Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 1 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA CÓDIGO: FAR 315L FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN: M. C. Nidia Gary Pazos Salazar M. C. Maria Susana Pérez Fernández M. C. Oscar Pérez Toríz M. C. Alejandro Ruíz Tagle M. C. Carlos Téllez Osorio M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS: 8
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1
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA
NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA CÓDIGO: FAR 315L FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:
M. C. Nidia Gary Pazos Salazar M. C. Maria Susana Pérez Fernández M. C. Oscar Pérez Toríz M. C. Alejandro Ruíz Tagle M. C. Carlos Téllez Osorio M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla
HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS: 8
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INDICE
NÚMERO DE LA PRÁCTICA
TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA
PRÁCTICA No. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA.
3
PRÁCTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES.
7
PRÁCTICA No. 3
PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
12
PRACTICA NO 4 PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.
16
PRÁCTICA No. 5 HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS.
20
PRÁCTICA No. 6 ENSAYO DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.
24
PRÁCTICA No. 7 REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.
28
PRÁCTICA No. 8 TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.
28
PRÁCTICA No. 9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO.
32
PRACTICA No 10 SEMINARIO: OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO DE FIBROBLASTOS DE EMBRIÓN DE POLLO.
PRÁCTICA No. 11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2
37
PRÁCTICA No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS.
40
PRÁCTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN ESCHERICHIA COLI.
43
PRÁCTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES.
47
PRACTICA No 15 ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV.
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PRACTICA No 16 EVALUACIÓN FINAL
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PRACTICA NO. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
VIROLOGÍA
INTRODUCCIÓN
El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-
contagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de
seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma
accidental, una infección por este tipo de partículas.
Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas
que habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar
la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización
adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes.
La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se
permitirá el acceso al laboratorio.
Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.
Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de
las mesa de trabajo.
Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón
desinfectante.
Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así
como introducir algún objeto en la boca.
La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada.
Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla.
Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo.
Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable.
Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo
con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para
aclararlas.
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Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material,
derramamiento de suspensiones virales, etc.).
Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de
desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores
correspondientes.
En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se
le proporcione en el laboratorio.
Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo,
sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida.
En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma
Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para
la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y
disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en
establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud.
En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los
laboratorios y áreas de microbiología, tales como:
Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes,
materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos,
físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de
transmisión de enfermedades.
Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros
microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede
contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a
seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de
atención médica.
En adición, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los
siguientes:
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La sangre
Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos
Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación,
así como los generados en la producción de biológicos
Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos
Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e
histológico
Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los
laboratorios
Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma
de muestras
Los objetos punzo cortantes usados o sin usar
Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas
durante el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas,
pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes,
cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo
y similares.
Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán
ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales:
Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos
Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos
Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos.
El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza
la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las
prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas.
Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en
esta primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que a través de las diferentes
prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas
para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección
hacia los estudiantes.
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CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a
materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de
tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de virus hasta su destino final.
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PRACTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA
HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Desde el descubrimiento de los virus, se identifico que de acuerdo a sus
características moleculares, estos agentes requieren del empelo de modelos vivos
para su análisis; esta condición hace particularmente difícil implementar el uso de
sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de
Células en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la búsqueda de alternativas
para el análisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos.
PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA). Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo
como explicaremos más adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre
cualquier virus con proteínas estructurales con propiedades hemaglutinantes. El
nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían
aglutinar eritrocitos, posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se
debía a la existencia de una glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se
le denominó como hemaglutinina.
Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen proteínas
externas con estas características por lo que el método tiene una amplia
aplicabilidad en el análisis de diferentes entidades virales.
También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar
precisamente como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las
células blanco. De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de
ácido siálico presente sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que
dependiendo del virus esta molécula puede estar enlazada en diferentes tipos de
enlaces químicos.
A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es
entonces aglutinar eritrocitos, más bien es participar en el primer paso de la
replicación viral que es la adsorción, pero sus propiedades sirven para desarrollar la
prueba de HA que se utiliza como un ensayo in vitro.
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Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las
ventajas y desventajas que ofrece.
Ventajas: Prueba sencilla de desarrollar.
No requiere de una infraestructura complicada.
Es económica.
Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral.
Se aplica en los ensayos para la determinación de la naturaleza química
de los receptores celulares.
Desventajas: Se emplea sólo como diagnóstico presuntivo.
