1 INMUNORREACTIVIDAD DE NEURONAS GABAERGICAS Y GLUTAMATERGICAS EN LA CORTEZA Y EL CEREBELO DE RATONES INFECTADOS CON RABIA AURA CATERINE RENGIFO CASTILLO UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Facultad de Medicina, Maestría en Neurociencias Bogotá, Colombia 2012
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Transcript
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INMUNORREACTIVIDAD DE NEURONAS GABAERGICAS Y
GLUTAMATERGICAS EN LA CORTEZA Y EL CEREBELO DE
RATONES INFECTADOS CON RABIA
AURA CATERINE RENGIFO CASTILLO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Facultad de Medicina, Maestra en Neurociencias
Bogot, Colombia
2012
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INMUNORREACTIVIDAD DE NEURONAS GABAERGICAS Y
GLUTAMATERGICAS EN LA CORTEZA Y EL CEREBELO DE
RATONES INFECTADOS CON RABIA
AURA CATERINE RENGIFO CASTILLO
Tesis presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:
Magister en Neurociencias
Director
Biologo, MSc, Ph.D., ORLANDO TORRES FERNANDEZ
Investigador Cientfico
Grupo de Morfologa Celular
Instituto Nacional de Salud
Codirectora:
Lic en Biologa, MSc, Ph.D., Zulma Dueas Gmez
Profesora Asociada
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia
Lnea de Investigacin:
Vulnerabilidad Selectiva Neuronal
Grupo de Morfologa Celular
Instituto Nacional de Salud
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Maestra en Neurociencias
Bogot, Colombia
2012
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DEDICATORIA
Esta tesis esta dedicada a Dios por darme la fuerza, el valor y los principios necesarios para
seguir adelante.
A todos los docentes que lograron motivarme ensendome a confiar en mis capacidades.
A mi madre por haberme inculcado el amor al estudio y por haber hecho de mi lo que soy.
A mi esposo Emilio Alvarado por su amor, amistad y por ser mi compaero incondicional
en las alegras y tristezas.
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Me volv y vi debajo del sol, que ni es de los ligeros la
carrera, ni la guerra de los fuertes, ni aun de los
sabios el pan, ni de los prudentes las riquezas, ni de
los elocuentes el favor; sino que tiempo y ocasin
acontecen a todos.
Ecl. 9:11
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La creatividad requiere del intelecto del filsofo, del
toque fino del escultor, de la habilidad y versatilidad
del artesano, de la intensidad del buen guerrero y del
estoicismo del monje.
Raul Cuero
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AGRADECIMIENTOS
A travs de este trabajo expreso mi agradecimiento a las siguientes personas y entidades:
Al Doctor ORLANDO TORRES FERNNDEZ, investigador cientfico y director de este
trabajo de grado, por el apoyo constante y orientacin en la elaboracin del mismo, y por
mi vinculacin al Instituto Nacional de Salud (INS) desde el ao 2005 a travs del
programa de Jvenes Investigadores e Innovadores-Colciencias.
A la Doctora ZULMA DUENAS GMEZ, codirectora de este trabajo, investigadora
cientfica y profesora asociada de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de
Colombia, por su apoyo constante en la codireccin de este trabajo y por las experiencias
compartidas como profesora de la Maestra en Neurociencias.
A la doctora SONIA CORTS HURTADO quien trabaj en la elaboracin de vacuna
antirrbica en el INS, por su orientacin y explicaciones constantes durante la titulacin del
virus rbico, determinacin de la DL-50 y de la dilucin de trabajo.
Al Bilogo GERARDO SANTAMARA ROMERO, por su apoyo valioso en el
seguimiento de los signos clnicos de los animales infectados y acompaamiento en la
elaboracin de los procedimientos cuantitativos, para contrastar los resultados obtenidos.
Al Bilogo JEISON ALEXANDER MONROY por el apoyo y acompaamiento durante la
titulacin del virus y seguimiento de los signos clnicos de los animales infectados.
Al Dr. EDGAR PARRA coordinador del laboratorio de patologa del INS por la
orientacin en la lectura de las coloraciones de Hematoxilina&Eosina (H&E) y por el
prstamo constante del espacio y equipos de trabajo de su laboratorio.
Al Doctor y Neuropatlogo GABRIEL TORO del INS, por la orientacin en la segunda
lectura de las laminas de (H&E) de tejidos infectados con rabia, por toda una vida
consagrada a la investigacin y por ser fuente de inspiracin para las generaciones futuras
interesadas en las Neurociencias.
A la bacteriloga MARCELA NEIRA por la gran amistad que me ha brindado desde mi
llegada al INS. Por la orientacin recibida en el manejo de equipos del labotario de
patologa del INS y por el entrenamniento en elaboracin de inmunohistoqumica de rabia
en lminas obtenidas a partir de parafina.
A la doctora MARA LEONOR CLDAS MARTINEZ, Coordinadora del Grupo de
Morfologa Celular del INS por haberme aceptado en su grupo de trabajo y por su
colaboracin constante durante el tiempo que he permanecido en el INS.
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Al profesor Leonardo Rene Lareo por haber sido la persona que me introdujo en las
Neurociencias, gracias por haber sido un gran ejemplo como investigador, docente y
motivador del discernimiento terico.
A las profesoras Clara Spinel y Lucy Rivera Rojas por su apoyo constante y seguimiento
durante mi formacin acadmica.
A mi esposo Emilio Alvarado por su amor, apoyo y colaboracin incondicional.
Al INSTITUTO NACIONAL DE SALUD por todo la colaboracin brindada a travs de
sus directivos, instalaciones y personal involucrado en el desarrollo y financiacin de este
trabajo de investigacin.
A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA por contribuir con mi formacin
acadmica y personal a travs del programa de la Maestra en Neurociencias y a su director
Humberto Arboleda Granados por permitir mi formacin en una maravillosa ciencia
interdisciplinar.
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RESUMEN
La rabia es una enfermedad viral que produce cambios en la funcin neuronal. Estos
cambios, entre otros, inducen alteraciones en el metabolismo de los neurotransmisores. Los
signos clnicos de la rabia indican que se podra afectar el sistema GABA-glutamato y, por
lo tanto, el balance entre la inhibicin y excitacin neuronal. El objetivo de este trabajo
consisti en evaluar la inmunorreactividad de neuronas GABArgicas y glutamatrgicas en
la corteza y el cerebelo de ratones infectados con rabia, mediante dos vas de inoculacin.
Se inocularon ratones adultos por va intramuscular e intracerebral con virus de la rabia
CVS; en la etapa terminal de la enfermedad se anestesiaron y se sacrificaron por perfusin
con paraformaldehdo y glutaraldehdo. Se obtuvieron cortes en vibrtomo y se procesaron
para inmunohistoqumica con anticuerpos anti-Glu (glutamato), anti-GABA y anti-PV
(parvoalbmina); una proteina buffer de calcio que adems sirve como marcador de algunas
clulas GABArgicas. Se realizaron conteos celulares y anlisis densitomtricos. En la
corteza cerebral motora se demostr aumento significativo en la Glu-ir y prdida de
GABA-ir por las dos vas de inoculacin, pero en la corteza somatosensorial los resultados
fueron contrarios. En las folias del cerebelo se hall aumento de Glu-ir en la capa granular
as como aumento de PV-ir y prdida de GABA-ir en la capa molecular, slo despus de la
inoculacin intramuscular. Los resultados fueron similares en los ncleos profundos. La
inoculacin intracerebral del virus no provoc cambios de inmunorreactividad para GABA,
Glu, y PV en ninguna de las reas del cerebelo. Aunque el estudio de PV no haca parte de
los objetivos permiti realizar diversas interpretaciones entre ellas el establecer que la
expresin de la protena aumenta como respuesta al aumento del glutamato y la prdida de
GABA, por otro lado con este trabajo se ilustra por primera vez que que el virus de la rabia
afecta el metabolismo de GABA y el glutamato de manera antagnica y que los efectos
varan segn la ruta de inoculacin y el rea enceflica evaluada.
Palabras clave: Glutamato, GABA, corteza cerebral, cerebelo, inmunohistoqumica, rabia
SUMMARY
Rabies is a viral disease that induces changes in neuronal function. These changes induce
alterations in the metabolism of neurotransmitters. Clinical signs of rabies indicate that the
system could affect GABA-glutamate and, therefore, the balance between inhibition and
neuronal excitation. The aim of this study was to evaluate the immunoreactivity of
GABAergic and glutamatergic neurons in the cortex and cerebellum of mice infected with
rabies through two routes of inoculation. Adult mice were inoculated intramuscularly and
intracerebrally with CVS rabies virus, in the terminal stage of disease were anesthetized
and sacrificed by perfusion with paraformaldehyde and glutaraldehyde. In vibratome
sections were obtained and processed for immunohistochemistry with anti-Glu (glutamate),
anti-GABA and anti-PV (parvoalbmina), a calcium buffer protein also serves as a marker
of GABAergic cells. Cell counts were performed and densitometric analysis. In the motor
cortex showed significant increase in the Glu-ir and loss of GABA-ir by both routes of
inoculation, but in the somatosensory cortex results were contrary. In the cerebellar folia
was found increased Glu-ir in the granular layer and increased PV-ir and GABA-ir loss in
the molecular layer, only after intramuscular inoculation. The results were similar in the
deep nuclei. Intracerebral inoculation of virus did not cause changes in immunoreactivity
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for GABA, Glu, and PV in any area of the the cerebellum. Although the study of PV was
not part of the objectives allowed for different interpretations including establishing that the
protein expression increases in response to increased glutamate and GABA loss, on the
other side with this work is illustrated for the first time the rabies virus affects the
metabolism of GABA and glutamate in an antagonistic manner and that the effects vary by
route of inoculation and the brain area evaluated.
