1 UNESP – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CURSO DE ENFERMAGEM Disciplina de Microbiologia AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA 2017
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UNESP –
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
CURSO DE ENFERMAGEM
Disciplina de Microbiologia
AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA
2017
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LEMBRETES IMPORTANTES
1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o uso
de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma
sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do
ambiente fora do laboratório.
2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são
realizados.
3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente
(derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de
qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.).
4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.
5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.
6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que
deixe os pés expostos.
7. Não serão permitidas fotografias no interior do laboratório, salvo em caso de
autorização do docente responsável pela aula.
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS
Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório
individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso
da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente
deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo
menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em
seu relatório, mesmo que o entregue.
Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de
forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos
experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais que
duas folhas.
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MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA
Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das lâminas
será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram coradas e
estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas pelo método
de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração (como Gram
positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco ou bacilo). Além
das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a observação de uma lâmina
contendo um esfregaço de escarro apresentando bacilos álcool-ácido resistentes
(que não se coram pelo método de Gram) e corada pelo método de Ziehl-Neelsen.
Coloração de Bactérias pelo Método de Gram
Material:
- Lâminas contendo o esfregaço de bactérias
- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%, fucsina.
Procedimento:
a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto.
b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto.
c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool
cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os
esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o
corante dos mesmos.
d) Lavar a lâmina em água corrente.
e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1
minuto.
f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro.
g) Observar ao microscópio e desenhar na folha seguinte.
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Desenhos:
Lâmina B (Staphylococcus aureus)
Forma:________________
Arranjo: ________________
Gram: ________________
Lâmina A (Escherichia coli)
Forma:________________
Arranjo: ________________
Gram:_________________
Lâmina C (Streptococcus agalactiae)
Forma:________________
Arranjo: ________________
Gram: ________________
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Lâmina E (Neisseria sp)
Forma:________________
Arranjo: ________________
Gram:_________________
Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR)
(Mycobacterium tuberculosis) Lâmina contendo um esfregaço de escarro de um paciente com tuberculose, corada pelo método de Ziehl-Neelsen e apresentando BAAR
Lâmina D (Bacillus cereus)
Forma:________________
Arranjo: ________________
Gram: ________________
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MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO
A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias
Material:
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura B (Staphylococcus aureus)
- Cultura C (Streptococcus agalactiae)
- Caldo sintético
- Caldo comum
- Caldo glicosado (caldo comum acrescido de 1% de glicose)
- Alça de níquel cromo
Procedimento:
1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.
2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.
3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).
4. Anotar os resultados.
Cultura Crescimento em
Caldo sintético Caldo comum Caldo glicosado
A
B
C
B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano
Material:
- Meio de Tiogel
- Caldo simples
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)
- Cultura F (Clostridium sp)
- Agulha de níquel cromo
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Procedimento:
Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos de tiogel e
incubar em estufa a 37 °C. No dia seguinte, observar o crescimento das culturas A
e D juntamente com a cultura F que foi previamente semeada quando do preparo
da aula prática. Classificar cada cultura quando à dependência de oxigênio em
aeróbia, anaeróbia ou facultativa, conforme o local de seu crescimento no tubo de
tiogel (em cima, no fundo ou em toda a extensão do tubo)
Cultura Local do crescimento no tubo
Classificação Superfície Toda extensão Base do Meio
A
D
F
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CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS
A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias
Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada ou
não.
Material
- Suspensão da cultura A (Escherichia coli, bactéria não esporulada) em solução
salina
- Suspensão da cultura E (Bacillus cereus, bactéria esporulada) em solução salina
- Placas de Petri contendo ágar nutriente e divididas em quadrantes, identificados
pelo tempo de cultivo bacteriano em minutos (0’, 5’, 10’ e 15’).
- Banho-Maria a 60º C
- Alça de Níquel cromo
Procedimento
1. Inocule (com a alça de níquel cromo) amostras das suspensões bacterianas A
e E nas respectivas placas, no quadrante correspondente ao tempo 0’.
