of exposure to the B1, A1B and A2 climate
scenarios. Representation of the top 20 GO terms from the molecular function (A),
biological process (B) and cellular component (C) categories in the experimental
groups compared with the control. The terms other than the top 20 are represented
together.
73
74
Figure 3. Pie chart of the top 20 GO terms associated with down-regulated genes
identified in tambaqui after five days of exposure to the B1, A1B and A2 climate
scenarios. Representation of the top 20 GO terms from the molecular function (A),
biological process (B) and cellular component (C) categories in the experimental
groups compared with the control. The terms other than the top 20 are represented
together.
75
76
Figure 4. Pie chart of the top 20 GO terms associated with up-regulated genes
identified in tambaqui after fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate
scenarios. Representation of the top 20 GO terms from the molecular function (A),
biological process (B) and cellular component (C) categories in the experimental
groups compared with the control. The terms other than the top 20 are represented
together.
77
78
Figure 5. Pie chart of the top 20 GO terms associated with down-regulated genes
identified in tambaqui after fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate
scenarios. Representation of the top 20 GO terms from the molecular function (A),
biological process (B) and cellular component (C) categories in the experimental
groups compared with the control. The terms other than the top 20 are represented
together.
STRING software was used to generate a confidence gene interaction network
merging all of the differentially expressed genes identified after five and fifteen days
in animals exposed to the B1, A1B and A2 climate scenarios (Fig 6). The proteins are
represented with nodes. Direct protein-protein interactions are represented with
continuous blue lines. Due to the high number of interactions observed, the settings
were changed to only identify gene expression with the “highest confidence” (score
>0.9). Nodes with no interactions were hidden. A total of 985 interactions (S3 Table)
were obtained using 296 nodes among the analyzed genes. The gene network
showed five major clusters. Cluster 1, Cluster 2, Cluster 3 and Cluster 4 exhibited
interconnected interactions and sparsely connected sub-networks. Only Cluster 5
showed no connections with the other clusters. The lists of genes grouped in each of
the five clusters are highlighted in S1-S5 Figs.
79
Figure 6. Gene network interactions identified using STRING software (v.10).
Interactions of genes (or proteins) expressed in the white muscle of tambaqui after
five and fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate scenarios. Circles
with different colors represent different genes (or proteins). Blue lines represent
strong interactions between genes (or proteins). Nodes with no interactions have
been hidden.
A total of 1,201 SSRs, comprising 93% simple and 7% compound motifs, were
detected among the tambaqui contigs (Fig 7). These SSRs included the following
80
types of repeats: 81% dinucleotides, 16% trinucleotides and 3%
tetra/pentanucleotides. Among the dinucleotide repeats, the GT (33.5%) and CT
types (32.8%) were most abundant, while GAT was the most frequent trinucleotide
repeat (15.5%). Based on the detected SSRs, 88 primer sets were successfully
designed and will be tested in natural or captive populations (S4 Table).
Figure 7: Distribution of simple sequence repeats found in tambaqui sequences.
Discussion
Climate change is likely to endanger regions with high biodiversity, such as the
Amazon. Although several studies have sought to predict the impacts of climate
change in the Amazon, they are generally based on computer models that do not
always take into account all of the hidden characteristics of the rainforest. Thus, we
used the second most commonly farmed species in Brazil, and the most commonly
farmed species in the Amazon, to investigate the main impacts of climate change on
the regulation of gene expression in fish exposed to the B1, A1B and A2 climate
scenarios foreseen by the IPCC for the year 2100.
In the present study, a transcriptome-level analysis was conducted to
determine how tambaqui will respond to exposure to climate change using the NGS
81
and RNA-Seq methods. Two critical factors for fish survival were tested at different
levels during five and fifteen days of exposure to the B1, A1B and A2 climate
scenarios: temperature and CO2 levels. Because thermal stress and CO2 elevation
have broad biological effects on organisms, the transcriptional responses to these
parameters are expected to be highly diverse across a number of genes found in
ectothermic species such as tambaqui. This study confirms that numerous genes are
differentially expressed in tambaqui under the B1, A1B and A2 climate scenarios,
and several pathways are involved (S1 and S2 Tables). However, according to the
GO tool, a few key pathways contained a high proportion of differentially expressed
transcripts, including the mitochondrion, protein binding, protein metabolic process,
metabolic processes, gene expression, structural constituent of ribosome and
translation categories.
In the present study, SOLiD sequencing allowed the identification of 32,512
genes. Considering that no sequenced genome currently exists for tambaqui,
comparison with the D. rerio transcriptome was performed. Because D. rerio has a
total of 34,460 annotated genes [32], if we consider that the two species have the
same number of genes, the identified genes in the present work would represent
approximately 94% of the genes of the tambaqui transcriptome and can therefore be
employed in various approaches to evaluate information on the transcriptome,
genome and genetic breeding of tambaqui. The tool used in the present study
allowed us to identify 388 genes that showed different levels of expression according
to the time of exposure and the climate scenario. Evidence of acclimation was
indicated by the 11.4% decrease in the number of differentially expressed transcripts
from five to fifteen days (Fig 1). Despite the short period of time, this result is in
accordance with theories on acclimation to heat stress under which organisms can
regulate their heat shock response over time [15], as opposed to the theory in which
immediate survival is a priority [33]. However, the current results demonstrate that
from five to fifteen days, acclimation occurs throughout much of the transcriptome
and is not limited to genes related to heat shock, such as chaperones.
Climate change may introduce a number of environmental challenges for
fishes due to increased temperatures above the optimal range, leading to altered
transcription of genes involved in protein folding and heat-shock responses
[29,34,35], ribosomal and metabolism-related genes [27,36,37] and genes
associated with cell cycle arrest and apoptosis [23,29,34]. Ectothermic animals, such
82
as fishes, generally show temperature-dependent oxygen consumption [38].
Considering that increases in temperature may induce low-oxygen stress because
oxygen solubility is reduced in warmer water [18], fishes may also experience
hypoxia at elevated temperatures due to a reduced binding capacity of hemoglobin
for oxygen transport [19,39].
A sufficient oxygen supply is fundamental to ensuring optimal growth, foraging
and reproduction performance in fishes [13]. Under these conditions, the tambaqui
have developed several adaptation mechanisms to safeguard survival ability. For
example, tambaqui are able to expand their lower lip to direct the first film of the
water column, which is richer in oxygen, over their gills [18]. Simultaneously, the
species can reduce erythrocytic ATP and GTP to increase Hb-O2 affinity [18,40]. All
of these biochemical and physiological adaptations are important for increasing the
thermal tolerance of tambaqui and buffering the negative effects of low oxygen
concentrations in water.
In the present study, at least four gene groups were identified among all of the
differentially expressed genes. The first group comprised several types of heat shock
proteins (Hsps), including Hsp90 and Hsp40 (dnaja2, dnajc7). The expression levels
of these genes changed after five and fifteen days under the B1, A1B and A2 climate
scenarios. Hsps are a well-studied group of highly conserved, ubiquitously distributed
genes that are expressed upon exposure to various stress factors, including elevated
temperatures [41]. Hsps are part of an important mechanism that helps organisms
survive under different environmental conditions, such as thermal stress [41]. Hsp90
is a highly conserved molecular chaperone that has been proposed to act as a hub
for the signaling network and protein homeostasis associated with diverse
physiological processes, including the heat shock response, signal transduction and
stress responses, in eukaryotic cells [42]. Our findings suggest that Hsps are directly
involved in the thermal tolerance of tambaqui.
The second group of differentially expressed genes were involved in ATP-
derived energy production. Genes related to glycolysis, such as aldoaa, aldoab,
aldocb, eno1a, eno3, ldha, and pkmb, were down-regulated under all three tested
climate scenarios. Similarly, genes such fh, ndufs4, cox5b2, and mdh2, which play
important functions in the tricarboxylic acid cycle and electron transport chain, were
down-regulated in the white muscle of tambaqui under all three tested climate
scenarios. These results suggest an impairment of several ATP-generating enzymes,
83
which can cause an increase in the expression of transcription factors and target
genes as well changes in the fatty acid composition of membranes to equilibrate the
cellular energy balance and to maintain cellular homeostasis [43].
The third group consisted of genes that act as translation initiation factors.
These genes were repressed in tambaqui after fifteen days of exposure to all three
climate scenarios (eef1a1a, eef1a1l1, eef1a2, eif2s1b, eif4a3, eif4eb, and eif4ebp3l).