Key words: Glutamate, GABA, cerebral cortex, cerebellum, immunohistochemistry
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CONTENIDO Pg.
1. INTRODUCCIN ........................................................................................................ 15
2. MARCO TERICO ..................................................................................................... 16
2.1 Estructura de la corteza cerebral ........................................................................ 16
2.2 Estructura y funcin del cerebelo ....................................................................... 20
2.3 Metabolismo y funcin del sistema GABA-glutamato ...................................... 24
2.4 Alteraciones y enfermedades asociadas con la disfuncin del ciclo glutamina- glutamato-GABA ............................................................................................... 30
2.5 Importancia de la rabia en Colombia ................................................................. 33
2.6 Biologa del virus de la rabia ............................................................................. 35
2.7 Patognesis de la rabia ....................................................................................... 36
2.8 Hiptesis sobre la patognesis de la rabia paraltica y enceflica ...................... 37
2.8.1 El Papel de la respuesta inmune y la cepa viral ...................................... 37
2.8.2 Efectos del virus rbico sobre la mdula espinal y el sistema nervioso
perifrico ............................................................................................................... 37
2.8.3 Efectos del virus rbico sobre el encfalo y los sistemas de neurotransmisin .................................................................................................. 38
3. OBJETIVOS Y JUSTIFICACIN ............................................................................... 42
3.1 Objetivo General ................................................................................................ 42
3.2 Objetivos especficos.......................................................................................... 42
3.2.1 Determinar el patrn de distribucin de neuronas inmunorreactivas a GABA y glutamato en la corteza motora y el cerebelo de ratones normales e
infectados con virus rbico. .................................................................................. 42
3.2.2 Establecer las diferencias inducidads por cada una de las rutas de
inoculacin del virus de la rabia sobre la expresin inmunohistoqumica de
GABA y glutamato. .............................................................................................. 42
4. MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 43
4.1 Manejo de animales, titulacin e inoculacin viral ............................................ 43
4.2 Procedimiento para la fijacin y extraccin del tejido cerebral. ........................ 44
4.3 Obtencin de los cortes de tejido cerebral y definicin del rea de estudio. ..... 45
4.4 Protocolo de inmunohistoqumica ...................................................................... 45
4.5 Anlisis histolgico y digital de las imgenes. .................................................. 48
4.6 Diseo e interpretacin de los experimentos...................................................... 48
4.6.1 Tamao de la muestra y repeticiones experimentales ............................. 48
4.6.2 Anlisis Estadstico ................................................................................. 49
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5. RESULTADOS ............................................................................................................ 49
5.1 Titulacin y signos clnicos en las vas de inoculacin viral ............................. 49
5.2 Ensayos inmunohistoqumicos y coloraciones histolgicas............................... 53
5.2.1 Fijacin del tejido y estandarizacin de anticuerpos en cerebelo. ......... 53
5.2.2 Observaciones morfolgicas y distribucin de antgeno rbico en los encfalos de ratones inoculados por alguna de las vas de infeccin. .... 55
5.2.3 Distribucin de neuronas inmunorreactivas a glutamato en la corteza motora ...................................................................................................... 60
5.2.4 Distribucin de neuronas inmunorreactivas a glutamato en la corteza
somatosensorial. ...................................................................................... 63
5.2.5 Relacin de la distribucin de glutamato en la corteza motora y somatosensorial por las dos vas de inoculacin ...................................... 67
5.2.6 Distribucin de neuronas inmunorreactivas a GABA en la corteza motora
68
5.2.7 Distribucin de neuronas inmunorreactivas a GABA en la corteza
somatosensorial. ....................................................................................... 71
5.2.8 Relacin de la distribucin de GABA en la corteza motora y
somatosensorial por las dos vas de inoculacin ...................................... 75
5.2.9 Glutamato en cerebelo. ............................................................................ 75
5.2.10 GABA en cerebelo .................................................................................. 78
5.2.11 Parvoalbmina en cerebelo ..................................................................... 81
6. DISCUSIN ................................................................................................................. 85
6.1 Uso de los anticuerpos para GABA y glutamato como marcadores neuronales 85
6.2 Tcnica de fijacin y distribucin de GABA, glutamato y parvoalbmina en
cerebelo. ........................................................................................................................ 89
6.3 Efectos de la infeccin rbica sobre la distribucin de GABA glutamato y parvoalbmina en cerebelo. ................................................................................ 92
6.4 Distribucin de glutamato en la corteza del ratn normal ................................. 95
6.5 Distribucin de GABA en la corteza del ratn normal ...................................... 95
6.6 Efectos de la infeccin viral sobre la distribucin de glutamato y GABA en la
corteza motora .................................................................................................... 96
6.7 Efectos de la infeccin viral sobre la distribucin de glutamato y GABA en la corteza somatosensorial ...................................................................................... 98
6.8 Signos clnicos y correlacin con los marcadores neuronales .......................... 99
7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 101
8. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 102
9. REFERENCIAS ......................................................................................................... 104
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INDICE DE FIGURAS
Pg. Figura 1. Representacin de lminas corticales en la neocorteza. ...................................... 18 Figura 2. Cerebelos cortados en un plano sagital. ............................................................... 21 Figura 3. Esquema de una vista dorsal del cerebelo que representa una reconstruccin en
direccin rostrocaudal........................................................................................................... 21 Figura 4. Descripcin de la corteza cerebelosa. .................................................................. 23 Figura 5. Ruta metablica del ciclo glutamina-glutamato-GABA. .................................... 28 Figura 6. Lmite rostral (a) y caudal (b) de la corteza motora del ratn.............................. 46 Figura 7. Lmite rostral (a) y caudal (b) de la corteza somatosensorial del ratn. .............. 46
Figura 8. Lmite medial (a) y lateral (b) seleccionados en el cerebelo del ratn. ............... 47
Figura 9. Comportamiento del peso de animales control e infectados con rabia. ............... 52
Figura 10. Signos clnicos de animales infectados por las diferentes vas de inoculacin. 52 Figura 11. Estndarizacin inmunohistoqumica de GABA en cerebelo. ........................... 54 Figura 12. Observaciones histolgicas y distribucin de antgeno rbico en la corteza
motora. .................................................................................................................................. 56
Figura 13. Observaciones morfolgicas y distribucin de antgeno rbico en la corteza
somatosensorial y el hipocampo. .......................................................................................... 57
Figura 14. Morfologa de las folias cerebelares y distribucin de antgeno rbico en los
ncleos profundos. ................................................................................................................ 58 Figura 15. Distribucin de antgeno rbico en las folias cerebelares. ................................. 59
Figura 16. Clulas inmunorreactivas a glutamato en la corteza motora de ratn. ............... 61
Figura 17. Celulas inmunorreactivas a glutamato en la corteza somatosensorial. .............. 66 Figura 18. Celulas inmunorreactivas a glutamato en el hipocampo de ratn. ..................... 67 Figura 19. Relacin de la distribucin de glutamato en las diferentes reas corticales. ..... 68
Figura 20. Clulas inmunorreactivas a GABA en la corteza motora de ratn. ................... 69 Figura 21. Clulas inmunorreactivas a GABA en la corteza somatosensorial de ratn y en
el hipocampo. ....................................................................................................................... 74 Figura 22. Relacin de la distribucin de GABA en las diferentes reas corticales. .......... 75 Figura 23. Clulas positivas para glutamato en el cerebelo de ratn. ................................. 77
Figura 24. Clulas positivas para GABA en el cerebelo de ratn. ...................................... 79 Figura 25. Clulas positivas para parvoalbmina en el cerebelo del ratn. ........................ 83
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INDICE DE TABLAS
Pg. Tabla 1. Variacin en el peso de animales inoculados por la va IC y controles. ............... 51 Tabla 2. Variacin en el peso de animales inoculados por va IM y controles. .................. 51 Tabla 3. Distribucin de clulas glutamatrgicas en la corteza motora de ratones control e