Existen agentes no virales que pueden causar HA.
Es poco sensible.
Genera falsos negativos.
El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia
de virus con proteínas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores
celulares. De esta manera los virus se unirán a los eritrocitos de la especie que sea
siempre que contenga en su superficie moléculas de ácido siálico. La prueba se
representa en el siguiente esquema: | HEMAGLUTINACIÓN Para la realización de esta prueba se requiere tomar una muestra que
contenga virus, como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes
vacunales o de cosechas obtenidas de células en cultivo; muestras de origen clínico
tomadas de acuerdo a la zona anatómica que afecta el virus, tal es el caso del virus
influenza donde la muestra a tomar corresponde a un lavado faríngeo.
ERITROCITO
Virus con proteínas Hemaglutinantes
ERITROCITO
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Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble
empezando desde la dilución 1:10 hasta la dilución 1:1280 empleando como
diluyente una solución amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se
le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%.
Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los
eritrocitos aglutinados sedimentarán en el fondo del pozo formando una red,
mientras los no aglutinados sedimentan por gravedad. De acuerdo a la forma del
pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los sedimentos se aprecian de la
siguiente manera:
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la
muestra, sin embargo la determinación exacta del virus involucrado en una patología
es aún incierta. Por esta razón como siguiente paso se debe aplicar una prueba que
permita la plena identificación del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una
prueba serológica.
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se
conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el
receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:
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Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.
Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA.
La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales
específicas permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el
responsable de alguna patología. Esto basándose en un principio fundamental de
inmunología: La presencia de anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de
la exposición previa al antígeno que induce entonces su producción.
Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se
realizan diluciones seriadas también con factor dos como en HA pero iniciando de la
dilución 1:2 hasta alcanzar la de 1:256.
Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un
virus conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento.
ERITROCITO
NO EXISTE RECONOCIMIENTO
Virus con proteínas
hemaglutinantes
Anti-HA
Neutralización viral
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Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1 %. Al igual
que para HA la prueba se efectúa en microplacas o tubos con fondo en U. De esta
manera los patrones de sedimentación para los resultados positivos y negativos se
observan de la siguiente manera:
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
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PRACTICA No. 3
PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE
INTRODUCCIÓN.
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el
genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar
puentes entre los glóbulos para constituir una red. Este fenómeno conocido como
Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis del virus Influenza. En
este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virión es
una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura
viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve
los receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido N-
AcetilNeuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los
Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones
respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a
parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis
autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar
aglutinación, por lo que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la
presencia de pequeñas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un
ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.
OBJETIVOS:
1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de
Hemaglutinación (HA).
2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una
suspensión, la cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).
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MATERIAL Solución reguladora de fosfatos SRF.
Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
Espejo.
Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
Puntillas para micopipeta.
Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET)
Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
Solución de Hipoclorito de Sodio.
Alcohol y algodón.
Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA 1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensión
concentrada (vacuna viral), con factor de dilución 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de
acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendrá virus.
El proceso se describe a continuación:
a Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 µl de SRF y del 2 al 9
agregar 100 µl.
b Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar
por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la
dilución 1:10.
c Transferir 100 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente
de la misma manera que para el paso b.
d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que
corresponderá a la dilución 1:1280.
e Desechar del pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de
desechos.
f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución viral al pozo No. 9
que sirve como control.
2. Agregar a todos los pozos 100 µl de una suspensión de glóbulos rojos de pollo al
1%.
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3. Agitar la microplaca y dejar reposar a temperatura ambiente el sistema hasta que
los eritrocitos del pozo 9 hayan sedimentado.
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN 1. Los glóbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botón,
mientras que los glóbulos rojos aglutinados forman una malla homogénea.
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
2. Determinar el título de la muestra, identificando la última dilución en que se
presenta una reacción de HA evidente, que corresponderá entonces a 1 UHA por
volumen.
3. Identificar la dilución que contiene 4 UHA.
Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fig. No 1. Realización de las diluciones virales
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones
c y d) Transferir seriadamente 100 µl de cada dilución al siguiente pozo
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CUESTIONARIO 1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA. 2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de HA. 3.- Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.
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PRACTICA No. 4
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD
DEL NEWCASTLE INTRODUCCIÓN
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no
específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva
no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal.
Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que
demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta
está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se
conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la
hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el
receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce
como neutralización vírica.