These genes encode proteins that are components of the eukaryotic translation
initiation factor complex, which is fundamental for several steps in the initiation of
protein synthesis through association with the 40S ribosome, and facilitate the
recruitment of eif-1, eif-1a, eif-2, and eif-5 to form a complex known as the 43S pre-
initiation complex (43S PIC), which is necessary for scanning mRNA for the
translation-initiation codon AUG [44,45]. Another important translation initiation factor
that was identified was the high-mobility group b1 protein, encoded by hmgb1. This
protein plays key roles in the immune system, transcription initiation and the
assembly of numerous nucleoprotein complexes that are critical to cell function and
the formation of enhanceosome complexes. Through these functions, hmgb1a acts
as a compensatory modulator of transcription in response to increased temperature,
making it a global temperature sensor that reduces the expression of key genes in
response to elevated temperature [46]. Hmgb1a may be also involved in the
modulation of the immune system of tambaqui in response to diverse climate
changes scenarios. However, additional studies are needed to confirm this
hypothesis.
The fourth and last group was composed of genes that are related to the
production of constituents of ribosomes or are important in the assembly and stability
of ribosomal subunits. Some of these genes were significantly repressed in
tambaqui, especially after fifteen days (rpl3, rpl7, rpl13, rpl18a, rpl35, rps10, rps27.1
and rpsa), while others (rpl5a, rpl14, rpl23, rpl32, rplp2 and rps26) showed varying
expression levels. Similar results have been obtained following thermal stress in
Arctic char [27]. These results, together with the translation initiation factors that were
found to be repressed, indicate that commitment of the translational machinery after
fifteen days of exposure preserves the synthesis of specific stress-responsive
proteins to enhance cell survival under climate changes, which can cause
disequilibrium of vital functions, such as metabolism, reproduction, growth and
competitiveness [13,14].
84
As explained above, the list of differentially expressed genes indicates that the
cellular responses to climate change in tambaqui are complex, involving a number of
genes, and may be controlled by different cues and transcription/translation
regulation mechanisms, as observed in other fishes [29,34,47] and various other
types of organisms [48,49], including humans [50].
When exposed to thermal stress, fishes need to increase their oxygen supply
in response to an elevated metabolic rate, resulting in behavioral changes [47].
Consequently, food consumption and foraging activities may be increased at higher
temperatures, increasing the energy requirement of the fishes. However, if a constant
search for food is not successful, fishes will be unable to maintain their growth rates
[51]. Furthermore, under conditions of increased CO2, the effects caused by thermal
stress are potentiated, impairing feeding and growth [52]. Another consequence is
that increases in temperature have a significant impact on predator–prey interactions,
potentially leading to ecosystem imbalances with consequences at various food
chain levels [53,51].
Gene ontology is commonly used to categorize gene products and to
standardize their representation across different species or environmental stress
situations [54–56]. To characterize transcriptional events over time, only the
differentially expressed genes related to the A2 climate scenario were subjected to
GO analysis (Figs 2-5). The results showed that the up-regulated genes were related
to the following categories: protein binding (MF), protein dimerization activity (MF),
protein heterodimerization activity (MF), protein homodimerization activity (MF), and
identical protein binding (MF). This is expected under thermal stress given that
proteins such as HSPs are involved in protein folding and unfolding, providing
thermo-tolerance in cells upon exposure to heat stress [41]. In the opposite situation,
the down-regulated genes were related to the following categories: cellular metabolic
process (BP), phosphorus metabolic process (BP), organic substance metabolic
process (BP), primary metabolic process (BP), protein metabolic process (BP),
macromolecule metabolic process (BP) and cellular protein metabolic process (BP).
These results, together with those for the gene expression (BP) and translation (BP)
categories, indicate suppression of various metabolic processes to ensure cellular
homeostasis and, thus, overcome the environmental challenge. The categories
mentioned above appeared at low percentages after five days, but their percentages
almost doubled after fifteen days of exposure to the A2 climate scenario, indicating
85
that these mechanisms that enable organisms to minimize some temperature-related
effects were already present at five days and increased after fifteen days. The results
of GO analysis followed a similar pattern to those observed in transcriptomic
analyses of other fish species [34,46,57].
Protein functional interaction networks, such as the one we generated using
the STRING database, are commonly employed to predict protein–protein
associations derived from high-throughput experimental data or from the mining of
databases and the literature as well as predictions based on genomic analyses of
more than 2,000 organisms [30]. We searched the interactions among all of the
differentially expressed genes obtained after five and fifteen days of exposure to the
three climate scenarios and used STRING to construct an interaction network (Fig 6).
The 296 nodes allowed the identification of five clusters (S1-S5 Figs). A central
interplay cluster was not detected, although cluster 1 appeared to start a chain of
interactions that extended to cluster 4. Cluster 1 included genes related to the folding
and unfolding of proteins, such as pdfn2, dnaja2, hsp90aa1.1 and hsp90aa1.2, which
are known to control gene expression in a number of organisms under thermal stress
[41,35,48]. Hsp90 (also known as endoplasmin) is a molecular chaperone that
functions in the processing and transport of secreted proteins [58]. The up-regulation
of Hsp90 is often used as a hallmark of endoplasmic reticulum stress [29]. Hsp90
interacts with more than 100 proteins, and some of its notable partners include
kinases, nuclear hormone receptors, transcription factors, and ion channels [58].
Clusters 2 and 3 comprised genes related to glycolysis and the mitochondrial
respiratory chain, including pkmb, ldha, aldoab, eno2, atp5d, and cox5b2. Cluster 5
mainly consisted of translation factors (eif2s1, eif4eb, eif3f, and eif1a1a) and genes
related to rRNA processing and ribosomal biogenesis (rpl11, rpl7, rps 3, and rps29)
that play key roles in the regulation of gene expression. Ribosomal proteins are
potential biomarkers of tolerance to thermal stress in fishes [27].
The 1201 SSRs identified and 88 primer sets designed in the current study
(S4 Table) provide a valuable resource for the development of molecular tools for
tambaqui and other closely related species. Given that only 41 SSR loci had
previously been developed for tambaqui [59–61], the 88 primer sets designed in the
present study more than double the number of SSR loci currently available. The high
number of dinucleotide repeats (Fig 7) observed in tambaqui (approximately 81%) is
consistent with previous studies in fishes and other aquatic organisms [62,63]. SSR
86
markers have been efficiently used for the identification of individuals, population
diversity and quantitative trait loci (QTL) analyses, and genetic breeding of stocks
[64,65]. The SSR loci developed here must be validated before use in future
applications.
Conclusions
This is the first RNA-Seq-based study of the transcriptional response of
tambaqui exposed to climate change. Several candidate genes that can be employed
to screen for genetic markers for climate change were identified. Using GO
enrichment analysis and STRING software, we identified diverse biological processes
and intracellular pathways related to the functional impacts of the observed changes
in transcript expression. The obtained results provide clues toward elucidating the
molecular mechanisms underlying the regulatory networks of gene expression during
climate change exposure. In addition, an analysis of repetitive elements was
conducted, and SSRs were identified for future marker development and linkage
analysis. The large number of differentially expressed genes recorded in this study
suggests that a complex combination of genes has evolved in tambaqui as a
response to climate change scenarios; in particular, these genes include chaperones,
energetic metabolism-related genes, translation initiation factors and ribosomal
genes. Overall, the results of this study on the tambaqui transcriptome should serve
as a valuable resource for future genetic or genomic studies.
Acknowledgments
We thank Dr. Alzira Miranda, Fernanda Dragan, MSc., and Maria de Nazaré
Paula da Silva, MSc., for their contributions to the fish exposure experiments and
Lucas Canesin, MSc., for the help provided with the bioinformatics analysis. This
work forms part of INCT-ADAPTA (CNPq/FAPEAM). MPL was a recipient of a Ph.D.
fellowship from CAPES, and ALV is a recipient of a research fellowship from CNPq.
References
1. Rockström J, Brasseur G, Hoskins B, Lucht W, Schellnhuber J, Kabat P, et al.
Climate change: the necessary, the possible and the desirable Earth League
climate statement on the implications for climate policy from the 5th IPCC
S3 Table: Genes of tambaqui after five and fifteen days of B1, A1B and A2 climate scenarios exposure grouped in five clusters
using STRING software (v. 10).