infectados por la va intracerebral. ....................................................................................... 62 Tabla 4. Distribucin de clulas glutamatrgicas en la corteza motora de ratones control e
infectados por la va intramuscular. ...................................................................................... 63 Tabla 5. Distribucin de clulas glutamatrgicas en la corteza somatosensorial de ratones
control e infectados por la va intracerebral. ........................................................................ 64
Tabla 6. Distribucin de clulas glutamatrgicas en la corteza somatosensorial de ratones
control e infectados por la va intramuscular........................................................................ 65
Tabla 7. Densitometra del giro dentado en ratones inoculados por la va intramuscular. .. 67 Tabla 8. Distribucin de clulas GABArgicas en la corteza motora de ratones control e
infectados por la va intracerebral. ....................................................................................... 70 Tabla 9. Distribucin de clulas GABArgicas en la corteza motora de ratones control e
infectados por la va intramuscular. ...................................................................................... 71 Tabla 10. Distribucin de clulas GABArgicas en la corteza somatosensorial de ratones
control e infectados por la va intracerebral. ........................................................................ 72 Tabla 11. Distribucin de clulas GABArgicas en la corteza somatosensorial de ratones
control e infectados por la va intramuscular........................................................................ 73
Tabla 12. Densitometra de glutamato en las folias cerebelares de ratones inoculados por la
va IC. ................................................................................................................................... 76 Tabla 13. Densitometra de glutamato en las folias cerebelares de ratones inoculados por la
va IM. .................................................................................................................................. 78
Tabla 14. Densitometra de GABA en las folias cerebelares de ratones inoculados por la
va IC. ................................................................................................................................... 80
Tabla 15. Densitometra de GABA en las folias cerebelares de animales inoculados por la
va IM. .................................................................................................................................. 80 Tabla 16. Densitometra de parvoalbmina en las folias cerebelares de animales inoculados
por la va IC. ......................................................................................................................... 81 Tabla 17. Densitometra de parvoalbmina en las folias cerebelares de animales inoculados
por la va IM. ........................................................................................................................ 82
Tabla 18. Densitometra de parvoalbmina en los ncleos profundos cebelares de ratones
inoculados por la va IC. ....................................................................................................... 84 Tabla 19. Densitometra de parvoalbmina en los ncleos profundos cebelares de ratones
inoculados por la va IC. ....................................................................................................... 85
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NDICE DE APNDICES # Pag
Apndice 1. Datos Primera titulacin del virus................ 2
Apndice 2. Datos segunda titulacin del virus............... 3
Apndice 3. Protocolo inmunohistoqumica de glutamato gaba y parvoalbmina.. 3
Apndice 4. Inmunohistoqumica de rabia para cortes de vibrtomo y parafina .. 2
Apndice 5. Tratamiento de datos del nmero de neuronas positivas para glutamato en la
Corteza motora de ratones infectados por va Intracerebral. 3
Apndice 6. Tratamiento de datos del nmero de neuronas positivas para glutamato en la
corteza motora de ratones infectados por va Intramuscular. 3
Apndice 7. Tratamiento de datos de cambio en el peso en animales control e infectados
por la va intracerebral 4
Apndice 8. Tratamiento de datos de cambio en el peso en animales control e infectados
por la va intramuscular . 4
Apndice 9. Tratamiento de datos de las mediciones densitomtricas de parvoalbmina en
cerebelo en animales control e infectados por la va intracerebral . 3
Apndice 10. Purificacin de glutaraldehido. .. 1
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15
1. INTRODUCCIN
La rabia contina siendo un problema de salud pblica y a pesar del alto impacto en la
salud son pocos los estudios dirigidos a esclarecer los mecanismos de su patognesis; esto
se debe entre otros, a la falta de integracin de virlogos y neurocientficos y al hecho de
que la enfermedad afecte principalmente los pases en desarrollo (1).
La infeccin rbica es producida por un virus neurotrpico cuyo blanco principal es el
sistema nervioso central (SNC) (2). Esta enfermedad genera cambios morfolgicos
mnimos, que no reflejan la magnitud de los signos clnicos observados en la patologa. La
aparente falta de alteraciones morfolgicas en los tejidos infectados, ha hecho que algunos
autores consideren que la letalidad producida en la rabia, se puede atribuir a modificaciones
en los sistemas de neurotransmisin y a otros cambios bioqumicos (3,4).
Se cree que los cambios bioqumicos puntuales producidos durante el desarrollo de la
infeccin, pueden impactar severamente la funcin neuronal (3,5,6). Esta hiptesis es
coherente porque se ha comprobado que modificaciones pequeas en el componente
bioqumico neuronal afectan por completo la respuesta cerebral (7).
Los sntomas observados en el periodo prodrmico (periodo de sntomas observados que
dificultan determinar la patologa del husped) de la rabia indican que se puede afectar la
funcin del sistema GABArgico, como lo han demostrado algunos autores (8,9). El
GABA (cido gamma-amino-butrico) y el glutamato comparten ciclos metablicos a nivel
cerebral, as que los efectos sobre uno de los dos aminocidos podran reflejar alteraciones
en el otro (10,11).
Existen muy pocas investigaciones dirigidas a esclarecer el papel del sistema GABA-
glutamato en la patologa rbica (3,6,8,9,12,13). En nuestro grupo se han evaluado los
efectos de la rabia sobre la inmunorreactividad de tres protenas de enlace del calcio
presentes en clulas GABArgicas y del neurotransmisor GABA, en la corteza frontal de
ratones inoculados con el virus por va intramuscular (IM) (9,13). En el roedor esta corteza
cumple funciones motoras (1) y resulta ser una zona de inters porque los ratones
inoculados con virus por va IM desarrollan rabia paraltica, una de las formas en que se
manifiesta la enfermedad (14,15). Otra rea del encfalo que puede afectarse durante el
desarrollo de la enfermedad rbica es el cerebelo, un rea que tambin regula el
movimiento pero no se han realizado estudios in vivo sobre el rol del virus rbico en sus
sistemas de neurotransmisin.
Algunos estudios indican que durante la infeccin rbica pueden ocurrir alteraciones en el
balance de inhibicin y excitacin neuronal, con una tendencia al estmulo despolarizante
(3,7,12,16,17,18). Basndose en esta hiptesis, se han reportado dos casos controvertidos
de pacientes sintomticos que sobrevivieron a la enfermedad rbica, cuya esquema
teraputico incluy la induccin del coma con el uso de antagonistas glutamatrgicos y
agonistas GABArgicos; esta terapia se denomin protocolo de Milwaukee (8,19). Otros 14
pacientes tratados con procedimientos similares no mostraron resultados satisfactorios y
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16
fallecieron, por lo que no se ha aceptado el protocolo de induccin del coma como una
alternativa del tratamiento para el paciente con rabia (19,20).
No, obstante el protocolo de Milwaukee no debe ser ignorado, a pesar de la falta de
replicacin, debido a la importancia que puede tener el sistema GABA-glutamato en la
patognesis de la rabia. Este hallazgo al igual que lo obtenido en otras investigaciones
sobre rabia, reflejan la gran necesidad de aumentar los estudios del virus rbico en modelos
animales.
Existen pocos estudios sobre los efectos del virus rbico en el sistema nervioso in vivo y
an menos que asocien los efectos del virus con alteraciones en los sistemas de
neurotransmisin (3,4,6,8,12,13), adems gran parte de las investigaciones experimentales
en rabia se han realizado en animales inoculados por va intracerebral (IC) o en cultivos
neuronales (6), lo que aumenta la necesidad de realizar ms ensayos in vivo a travs de la
inoculacin intradrmica o intramuscular, unas rutas ms cercanas a las condiciones
naturales en que ocurre la infeccin (21).
En este trabajo se evalu la distribucin de neuronas inmunorreactivas a GABA y
glutamato en la corteza y el cerebelo de ratones inoculados por dos vas distintas de
infeccin, porque son escasos los reportes sobre la inmunorreactividad de los dos
aminocidos en el modelo murino. Nuestro objetivo fue determinar si existen efectos
diferentes sobre los neurotrasnmisores segn la va de infeccin y si estas diferencias se
reflejan en algunos signos clnicos observables durante el desarrollo de la enfermedad. Los
resultados aqu obtenidos contribuyen con parte del enfoque neurocientfico que se requiere
para el estudio de la rabia y se suman a las pocas investigaciones que simulan las
condiciones naturales de la infeccin, como lo son el modelo animal y la inoculacin
perifrica.
2. MARCO TERICO
2.1 Estructura de la corteza cerebral
La corteza cerebral es una estructura de alta complejidad, representada por una lmina de
sustancia gris (cuerpos de neuronas y glia) que cubre los hemisferios cerebrales (22). Esta
lmina contiene un rea superficial aproximadamente de 2600 cm2 y un espesor de 3-4 mm
(23) compuesto por dos poblaciones neuronales: las neuronas piramidales y las
interneuronas. Las neuronas piramidales representan el 70% del total de las neuronas
corticales y sus axones pueden emerger desde la sustancia gris cortical llegando a sitios
distantes en el hemisferio contralateral, el tallo cerebral o, inclusive, a la mdula espinal
(1,24). Las interneuronas alcanzan entre el 20 al 30% de las neuronas en la corteza y se
conocen tambin como clulas de axn corto, puesto que sus axones no salen de la
sustancia gris; su blanco principal son las neuronas piramidales vecinas (25).
