INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CIIDIR-IPN, UNIDAD DURANGO P Pr r o og g r r a a m ma a d d e e B Bi i o ot t e e c c n n o o l l o og g í í a a Informe Técnico Final (Enero de 2006 – Diciembre de 2007) Proyecto Evaluación de la actividad estrogénica de extractos de tallos de orégano (Lippia graveolens HBK. var. berlandieri Schauer. y comparación de su xilema secundario Clave CGPI: 20061537 Director del Proyecto M. en C. Martha Celina González Güereca Colaboradores (C.) M. en C. Agustín Ángel Meré Rementería, Prof. Investigador de CIIDIR-IPN, Unidad Durango. Dra. Teresa Margarita Terrazas Salgado, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados. Dr. Marcos Soto Hernández, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados. Dra. Cristina Lemini Guzmán, Prof. Investigador de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México. Estudiantes participantes Tesis profesional : Iliana Espinoza Valles. Instituto Tecnológico de Durango. Tesis profesional : Faviola Gómez Romero. Instituto Tecnológico de Durango. Residencia profesional y Tesina : C. Jesús Olguín Soto. Instituto Tecnológico Villa Montemorelos, Dgo. Servicio social : Edgar Francisco Esparza Soto. Instituto Tecnológico de Durango. Servicio social : Erica Estela Córdova Gurrola. Instituto Tecnológico de Durango. Servicio social : Cinthya Araceli Hernández Hernández. Instituto Tecnológico de Durango. Tesista y prácticas profesionales en proceso : Yuridia Frayre. Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Juárez del Estado de Dgo.
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INNSSTTIITTUUTTOO PPOOLLIITTÉÉCCNNIICCOO …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20061537_4028.pdf · La hoja de orégano mexicano, Lippia graveolens H. B. K. tiene gran demanda en
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Informe Técnico Final(Enero de 2006 – Diciembre de 2007)
ProyectoEvaluación de la actividad estrogénica de extractos de tallos de orégano(Lippia graveolens HBK. var. berlandieri Schauer. y comparación de suxilema secundario
Clave CGPI: 20061537
Director del ProyectoM. en C. Martha Celina González Güereca
Colaboradores(C.) M. en C. Agustín Ángel Meré Rementería, Prof. Investigador de CIIDIR-IPN, UnidadDurango.Dra. Teresa Margarita Terrazas Salgado, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados.Dr. Marcos Soto Hernández, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados.Dra. Cristina Lemini Guzmán, Prof. Investigador de la Facultad de Química de laUniversidad Nacional Autónoma de México.
Estudiantes participantesTesis profesional: Iliana Espinoza Valles. Instituto Tecnológico de Durango.Tesis profesional: Faviola Gómez Romero. Instituto Tecnológico de Durango.Residencia profesional y Tesina: C. Jesús Olguín Soto. Instituto Tecnológico VillaMontemorelos, Dgo.Servicio social: Edgar Francisco Esparza Soto. Instituto Tecnológico de Durango.Servicio social: Erica Estela Córdova Gurrola. Instituto Tecnológico de Durango.Servicio social: Cinthya Araceli Hernández Hernández. Instituto Tecnológico de Durango.Tesista y prácticas profesionales en proceso: Yuridia Frayre. Facultad de CienciasQuímicas de la Universidad Juárez del Estado de Dgo.