STRING protein name
STRING id Gene name and description
Cluster 1
mob4 7955.ENSDARP00000072975 MOB family member 4, phocein tcp1 7955.ENSDARP00000104575 t-complex polypeptide 1
vbp1 7955.ENSDARP00000111810 von Hippel-Lindau binding protein 1
pfdn2 7955.ENSDARP00000035261 prefoldin subunit 2
zgc:65894 7955.ENSDARP00000002175 zgc:65894; Tubulin is the major constituent of microtubules. It binds two moles of GTP, one at an exchangeable site on the beta chain and one at a non-exchangeable site on the alpha chain (By similarity)
hsp90aa1.1 7955.ENSDARP00000022302
heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A member 1, tandem duplicate 1; Molecular chaperone that promotes the maturation, structural maintenance and proper regulation of specific target proteins involved for instance in cell cycle control and signal transduction. Undergoes a functional cycle that is linked to its ATPase activity. This cycle probably induces conformational changes in the client proteins, thereby causing their activation. Interacts dynamically with various co-chaperones that modulate its substrate recognition, ATPase cycle and chaperone function (By similarity). [...]
dnaja2 7955.ENSDARP00000028641 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 2
hsp90aa1.2 7955.ENSDARP00000026065 heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A member 1, tandem duplicate 2
zgc:86598 7955.ENSDARP00000024748 zgc:86598
Cluster 2
ATP5B 7955.ENSDARP00000060309 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide; Produces ATP from ADP in the presence of a proton gradient across the membrane (By similarity)
atp5a1 7955.ENSDARP00000027947 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle; Produces ATP from ADP in the presence of a proton gradient across the membrane (By similarity)
atp5h 7955.ENSDARP00000038799 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d
atp5l 7955.ENSDARP00000007716 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit g
111
atp5d 7955.ENSDARP00000022528 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, delta subunit
atp5c1 7955.ENSDARP00000066929
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1; Mitochondrial membrane ATP synthase (F(1)F(0) ATP synthase or Complex V) produces ATP from ADP in the presence of a proton gradient across the membrane which is generated by electron transport complexes of the respiratory chain. F-type ATPases consist of two structural domains, F(1) - containing the extramembraneous catalytic core, and F(0) - containing the membrane proton channel, linked together by a central stalk and a peripheral stalk. During catalysis, ATP synthesis in the catalytic domain of F(1) is cou [...]
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex unknown, 2, 14.5kDa; Accessory subunit of the mitochondrial membrane respiratory chain NADH dehydrogenase (Complex I), that is believed not to be involved in catalysis. Complex I functions in the transfer of electrons from NADH to the respiratory chain. The immediate electron acceptor for the enzyme is believed to be ubiquinone (By similarity)
uqcrc1 7955.ENSDARP00000108798 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I
cox7c 7955.ENSDARP00000069896 cytochrome c oxidase, subunit VIIc
cox4i2 7955.ENSDARP00000095260 cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2
cox5b2 7955.ENSDARP00000105206 cytochrome c oxidase subunit Vb 2
Cluster 3 aldoaa 7955.ENSDARP00000119413 aldolase a, fructose-bisphosphate, a
aldocb 7955.ENSDARP00000024492 aldolase C, fructose-bisphosphate, b
pgm1 7955.ENSDARP00000006510 phosphoglucomutase 1
gapdhs 7955.ENSDARP00000058383
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, spermatogenic; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a key enzyme in glycolysis that catalyzes the first step of the pathway by converting D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) into 3-phospho-D- glyceroyl phosphate (By similarity)
gpib 7955.ENSDARP00000014578 glucose phosphate isomerase b
112
Gapdh 7955.ENSDARP00000063799
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; Has both glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and nitrosylase activities, thereby playing a role in glycolysis and nuclear functions, respectively. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a key enzyme in glycolysis that catalyzes the first step of the pathway by converting D-glyceraldehyde 3- phosphate (G3P) into 3-phospho-D-glyceroyl phosphate. Modulates the organization and assembly of the cytoskeleton. Also participates in nuclear events including transcription, RNA transport, DNA replication and apoptosis. Nuclear functions are prob [...]
alpha-tropomyosin; Binds to actin filaments in muscle and non-muscle cells. Plays a central role, in association with the troponin complex, in the calcium dependent regulation of vertebrate striated muscle contraction. Smooth muscle contraction is regulated by interaction with caldesmon. In non-muscle cells is implicated in stabilizing cytoskeleton actin filaments
tmem38a 7955.ENSDARP00000037150 transmembrane protein 38A; Monovalent cation channel required for maintenance of rapid intracellular calcium release. May act as a potassium counter-ion channel that functions in synchronization with calcium release from intracellular stores (By similarity)
tnnc1b 7955.ENSDARP00000054663 troponin C type 1b (slow)
actn2 7955.ENSDARP00000095652 actinin, alpha 2
desmb 7955.ENSDARP00000065355 desmin b
tnnc1a 7955.ENSDARP00000025541 troponin C type 1a (slow)
tnni2a.1 7955.ENSDARP00000031650 troponin I, skeletal, fast 2a.1
calm1a 7955.ENSDARP00000092307 calmodulin 1b; Calmodulin mediates the control of a large number of enzymes, ion channels and other proteins by Ca(2+). Among the enzymes to be stimulated by the calmodulin-Ca(2+) complex are a number of protein kinases and phosphatases
eif4ebp3l 7955.ENSDARP00000060989 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 3, like; Regulates eif4e1a activity by preventing its assembly into the eIF4F complex (By similarity)
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit F; Component of the eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF-3) complex, which is involved in protein synthesis and, together with other initiation factors, stimulates binding of mRNA and methionyl-tRNAi to the 40S ribosome (By similarity)
114
eef1a1a 7955.ENSDARP00000104468 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1a; This protein promotes the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of ribosomes during protein biosynthesis (By similarity)
rpl11 7955.ENSDARP00000063869 ribosomal protein L11
rpl5a 7955.ENSDARP00000006085 ribosomal protein L5a
rpl7 7955.ENSDARP00000018980 ribosomal protein L7
rps26 7955.ENSDARP00000105328 ribosomal protein S26
rps3a 7955.ENSDARP00000051762 ribosomal protein S3A
rpsa 7955.ENSDARP00000123183
ribosomal protein SA; Required for the assembly and/or stability of the 40S ribosomal subunit. Required for the processing of the 20S rRNA- precursor to mature 18S rRNA in a late step of the maturation of 40S ribosomal subunits. Also functions as a cell surface receptor for laminin. Plays a role in cell adhesion to the basement membrane and in the consequent activation of signaling transduction pathways. May play a role in cell fate determination and tissue morphogenesis (By similarity)
rps29 7955.ENSDARP00000060443 ribosomal protein S29
rps26l 7955.ENSDARP00000111782 ribosomal protein S26, like
eif4a3 7955.ENSDARP00000027276
eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 3; ATP-dependent RNA helicase. Component of a splicing- dependent multiprotein exon junction complex (EJC) deposited at splice junction on mRNAs. The EJC is a dynamic structure consisting of a few core proteins and several more peripheral nuclear and cytoplasmic associated factors that join the complex only transiently either during EJC assembly or during subsequent mRNA metabolism. Core components of the EJC, that remains bound to spliced mRNAs throughout all stages of mRNA metabolism, functions to mark the position of the exon-exon [...]
rps3 7955.ENSDARP00000067802 ribosomal protein S3
eef2l2 7955.ENSDARP00000051080 eukaryotic translation elongation factor 2, like 2
rps27.1 7955.ENSDARP00000029079 ribosomal protein S27, isoform 1
rps23 7955.ENSDARP00000035273 ribosomal protein S23
rpl18a 7955.ENSDARP00000038658 ribosomal protein L18a
rps27.2 7955.ENSDARP00000072300 ribosomal protein S27, isoform 2
rpl35 7955.ENSDARP00000018594 ribosomal protein L35; Plays an essential role in early embryonic development. May act as a haploinsufficient tumor supressor
115
rpl28 7955.ENSDARP00000024189 ribosomal protein L28
rpl22 7955.ENSDARP00000111487 ribosomal protein L22
eef1a1l1 7955.ENSDARP00000111742 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, like 1; This protein promotes the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of ribosomes during protein biosynthesis (By similarity)
rpl3 7955.ENSDARP00000003700 ribosomal protein L3
rpl32 7955.ENSDARP00000060004 ribosomal protein L32
ddost 7955.ENSDARP00000054289
dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase; Essential subunit of the N-oligosaccharyl transferase (OST) complex which catalyzes the transfer of a high mannose oligosaccharide from a lipid-linked oligosaccharide donor to an asparagine residue within an Asn-X-Ser/Thr consensus motif in nascent polypeptide chains (By similarity)
rplp2 7955.ENSDARP00000025616 ribosomal protein, large P2
spcs1 7955.ENSDARP00000076814 signal peptidase complex subunit 1 homolog (S. cerevisiae)
rbm8a 7955.ENSDARP00000026575
RNA binding motif protein 8A; Component of a splicing-dependent multiprotein exon junction complex (EJC) deposited at splice junction on mRNAs. The EJC is a dynamic structure consisting of a few core proteins and several more peripheral nuclear and cytoplasmic associated factors that join the complex only transiently either during EJC assembly or during subsequent mRNA metabolism. Core components of the EJC, that remains bound to spliced mRNAs throughout all stages of mRNA metabolism, functions to mark the position of the exon-exon junction in the mature mRNA and thereby influences dow [...]
rpl36a 7955.ENSDARP00000075363 ribosomal protein L36A
rpl14 7955.ENSDARP00000052528 ribosomal protein L14
rpl19 7955.ENSDARP00000105649 ribosomal protein L19
rps10 7955.ENSDARP00000045900 ribosomal protein S10
rps16 7955.ENSDARP00000066897 ribosomal protein S16
rpl6 7955.ENSDARP00000091899 ribosomal protein L6
rpl13 7955.ENSDARP00000047390 ribosomal protein L13
rpl23 7955.ENSDARP00000069977 ribosomal protein L23
rps24 7955.ENSDARP00000091586 ribosomal protein S24
116
S4 Table: Primers and types of SSR motifs found in tambaqui sequences.