La estructura histolgica del neocortex es similar, por lo menos en las especies
comnmente utilizadas para estudios de neurobiologa (roedores, carnvoros, primates y en
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17
el humano) la misma en todos los mamferos, pero la poblacin de interneuronas aumenta
entre ms alto sea el nivel en la escala filogentica (26). Entre los tipos de interneuronas se
tienen siete como las ms comunes: Clulas en candelabro, clulas en cesta, clulas de
doble bouquet, clulas de Martinotti, clulas horizontales de Cajal-Retzius, clulas
bipolares (fusiformes) y clulas neurogliaformes (26,27) (figura 1). Las neuronas
piramidales sintetizan el glutamato (28), el neurotransmisor ms importante de la corteza
cerebral, mientras que las interneuronas sintetizan GABA (28,29), excepto las clulas
espinosas estrelladas de la capa IV que tambin son glutamatrgicas (30).
Ontognicamente se puede hablar de tres tipos de corteza la arquicorteza compuesta por el
hipocampo y fascia dentata o girodentado; la paleocorteza o corteza olfativa y la isocorteza
o neocorteza compuesta por seis capas enumeradas I-VI (figura 1) o lminas que se pueden
observar en plano coronal (22). Existen caractersticas comunes que se repiten en todas las
reas corticales de los mamferos tales como la proporcin entre clulas piramidales y
estrelladas (31) y los circuitos bsicos en que interactan las neuronas. (30).
La capa I es la capa ms superficial, se caracteriza por poseer proyecciones de neuronas
piramidales y fusiformes, los pocos cuerpos celulares en su mayora corresponden a
neuronas horizontales de Cajal (26,32) (figura 1).
La capa II presenta clulas piramidales de pequeo tamao que se caracterizan por poseer
una dendrita apical de corto tamao. El axn de estas neuronas es largo y atraviesa las
capas ms profundas de la corteza sin abandonarla (28). En algunas ocasiones estos axones
tambin pueden atravesar el hemisferio contralateral haciendo parte de las fibras callosas
(22,28). En la capa II tambin se encuentran un gran nmero de clulas estrelladas o
multipolares como clulas en cesta, en candelabro, neurogliaformes y bipenachadas (27,
26) (figura 1).
La capa III est conformada por clulas piramidales medianas. Las dendritas apicales de
estas clulas ascienden hacia la capa molecular I y sus axones penetran a la sustancia
blanca (fibras nerviosas mielinizadas) como fibras de asociacin o comisural conformando
el cuerpo calloso (23). Las dendritas de las capas II y III hacen contacto con la capa IV (23)
(figura 1).
La capa IV posee dos tipos de neuronas: neuronas estrelladas cuyas dendritas estn
distribuidas solo dentro de la misma capa y neuronas espinosas estrelladas, clulas de axn
corto cuyas ramas dendrticas pueden ascender hasta la capa I (32), pero su mayor
proyeccin axonal es hacia la capa III (25). Las clulas espinosas estrelladas sintetizan
principalmente el glutamato a pesar de pertenecer al grupo de interneuronas (30) (figura 1).
La capa V posee clulas piramidales medianas y grandes, cuyas dendritas ascienden hacia
la capa molecular. Estas clulas se encuentran intermezcladas con unas pocas clulas
estrelladas (26) y clulas de Martinoti; clulas que tambin son estrelladas pero que
comnmente se encuentran confinadas hacia las capas V y VI de la corteza (24, 27). Los
axones de las neuronas piramidales de la capa V abandonan la corteza como fibras de
proyeccin, hacia sitios tan lejanos como el tallo cerebral o la mdula espinal (1) (figura 1).
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Figura 1. Representacin de lminas corticales en la neocorteza.
(1) Neurona piramidal de la capa 5; (2) Interneurona de Martinnotti, haciendo contacto con la capa I; (3)
Inrteneurona en candelabro, clula en donde el axn hace contacto con el segmento inicial del axon de una
neurona piramidal; (4) Interneurona en cesta, clula en la cual los axones hacen contacto alrededor del soma
de la clula priramidal; (5) Interneurona de cajal, clula que se ubica exclusivamente en la capa I y cuyos
axones hacen contacto con la dendrita apical de la neurona piramidal; (6) interneurona bipenachada, clula
que hace contacto con las ramas colaterales de la dendrita apical; (7) Neurona piramidal de la capa VI con
morfologa fusiforme; (8) Interneurona neurogliaforme, clula estrellada de axn corto que no sale de la
lmina cortical; (9) Interneurona espinosa estrellada, nico grupo de interneuronas glutamatrgicas. Adaptado
de referencias (22,25,28,32)
La capa VI posee un gran nmero de neuronas de forma variada, entre las que predominan
clulas fusiformes y piramidales (26), y est atravesada por gran nmero de axones
aferentes a la corteza cerebral o salen de ella como fibras eferentes (32,25). Las dendritas
de algunas de las clulas de esta capa ascienden hasta la lamina IV y sus axones abandonan
la corteza como fibras de proyeccin corticotalmicas (28) (figura 1).
La corteza cerebral recibe tres clases de fibras conocidas como fibras aferentes,
provenientes de reas distintas a la corteza; fibras intracorticales que se originan en la
misma rea cortical y fibras de asociacin provenientes de otras reas corticales (32). Las
fibras aferentes provienen de los ncleos de la base, tlamo, claustro, sustancia innominada,
locus coeruleus, rea tegmental ventral, y ncleos del rafe, (33,24). En diferentes especies
(ratn, rata, gato y mono) se observa que las fibras aferentes talamocorticales llegan
principalmente a la capa IV y a la parte inferior de la capa III. Un gran nmero de sinapsis
provenientes del tlamo establecen contactos con las neuronas estrelladas espinosas de la
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capa IV y tambin con las dendritas basales y apicales de las neuronas piramidales de las
capas III, V y VI (24,28).
A pesar de que son ms las conexiones corticotalmicas se describen con mayor frecuencia
las tlamocorticales debido a que el tlamo provee el enlace de los aferentes sensoriales a
travs de los ncleos de relevo y canaliza las influencias motoras desde reas subcorticales
tales como el globo plido y el cerebelo, a travs de los ncleos de asociacin (34). Los
ncleos de tlamicos de relevo reciben aferencias de reas subcorticales y envan fibras
hacia la capa IV de la corteza portando informacin sensorial excepto la del olfato (24). Los
ncleos de asociacin reciben aferencias de reas corticales y de otros ncleos talmicos y
envan sus proyecciones hacia las capas I, III y VI de la corteza (35).
El modelo bsico de conectividad intracortical comnmente aceptado que puede extenderse
a todas las reas de recepcin (somatosensorial, auditiva y visual) se resume as: La entrada
principal o aferente se realiza principalmente sobre las neuronas de la capa IV e inferiores
de la III (23), sin embargo las aferentes talmicas tambin se proyectan en las capas I, III y
VI (35). Las clulas de la capa IV proyectan hacia las capas II y III, y stas ltimas lo hacen
hacia la capa V. Las neuronas de la capas V se proyectan hacia las capas II, III y IV, pero
las capa VI solo logran ascender hasta la capa IV (22, 23). Las neuronas de la capa V
proyectan al estriado, tronco del encfalo, a la mdula espinal y al tracto piramidal y las de
la capa VI al tlamo y otras reas subcorticales (23), (figura 1). Esto quiere decir que la
corteza cerebral se conecta directamente con todas las reas del SNC excepto con el
cerebelo con el cual se contacta de manera indirecta a travs del tallo cerebral (34).
La poblacin no neuronal que tambin hace parte del SNC y por ende de la corteza cerebral
se denomina neuroglia; aqu se tienen cuatro poblaciones celulares: microglia,
oligodendrocitos, clulas ependimales y astrocitos (36).
Las clulas de la microglia se encuentran dispersas en el tejido nervioso haciendo contacto
con neuronas, vasos sanguneos y otras clulas gliales. A la microglia se le atribuyen
funciones de fagocitosis, liberacin de toxinas, muerte de clulas vecinas y secrecin de
factores de crecimiento astroctico, por tal razn, se afirma que las clulas microgliales
tienen una funcin equivalente a los macrfagos presentes en otras partes del cuerpo (37).
Los oligodendrocitos son las clulas que componen y forman la mielina a nivel del SNC,
pero tambin son clulas satlite que se encuentran a nivel perineural, contribuyendo con la
preservacin del microambiente neuronal. Estas clulas pueden expresar receptores para
glutamato tipo no NMDA (AMPA y Kainato) y adems la enzima glutamina sintetasa
encargada de trasformar el glutamato a glutamina (38), un aminocido implicado en el ciclo
glutamina-glutamato-GABA.