2
Í N D I C E D E C O N T E N I D O
CARÁTULA 1
RESUMEN 8
1 INTRODUCCIÓN 9
2 ANTECEDENTES 11
3 OBJETIVOS 16
3 METAS 16
4 MATERIALES Y MÉTODOS 17
4A Anatomía del orégano 17
4B Ensayo de fitotoxicidad 18
4C Ensayos antimicrobianos 19
4D Ensayo de actividad estrogénica 20
4E Ensayo de actividad genotóxica 22
5 RESULTADOS 24
5A Anatomía del xilema secundario 24
5B Bioensayo: efecto fototóxico de extractos de tallo de orégano
en semillas
30
5C Ensayos antimicrobianos 39
5D Bioensayo de la actividad estrogénica 42
5E Bioensayo de actividad genotóxica 43
6 IMPACTO SOCIAL 48
7 LITERATURA CITADA 49
8 ANEXO 54
3
Í N D I C E D E C U A D R O S
Cuadro 1. Características cuantitativas de Lippia graveolens en tres sitios de
colecta
26
Cuadro 2. Datos estadísticos de Lippia graveolens en los tres sitios de colecta 26
Cuadro 3. Porcentaje de brotación en las semillas utilizadas 31
Cuadro 4. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de metanol 35
Cuadro 5. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y precipitado de acetato
de etilo
35
Cuadro 6. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de acetato de
etilo
35
Cuadro 7. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de hexano 36
Cuadro 8. Componentes detectados en el aceite esencial 39
Cuadro 9. Componentes efectividad antimicrobiana del aceite esencial de
orégano
39
Cuadro 10. EMN/10,000 ET de los grupos de trabajo en los diferentes tiempos
de muestreo
45
Cuadro 11. EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo en los diferentes
tiempos de muestreo
46
Cuadro 12. EPC/1000 ET de los grupos de trabajo en los diferentes tiempos
de muestreo
47
4
Í N D I C E D E F I G U R A S
Figura 1. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de
Mapimí: A) Heterogeneidad de anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados;
C) Vasos irregulares y en grupos; D) Traqueida vasicéntrica; E) Células de
floema; F) Material recolectado.
27
Figura 2. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de
Nombre de Dios: A) Anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados; C) Vasos y
fibras y en grupos; D) Aceite esencial; E) Presencia de cristales; F) Material
recolectado.
28
Figura 3. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de El
Mezquital: A) .Anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados; C) Vasos y fibras
y en grupos; D) Fibra; E) Ritidoma; F) Material recolectado.
29
Figura 4. Gráfica de los ensayos con semilla de lechuga 32
Figura 5. Gráfica de los ensayos con semilla de tomate verde 33
Figura 6. Gráfica de los ensayos con semilla de tomate rojo 34
Figura 7. Efecto de los extractos de ensayo en el hipocótilo de semillas de
lechuga
37
Figura 8. Efecto de los extractos de ensayo en la radícula de semillas de
lechuga
37
Figura 9. Efecto fitotóxico sobre la germinación de semillas de tomate rojo 38
Figura 10. Longitud de radículas de semillas de lechuga 38
Figura 11. Desarrollo de semillas de tomate rojo 38
Figura 12. Halos de inhibición de Salmonella sp. 40
Figura 13. Mesofílicos aeróbicos aislados de carne molida de cerdo 40
Figura 14. Ensayos del aceite con carne molida 41
Figura 15. Administración subcutánea de estradiol y compuestos de prueba 42
Figura 16. Toma de muestra de sangre de la vena caudal 44
Figura 17. Preparación de los frotis 44
Figura 18. Célula de eritrocito mononucleado y células policromáticos 44
5
D O C U M E N T O S D E L A N E X O
I Documentos de las tesistas de licenciatura que participaron en el proyecto:
Faviola Romero Gómez e Iliana Espinoza Valles:
Ia Copia de solicitud de tesis: Oficio D.I.Q. y B. 744/06 del 31 de marzo de
2006.
Ib Copia de carta de aceptación: Oficios CDDV/061/06 del 6 de abril de 2006 y
CDDV/062/06 del 6 de abril de 2006.
Ic Copia de la autorización del tema de tesis: PRO-1319-06 y PRO-1321-06 del
22 de agosto de 2006.
Id Copia de liberación de tesis: Constancia UPIS/050/07 y Constancia
UPIS/051/07.
Ie Copia de constancia de asesoría sin percepción económica: Oficio D.I.Q. y
B. 167/07.
If Copia de carátula del CD de la tesis correspondiente.
Ig Copia de carátula de la portada, hoja de la clave de registro, contenido,
índice de cuadros y figuras y resumen de la tesis correspondiente.
Ih Copias de las actas de examen profesional Libro 04, Fojas 134 y 135.
Ii Copias de integrantes de jurado para solicitud del acto de recepción
profesional profesional PRO-048-07 y PRO-050-07 del 23 de enero de 2007.
II Documentos de la tesista en proceso: Yuridia Rosalía Frayre Fernández:
IIa Copia de solicitud de tesis: Oficio SAC/086/07 del 22 de junio de 2006.
IIb Copia de carta de aceptación: Oficio UPIS/116/07 del 28 de junio de 2007.