Contig name Primer left Left_Tm Primer_right Right_Tm Motif
Capítulo 3 ___________________________________________________________________ Prado-Lima, M. & Val, A.L. Da Genética à Fisiologia: uma abordagem integrativa sobre a exposição do tambaqui (Colossoma macropomum) aos principais cenários de mudanças climáticas previstos pelo IPCC. Manuscrito formatado de acordo com as regras da Acta Amazonica.
120
Resumo As mudanças climáticas têm causado alterações físicas e biológicas nas
diversas partes do planeta e impactado o clima, os ecossistemas e seus organismos. As consequências geradas pelo aquecimento global ameaçam todos os níveis da organização biológica, desde os mais abrangentes até o molecular. No caso dos peixes, que estão sujeitos a variações ambientais, a elevação na temperatura da água e as modificações na concentração de gases dissolvidos colocam em risco a sobrevivência de diversas espécies, especialmente aquelas mais sensíveis. A capacidade de se adaptar às variações na temperatura ambiental depende de alterações em diversos processos metabólicos e bioquímicos que têm origem na regulação da expressão gênica em resposta ao agente estressor. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi investigar como o tambaqui (Colossoma macropomum), uma espécie amazônica de grande importância ecológica e econômica, pode reagir à exposição às mudanças climáticas globais. Os peixes foram expostos durante 150 dias aos cenários climáticos atual, B1, A1B e A2, previstos pelo IPCC para o ano 2100, e tiveram investigadas as alterações no transcriptoma, na integridade do DNA de eritrócitos, em parâmetros hematológicos e enzimas de regulação iônica. Os resultados obtidos indicam que os principais genes que responderam à exposição foram: atp2a1, atp2a2b, calm2a, calm3a, cox4i2, cox5b2, cox7c, cox8b, dnaja2, dnajc7, hmgb1a, hsp90aa1.1, hsp90aa1.2, pfdn2 e slc4a4b. As análises de ontologia indicaram que esses genes atuam em importantes processos metabólicos responsáveis pela homeostase celular e sobrevivência do organismo em situações de estresse térmico, principalmente, síntese, dobramento e transporte de proteínas, remodelamento da membrana plasmática, mecanismos de defesa antioxidante, osmoregulação e atividade das principais enzimas de regulação iônica. Assim, a análise integrativa de parâmetros genéticos e fisiológicos possibilitou um importante avanço na compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à exposição do tambaqui às mudanças climáticas globais previstas pelo IPCC.
A temperatura corporal dos animais ectotérmicos está sujeita a variações
decorrentes de alterações na temperatura do ambiente onde vivem (Huey e
Kingsolver 1993). Dessa forma, muitos organismos aquáticos, como os peixes, não
conseguem controlar sua temperatura corporal, mas podem nadar para áreas com
temperaturas mais adequadas ao seu metabolismo (López-Olmeda e Sánchez-
Vázquez 2011). Ainda assim, os peixes podem se deparar com uma série de
variações diárias e sazonais na temperatura da água devido a variações rápidas na
irradiação solar, movimentos anormais na coluna d’água e ocorrência de
precipitações rápidas (Long et al. 2012; 2013). Em decorrência disso, as espécies
fazem uso de diversas estratégias adaptativas para superar esse estresse ambiental
(Ficke et al. 2007; Long et al. 2012).
A capacidade de se adaptar às variações de temperatura do ambiente é
dependente da alteração de diversos processos metabólicos e bioquímicos, à fim de
manter a homeostase celular e garantir a sobrevivência do organismo (Pörtner e
Farrell 2008; Clark et al. 2010; Logan e Buckley 2015). As taxas metabólicas de
animais ectotérmicos normalmente aumentam com o incremento na temperatura
ambiental, o que leva ao aumento nas exigências de combustíveis metabólicos
preciosos (Iftikar e Hickey 2013). Porém, se o aumento na taxa metabólica for
insuficiente, as reservas metabólicas devem ser direcionadas para a geração de
energia, comprometendo, consequentemente, o equilíbrio de processos fisiológicos
vitais como crescimento, reprodução, alimentação e, em última instância, a
sobrevivência do organismo (Iftikar e Hickey 2013; Strobel et al. 2013)
Em situações de estresse térmico, os peixes podem enfrentar também
modificações nas propriedades e no funcionamento de biomoléculas, alterações em
componentes estruturais das células, como o funcionamento, dobramento e
estabilidade de proteínas, modificações na composição, permeabilidade e fluidez
das membranas celulares (Hazel e Williams 1990; Los e Murata 2004; Long et al.
2012). Adicionalmente, devido a água aquecida possuir menor capacidade de
retenção de oxigênio dissolvido, os peixes podem enfrentar um estresse adicional
provocado pela hipóxia que, consequentemente, gera uma série de modificações
como aumento na taxa respiratória para lidar com esse novo desafio (Jeppesen et
al. 2012).
122
As consequências geradas pelas mudanças climáticas, especialmente
aumento na temperatura e na concentração de CO2, ameaçam todos os níveis da
organização biológica, desde o comportamental até o molecular (Podrabsky e
Somero 2004; Hofmann 2005). As estratégias utilizadas pelos organismos para
superar as modificações ambientais têm início a partir de alterações na expressão
de genes, passando por modificações pós-transcricionais até chegar à síntese de
proteínas (Sterky e Lundeberg 2000; Oshlack et al. 2010). Diversos estudos
mostram que o estresse térmico gerado pelo aumento na temperatura resulta em
severas modificações nos padrões considerados normais de expressão gênica em
diversos peixes como zebrafish (Long et al. 2013), truta (Oncorhynchus mykiss
gairdneri) (Narum e Campbell 2015), bagre de canal (Ictalurus punctatus) (Liu et al.
2013), Pagothenia borchgrevinki (Bilyk e Cheng 2014), truta do ártico (Salvelinus
alpinus) (Quinn et al. 2011) e bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) (Hori et al.
2010). Embora a expressão de vários genes seja alterada devido ao estresse
desencadeado pelo aumento na temperatura ambiental, poucos estudos têm
conseguido estabelecer uma correlação segura entre o nível de expressão gênica,
obtido a partir de diferentes abordagens de análise de transcriptomas, como RNA-
Seq, e os processos metabólicos celulares e proteínas resultantes da regulação
positiva ou negativa desses genes (Narum e Campbell 2015).
Contudo, o correto funcionamento das proteínas é dependente do seu
formato, ou seja, apenas as proteínas que tenham sido devidamente dobradas
podem manter-se estáveis para atuar em processos biológicos fundamentais ao
organismo (Basu et al. 2002; Hofmann 2005; Long et al. 2013). O dobramento das
proteínas, tanto aquelas recém-sintetizadas pelos ribossomos quanto a estabilidade
funcional das que foram sintetizadas há mais tempo, é um processo especializado e
altamente dependente da temperatura, tendo em vista que esse processo é
realizado, principalmente, por proteínas termossensíveis como as chaperonas,
também conhecidas como HSPs (heat shock proteins) (Basu et al. 2002; Liu et al.
2013; Narum e Campbell 2015).
A espécie escolhida para esse estudo foi o tambaqui, Colossoma
macropomum, um peixe nativo da bacia Amazônica que habita rios, lagos e áreas
alagáveis (Junk et al. 2007), onde se alimenta de frutos e sementes na idade adulta
(Araújo-Lima e Goulding 1998). É amplamente criado em diferentes regiões do Brasil
devido ao seu alto valor comercial e facilidade no cultivo (Araújo-Lima e Goulding
123
1998; Brasil 2012). O tambaqui apresenta estratégias fisiológicas, morfológicas,
comportamentais e genéticas que lhe permite sobreviver em ambientes que seriam
desfavoráveis para muitas espécies devido a variações nas propriedades físicas e
químicas como a baixa concentração de oxigênio dissolvido e pH (Val e Almeida-Val
1995; Wood et al. 1998; Val e Kapoor 2003; Aride et al. 2007).