Existen las llamadas clulas NG2 o precursoras de oligodendrocitos, cuyo nombre se
atribuye a la presencia del proteoglicano NG2 tambin conocido como CSPG4. Estas
clulas son muy ramificadas por lo que tambin se denominan polidendrocitos (39). En
condiciones in vitro, las clulas NG2 pueden ser totipotentes y diferenciarse en astrocitos o
neuronas segn las condiciones del medio (40,41). Los polidendrocitos se encargan de
regenerar la mielina en axones regenerados; se diferencian a oligodendrocitos u otras
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clulas, pero algunos de ellos permanecen en el SNC en desarrollo y en el adulto, haciendo
parte de la sustancia gris y la sustancia blanca, razn por la que algunos autores la
consideran otro tipo de clula glial (41).
Las clulas ependimales recubren el sistema ventricular, forman parte del epitelio del plexo
coroideo en donde se produce el lquido cefalorraquideo. Estas clulas ayudan al
intercambio de metabolitos entre el lquido cefalorraqudeo y los espacios extracelulares del
encfalo y la mdula espinal (26), su disfuncin puede causar alteraciones en el lquido
cefalorraqudeo y por ende en la funcin cerebral (42).
Los astrocitos se clasifican en protoplasmticos y fibrosos, los primeros se encuentran
vecinos a la sustancia gris (cuerpo neuronal) y los segundos a la sustancia blanca (axones)
(26,36). Los astrocitos son clulas excitables cuyo potencial de membrana est sujeto a
cambios en la concentracin del calcio intracelular (36,43). Estas clulas juegan un papel
importante en la sinapsis participando en la modulacin de la excitacin neuronal (sinapsis
tripartita) y en los ciclos bioqumicos de la sntesis de neurotransmisores (43). En cultivos
celulares se ha demostrado que los astrocitos y oligodendrocitos expresan receptores de
glutamato; esto corrobora un papel ms activo de la glia en la fisiologa sinptica (38,44).
2.2 Estructura y funcin del cerebelo
Aunque el cerebelo pesa en promedio apenas el 10% del encfalo contiene
aproximadamente la mitad de neuronas del sistema nervioso. Su funcin esta asociada
principalmente a la ejecucin y retroalimentacin de seales (45) relacionadas con la
programacin y ejecucin del movimiento (46). Anatmicamente se encuentra alojado en la
fosa craneana posterior en donde forma con el puente y el bulbo raqudeo (componentes del
tallo cerebral) el techo del cuarto ventrculo (figura 2). El cerebelo se comunica con el resto
del encfalo a travs a travs de tres pednculos (fibras nerviosas) denominados pednculo
inferior, medio o pontino y superior (26,46).
Macroscpicamente en el cerebelo se logra apreciar una zona central o vermis rodeado por
dos estructuras denominadas hemisferios (47). Tanto el vermis como los hemisfereos se
dividen en tres lbulos orginados por dos cisuras anterior y posterior separados por la fisura
primaria y el lbulo floculonodular separado por la fisura posterolateral (Figura 3)
(45,47,48,49). Los lbulos cerebelares estn subdivididos en lobulillos o folias. Tanto en
aves como en mamferos se logran ubicar 10 folias en direccin rostrocaudal enumeradas
del I al X (figuras 2 y 3) (26,45,47).
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Figura 2. Cerebelos cortados en un plano sagital.
(a) Cerebelo de humano; (b) Reconstruccin de varias fotografas mediante el programa Mosaic J de un corte
de 50 m de espesor de cerebelo de ratn coloreado con azul de metileno y cido pcrico (10x). En la imagen
se nota el gran parecido entre el cerebelo de ratn y de humano; son evidentes las 10 folias cerebelares
excepto en las subdivisiones a y b de la folia VII que no existen en ratn. Pc, pednculo cerebral; As,
acueducto de Silvio; Pc, plexo coroideo; 4v, cuarto ventrculo; Np, ncleos profundos. Imagen (a) modificada
de referencia 49.
Figura 3. Esquema de una vista dorsal del cerebelo que representa una reconstruccin en direccin
rostrocaudal.
La estructura natural requiere ser desenrrollada para lograr visualizar todos los lbulos simultaneamente. En
color verde se delimita el vermis, en azul la parte intermedia de los hemisferios, en naranja la parte lateral y
en rojo la fisura primaria. Fp, fisura posterolateral; Lf, lbulo floculonodular. Adaptado de referencias 47 y 48.
El lbulo X o lobulo floculonodular se denomina arquicerebelo, por ser el ms antiguo en la
escala evolutiva, los lbulos I, V y VIII, IX se denominan paleocerebelo y los lbulos VI y
VII conforman el neocerebelo que alcanzan su mximo desarrollo en los primates (45).
Cada zona observada en la figura 3 representa una funcin cerebelar. La zona
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floculonodular o arquicerebelo recibe aferencias vestibulares primarias y enva
proyecciones a los ncleos vestibulares externos. Su funcin se limita a controlar el
equilibrio y los movimientos del ojo (46). El vermis recibe seales auditivas, visuales
somatosensoriales y vestibulares de la cabeza y partes proximales del cuerpo y enva sus
seales a travs del ncleo fastigial a regiones de la corteza y tronco cerebral (46). Estas
proyecciones dan origen a los sistemas descendentes centrales que controlan los msculos
proximales y extremidades del cuerpo. La parte intermedia de los hemisferios recibe
aferencias somatosensitivas de las extremidades y enva sus seales a travs del ncleo
interpuesto (emboliforme ms globoso) a los sistemas corticoespinal y rubroespinal para
controlar los msculos ms distales de las extremidades. Como el vermis y la parte central
de los hemisferios son las nicas zonas que reciben seales de la mdula constatemente se
denominan espinocerebelo (45).
Las partes laterales de los hemisferios y el vermis superior en el lbulo posterior se
denominan o constituyen el pontocerebelo, y recibe aferencias desde los ncleos pontinos
contralaterales (26). Las zonas laterales reciben seales desde la corteza a travs del puente
por lo que se denomina cerebrocerebelo y tambin recibe aferencias desde el ncleo
dentado (46).
La anatoma interna del cerebelo exhibe una corteza o capa superficial de sustancia gris y
una de sustancia blanca central en donde se hallan incrustados cuatro pares de ncleos:
fastigiado, globoso, emboliforme y dentado (figura 2) (26). Estos ncleos estn
conformados por grupos de neuronas GABArgicas, glicinrgicas y glutamatrgicas (50,
51) que reciben aferencias desde la corteza cerebelar y que a su vez envan proyecciones
hacia el tallo cerebral y al tlamo (45). Las proyecciones glutamatrgicas de los ncleos
profundos se conectan con el tlamo y el ncleo rojo y las glicinrgicas con regiones
ipsilaterales del tallo cerebral. Las eferencias GABArgicas de los ncleos cerebelares
establecen seales de retroalimentacin con la oliva inferior. Los ncleos profundos reciben
en su mayora aferencias GABArgicas de las clulas de Purkinje y glutamatrgicas de las
ramas colaterales de las fibras musgosas y trepadoras (50,52).
En la corteza cerebelar se distinguen tres estratos corticales: La capa externa molecular, la
capa intermedia o capa de clulas piriformes tambin llamadas de Purkinje y la capa
profunda o capa de clulas grnulo (figura 4). La capa molecular contiene dos tipos de
interneuronas GABArgicas de tamao pequeo conocidas como clulas en cesta y clulas
estrelladas; gran parte de su neuropilo est formado por las dendritas de las clulas de
Purkinje y por fibras aferentes de capas subyacentes, especialmente las fibras paralelas y las
fibras trapadoras (48). Los axones de las clulas en cesta rodean a los somas de las clulas
de Purkinje y los axones de las clulas estrelladas hacen contacto con su rbol dendrtico
(53). La capa intermedia est conformada por las clulas de Punkinje; estas son
GABArgicas y son las nicas clulas de proyeccin de la corteza cerebelar pero sus
proyecciones llegan slo hasta los ncleos profundos (44,54). La capa granular, como su
nombre lo indica, est densamente ocupada por las clulas grnulo; otros tres tipos de
neuronas se distinguen entre ellas: clulas de Golgi, clulas de Lugaro y clulas en cepillo
(45).
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Las clulas grano son glutamatrgicas y su axn amielnico asciende hasta la capa
molecular, se bifurca en T por arriba de los somas de las clulas de Purkinje dando origen a
las denominadas fibras paralelas (45,48) (figura 4). Las clulas de Lugaro se encuentran
justo por debajo del soma de las clulas de Purkinje, su axn asciende hasta la capa
molecular y probablemente hace contacto con los somas y dendritas de las clulas
estrelladas y clulas en cesta, mientras que las dendritas se extienden horizontalmente sobre
la capa de las neuronas de Purkinje (53). Las clulas en cepillo se encuentran distribuidas
en los lbulos I, IX y X de los mamferos (45) son glutamatrgicas (53) y su blanco
principal son las fibras musgosas y ls clulas grnulo (54). Las clulas de Golgi son
GABArgicas y glicinrgicas, stas envan su dendrita a la capa molecular y su axn
permanece en la capa granular (45,48,53,54).
Figura 4. Descripcin de la corteza cerebelosa.