OBJETIVOS
1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para
determinar el título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la
prueba de IHA.
MATERIAL
Solución reguladora de fosfatos SRF.
Microplaca de poliestireno con fondo en U.
Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.
Puntillas para micopipeta.
Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET),
preparada en una suspensión con 4 UHA.
Suspensión de glóbulos rojos al 1%.
Suero problema.
Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
Solución de Hipoclorito de Sodio.
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Alcohol y algodón.
Tina para recolectar desechos.
METODOLOGÍA Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una
dilución del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para
realizar la prueba de IHA.
Ejemplo:
a Resultado de la práctica de HA:
Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA
b Volúmen suficiente para realizar IHA= 2ml Entonces.....
Vacuna viral concentrada 100 µl + SSI 1900 µl _________ Volúmen final 2000 µl de dilución con 4 UHA
1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo
al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni
virus. El proceso se describe a continuación:
a Agregar 75 µl de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca.
b Colocar en el pozo 1 75 µl del suero problema y mezclar por aspersión
y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2.
c Transferir 75 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente
de la misma manera que para el paso b.
d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que
corresponderá a la dilución 1:256.
e Desechar del pozo 8 75 µl en el recipiente para recolección de
desechos.
f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo
No. 9 que sirve como control.
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2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno viral
en un volumen de 75 µl.
3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante 10
min.
4. Agregar 75 µl de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos,
agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos
del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.
5. Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA.
PATRONES DE SEDIMENTACIÓN: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA
Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones
Multiplicar el logaritmo negativo del radio de dilución por el valor de interpretación
para así calcular el valor de interpolación corregido.
Para este caso:
log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49 = V.I.C.
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Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad
En el ejemplo: 10-4 y 10-5
Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor
al 50% de efecto.
En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50
El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.
Finalmente:
Titulo = 104.49
CUESTIONARIO 1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote
vacunal antes de salir al mercado.
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra
viral.
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PRACTICA No.9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN
DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO
En 1949 John Enders, Thomas Séller y Frederick Robbins descubrieron que
el poliovirus podía cultivarse en células de origen no neuronal, lo que les valió el
premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos
celulares reemplazaron a los animales de laboratorio convirtiéndose en el principal
método para la propagación de virus y son utilizados en prácticamente todos los
campos de la bio-medicina.
Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biológico conformado por un
grupo de células con características específicas que se mantienen adecuadamente
bajo condiciones in vitro. En este sentido deberemos entender que las células
deben ser obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagación
in vitro, requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que
cubran sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus
condiciones originales.
Para la preparación de un CC se puede considerar el siguiente orden.
1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier
tejido sano de algún animal, por ejemplo, células epiteliales de intestino,
embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que
se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que
inicialmente son normales y que por exposición a algún mutágeno se
transforman en el laboratorio.
2) Las células que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una
suspensión celular mediante métodos mecánicos, como maceración. De esta
manera, se tienen trozos de tejido, más pequeños que el original, pero sin
células individuales. Para disgregar a las células, el procedimiento continúa
con una….
3) Digestión con enzimas proteolíticas.
4) Centrifugación
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5) Las células se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en recipientes
o placas de plástico, conforme las células se dividen van cubriendo la
superficie. Las células de fibroblastos o epiteliales se adsorben al plástico y
van formando una monocapa, mientras que células como las sanguíneas o
los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren.
6) El medio adecuado para las células consiste de una solución isotónica de
sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos mantenidos en buffers a
un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibióticos para inhibir el
crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de
suero para proveer a las células de una fuente rica de factores de crecimiento
Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares:
Cultivos celulares primarios
Cepas celulares diploides
Líneas celulares continuas
Dado que el desarrollo de una línea celular es un proceso costoso, la gran mayoría
de líneas celulares de amplia utilización, son depositadas en y distribuidas desde
centros de reposición. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal
en EEUU es el American Type Culture Collection (ATCC). Algunos ejemplos de líneas celulares que se distribuyen con origen y calidad certificados ATCC son: Vero
E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre otras.
Además del análisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en
diferentes áreas y aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del
RNA, de proteínas etc. Ecología celular, Interacciones celulares, Inmunología,
Ingeniería de proteínas, Estudios de diferenciación y desarrollo celular, Aplicaciones
diagnósticas. Medicina, Farmacología,etc.