III Documentos del tesista por titulación con residencia profesional: Jesús
Olguín Soto:
IIIa Copia de titulación por residencia profesional: Oficio GTV/158/07.
IIIb Copia de acta de examen.
IV Documentos de los prestadores de servicio social que participaron en el
M = Extracto de metanol; PAE = Precipitado de acetato de etilo; AE = Extracto de Acetato de etilo; H = Extracto de hexano.
32
Lechuga
0102030405060708090
100
Testig
o
Testig
one
gativ
o
50pp
m
100
ppm
300
ppm
500
ppm
1000
ppm
Dilución
Po
rcen
taje
M
PAE
AE
H
Figura 4. Ensayos con semilla de lechuga
33
Tomate verde
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Testigo Testigonegativo
50 ppm 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000ppm
Dilución
Po
rcen
taje M
PAE
AE
H
Figura 5. Ensayos con semilla de tomate verde
34
Semilla de tomate rojo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Testigo Testigo
negativo
50 ppm 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000
ppm
Dilución
Po
rce
nta
je
M
PAE
AE
H
Figura 6. Ensayos con semilla de tomate rojo
35
Cuadro 4. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de metanol
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 13.95000 7.77529 13.10000 6.92992
100 15.48333 7.86214 13.35000 6.60720
T 23.45000 13.03506 31.16667 14.00746
TN 4.85000 5.66870 20.75000 35.27169
300 16.16667 10.32221 10.71667 6.47051
500 22.01667 25.22071 12.16667 6.96521
1000 18.55000 26.67979 9.28333 7.08565
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
Cuadro 5. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y precipitado de acetato de etilo
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 29.66667 39.91969 8.80000 10.57628
100 22.51667 28.07163 12.31667 8.60329
T 23.43333 12.93054 31.16667 14.00746
TN 13.50000 8.86448 15.90000 10.61231
300 21.63333 30.34042 10.03333 7.86748
500 14.13333 18.79187 12.68333 8.53208
1000 27.76667 42.54344 4.50000 7.17694
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
Cuadro 6. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de acetato de etilo
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 18.15000 18.82284 12.96667 8.91574
100 17.00000 21.30887 11.76667 9.60467
T 23.46667 13.14001 31.16667 14.00746
TN 13.50000 8.86448 15.90000 10.61231
300 18.43333 24.18107 10.40000 7.80091
500 14.15000 35.13790 0.50000 3.18098
1000 1.71667 13.29724 0.00000 0.00000
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
36
Cuadro 7. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de hexano
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 17.73333 24.30796 10.10000 8.53845
100 19.30000 24.14946 11.23333 9.67500
T 23.45000 13.03506 31.16667 14.00746
TN 26.15000 46.47498 0.00000 0.00000
300 17.46667 21.27740 12.38333 9.12826
500 14.66667 16.12417 12.20000 10.78260
1000 18.95000 24.99859 11.35000 10.43434
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
37
Hipocótilo
0
5
10
15
20
25
30
35
T TN 50 ppm 100ppm 300ppm 500ppm 1000ppm
Lo
ng
itu
d(m
m)
MeOH
PAE
AE
H
Figura 7. Efecto de los extractos de ensayo en el hipocótilo de semillas de lechuga
0
5
10
15
20
25
30
35
Longitud (mm)
T TN 50 ppm 100ppm 300ppm 500ppm 1000ppm
Radícula
MeOH
PAE
AE
H
Figura 8. Efecto de los extractos de ensayo en la radícula de semillas de lechuga
38
Figura 9. Efecto fitotóxico sobre la germinación Figura 10. Longitud de radículas de semillas deDe semillas de tomate rojo. Lechuga.
Figura 11. Desarrollo de semillas de tomate rojo.
39
C Ensayos antimicrobianos
Los resultados obtenidos del rendimiento de aceite esencial en la planta, fueron bajos
(1.64-1.14 %), dadas las características de la edad de la muestra, por lo que se considera
relevante la cantidad de aceite extraído bajo esas condiciones. Con respecto a su
caracterización, se identificaron solamente 6 componentes de los 84 detectados por el
cromatógrafo de gases (Cuadro 8).