(a) Esquema de la corteza cerebelosa en donde se aprecian las tres capas corticales, el glomrulo cerebelar y
las fibras trepadoras y musgosas (adaptado de referencia 46). (b) Corte sagital de cerebelo de ratn que exhibe
neuronas de Purkinje (conector angular flecha) reveladas mediante inmunohistoqumica para calbindina
coloreada con diaminobencidina (DAB). Es notable la arborizacin dendrtica dentro de la capa molecular,
40X. (c) Corte sagital de cerebelo de ratn que muestra las capas corticales: estrato molecular (arriba),
neuronas de Purkinje (conector angular flecha) y clulas grnulo (flecha roja). Coloracin de cido pcrico,
fucsina cida y azul de toluidina, 20X.
c a b
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Los principales grupos de fibras que recorren el cerebelo son: fibras paralelas, fibras
musgosas y fibras trepadoras (figura 4). Las fibras paralelas mencionadas anteriormente,
poseen un axn que atraviesa el campo de las dendritas de aproximadamente 450 clulas de
Purkinje (26), pero que tambin hacen contacto con las clulas en cesta y las clulas
estrelladas del estrato molecular. Las fibras musgosas provienen de los ncleos de la
mdula espinal y del tronco enceflico y llevan informacin tanto de la periferia como de la
corteza cerebral. Estas fibras hacen contacto con las dendritas de las clulas grnulo y con
los axones de las clulas de Golgi conformando una estructura llamada glomrulo cerebelar
(figura 4) (26,48). Las fibras trepadoras se originan en el ncleo de la oliva inferior y hacen
contacto con las dendritas proximales y somas de las neuronas de Purkinje, cada clula de
Purkinje hace contacto con una a diez fibras mientras que cada fibra hace contacto con diez
neuronas de Purkinje (55,46).
La poblacin no neuronal del cerebelo la componen los astrocitos de la capa granular y
molecular, los oligodendrocitos de la capa granular y la glia radial de Bergmann, el tipo de
clula glial ms abundante en la corteza del cerebelo (56). Estas clulas sitan su soma
entre el cuerpo de las clulas de Purkinje y se ha calculado que existen ocho clulas gliales
de Bergman por cada clula de Purkinje (48,56). La glia de Bergman interacciona con los
neurotrnansmisores del SN a travs de receptores y trasnportadores y puede incrementar su
expresin de GFAP frente algunos eventos neurotxicos.
2.3 Metabolismo y funcin del sistema GABA-glutamato
El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el SNC de los mamferos (57,
58,59). Participa en diversos procesos fisiolgicos tales como la respiracin celular, los
actos reflejos, el neurodesarrollo, la nocicepcin y la plasticidad neuronal (60,61). El
glutamato en la mayora de sus sinapsis produce efectos excitatorios al actuar sobre
receptores ionotrpicos (protenas que conforman un canal receptor de iones) denominados
iGlu que a la vez se subdividen en receptores N-metil-D-aspartatotipo tambin conocidos
como receptores NMDA y no NMDA como el kainato y el cido -amino-3-hydroxy-5-
methyl-4-isoxazolepropionico tambin denominados recptores AMPA y Kainato.
(62,63,64). Otro grupo de receptores sobre los que acta el glutamato son los receptores
metabotrpicos mGlu (receptores que actan acoplando una protena G), una familia
compuesta por ochos subtipos denominados mGlu1-8; estos receptores ayudan a modular
los efectos producidos sobre los receptores ionotrpicos produciendo seales tanto
inhibitorias como excitatorias (60).
El GABA es el mayor inhibidor neuronal y, paradjicamente, se sintetiza a partir del
glutamato. Su funcin es modular la excitacin neuronal (65) facilitando el balance
correcto entre la inhibicin y la excitacin (36). El GABA realiza su accin inhibitoria a
travs de la interaccin con los receptores ionotrpicos GABAA y GABAC y con el
receptor metabotrpico GABAB. Al igual que los receptores metabotrpicos de glutamato,
el GABAB, regula la accin ejercida por los receptores ionotrpicos de GABA (66).
El gutamato y el GABA son los dos neurotransmisores ms importantes del SNC; son los
responsables del 90% de la transmisin sinptica (67). Los principales receptores
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25
ionotrpicos de glutamato implicados en la transmisin sinptica rpida son el AMPA y el
NMDA y para GABA el GABAA. Los receptores mGlu modulan los efectos de los tres; por
ejemplo, la activacin de los receptores del grupo mGlu I pueden producir la liberacin de
glutamato desde sinaptosomas cerebrocorticales y desde la corteza parietal de ratas en
movimiento, mientras que los del grupo mGlu II pueden incrementar los niveles de GABA
a nivel hipocampal en ratas gerbil (68). La correcta actividad cerebral se define por el
balance preciso entre la excitacin y la inhibicin; las alteraciones del mismo se encuentran
asociadas con varias patologas del sistema nervioso.
Distintos estudios in vitro indican que los astrocitos pueden tener receptores ionotrpicos y
metabotpicos de glutamato (36,69), as como receptores de GABA, GABAA y GABAB y
las enzimas GAD 67 (glutamado descarboxilasa) y GABA-T (GABA-transaminasa) (70).
Se ha observado que la inoculacin de cultivos de astrocitos con AMPA, Kainato y
Quisqualato (agonistas glutamatrgicos) producen efectos despolarizantes (71,72) y que la
que la aplicacin de glutamato y GABA incrementan el calcio intracelular tanto en cultivo
de astrocitos como en rodajas cerebrales (43). El aumento del calcio astrocitario puede
deberse a la accin de GABA y glutamato sobre grupos de receptores que comnmente se
encuentran en las neuronas, sin embargo, este efecto no se ha podido comprobar in vivo o
en rodajas cerebrales dado que famacolgicamente no se pueden distinguir los receptores
gliales de los neuronales con excepcin de la protena de unin a kainato aislada y
caracterizada en la glia de Bergmann del cerebelo de pollo (73).
Como todos los neurotransmisores, el GABA y el glutamato son liberados al espacio
sinptico mediante un proceso de exocitosis, un mecanismo que requiere de un umbral de
calcio intracelular y de la accin de las protenas SNARE del ingles (soluble N-
ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors). Estos son polmeros
involucrados en el trfico vesicular que participan en la fusin de la vescula portadora del
neurotrasmisor con la membrana celular (74).
Se crea que la liberacin del glutamato mediante exocitosis era un proceso exclusivo de las
neuronas pero los astrocitos tambin pueden liberar el glutamato de una manera
dependiente de calcio y de las protenas SNARE; tres de estas protenas se encuentran en
los astrocitos: la sinaptobrevina II (VAMP), la sintaxina y SNAP-23, (75). En cultivos de
astrocitos se ha comprobado que la incubacin con frmacos bloqueadores de las protenas
sinaptobrevina II o sintaxina disminuye o bloquea la liberacin del glutamato glial (76). El
GABA tambin puede ser liberado por los astrocitos (70) de una manera dependiente de
calcio, pero los mecanismos de liberacin pueden ser diferentes a los postulados para
glutamato. La incubacin de cultivos de astrocitos con inhibidores de los trasportadores de
recaptura de GABA, GAT-1, GAT-2 y GAT-3 inhibe la liberacin de GABA y la
incubacin de astrocitos con glutamato o con agonistas del receptor NMDA aumenta la
liberacin de GABA y la concentracin intracelular de calcio; tal efecto es bloqueado con
acido 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetico un quelante del calcio
conocido como BAPTA. Por esta razn no debe descartarse el trmino de gliotransmisores,
pero este es un tema que an genera controversia (70).
La sntesis de aminocidos cerebrales y de neurotransmisores se realiza gracias al ciclo de
los cidos tricarboxlicos (TCA) del ingles tricarboxylic acid cycle, el cual suple los
http://en.wikipedia.org/wiki/Aminehttp://en.wikipedia.org/wiki/Aminehttp://en.wikipedia.org/wiki/Ethanehttp://en.wikipedia.org/wiki/Acetic_acid -
26
metabolitos necesarios para su formacin (77) a travs de reacciones de anaplerosis,
(78,79). La glutamina, un aminocido no esencial, es el principal precursor del glutamato
en el cerebro y el cerebelo y en menor proporcin la glucosa (80,81,82,83,84), pero la
lutamina y el glutamato son incapaces de atravesar la barrera hematoenceflica por ello se
requiere su sntesis dentro de las clulas del tejido nervioso a partir de los TCA (65).
Las neuronas no poseen la enzima anaplerotica ms activa del cerebro, la piruvato
carboxilasa (PC) (85) y esto las inhabilita para realizar la sntesis de la glutamina, por el
contrario, los astrocitos s cuentan esta enzima por lo que suplen los requerimientos de
glutamina neuronal a partir de intermediarios de los TCA. (65,84). La PC al igual que otras
carboxilasas emplea CO2 y la coenzima biotina (vitamina B7-hidrosoluble) para llevar a
cabo la conversin de piruvato a oxalacetato. Adems, requiere del activador alostrico
acetil-CoA, que a su vez acta como un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa (PDH), una
enzima que cataliza la conversin de piruvato hacia el acetil-CoA (86,87). La va principal
de la sntesis de glutamato y GABA se produce a partir del ciclo conocido como
glutamato/GABA-glutamina que se puede resumir en nueve pasos descritos a continuacin
y que se ilustran en la figura 5.