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RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS INFECCION VIRAL
CAMBIO MORFOLÓGICO
EFECTO CITOPATICO (ECP) Sin cambio aparente:
Hemadsoción Hemaglutinación. Interferencia
TIPOS DE EFECTO CITOPATICO
Monocapa confluente de células
Formación de sincitios
Redondeamiento
Vacuolización
Lisis
Cuerpos de inclusión
Alargamiento
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HEMADSORCIÓN
INTERFERENCIA
Monocapa confluente de células
Eritrocitos con el receptor adecuado
Virus con HA
Línea celular
Línea celular, previamente infectada con Rubéola
Línea celular
Sin efecto aparente
Redondeamiento
Interferencia
Muestra presuntiva de Rubéola
Infección con Rinovirus
Infección con Rinovirus
A
B
C
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PRACTICA No.11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE
SUBCULTIVO O PASE 1:2
INTRODUCCIÓN El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales requiere
frecuentemente del aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto,
monocapas celulares son inoculadas con un espécimen clínico adecuado y entonces
son observadas para detectar cambios citológicos inducidos por la reproducción de
virus.
El término efecto citopático (ECP) es aplicado para indicar los cambios
celulares que inducidos por virus, son observables al microscopio óptico. Estos
cambios incluyen el redondeamiento o lisis de células, la formación de células
gigantes multinucleadas (sincitios) y la producción de inclusiones en el núcleo y
citoplasma de células infectadas.
La obtención de cultivos de células eucarióticas en el laboratorio de Virología,
es una de las mayores contribuciones históricas para toda el área de las ciencias
naturales, en especial para la Biología Celular y Molecular. La labor de los
investigadores que sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de
varios premios Nobel en Fisiología y Medicina.
Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de
reproducción de cultivos celulares a través de un subcultivo o pase en relación 1:2,
ya que de esta manera, se pueden obtener monocapas de células en cultivo para la
reproducción de virus en condiciones de laboratorio.
OBJETIVO Realizar un subcultivo in vitro de células eucarióticas para promover su
proliferación por división mitótica y obtener monoestratos celulares.
MATERIAL Y EQUIPO Gabinete de bioseguridad
Incubadora con fuente de CO2
Microscopio con circuito cerrado de televisión
Medidor de pH
Pipeteador automático
Bomba de vacío
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Equipo de esteriliación por filtración
Etanol al 70%
Cultivo celular MRC-5
Frascos para cultivo celular de 25 cm2
Medio para cultivo de células Mínimo Esencial (MEM)
Suero fetal de ternera
Solución de tripsina en regulador de pH de Dulbecco
Agua desmineralizada
DESARROLLO 1. Desinfectar el área de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con
etanol al 70%.
2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso y encender
la luz ultravioleta por espacio de 30 minutos, evitando observar en forma
directa la fuente de radiación.
3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminación convencional del gabinete
de bioseguridad.
4. Disolver en condiciones asépticas, el medio mínimo esencial en agua
desmineralizada y ajustar el pH a 7.0
5. Esterilizar el medio de cultivo por filtración con vacío a través de una
membrana con diámetro de poro de 0.22 micrometros.
6. Decantar el medio del frasco de cultivo original que contiene células MRC-
5.
7. Agregar 2.0 ml de solución de tripsina y dejar interaccionar con las células
durante 30 segundos; retirar el exceso de la solución de tripsina.
8. Incubar a 37° C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las
células se hayan redondeado (disgregación celular).
9. Añadir al frasco de cultivo con las células disgregadas, 14 ml de medio para
cultivo celular adicionado de 5% de suero fetal de ternera y homogenizar por
pipeteo hasta formar una suspensión celular homogénea.
10. Dispensar 7 ml de la suspensión celular obtenida a cada uno de dos frascos
estériles para cultivo celular.
11. Incubar a 37° C en la incubadora con una concentración de 5% de CO2,
durante 24 a 48 horas.
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12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una
confluencia del 100% (monoestrato celular).
13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo
contenga 0.5 % de suero fetal de ternera, hasta el momento de emplear el
cultivo de células MRC-5 para la reproducción de virus.
CUESTIONARIO 1. ¿Que significa confluencia?
2. ¿Que función tiene el Suero de ternera adicionado al medio de cultivo para
células?