Cuadro 8. Componentes detectados en el aceite esencial
Compuesto Tr
(min)
Concentración
(%)
Carvacrol 28.8 46.3
P-cimeno 9.5 29.70
Timol 29.2 2.2
Cineol 7.9 1.8
Limoneno 7.7 0.5
Aldehído cinámico 26.9 0.06
Tr = Tiempo de retención
En los resultados obtenidos de los microorganismos de prueba, indican la bacteria más
sensible fue la de S. aureus (Cuadro 8, Figura 12).
Cuadro 9. Componentes efectividad antimicrobiana del aceite esencial de orégano
Concentraciones (ppm)
Halos de inhibición (mm)
10 50 100
Microorganismo de prueba
Escherichia coli 16.6 25.0 31.3
Staphyloccoccus aureus 18.3 22.6 37.0
Salmonella spp. 18.5 40.5 53.0
40
Los resultados en la cuenta total de carga microbiana en la carne molida de cerdo
señalaron que la carne molida sin tratamiento se encuentra dentro de los parámetros que
marca la norma de la Secretaría de Salud (NOM-SSA-1-1993), que permite hasta 5000000
UFC como máximo. Así mismo la cuenta total de mesófilos aérobios contenidos en la
muestra de carne fue irrelevante y el mejor tratamiento fue el que se sometió con 5 mL de
aceite con una disminución de los microorganismos hasta de 42 % y con 10 mL de aceite,
la carga microbiana disminuyó en 48 %. (Figuras 14).
Figura 12. Halos de inhibición de Salmonella sp. Figura 13. Mesofílicos aeróbicos aisladosde carne molida de cerdo.
Figura 14. Ensayos del aceite con carne molida.
41
D Bioensayo de la actividad estrogénica
Los resultados preliminares de la evaluación uterotrófica fueron insuficientes, y no
permiten inferir acerca de la actividad uterotrófica de los extractos, es necesario llevar a
cabo la repetición de los experimentos para poder conocer si estos extractos poseen la
actividad señalada, sin embargo, el análisis preliminar arrojó información importante que
permitirá realizar estudios más completos para evaluar la capacidad estrogénica del
orégano.
Todos los animales tratados con estradiol mostraron efectos uterotróficos importantes con
respecto al grupo control. El peso de los úteros de los ratones tratados con estradiol
aumentó de manera significativa en un 80 %. Los animales a los cuales se les
administraron los extractos de orégano, no mostraron diferencias estadísticamente
significativas, aunque si pudieron observarse cambios en el peso uterino. Este resultado
podría indicar que el efecto sobre el útero no fue significativo con las dosis probadas, por
lo tanto se requiere realizar una evaluación y realizar una curva de dosis-respuesta para
obtener la ED50 y la Emáx de todos los compuestos de prueba utilizados en el experimento,
así como probar en otra especie animal, como son las ratas.
Figura 15. Administración subcutánea de estradiol ycompuestos de prueba.
42
E Bioensayo de actividad genotóxica
Esta prueba arrojó los resultados reportados en los cuadros 10, 11 y12.
En el primer caso se muestra que no existe una variación muy significativa, de los
EMN/10,000 ET, de cada uno de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de
muestreo, a excepción del grupo IV, y obviamente del control positivo (Cuadro 10).
En el caso de la relación EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo a los diferentes
tiempos de muestreo, se observó una respuesta similar a la anterior (Cuadro 11). Y en los
eritrocitos policromáticos (EPC/1000 ET), solo el grupo II tuvo una respuesta muy
significativa a las 144 h, lo cual no es congruente con los resultados que debían
esperarse, por lo que, es necesario repetir este ensayo con la misma dosis (Cuadro 12).
La información obtenida de este ensayo, indica que el extracto acuoso de la hoja de
orégano, no produce daño al ADN de los animales de prueba con las concentraciones
utilizadas.
Por lo cual, estos resultados amplían los conocimientos sobre las propiedades biológicas
de los extractos de orégano y contribuyen a la estimación del riesgo-beneficio que puede
derivarse del uso de esta planta como un fitoterapeútico.
43
Figura 16. Toma de muestra de sangre de la venacaudal.
Figura 17. Preparación de los frotis.
Figura 18. Célula de eritrocito mononucleado ycélulas policromáticos.