Al inicio del ciclo ocurre la captura de la glucosa por los astrocitos y la gliclisis para
sintetizar el piruvato (paso 1) (81, 96, 97), seguida de la conversin a oxalacetato (paso2).
Como ruta alterna se produce la sntesis de lactato en astrocitos a partir de piruvato por la
enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (paso 2a). (65,83,85,97). A continuacin ocurre la
sntesis de novo de glutamato en astrocitos a partir de los intermediarios de los TCA y la
conversin a glutamina por accin de la enzima glutamina sintetasa (GS) (paso 3) (81). La
glutamina es liberada hacia las neuronas glutamatrgicas para que ocurra la sntesis del
glutamato mediante la enzima glutaminasa activada por fosfato (PAG) (paso 4), pero la
sntesis tambin puede ocurrir a travs de la transaminacin de diferentes aminocidos
(paso 4a) sobre alfa-cetocidos, gracias a la accin de distintas transaminasas
citoplasmticas o a la aminacin directa del alfa-cetoglutarato por la enzima mitocondrial
glutamato deshidrogenasa (GDH) (paso 4b). (84,88,99). El glutamato sintetizado se libera
al espacio sinptico y se une a un receptor en la neurona postsinptica (paso 5), pero el
glutamato que no se uni es reciclado por las neuronas GABArgicas (paso 6) (101) o
capturado por los astrocitos (paso 6a). Las neuronas GABArgicas transforman el
glutamato reciclado a GABA mediante la enzima glutamato descarboxilasa (GAD) y el
cofactor fosfato de piridoxal (paso 7), pero la sntesis de GABA tambin puede ocurrir a
travs de la glutamina liberada por los astrocitos y la captura por las neuronas
GABArgicas (paso 7a) (65,83,84). El GABA liberado al espacio sinptico se une al
receptor (paso 8). El neurotransmisor que no interacciona con ste es reciclado por las
neuronas GABArgicas (paso9) o catlizado por los astrocitos a succinato, mediante la
accin de las enzimas GABA transaminasa (GABA-T) y semialdehido succcinico
deshidrogenasa (SSADH) (paso 9a). Finalmente, una vez se tiene el succinato, se comienza
de nuevo el ciclo (65,77).
La ruta del ciclo glutamina/glutamato-GABA sugiere que la activacin de neuronas
inhibitorias es seguida de la activacin de neuronas excitatorias; prueba de ello es que el
glutamato en su rol metablico sea el principal precursor del GABA (65). Por otro lado, se
cree que las neuronas GABArgicas suplen sus requerimientos de produccin de
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neurotransmisor recapturando o reciclando frecuentemente el GABA y el glutamato (80)
pasos 6 y 9 (figura5), mientras que las glutamatrgicas lo hacen principalmente a travs de
la conversin de glutamina a glutamato. (88).
La recaptura de glutamato se lleva a cabo por los transportadores denominados EAAT1-5
en el humano o GLAST/GLT-1/EAAC1/EAAT4/EAAT5 en roedores (89,90,91). Los
transportadores para GABA presentan mayores variaciones entre especies respecto a los del
glutamato y hasta el momento se han denominado GAT1-4 y BGT-1 (36). Las formas
GAT1 y GAT-3 se expresan en el SNC de rata, ratn y humano; BGT-1 se expresa tanto
en el SNC como en el perifrico, al igual que la forma GAT-2. La forma GAT-2 solo se ha
localizado en rata y ratn y se tiene informacin de una secuencia muy similar en humano
de la que an no se conoce su funcin (92). Los trasportadores de GABA se expresan
principalmente a nivel neuronal mientras que los de glutamato lo hacen en astrocitos
(67). Esto soporta la hiptesis mencionada sobre la mayor recaptura neuronal del GABA respecto al glutamato, asi como el hecho de que exista un gran nmero de trasportadores
de glutamina asociados a neuronas glutamatrgicas (67).
Cerca del 99% de los vasos sanguneos del SNC estn recubiertos por proyecciones
llamadas pies de astrocitos que poseen el transportador de glucosa GlUT1 de 55 KDa
(96). Estas proyecciones celulares permiten que los astrocitos tengan una alta posibilidad
de utilizar la glucosa como fuente energtica paso 1 (figura 5). Por otro lado, los pies de
astrocitos hacen contacto con las neuronas especficamente en las reas perisinpticas. Esta
conexin y la presencia de los transportadores y receptores de los neurotransmisores hacen
que los astrocitos puedan sincronizar la actividad neuronal con sus demandas energticas
(97,93).
Se ha probado una alta correlacin entre el metabolismo de la glucosa y la actividad
glutamatrgica. La prdida de glutamato refleja una prdida de los intermediarios en el
ciclo de los TCA (80) y esto se ha logrado cuantificar porque el glutamato se encuentra en
equilibrio directo con el -cetoglutarato (101). En cultivos de astrocitos el uso de una
concentracin de glucosa 25mM produjo un incremento en el nivel de CO2 como seal del
aumento en la actividad glicoltica, pero a concentraciones menores o iguales a 7,5mM de
glucosa no se logr tal efecto (101). La actividad glicoltica no est determinada
nicamente por la concentracin de glucosa. Pellerin y colaboradores probaron en cultivos
de astrocitos corticales que la incorporacin de 2-Deoxy-D-[1,2-3H]-glucosa ([
3H]2DG)
aument aproximadamente en 700 unidades luego de la adicin de 500m de glutamato.
Igualmente la adicin de una concentracin de 200 m de glutamato increment el lactato
liberado al medio en 500 unidades (94).
Existen otras investigaciones que corroboran los hallazgos de Pellerin. En un estudio se
demostr que despus de estimular las colaterales de Schaffler (proyecciones axnicas
glutamatrgicas) en rodajas de hipocampo se produjo un incremento a nivel citoslico en la
nicotinamida adenn dinucletido en su forma reducida (NADH), seal interpretada como
aumento de la gliclisis (101). En ratas despiertas se ha comprobado que cerca del 80% de
la oxidacin de la glucosa es utilizada en la interconversin glutamina-glutamato. En
humanos se determin que bajo anestesia con pentobarbital, en donde se inhibe fuertemente
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la liberacin de glutamato, disminuye el uso de glucosa entre un 50 a 70% (93). Esta es una
prueba de la correlacin entre la actividad de la glucosa y la actividad glutamatrgica, por
lo que la sntesis del glutamato planteada en los pasos 4a y 4b de la figura 5, puede ocurrir
en menor proporcin respecto a la obtenida a travs de la PAG (paso 4). Las evidencias
hasta aqu planteadas, contrastan con el paradigma de la gran separacin entre el rol
metbolico y el de neurotransmisor del glutamato propuesto por distintos autores (95).
Figura 5. Ruta metablica del ciclo glutamina-glutamato-GABA.
Explicacin pgina 29
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29
Figura 5. Esquema que indica las rutas de sntesis de GABA y glytamato. (a) Neurona glutamatrgica y (b) clula astroglial. Los nmeros solos indican las vas principales de sntesis y las vas alternas que ocurren en
menor proporcin se sealan por los nmeros con letra. Ace-CoA, acetil-CoA; Ala, alanina; ALAT, alanina aminotransferasa; a-KG = a-cetoglutarato; GDH = glutamato deshidrogenasa; Gln = glutamina; Glu =
glutamato; GS = glutamina sintetasa; Lac = lactato; OAA = oxaloacetato; GAD = glutamato descarboxilasa;
PAG = glutaminasa activada por fosfato; PC = pyruvate carboxylase; Pir = pyruvato; TCA = ciclo de los
cidos tricarboxlicos; GABA-T = GABA transaminasa; SSADH = Semialdehido succnico deshidrogenasa;
Suc = succinato. Figura adaptada a partir de referencias (77,80,83,84,85,96,97,98,99,100,101,102).
En condiciones de normoxia, hasta el momento se acepta que el cerebro usa glucosa en sus
dos compartimentos metablicos (neuronas y glia) como principal fuente de energa en
forma de ATP (77). Durante la gluclisis, la glucosa es transformada a piruvato y ste
puede tomar varios rumbos segn sean las condiciones metablicas del momento. El
piruvato puede ser convertido a lactato en el citoplasma por accin de la enzima LDH.
Tambin puede convertirse en alanina por la enzima alanina aminotransferasa (ALT) y
entrar en la matriz mitocondrial gracias al transportador de piruvato (77,103) y ser oxidado
hacia Acetil-CoA, a travs del complejo multienzimtico de la piruvato deshidrogenasa,
para hacer parte de los TCA. El piruvato en la mitocondria tambin puede ser carboxilado a
oxalacetato, otro intermediario que participa en el ciclo de los TCA (86).