Considerando o crescente aumento na temperatura média do planeta e na
concentração de gases do efeito estufa, é importante compreender como o tambaqui
pode lidar com esse novo desafio ambiental e quais os principais impactos
resultantes dessa exposição. Assim, o objetivo do presente estudo foi realizar uma
análise integrativa envolvendo o perfil de expressão gênica e informações obtidas a
partir da análise de diversas variáveis fisiológicas para compreender como o
tambaqui poderá reagir à exposição aos principais cenários de mudanças climáticas
previstos pelo IPCC para o ano 2100.
Materiais e métodos
As variáveis fisiológicas analisadas foram: avaliação de danos ao DNA de
eritrócitos, análise de parâmetros hematológicos, concentração de íons plasmáticos
e atividade enzimática da Na+/K+-ATPase e H+-ATPase após exposição do tambaqui
durante 150 dias aos cenários climáticos B1, A1B e A2. Os métodos utilizados para
essas análises encontram-se descritos detalhadamente no Capítulo 1 desta tese.
Para investigar alterações no transcriptoma do tambaqui e identificar genes
diferencialmente expressos após 5 e 15 dias de exposição aos cenários climáticos
B1, A1B e A2, foi utilizado o sequenciamento de RNA (RNA-Seq). Os métodos
utilizados encontram-se descritos detalhadamente no Capítulo 2 desta tese.
Resultados
A partir da análise funcional e da ontologia de todos os genes
diferencialmente expressos identificados após a exposição do tambaqui aos
cenários climáticos B1, A1B e A2, foram selecionados os genes com rotas
metabólicas diretamente relacionadas às variáveis fisiológicas investigadas no
Capítulo 1. Esses genes foram agrupados na Tabela 1, que é composta
principalmente por vários tipos de chaperonas como Hsp90, DnaJ e Pfdn2 e genes
que estão envolvidos em modificações na composição e no funcionamento da
membrana plasmática como Citocromo oxidase, Calmodulina e Solute carrier.
124
Tabela 1: Principais genes diferencialmente expressos que responderam a exposição do tambaqui aos cenários climáticos B1, A1B e A2.
SÍMBOLO GENE ONTOLOGIA1 Bibloteca RNA-seq2
Atp2a1 ATPase, Ca++
Transporting, Cardiac Muscle, Fast Twitch 1
Calcium-transporting ATPase activity Calcium ion binding Nucleotide binding Protein binding
5 dias
Atp2a2b ATPase, Ca++
Transporting, Cardiac Muscle, Slow Twitch 2
Calcium-transporting ATPase activity Calcium ion binding Nucleotide binding Protein binding
5 dias
Calm2a Calmodulin 2
(Phosphorylase Kinase, Delta)
Calcium ion binding Membrane organization Detection of calcium ion Ion channel binding
15 dias
Calm3a Calmodulin 3
(Phosphorylase Kinase, Delta)
Calcium ion binding Membrane organization Detection of calcium ion Ion channel binding
15 dias
Cox4i2 Cytochrome C Oxidase Subunit IV Isoform 2 (Lung)
Cytochrome-c oxidase activity Cellular respiration Oxidation-reduction process Hydrogen ion transmembrane transport
5 dias
Cox5b2 Cytochrome C Oxidase Subunit Vb
Cytochrome-c oxidase activity Hydrogen ion transmembrane transport Metal ion binding Protein binding
15 dias
Cox7c Cytochrome C Oxidase Subunit VIIc
Cytochrome-c oxidase activity Hydrogen ion transmembrane transport Integral component of membrane Respiratory electron transport chain
5 dias
Cox8b Cytochrome C Oxidase Subunit VIIIB, Pseudogene
Cytochrome-c oxidase activity Integral component of membrane Respiratory electron transport chain Transmembrane transport
5 dias
Dnaja2 DnaJ (Hsp40) Homolog, Subfamily A, Member 2
Cellular response to heat Hsp70 protein binding Heat shock protein binding Protein binding
5 dias
Dnajc7 DnaJ (Hsp40) Homolog, Subfamily C, Member 7
Cellular response to heat Heat shock protein binding Protein binding Regulation of cellular response to heat
5 dias
125
Hmgb1a High Mobility Group Box 1
Chromatin remodeling DNA ligation involved in DNA repair Negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Transcriptional repressor complex
5 dias 15 dias
Hsp90aa1.1 Heat Shock Protein 90kDa Alpha (Cytosolic), Class A
Member 1
Chaperone-mediated protein complex assembly Protein binding Response to heat Regulation of cellular response to heat
5 dias
Hsp90aa1.2 Heat Shock Protein 90kDa Alpha (Cytosolic), Class A
Member 1
Chaperone-mediated protein complex assembly Protein binding Response to heat Regulation of cellular response to heat
15 dias
Pfdn2 Prefoldin Subunit 2
Protein folding Protein binding involved in protein folding Positive regulation of cytoskeleton organization Unfolded protein binding
5 dias 15 dias
Slc4a4b Solute Carrier Family 4 (Sodium Bicarbonate
Cotransporter), Member 4
Inorganic anion exchanger activity Regulation of intracellular pH Sodium ion transmembrane transport Sodium: bicarbonate symporter activity
15 dias
1 Anotação funcional obtida a partir da base de dados do Gene Ontology (http://www.geneontology.org/), que inclui as categorias: processo biológico, função molecular e componente celular. 2 Gene diferencialmente expresso identificado após 5 e/ou 15 dias de exposição aos cenários climáticos.
Discussão
Entre os genes diferencialmente expressos identificados no tambaqui após
exposição aos cenários climáticos B1, A1B e A2, destacam-se genes ou famílias
gênicas (Tabela 1) que atuam individualmente ou em grupo para garantir a
homeostase celular. Nesse sentido, esses genes sintetizam enzimas e proteínas que
desempenham importantes funções no dobramento de proteínas, na regulação da
transcrição, como canais iônicos e reguladores do potencial da membrana
plasmática.
126
São genes como Atp2a1 e Atp2a2b que atuam no armazenamento e controle
dos níveis intracelulares de cálcio a partir da ação coordenada de diversos
mecanismos de armazenamento de cálcio no retículo endoplasmático e ligação de
íons Ca2+ no citoplasma (Korosec et al. 2006; Pegoraro et al. 2011). A manutenção
dos níveis de cálcio e sua mobilização a partir do retículo endoplasmático para o
citoplasma celular é um fator fundamental para o controle de diversos padrões de
sinalização celular que são responsáveis, dentre outras funções, pela proliferação e
diferenciação celular, assim como pela apoptose, a morte programada da célula
(Korosec et al. 2008). O cálcio desempenha muitas funções fisiológicas
fundamentais para a sobrevivência dos organismos, como a coagulação sanguínea,
batimento cardíaco, contração muscular e transmissão de impulso nervoso (Heyen
et al. 2000; Korosec et al. 2008).
A concentração dos níveis plasmáticos de Ca2+ é regulada por diversos
receptores de membrana e bombas de cálcio (Ca2+-ATPase) (Varga-Szabo et al.
2009). Devido a atividade da Ca2+-ATPase, localizada na membrana plasmática da
célula e em organelas intracelulares como as mitocôndrias, os níveis de cálcio são
mantidos baixos dentro da célula na ausência de sinalização celular (Pegoraro et al.
2011). A Ca2+-ATPase atua no controle da homeostase celular de cálcio por meio da
hidrólise de um ATP que possibilita a captura de dois íons Ca2+ para dentro do
retículo endoplasmático (Periasamy e Kalyanasundaram 2007). Dentro da célula
podem estar ligadas ao retículo endoplasmático ou sarcoplasmático, (Atp2a /
SERCA) sendo transportadores de cálcio altamente conservados, encontrados
desde leveduras até mamíferos, e codificados por três genes: Atp2a1 (SERCA1),
Atp2a2 (SERCA 2) e Atp2a3 (SERCA3) (Korosec et al. 2008).