3. ¿Explique el efecto que produce la adición de tripsina a la monocapa celular?
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SESIÓN No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN
DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS
INTRODUCCION. Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los
animales de laboratorio, el embrión de pollo y los cultivos celulares. Estos últimos
ofrecen ventajas como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus
que pueden ser analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes
eventos que ocurren dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia
del virus, la célula. Debido a estas propiedades las células en cultivo representan el
estándar de oro para la validación de pruebas efectuadas tanto en investigación
como a nivel industrial para la producción y control de calidad de vacunas.
Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para
su implementación, situación que vuelve inaccesible su aplicación en el diagnóstico
clínico de rutina.
La técnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre células en
monocapa, que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando
un observación diaria de los cambios presentados. Los cambios que son
perceptibles como modificaciones morfológicas en la célula, inducidos y
característicos de cada virus analizado se conocen como Efecto Citopático ECP.
Existen diferentes tipos de ECP como: redondeamiento, alargamiento, formación de
Sincicios, vacuolización, cuerpos de inclusión, lisis, etc. En algunos casos el ECP
presentado es tan característico que se relaciona con un solo tipo de virus, en otros,
la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la aplicación de otras
técnicas. Sin embargo el modelo de Cultivos Celulares se requiere para el primo
aislamiento de los virus a partir de un espécimen dado.
OBJETIVOS 1.- El alumno valorará la importancia de los cultivos celulares para el aislamiento de
virus.
2.- El alumno será capaz de determinar la presencia de virus en una muestra
reconociendo el ECP inducido en células en monocapa.
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MATERIAL Y REACTIVOS 2 Botellas de 25 cm2 con células en monocapa con un 80% de confluencia.
Micro pipetas con volumen variable de 20-200 µl y de 100-1000 µl.
Puntillas amarillas y azules estérilizadas.
Solución Salina de Fosfatos (SSF) estéril.
Pipetas Pasteur esterilizadas.
Pipetas de 5 y 10 ml esterilizadas
Plancha de agitación.
Medio Mínimo Esencial (MME) esterilizado por filtración.
Suero fetal de ternera esterilizado por filtración.
DESARROLLO 1. Revisar en el microscopio invertido la integridad de la monocapa celular de
las dos botellas.
2. Asignar una de las botellas como control y la otra como botella de prueba.
3. Decantar el medio de cultivo de ambas botellas.
4. Adicionar 7 ml de SSF a cada una de las botellas y lavar las células,
aspirando y dispensando por pipeteo la SSF sobre las monocapas. Desechar
la solución y repetir el procedimiento dos veces más.
5. Adicionar 500 µl de MME a la botella control y 500 µl del inóculo viral a la
botella de prueba.
6. Colocar ambas botellas en la plancha de agitación y mantener a temperatura
ambiente por una hora.
7. Adicionar a cada botella 5 ml de MME complementado con 0.5% de suero de
ternera e incubar a 37° C dentro de una estufa de CO2 en posición horizontal.
8. Observar diariamente, la botella control debe mantener la integridad de la
monocapa mientras en la botella de prueba se presentan cambios
morfológicos.
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9. Registrar los cambios especificando el tiempo en que se presentaron los
primeros cambios morfológicos y a cual de los ECP conocidos corresponde.
CUESTIONARIO 1. Cite tres ejemplos de ECP, los virus que los producen y el tipo de cultivo
celular en que se presentan.
2. Además del ECP, de que otra manera se puede mostrar la infección de un
virus empleando como modelo las células en cultivo.
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PRACTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN
ESCHERICHIA COLI.
Introducción Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados
bacteriófagos o simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para
estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la
multiplicación viral y estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy
útiles en la tipificación de cepas bacterianas.
En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del
fago se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie
cada vez que la bacteria se divide por fisión binaria. En este estado lisógenico, los
fagos integrados al genóforo bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su
separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógenica expresar nuevas
actividades y producir diferentes proteínas.
El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido
bacteriano y su antigenicidad, así como codificar la producción de toxinas
bacterianas que causan enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el
botulismo y el síndrome urémico hemolítico.
Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria
huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más
extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con
la letra T y diferentes números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al
destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en
cultivos sobre placas de agar.
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Objetivo El alumno aprenderá a desarrollar bacteriófagos en el laboratorio y conocerá su
importancia en la Microbiología.