44
Cuadro 10. EMN/10,000 ET de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 29.3±5.4 28.5±3.7 40.3±10.0 46.0±17.1 68.8±15.5 74.3±29.2 55.0±17.1
Grupo II 2 43.8±10.1 47.5±19.1 43.0±6.6 61.8±13.0 59.3±15.9 57.8±9.3 41.8±10.3
Grupo III 2 44.3±11.2 56.3±18.1 52.5±21.9
NS
80.3±20.1 63.0±10.3 76.3±22.1 54.0±12.2
Grupo IV 2 38.3±10.3 55.3±10.8 60.0±14.5 61.5±5.6 75.8±17.7 104.3±17.8 76.8±30.4
Grupo V (control positivo) 2 39.8±11.9 46.3±2.4 49.3±7.3 92.0±8.1 97.8±18.3 100.0±19.7 94.8±17.1
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
45
Cuadro 11. EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 5.3±1.0 6.0±5.0 6.5±1.7 7.8±1.9 12.5±5.7 11.5±4.8 8.5±3.8
NS
Grupo II 2 6.3±1.9 6.8±2.8 7.3±2.8 9.0±2.9 9.0±3.4 8.8±5.3 6.3±3.0
Grupo III 2 6.5±3.7 8.5±3.1 11.5±1.3 14.0±2.7 10.3±3.8 16.0±4.2 8.8±2.9
Grupo IV 2 4.0±0.8 7.8±5.5 12.0±8.4 13.5±2.4 17.8±5.7 14.5±6.8 11.0±7.4
NS
Grupo V 2 4.8±1.7 7.5±4.2 10.3±1.5 27.3±5.6 22.8±7.0 20.0±5.2 17.5±2.7
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
46
Cuadro 12. EPC/1000 ET de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 65.8±19.5 56.6±14.8 73.2±22.3 48.8±19.6 61.0±8.9 78.0±26.3 61.5±12.0
Grupo II 2 56.3±16.1 54.8±18.3 50.3±10.0 53.8±11.2 63.0±9.4 69.3±13.4 747.0±49.2
Grupo III 2 58.5±13.3 47.5±11.1 46.8±9.3 63.5±6.2 71.5±9.8 54.5±7.6 54.5±6.1
Grupo IV 2 60.3±6.0 59.8±6.3 56.8±5.0 58.5±3.8 60.3±5.8 68.8±4.6 63.3±4.5
Grupo V (control positivo) 2 69.3±4.8 65.3±5.8 59.8±4.1 62.0±6.3 65.3±5.2 53.0±3.8 58.0±4.0
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
47
II MM PP AA CC TT OO SS OO CC II AA LL
La información anatómica del xilema secundario del tallo de orégano generada en este
trabajo contribuirá para su posible cultivo de la planta in vitro, para la preservación de la
amisma, así como para la caracterización sistemática de la especie a través se la
comparación de estructuras anatómicas.
Los ensayos realizados en las semillas de lechuga y tomates verde y rojo, señalan que los
extractos orgánicos de tallo de orégano, muestran actividad fitotóxica importante en el
control enfermedades de la planta.
Así mismo, la reducción de microorganismos mesofílicos aeróbios en la carne molida de
cerdo, representa una opción para la adición del aceite esencial como aditivo en alimentos
y confirman su potencial como antimicrobiano en los mismos.
Los resultados de la actividad estrogénica (en útero) no aportaron elementos importantes
que puedan ser concluyentes, por lo que es necesario realizar más ensayos, así como
evaluar otras especies animales, para que el resultado pueda ser más representativo.
En la actividad genotóxica se puede predecir que la hoja de orégano estudiada, a la
concentración administrada, aumentó de manera poco significativa la inducción de las
células micronucleadas, sin daño al ADN.
Dichos resultados amplían los conocimientos sobre las propiedades biológicas del extracto
de la hoja de orégano y contribuyen a la estimación del riesgo-beneficio que puede
derivarse del uso de estas plantas como fitoterapeúticos para uso humano.
Por todo lo anterior, el tallo de orégano se continúa desperdiciando, pero podría ser
susceptible de aprovechamiento por las industrias química, farmacéutica y agropecuaria
para generar un ingreso extra en las comunidades de las zonas áridas y semiáridas del
país, además de la explotación comercial de la hoja.
48
L I T E R A T U R A C I T A D A
1. Albado, P., E. G. Sáez F. y A Grabiel S. 2001. Composición química y Actividad
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