A estrutura molecular da família de genes Atp2a tem sido estudada em
abelhas (Magyar et al. 1995), galinhas (Machuca et al. 1999), mamíferos (Schleef et
al. 1996) e peixes (Lai et al. 2011). Em zebrafish (Danio rerio), peixe onde a família
gênica foi mais estudada, são conhecidas até o momento quatro formas
relacionadas a Atp2a: atp2a1, atp2a2a, atp2a2b e atp2a3 (Hirata et al. 2004; Ebert
et al. 2005). No tambaqui os genes da família Atp2a foram expressos negativamente
após 5 dias de exposição (Tabela S1 do Cap. 2), sendo Atp2a1 (B1: -3,825, A1B: -
1,1 e A2: -1,265) e Atp2a2b (B1: -4,553, A1B: 1,79 e A2: -1,161). Analisando os
níveis de Ca2+ detectados durante os 150 dias de exposição (Tabela 3 do Cap. 1),
fica evidente uma redução de Ca2+ plasmático já a partir de 5 dias de exposição em
127
todos os cenários experimentais (B1, A1B e A2), indicando uma correlação entre a
expressão negativa dos genes Atp2a1 e Atp2a2b e os níveis de Ca2+ no plasma de
tambaqui.
Outra família gênica que tem seu mecanismo de ação relacionado aos níveis
celulares de Ca2+ é a Calmodulina (CaM). A pequena proteína acídica sintetizada
por essa família de genes é conservada estrutural e funcionalmente, sendo
encontrada nas células de todos os eucariotos (Friedberg e Taliaferro 2005). A CaM
é considerada o principal sensor dos níveis de cálcio dentro da célula e seu
mecanismo de ação está diretamente relacionado à disponibilidade de Ca2+, atuando
principalmente em mecanismos de divisão celular, sobrevivência e apoptose, sendo
fundamental para viabilidade de células e tecidos, assim como para o sistema
nervoso central (Simão e Gomes 2001; Huo e Wong 2009). Quando a CaM se liga
aos íons Ca2+ torna-se ativa e, consequentemente, ativa muitas outras enzimas,
sendo considerada o ponto central de uma grande variedade de proteínas cálcio-
dependentes (Shimoda et al. 2002). Diversos estudos mostram que o complexo
CaM-Ca2+ atua de forma marcante na homeostase iônica e na modulação de
diversas proteínas celulares que incluem fosfodiesterase, Ca2+-ATPase,
calcineurina, óxido nítrico sintase, Ser/Tre quinases e fosfatases (Simão e Gomes
2001).
Nos vertebrados a estrutura molecular da CaM é conservada durante o
processo evolutivo, sendo 100% idêntica em todos os vertebrados, inclusive nos
peixes (Friedberg e Taliaferro 2005, Huo e Wong 2009). Enquanto nos invertebrados
foi encontrado apenas um gene, entre os vertebrados e mamíferos são encontrados
três genes (Calm1, Calm2 e Calm3) que codificam proteínas homólogas (Mototani et
al. 2010). No tambaqui duas das três formas gênicas foram identificadas após 15
dias de exposição aos cenários climáticos analisados (B1, A1B e A2). Os genes
Calm2a (B1: -1,418, A1B: -2,376 e A2: -2,507) e Calm3a (B1: -1,919, A1B: -2,874 e
A2: -1,567) tiveram sua expressão reduzida quando comparados a sala controle
(Tabela S2 do Cap. 2). Da mesma forma como ocorreu com o gene Atp2a, fica
evidente uma relação entre a expressão dos genes Calm2a e Calm3a e os níveis de
Ca2+ no plasma de tambaqui, pois tanto a expressão gênica quanto os níveis de
Ca2+ foram reduzidos nos três cenários climáticos analisados desde o início do
experimento até 150 dias de exposição.
128
Além dos genes relatados acima, a Citocromo C oxidase (Cox) foi identificada
no tambaqui entre os genes diferencialmente expressos após 5 e 15 dias de
exposição aos cenários climáticos. Em eucariotos os genes da Cox sintetizam um
complexo enzimático que está localizado na membrana interna das mitocôndrias, o
principal local onde ocorre a fosforilação oxidativa, fundamental para geração de
ATP (Zaslavsky e Gennis 2000; Popovic 2013). A Cox compreende uma família de
genes que sintetiza enzimas que atuam na etapa final da cadeia de transporte de
elétrons, onde catalisa a transferência de elétrons do Citocromo C para o oxigênio,
desempenhando, também, funções relacionadas a apoptose (Diaz 2010; Abumourad
2011). A Cox é composta por 13 subunidades, sendo as três maiores codificadas
pelo genoma mitocondrial (Cox1, Cox2 e Cox3) e dez pequenas subunidades
codificadas pelo genoma nuclear (Cox4, Cox5a, Cox5b, Cox6a, Cox6b, Cox6c,
Cox7a, Cox7b, Cox7c e Cox8). Além disso, qualquer limitação na síntese ou
atividade desse complexo enzimático implica na produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) sob condições de estresse oxidativo (Diaz 2010; Grim et al. 2010).
De uma maneira geral, os organismos aeróbicos enfrentam desafios
relacionados com a formação de ROS, incluindo superóxido (O2•–), radicais hidroxil
(–OH) e radicais peroxil (ROO•), que são capazes de danificar moléculas biológicas,
incluindo lipídios, proteínas e DNA (Dröge 2002). As células são protegidas dos
danos causados pela ROS utilizando dois mecanismos de defesa antioxidantes: não
enzimáticos, onde destacam-se a glutationa e as vitaminas E e C, e enzimáticos,
principalmente, superóxido dismutase e catalase. Em condições fisiológicas normais
a produção de ROS é similar à das defesas antioxidantes, mas devido à
interferência de agentes estressores diversos, os organismos podem se deparar
com situações de estresse oxidativo (Grim et al. 2010).
Modificações na temperatura ambiental onde vivem animais ectotérmicos
podem provocar uma reestruturação das membranas biológicas e modificações em
vários processos metabólicos que impactam as membranas biológicas, tornando-as
suscetíveis a processos potencialmente danosos desencadeados pelas ROS (Dröge
2002), alterações na permeabilidade da membrana a diversos íons como os prótons
(H+) (Hazel e Williams 1990; Zaslavsky e Gennis 2000) e até resultar em uma
completa perda de funcionamento da mitocôndria (Lee 2004). Em temperaturas mais
elevadas os organismos aumentam a demanda por oxigênio para a cadeia de
transporte de elétrons, com o objetivo de aumentar a produção de ATP (Strobel et al.
129
2013). Por isso em animais ectotérmicos as mitocôndrias desempenham um papel
central nas respostas térmicas desencadeadas pelo metabolismo aeróbico (Blier e
Lemieux 2001).
Para compreender as propriedades das enzimas responsáveis pela utilização
do oxigênio em nível celular, especialmente aquelas relacionadas à cadeia de
transporte de elétrons e a Cox, diversos estudos têm utilizado os peixes como
modelo para investigar a expressão da Cox e de suas subunidades em várias
espécies (Bremer e Moyes 2011) como goldfish (Carassius auratus) (LeMoine et al.
2008), zebrafish (D. rerio) (McClelland et al. 2006), Gasterosteus aculeatus
(Orczewska et al. 2010) e tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) (Abumourad 2011),
assim como a relação entre a Cox e taxa respiratória na truta do ártico (Salvelinus
alpinus) (Blier e Lemieux 2001).
No tambaqui foram identificadas quatro das 13 subunidades da Cox entre os
genes diferencialmente expressos, sendo Cox4i2, Cox7c e Cox8b após 5 dias
(Tabela S1 do Cap. 2) e Cox5b2 após 15 dias de exposição (Tabela S2 do Cap. 2)
aos cenários climáticos experimentais (B1, A1B e A2). Devido às limitações na
síntese de subunidades de Cox contribuírem de forma decisiva para a produção de
ROS, é possível que as quatro subunidades que tiveram sua expressão reduzida no
tambaqui tenham contribuído para o estresse oxidativo identificado no tambaqui. De
acordo com os resultados obtidos a partir do ensaio cometa, fica evidente que os
valores correspondentes ao índice de danos genéticos (GDI) começaram a
aumentar a partir de 5 dias, chegando aos valores mais elevados após 30 dias de
exposição (Tabela 3 do Cap. 1). Apesar dos resultados não mostrarem o nível de
expressão das subunidades de Cox a partir de 30 dias de exposição, os resultados
sugerem uma relação entre a redução dos níveis de expressão das subunidades de
Cox e o aumento de danos no DNA de eritrócitos de tambaqui, possivelmente em
decorrência do aumento na produção de ROS.
A família gênica mais frequente entre os genes diferencialmente foi, sem
dúvida, a das chaperonas, também conhecidas como heat shock proteins (Hsps).