2. Coloque, em banho-maria a 60º C, os tubos com a suspensões e, aos 5', 10' e
15', inocule novamente amostras das suspensões para os quadrantes
correspondentes nas placas.
3. Deixe as placa na estufa a 37ºC até o dia seguinte.
4. Observe a variação quantitativa de crescimento bacteriano nos quadrantes em
função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++,
conforme a intensidade de crescimento).
Cultura Tempo de aquecimento
0’ 5’ 10’ 15’
A
E
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B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal)
Material:
- 3 suabes estéreis
- Antisséptico bucal de uso comercial
- 1 placa de ágar-nutriente, dividida em três partes (identificadas por A, B e C)
Procedimento:
1. Friccionar um suabe estéril na mucosa da bochecha e espalhar (“em
ziguezague”) seu conteúdo no quadrante A da placa de ágar nutriente.
2. Bochechar, por 1 minuto, com parte do o antisséptico bucal fornecido.
3. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material, com outro
suabe, espalhando seu conteúdo no quadrante B.
4. Bochechar novamente com o antisséptico bucal por 1 minuto.
5. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta com um novo suabe estéril espalhando seu
conteúdo no quadrante C.
6. Deixe a placa na estufa a 37°C até o dia seguinte.
7. Fazer a leitura das placas, anotando com cruzes (de + a ++++), na tabela abaixo,
a intensidade do crescimento microbiano, conforme o tempo de exposição ao
antisséptico bucal.
Tempo de exposição* A B C
Crescimento Microbiano
*Tempo de exposição ao antisséptico = A (antes do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo tratamento).
C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1%)
Material:
- 1 tubo contendo aproximadamente 1 mL de álcool iodado a 0,1%
- 1 placa de ágar-nutriente dividida em duas partes iguais, identificadas como
“antes” e “depois”
- 3 suabes estéreis
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Procedimento
1. Umedeça um suabe em salina, contida em um tubo de ensaio. Após retirar o
excesso de salina, pressionando a suabe contra a parede do tubo, esfregue-a
vigorosamente no dorso de uma das mãos;
2. Passe o suabe em uma das partes da placa com ágar nutriente (“antes”);
3. Umedeça um segundo suabe em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da
outra mão;
4. Aguarde 2 minutos para que o antisséptico aja sobre a microbiota da pele;
5. Passe então, nessa área, um terceiro suabe umedecido em salina, tomando
cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Passe o suabe na superfície
da outra metade da placa com ágar nutriente (“depois”)
6. Incube a placa na estufa a 37°C, durante uma noite.
7. Observe as placas e anote a intensidade do crescimento microbiano com sinal
+ (de + a++++) na tabela abaixo
Sem álcool-iodado 0,1% Com álcool-iodado 0,1%
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CONJUGAÇÃO BACTERIANA
Material:
- 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), dividida em duas
partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas.
- 1 placa de ágar MacConkey contendo cloranfenicol (Clo), dividida em duas partes
iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas.
- 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico e cloranfenicol (Nal + Clo)
dividida em três partes, identificadas com as culturas a serem semeadas.
- Escherichia coli C600, não fermentadora de lactose (lac-) (cultura A) em meio
líquido.
- Escherichia coli J53 fermentadora de lactose (lac+) (cultura B) em meio líquido
- mistura das culturas A e B (cultura M) em meio líquido.
- alça de níquel cromo.
Procedimento:
1. Semear as culturas A e B nas partes correspondentes da placa de ágar
MacConkey contendo Nal. Fazer o mesmo na placa contendo Clo.
2. Semear as culturas A, B e M nas partes correspondentes da placa de ágar
MacConkey contendo Nal+Clo
3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte.
4. Verificar a ocorrência de crescimento (+ ou -) e o fenótipo de fermentação de
lactose (+ ou -) das culturas que cresceram e anote os resultados na tabela
abaixo.