Material y equipo
• Incubadora bacteriológica
• Pipeteador automático
• Pipetas Pasteur
• Pipetas serológicas de 1 y 5 ml
• Tubos de ensaye de 13 x 100
• Gradillas
• Asa bacteriológica
• Cajas Petri
• Suspensión de bacteriófago T2
• Cultivo en caldo de Escherichia coli
• Etanol al 70%
• Solución salina fisiológica
• Agar cerebro corazón
• Caldo cerebro corazón
Desarrollo
1. Prueba cualitativa:
a) Siembre una placa de agar cerebro corazón, depositando en la superficie 0.2 ml
de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago.
b) Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica.
c) A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en
cada uno deje caer una gota de suspensión del fago T2, utilizando una pipeta
Pasteur.
d) Incube a 37º C por 24 hrs.
e) Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas
de bacterias lisadas por replicación del fago.
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II. Prueba cuantitativa por dilución en placa:
a) Haga diluciones de una suspensión del fago de la siguiente manera: En un tubo
estéril coloque 0.5 ml de la suspensión del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro
corazón.
b) Transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica (S.
S. F.) y continúe haciendo diluciones con S. S. F. hasta obtener una dilución de
1:1000 000.
c) De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos que contengan 0.1 ml de
Escherichia coli. Mezcle e incube a 37º C por 20 min.
d) Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de agar cerebro corazón
“blando” (0.5%), mezcle y vacíe en cajas de Petri estériles con agar cerebro corazón.
e) Deje solidificar e incube a 37º C durante 24 hrs. Determine las placas líticas o
calvas y cuéntelas.
f) Para calcular el número de partículas virales / ml, cuente el número de placas
líticas en las cajas de cultivo que presenten pocas calvas y emplee la siguiente
fórmula:
UFP / ml = PV x FD
Donde:
PV = número de placas virales
FD = Factor de dilución
UFP / ml = unidades formadoras de placas por ml de suspensión original del fago.
Cuestionario
1. Anote Usted un ejemplo de bacteriófago temperado
2. En que mecanismo de recombinación genética entre bacterias se involucra la
participación de bacteriófagos
3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes
estructurales de los bacteriófagos de la serie T
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4. Investigue Usted el porque ciertas cepas de Escherichia coli son capaces de
producir colitis hemorrágica
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PRACTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES
El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que
se enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que
idealmente deseamos tener y otra la realidad con la que contamos. Durante las
últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para
evidenciar las etiologías de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan
descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios especializados, sino también en
los de diagnóstico de rutina.
¿Qué es lo ideal? Identificar plenamente el agente viral.
Resultados en corto tiempo.
Una sola prueba.
¿Cuál es la realidad?
No se hace diagnóstico directo del agente viral (descarte).
Se requiere la complementación entre la clínica y el laboratorio.
Recurrir al análisis por pruebas pares.
Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque
determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del paciente, además de que ayuda a realizar un seguimiento clínico de la entidad.
Llevada con ética, esta actitud impacta social y económicamente, puesto que la
administración oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de
hospitalización y directamente el gasto a familiares.
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PRUEBAS SEROLÓGICAS
Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden
descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que
evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar
presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se
utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con
el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus.
En el laboratorio clínico se cuenta con las pruebas serológicas que tanto de
forma directa e indirecta son la principal herramienta que se aplica en el diagnóstico
viral. En estos ensayos se aprovechan las características fisicoquímicas de los
anticuerpos, así como su especificidad. Los principales aspectos a considerar son:
Se pueden detectan antígenos virales.
Se pueden valorar anticuerpos con especificidad antiviral en el paciente.
Requiere del análisis de sueros pares. En muestras tomadas con periodos de
separación de 10-14 días, un incremento de 4 veces o más en el título de la
segunda muestra con respecto a la primera, es considerado significativo para
una infección viral en curso.
Puede diferenciar entre infecciones primarias y crónicas. La presencia de Ig
M específica es más rápido y detectable a pocos días del inicio de la
enfermedad
Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico clínico viral son:
INMUNOFLUORESCENCIA
a) Directa (Antígenos virales)
b) Indirecta (Anticuerpos de respuesta)
ENSAYOS ENZIMÁTICOS
a) Directo (Antígenos)
b) Indirecto (Anticuerpos de respuesta)
WESTERN-BLOT
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