Seus genes dão origem à síntese de proteínas altamente conservadas que já foram
encontradas em diversos organismos, inclusive em peixes. Nos vertebrados, a
expressão das Hsps é regulada pelos fatores de transcrição de choque térmico 1
(Hsf1), que se ligam às regiões promotoras das Hsps, chamadas de elementos de
choque térmico (Hse) (Adám et al. 2000). Com base em seu peso molecular, as
130
Hsps são divididas em três principais grupos: Hsp90 (com 85 a 90 kDa), Hsp70 (com
68 a 73 kDa), Hsps de baixo peso molecular (com 16 a 47 kDa) (Basu et al. 2002).
As Hsps desempenham importantes funções na fisiologia celular dos organismos,
tanto em células em condições normais (sem estresse), em que são expressas
constitutivamente para manter a forma e a função das proteínas sintetizadas pela
célula, quanto em situações de estresse físico e metabólico, incluindo estresse
oxidativo e, principalmente, estresse térmico (Tine et al. 2010; Oksala et al. 2014).
De uma maneira geral, as Hsps atuam no dobramento de polipeptídeos recém-
sintetizados, no reparo e degradação de proteínas alteradas ou desnaturadas, na
formação e manutenção de componentes do citoesqueleto e de receptores de
hormônios esteroides, na manutenção das membranas lipoproteicas das
mitocôndrias e do núcleo celular, no transporte de proteínas através da membrana e
no controle de mudanças no formato e na função de diversas proteínas (Kiang and
Tsokos 1998; Basu et al. 2002).
Estudos realizados em peixes e outros organismos mostram que cada uma
das três categorias de Hsps apresenta diferentes funções em situações de estresse
térmico (Basu et al. 2002). A Hsp90 atua na redução dos níveis de ROS e da
peroxidação lipídica, além de aumentar as defesas antioxidantes por meio da
indução de glutationa. Assim, a Hsp90, juntamente com os mecanismos de defesas
antioxidantes, atua no reparo de células danificadas pela exposição aguda ou
crônica a variações de temperatura, sendo considerada um importante mecanismo
que evita a apoptose (Cui et al. 2014; Oksala et al. 2014). Em larvas de zebrafish,
várias Hsps, incluindo Hsp90aa1 (heat shock protein 90-alpha 1) e Hsp90aa.2 (heat
shock protein 90-alpha 2), foram expressas após exposição ao calor e ao frio, porém
essa expressão foi mais rápida quando as larvas foram expostas ao calor do que ao
frio (Long et al. 2012). As Hsp90 são as únicas chaperonas moleculares que não
atuam no dobramento de proteínas recém-sintetizadas, porém são fundamentais em
processos de sinalização celular, devido seus principais substratos serem proteínas
de transdução de sinal como receptores de hormônios esteroides e diversas
enzimas kinases (Basu et al. 2002; Chen et al. 2005).
A Hsp70 compreende o maior e mais estudado grupo de Hsps, sua expressão
varia em diferentes condições fisiológicas. Existem três formas de Hsp70: a Hsc70
(heat shock cognate) que é expressa constitutivamente, a Hsp70 que é expressa em
condições de estresse resultante de um estímulo externo e algumas subunidades
131
que são expressas em ambas as condições (Jesus et al. 2013). Diversos padrões de
expressão da Hsp70 têm sido encontrados em vários peixes, incluindo zebrafish
(Malek et al. 2004), carpa (Ctenopharyngodon idellus) (Cui et al. 2014) e bacalhau
do Atlântico (Gadus morhua) (Hori et al. 2010). Um estudo recente comparou a
expressão da Hsp70 e da Hsc70 em duas espécies de peixe do gênero Squalius (S.
torgalensis e S. carolitertii) submetidos a diferentes temperaturas; os resultados
mostraram que apesar de serem evolutivamente próximas, o nível de expressão e a
tolerância térmica foram bastante diferentes entre as duas espécies do mesmo
gênero, pois enquanto S. torgalensis aumentou o nível de expressão de Hsp70 e
Hsc70 em temperaturas mais elevadas, S. carolitertii não evidenciou alterações na
expressão das Hsps, o que pode ter levado, de acordo com os autores, aos altos
níveis de mortalidade detectados em S. carolitertii quando submetido a temperaturas
mais elevadas (Jesus et al. 2013).
O terceiro e último grupo de Hsps, denominado de HSP40 ou DnaJ, atua de
forma muito semelhante a Hsp70, promovendo o dobramento, desdobramento, a
montagem, o transporte e a degradação de proteínas dentro da célula (Qiu et al.
2006; Li et al. 2011). A Hsp40 é capaz de regular o funcionamento da Hsp70
estimulando a atividade ATPase por meio do domínio J, normalmente localizado na
extremidade N-terminal da proteína (Li et al. 2011). Devido a hidrólise de ATP ser
essencial para a atividade da Hsp70, a Hsp40 consegue determinar a atividade da
Hsp70 promovendo a estabilização da sua interação com o substrato (Qiu et al.
2006; Liu et al. 2013). No bagre de canal diversas formas gênicas de Hsp40 foram
identificadas após construção de bibliotecas de RNA-seq de peixes submetidos a
diferentes níveis de estresse térmico (Liu et al. 2013).
Dois dos três grupos de Hsps foram identificados no tambaqui, sendo Hsp90
(Hsp90aa1.1 e Hsp90aa1.2) e Hsp40 (Dnaja3 e Dnajc7) (Tabelas S1 e S2 do Cap.
2). Com base na ontologia dos genes identificados e na amplitude da atividade das
Hsps, é possível que esses genes sejam os principais responsáveis pela
sobrevivência do tambaqui aos três cenários experimentais analisados (B1, A1B e
A2). A Hsp90, que é sintetizada apenas em situações de estresse, pode ter
contribuído para redução dos níveis de ROS e aumento das defesas antioxidantes
nos eritrócitos de tambaqui, particularmente após 30 dias de exposição. A Hsp40,
por atuar no controle do funcionamento da Hsp70 e na ligação a diversas enzimas
celulares, pode ter atuado no controle da atividade das principais enzimas de
132
regulação iônica, Na+/K+-ATPase e H+-ATPase, contribuindo assim para a
manutenção do pH celular e para a concentração de íons monovalentes como Na+,
K+ e Cl- do tambaqui nos três cenários experimentais investigados.
Outra chaperona identificada entre os genes diferencialmente expressos foi a
Prefoldin (Pfdn) que sintetiza uma proteína com o mesmo nome. A Pfdn é, assim
como as outras Hsps descritas acima, uma chaperona molecular presente em todos
os eucariontes, onde atua no dobramento de cadeias polipeptídicas recém-
sintetizadas por meio da ligação às proteínas sintetizadas pelos ribossomos e
também no transporte até outras chaperonas, como Hsp70 e Hsp40 (Abe et al.
2013). Seu correto funcionamento nos eucariotos é influenciado por variações na
temperatura ambiental (Zako et al. 2010). Por não depender da hidrólise de ATP, ela
sozinha não teria condições de realizar o correto dobramento de proteínas
desnaturadas, por isso atua de forma acessória às outras chaperonas, contribuindo
assim para atribuições de forma e função às proteínas recém-sintetizadas pelos
ribossomos (Zako et al. 2010; Abe et al. 2013; Mirón-García et al. 2014). Além
dessas funções, a Pdfn, in vitro, também consegue se aderir à outras proteínas
celulares (não recém-sintetizadas) e transportá-las até as Hsps, porém in vivo essa
função ainda não foi comprovada (Zako et al. 2010).
A Pfdn é composta por seis subunidades (Pfdn1 a 6), sendo duas
subunidades alfa (pfdn3 e pfdn5) e quatro beta (Pfdn1, Pfdn2, Pfdn4, Pfdn6) (Abe et
al. 2013). No tambaqui apenas a subunidade 2 (Pfdn2) foi identificada, tanto após 5
dias (B1: -1,378, A1B: 1,621 e A2: 3,999) (Tabela S1 do Cap. 2), quanto após 15
dias (B1: -2,897, A1B: -9,682 e A2: -2,246) (Tabela S2 do Cap. 2) de exposição aos
cenários climáticos experimentais (B1, A1B e A2). Assim, acreditamos que a Pfdn2
seja responsável pela captura e transporte das proteínas recém-sintetizadas pelo
tambaqui para manter a homeostase celular. Porém, a expressão negativa da Pfdn2
no tambaqui pode indicar um comprometimento de suas funções devido a exposição
aos cenários climáticos, especialmente após 15 dias de exposição, podendo assim
dar início a uma cadeia de eventos que resultaria no incorreto dobramento de
proteínas recém-sintetizadas pelas células.