Cultura
Crescimento em ágar MacConkey contendo: Fermentação
da lactose Nal Clo Nal + Clo
A
B
M
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DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS
Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby
Material:
- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos
contendo antibióticos distintos, em concentrações definidas
- Régua
- Tabela de referência
Procedimento:
1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.
2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no
quadro abaixo.
Droga Concentração
(g/ml)
Diâmetro do halo de inibição do crescimento
Interpretação*
1
2
3
4
5
* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário.
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STAPHYLOCOCCUS
1) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever
as características das colônias (cor, brilho, opacidade, tamanho, etc.) e
classificar as culturas quanto ao tipo de hemólise ( ou ).
Cultura Características das Colônias Hemólise
A
B
2) Observar lâmina com esfregaço da cultura A corada pelo método de Gram.
Desenhar. 3) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle (Streptococcus)
algumas gotas de água oxigenada. Observar se há formação de bolhas e anotar
abaixo o resultado (positivo ou negativo).
Cultura Catalase
A
B
Streptococcus
Cultura A
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4) Prova da Coagulase
Princípio: A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma
sanguíneo, produzindo coágulo.
Procedimento: Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de
sangue de coelho a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 3-4 horas. Fazer o
mesmo com a cultura B e anotar os resultados, como positivo ou negativo, segundo
houver ou não a formação de coágulo.
Cultura Prova da Coagulase
A
B
5) Compilação dos resultados e identificação das culturas
Cultura Hemólise Catalase coagulase Identificação
A
B
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ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS
Staphylococcus, Streptococcus e Micrococcus
Cocos Gram +
isolados ou
agrupados
Catalase
Negativa
Streptococcus
Positiva
Staphylococcus
Oxidativo e Fermentativo (OF)
Staphylococcus
Coagulase
Positiva
Staphylococcus aureus
Negativa
Staphylococcus epidermidis e outros
Oxidativo (O)
Micrococcus
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STREPTOCOCCUS
EXERCÍCIOS
A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Verificar
o tipo de hemólise.
Cultura Hemólise
C
D
E
B) Observar lâminas das culturas C e E coradas pelo método de Gram.
C) Prova da catalase.
Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo
algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado
(Positivo = formação de bolhas).
Cultura Catalase
C
Staphylococcus aureus (controle +)
Cultura C Cultura E
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D) Prova de sensibilidade à bacitracina
Princípio: Baseia-se na inibição de crescimento do Streptococcus pyogenes (-
hemolítico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. A inibição
do crescimento se manifesta através de um halo ao redor do disco de papel de
filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura a ser testada, que é
previamente espalhada sobre a superfície do ágar sangue.
Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento. resistente:
ausência de zona de inibição de crescimento.
E) Prova de sensibilidade à optoquina.
Baseada no mesmo princípio da prova anterior. Coloca-se um disco contendo
optoquina sobre uma cultura semeada em ágar sangue e incuba-se por uma
noite. No dia seguinte, verifica-se a ocorrência de um halo de inibição de
crescimento bacteriano em torno do disco contendo a droga.
F) CAMP teste
Princípio: A atividade da hemolisina do Staphylococcus aureus é aumentada
pela atividade hemolítica do Streptococcus agalactiae (-hemolítico do grupo B).
As bactérias são semeadas perpendicularmente no ágar e incubadas por uma
noite a 37ºC. Com o crescimento bacteriano, as hemolisinas de ambas as
bactérias difundem-se no ágar, de modo que no ponto onde se misturam forma-
se uma zona de hemólise mais clara e que tem o formato de uma ponta de flecha.
G) Identificação das culturas
Cultura Identificação
C
D
E
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Catalase negativos
Tipo de hemólise
GamaBeta
Bacitracina
Resistente
Streptococcus não do grupo A
Sensível
Streptococcus pyogenes (gr. A)
Alfa
Letalidade em camundongos
Negativa
Streptococcus -hemolítico
Positiva
Streptococcus pneumoniae
Bile-solubilidade
Negativa
Streptococcus -hemolítico
Positiva
Streptococcus pneumoniae
Optoquina
Resistente
Streptococcus-hemolítico
Sensível
Streptococcus pneumoniae
ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Streptococcaceae
Gênero: Streptococcus (Cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia)
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PSEUDOMONAS
1) Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.
Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar,
também, a pigmentação verde do crescimento em ágar simples – uma
característica peculiar da espécie.
Cultura Característica das colônias
P. aeruginosa
2) Observar lâmina com esfregaço da cultura de Pseudomonas aeruginosa corada
pelo método de Gram. Observar ao microscópio e desenhar.
3) Teste de fermentação da glicose
Observar uma cultura de Pseudomonas e uma de Escherichia coli em caldo
glicosado, contendo vermelho fenol ou indicador de Andrade. Interpretar a
diferença de cor das culturas e anotar os resultados na tabela abaixo.
Cultura Cor do meio Fermentação da glicose
P. aeruginosa
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
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4) Prova da Citocromo C-oxidase
Fazer prova da citocromo C-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma
cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado (positivo
ou negativo).
Cultura Prova de citocromo C-oxidase
P. aeruginosa
Escherichia coli
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ENTEROBACTÉRIAS
1) Observar a coloração das colônias das bactérias A, B, C e D cultivadas em
placas de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de fermentação
de lactose e de produção de H2S.
Cultura Coloração da colônia em
Lactose H2S MacConkey SS
A
B
C
D
2) Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e
citrato de Simmons (conforme orientação nas páginas 24 e 25) Anotar abaixo
os resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.
Prova Cultura
A B C D
Citrato
Glicose
Gás
Urease
H2S
LTD*
Motilidade
Lisina
Indol
Lactose**
*LTD = L-triptofano desaminase ** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)
Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 26, identificar
cada uma das culturas.
Culturas: A________________________
B________________________ C________________________ D________________________
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3) Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação
bioquímica.
Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os
soros anti - S. flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou
negativo).
Soro Cultura
B C
Anti - Shigella flexneri
Anti – Salmonella
Leitura das provas bioquímicas nos meios de EPM, MILi e Citrato de Simmons
Meio de cultura1 Cor/Aspecto Resultado Positivo para:
EPM
Amarelo na base Fermentação de Glicose
Verde na superfície 2 Desaminação de triptofano (LTD)
Preto na base H2S
Bolhas de ar Produção de gás de ferm. da glicose
Azul na base Urease
MILi
Roxo Descarboxilação da lisina (LDC)
Tubo completamente turvo
Movimento
Vermelho3 Produção de indol
Citrato de Simmons
Azul Aproveitamento de Carbono do citrato de sódio
Obs: 1Cor original dos meios: EPM e Citrato de Simmons = verde; MILi = roxo 2Resultado positivo difícil de ser identificado; as culturas da aula prática dão
resultado negativo nesta prova 3A prova de indol é feita com a adição do reativo de Kovacs
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24
25
Perfil bioquímico e motilidade de algumas Enterobactérias
*LTD = L-triptofano desaminase
Espécie/Gênero Prova Bioquímica
Citrato Glicose Gás Urease H2S LTD* Movimento Lisina Indol Lactose
Escherichia coli - + + ou - - - - + ou - + ou - + +
Shigella flexneri - + - - - - - - + ou - -
Edwardsiella tarda - + + - + - + + + -
Salmonella sp + ou - + + - + - + + - -
Citrobacter rodentium + + + + ou - + - + - - + ou -
Klebsiella pneumoniae + + + + - - - + - +
Enterobacter + + + + ou - - - + - - + ou -
Serratia marcescens + + + ou - + ou - - - + + - -
Proteus mirabilis + ou - + + + ou - + + + - - -
Proteus vulgaris + ou - + + ou - + + + + - + -
Morganella morganii - + + ou - + - + + ou - - + -
Providencia rettigeri + + + ou - + - + + - + -