Outro gene identificado no tambaqui após 5 e 15 dias de exposição aos
cenários climáticos foi o Hmgb (High-Mobility Group Box), que sintetiza um grupo de
proteínas não histônicas que compõe a cromatina, atuando na montagem de
complexos nucleoproteicos de enhanceossomos (Stemmer et al. 2002; Xie et al.
133
2014). As Hmgbs são consideradas compensadoras gerais da transcrição,
auxiliando tanto no processo de transcrição em si, quanto na abertura da molécula
de DNA para possibilitar a atuação das polimerases (Stemmer et al. 2002).
As Hmgbs são altamente móveis, podendo ser encontradas no núcleo, no
citoplasma e até mesmo fora da célula, desempenhando uma grande variedade de
funções que incluem recombinação e reparo do DNA (Moleri et al. 2011; Xie et al.
2014). Em mamíferos e outros vertebrados, as Hmgbs compreendem três grupos
principais: Hmgb1, Hmgb2 e Hmgb3. Hmgb1 é uma proteína nuclear amplamente
distribuída que apresenta variações no padrão de expressão e localização dentro da
célula, sendo altamente expressa tanto na embriogênese, quanto em animais
adultos. O oposto ocorre com a Hmgb2, que apresenta uma distribuição mais restrita
e limitada a animais adultos. A Hmgb3 é considerada uma forma intermediária com
distribuição mais ampla que Hmgb2, porém muito frequente durante o
desenvolvimento embrionário (Moleri et al. 2011).
Uma das características marcantes da Hmgb1 é sua ação como modulador
compensatório em resposta a elevação da temperatura, sendo seu gene
considerado um sensor global de temperatura, inclusive em peixes (Podrabsky e
Somero 2004; Somero 2005; Logan e Buckley 2015). Diversos trabalhos mostram
que a abundância dos transcritos de Hmgb1 em peixes é reduzida quando são
expostos a temperaturas elevadas (Podrabsky e Somero 2004; Jayasundara et al.
2013; Logan e Buckley 2015). Podrabsky e Somero (2004) utilizando o teleósteo
killifish (Austrofundulus limnaeus), primeiramente aclimataram um grupo de
indivíduos a 20ºC (controle) e outro a 37ºC e, em seguida, fizeram alterações de
temperatura nos dois grupos para simular as variações diárias de temperatura que
ocorrem durante o dia e a noite. Os resultados mostraram que a expressão dos
transcritos de Hmgb1 foi elevada e mais estável em peixes aclimatados a 20ºC,
enquanto que a 37ºC a expressão foi negativa e bastante variável. Segundo os
autores, a expressão de Hmgb1 é negativamente correlacionada com aumento da
temperatura, influenciando a síntese de enzimas envolvidas em alterações na
composição lipídica da membrana e a expressão de genes característicos de
variações de temperatura, como as Hsps.
A Hmgb1 atua também por meio da ligação a importantes fatores de
transcrição, como p53, HoxD9 e receptores de hormônios esteroides através de
domínios específicos de interação. Além disso, a Hmgb1 permite a ligação a uma
134
grande variedade de outras proteínas, incluindo diversos elementos que formam o
citoesqueleto, proteínas da matriz extracelular, várias classes de lipídeos e proteínas
da membrana plasmática (Podrabsky e Somero 2004). Ela também eleva em pelo
menos 20 vezes a afinidade de várias proteínas à região TATA box, controlando
assim a transcrição de centenas de genes que possuem TATA box na região
promotora (Das e Scovell 2001). Adicionalmente, a estabilidade térmica e as
propriedades bioquímicas de Hmgb1 indicam que a proteína é muito sensível à
variações de temperatura in vivo, o que poderia interferir na afinidade de complexos
nucleoproteicos com fatores de iniciação da transcrição, resultando em mudanças
na taxa de expressão de genes, especialmente aqueles que possuem TATA box
(Podrabsky e Somero 2004).
Tendo em vista que a expressão de Hmgb1a no tambaqui foi negativa após 5
(B1: -1,722, A1B: -2,413 e A2: -1,931) (Tabela S1 do Cap. 2) e 15 dias (B1: -1,842,
A1B: -4,908 e A2: -1,181) (Tabela S2 do Cap. 2) de exposição aos cenários
climáticos, é possível que, assim como ocorreu em killifish, o Hmgb1a atue no
tambaqui como modulador compensatório da transcrição, controlando a síntese de
vários genes em resposta ao aumento na temperatura, especialmente genes que
codificam enzimas que atuam na membrana plasmática, como Na+/K+-ATPase e H+-
ATPase.
Com função marcante na regulação iônica e no equilíbrio ácido-base dos
peixes, a família gênica conhecida como solute carrier (SLC) compreende cerca de
338 genes já identificados em teleósteos, incluindo zebrafish, salmão do Atlântico
(Salmo salar), truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e Anguilla japônica (Romano et
al. 2014). Os genes da família SLC são divididos em 12 grupos com base no tipo de
substrato que utilizam. Seus genes codificam proteínas que desempenham uma
variedade de funções nos peixes, principalmente transportadores de diversas
substâncias como aminoácidos, oligopeptídeos, cátions e ânions inorgânicos,
glicose e outros açúcares, íons metálicos e ureia (He et al. 2009; Romano et al.
2014). A ampla maioria dos estudos funcionais relacionados aos mecanismos de
ação dos genes da família SLC está relacionada aos mecanismos de transporte de
substâncias envolvendo peixes expostos a diferentes salinidades, temperaturas,
níveis de oxigênio e absorção de íons metálicos, com o objetivo de compreender
como esses desafios ambientais afetam a sobrevivência e o desenvolvimento dos
peixes desde a fase embrionária até a fase adulta (Romano et al. 2014).
135
Entre os membros da família SLC, o gene Slc4a4b é considerado decisivo na
determinação de padrões ionoregulatórios dos peixes, com atuação marcante nas
células da pele e do tecido branquial, agindo como principal transportador das
células basolaterais por meio da captação de Na+ e excreção de produtos acídicos
(H+), especialmente em situações de acidose ou hipercapnia (Parks et al. 2007; Lee
et al. 2011). Em zebrafish, o RNAm de Slc4a4b já foi sequenciado na pele e nas
brânquias, sempre associado à células ricas em H+-ATPase atuando como co-
transportador Na+/HCO3, por meio da captura de um Na+ e excreção de três HCO3-
(Lee et al. 2011). Utilizando anticorpos homólogos, o gene Slc4a4b foi encontrado
também associado a Na+/K+-ATPase em Tribolodon hakonensis, um ciprinídeo que
vive tanto na água doce quanto em água salgada (Hirata et al. 2003).
Em tambaqui o gene Slc4a4b foi identificado entre os genes diferencialmente
expressos após 15 dias de exposição (B1: -2,735, A1B: 1,476 e A2: -1,077) aos
cenários climáticos (Tabela S2 do Cap. 2). No entanto, as variações observadas na
atividade das enzimas Na+/K+-ATPase (Figura 3 do Cap. 1) e H+-ATPase (Figura 4
do Cap. 1) durante os 150 dias de exposição dificultam uma correlação direta com o
nível de expressão do gene nos três cenários experimentais (Tabela S2 do Cap. 2).
Apesar disso, com base na ontologia gênica e em resultados obtidos utilizando
outras espécies como modelo, é possível que o gene Slc4a4b exerça funções
importantes na regulação iônica e no controle do pH celular do tambaqui, tanto por
meio da captura de Na+ e excreção de HCO3-, quanto associado às enzimas Na+/K+-
ATPase e H+-ATPase. Mais estudos serão necessários para investigar a localização
do gene Slc4a4b no tambaqui e compreender melhor seu funcionamento.
O presente estudo confirma que numerosos genes estão envolvidos na
resposta do tambaqui aos cenários climáticos, especialmente Hsps e genes que
atuam no remodelamento das membranas celulares. A partir da análise integrativa
dos genes diferencialmente expressos com diversas variáveis fisiológicas
analisadas, fica evidente que a exposição do tambaqui aos principais cenários de
mudanças climáticas previstos pelo IPCC, pode comprometer processos biológicos e
vias de sinalização celular fundamentais para a sobrevivência do tambaqui,
particularmente a síntese, dobramento e transporte de proteínas recém-sintetizadas,
a biogênese mitocondrial, as defesas celulares antioxidantes, a osmoregulação, a
atividade de enzimas de regulação iônica e a manutenção de gradiente
eletroquímico das membranas celulares. Os resultados obtidos possibilitaram, por
136
meio da análise mais aprofundada de alterações no transcriptoma, conjuntamente
com a avaliação de características fisiológicas, a compreensão de importantes
mecanismos envolvidos em processos de adaptação do tambaqui às mudanças