A pesar de que se conocen los destinos que pueda tomar el piruvato, no existen referencias
in vivo sobre cual sea el combustible principal que utilizan las neuronas durante su
actividad en condiciones normales. En estudios de cultivos neuronales y de astrocitos con
concentraciones fisiolgicas de 1mM de lactato o glucosa, los astrocitos tienen una mayor
preferencia por el uso de la glucosa para sus requeriemientos metablicos mientras que las
neuronas lo tienen por el lactato. (104,105). Por otro lado se ha determinado que durante la
liberacin de glutamato al espacio sinptico aumenta la expresin de transportadores de
glucosa GLUT-1 presente en astrocitos y disminuye la de GlUT-3 presente en neuronas.
Esta situacin podra indicar que despus de la activacin neuronal se requiere de un
sustrato diferente a la glucosa por parte de las neuronas, para ayudar a cubrir sus
necesidades energticas (104).
Los hallazgos en estudios in vitro indican que el lactato puede ser una fuente energtica
preferida por las neuronas respecto a la glucosa, sin embargo, es difcil pensar que tales
resultados son extrapolables a lo que ocurre in vivo dado que el lactato no logra atravesar la
barrera hematoenceflica y ms an en el cerebro adulto (106). En el recin nacido la
disponibilidad de glucosa es mnima lo que provoca una carencia energtica que es suplida
por el lactato, un compuesto altamente oxidable en el metabolismo cerebral durante las
primeras semanas de lactancia (107,108). Durante este periodo hay un mayor grado de
permeabilidad en la barrera hematoenceflica y una mayor expresin de transportadores de
monocarboxilatos respecto al cerebro del adulto (96).
Gallagher C y colaboradores realizaron microinfusiones de 3-13
Clactato y 1-13
C glucosa
sobre cerebros de humanos con trauma crneo enceflico y luego del anlisis por NMR
lograron evidenciar la participacin del lactato en la sntesis de los carbonos 2, 3 y 4 de la
glutamina, as como de la 1-13
C glucosa en la sntesis de los carbonos 2 y 3 del lactato,
pero al evaluar el aporte de la glucosa hacia la sntesis de glutamina se not que fue
insignificante respecto al aporte del lactato (109). Este estudio es una prueba in vivo muy
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importante acerca del papel del lactato en el metabolismo neuronal del humano, por lo
menos en condiciones anormales y al igual que los estudios in vitro contribuye con el
soporte de la hiptesis denominada trasbordo del lactato entre astrocitos y neuronas
(ANLSH), del ingles the astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis.
La ANLSH ha sido reconceptualizada por Pellerin y colaboradores. En resumen esta
hiptesis indica que la glucosa cerebral es consumida principalmente por los astrocitos
como respuesta a la liberacin de glutamato, y una vez que la misma entra al astrocito se
sintetiza en gran cantidad el lactato, liberndose hacia las neuronas, para suplir as sus
requerimientos metablicos (101). Pese a esto no existen evidencias experimentales de que
en condiciones normales el lactato sirva como sustrato oxidable por las neuronas. Slo se
habla del uso del lactato cerebral en las primeras semanas de lactancia (107,108). Por esta
razn, la ANSHL debe seguirse contemplando como una hiptesis o como una situacin
que puede presentarse en determinadas condiciones.
El GABA y el glutamato tienen un rol metablico y uno de neurotransmisor. Se cree que a
nivel neuronal el GABA acta en los dos roles (110). Al parecer casi un 50% del
aminocido participa en cada rol (111) mientras que el glutamato lo hace a travs de tres
roles: el de neurotransmisor, el metablico neuronal como precursor de GABA y el
metablico glial como precursor de la glutamina (80,111). Los roles de GABA se han
comprobado gracias al uso de dos tratamientos despolarizantes: excitacin de pulsos de
potasio y excitacin con cocteles de agonistas del receptor NMDA. En los primeros se
produce la liberacin del GABA vesicular o del neurotransmisor y en los segundos del
GABA citoplasmtico o metablico (110,111).
2.4 Alteraciones y enfermedades asociadas con la disfuncin del ciclo glutamina- glutamato-GABA
Diferentes estudios indican que en condiciones patolgicas se afecta el ciclo de los
aminocidos glutamina-glutamato-GABA as como el funcionamiento de los receptores
para GABA GABAA y de glutamato tipo NMDA. Los receptores GABAA y NMDA juegan
un papel crucial en la funcin neuronal y en condiciones anormales han sido ampliamente
relacionados con alteraciones en el comportamiento y con mecanismos de degeneracin y
proteccin neuronal (112,113,114,115). El funcionamiento de estos receptores como de los
ciclos de los aminocidos se puede modificar por patologas propias del sistema nervioso,
disfunciones metablicas viscerales o agentes infecciosos que lo afecten de manera directa
o indirecta (116).
El buen funcionamiento del ciclo glutamina-glutamato-GABA permite, entre otras cosas,
regular los niveles de amoniaco. El amoniaco se genera durante la degradacin de la
glutamina por la enzima PAG y puede difundirse simplemente como NH3 a travs de la
membrana celular o ser trasbordado como NH4 por molculas transportadoras dentro y
fuera de la misma (10). Tambin se cree que el amonio se difunde a travs de acuaporinas,
como se indica en un estudio en el que se determin que el tratamiento en cultivo de
astrocitos con cloruro de amonio incrementa la expresin de la acuaporina 4 (117). Otra
alternativa al transporte de amoniaco es la que se lleva a cabo por aminocidos no
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neuroactivos como la alanina y la leucina (figura 5). Durante su sntesis capturan el
amoniaco del glutamato y se dirigen hacia los astrocitos para suministrarlo a la sntesis de
glutamina (84).
Las alteraciones en los niveles de amonio pueden producir modificaciones en la regulacin
del ciclo glutamina-glutamato-GABA. Los pacientes con disfunciones en el ciclo de la
rea, enfermedad heptica u otras condiciones en que ocurra la hiperamonemia, presentan
ataques de hiperexcitabilidad y edema cerebral. En el edema aumenta la presin
intracraneal y la permeabilidad de la barrera hematoenceflica, lo que permite el ingreso de
elementos citotxicos como el amonio (97,117). Los niveles de amonio en el plasma por
encima de 1000 g/dl o 587 mol/L resultan fatales porque logran atravesar la barrera
hematoenceflica y a concentraciones de amonio intracerebral de 500mol/L se inhibe la
transmisin sinptica (118,119).
En diferentes modelos experimentales de enfermedad heptica se han encontrado
concentraciones de 500M/L en los niveles de amonio intracerebral (97,120). La
inoculacin en cultivos de astrocitos con concentraciones de amonio de 5 a 10mM produjo
prdida de la captacin de glutamato y de los transportadores del neurotransmisor (EAAT1
y EAAT2) (121). A estas mismas concentraciones se ha observado hinchamiento de los
astrocitos (120), probablemente por sobreproduccin de glutamina, puesto que el
tratamiento con metionina sulfxido (MSO) (inhibidor de la glutamina sintetasa),
disminuye el hinchamiento de estas clulas gliales durante el edema cerebral (97,156).
Bosman y colaboradores sometieron ratas a dos tratamientos por separado de isquemia y
uremia. En los dos casos observaron incremento en la actividad del electroencefalograma
(EEG), aumento de la concentracin de los niveles de amonio intracerebral, prdida de
glutamato y aumento de la concentracin de glutamina y de lactato, (122). La
hiperamonemia no solo altera la sntesis y el transporte glutamatrgico durante la
exposicin aguda y crnica al amoniaco tambin afecta la funcin de los receptores
NMDA, un receptor ionotrpico de glutamato cuya disfuncin produce deterioro cognitivo
y fallas de tipo letal (123).
El glutamato acta a travs de distintos grupos de receptores iGlu (ionotrpicos) y mGlu
(metabotrpicos). La acumulacin del glutamato en el espacio extracelular puede producir
estimulacin excesiva de los iGlu especficamente del tipo NMDA. El sobreestmulo de los
receptores ionotrpicos por parte del glutamato o de sus agonistas activa canales de calcio
que producen un incremento en la concentracin del ion a nivel intracelular. El aumento
exacerbado del calcio puede producir la muerte neuronal a travs del fenmeno conocido
como excitotoxicidad (124). Esta condicin ha sido ampliamente relacionada con estados
patolgicos como la isquemia, hipoxia y la epilepsia (113,125), as como con algunas
enfermedades neurodegenerativas y del comportamiento como la corea de Huntington,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer (EA), esquizofrenia, dependencia a
psicoactivos y el transtorno obsesivo compulsivo (TOC) (66,112,123,126). Los receptores
de GABA del tipo GABAA estn ampliamente asociados con el desarrollo de estas
patologas y muchos de los mecanismos de disfuncin neuronal se atribuyen a
modificaciones en la regulacin de los mismos. (66,112,127 ).
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Contrario al glutamato la acumulacin excesiva de GABA o de frmacos GABAmimticos
en el espacio extracelular produce efectos benficos en situaciones de disfuncin neuronal
al parecer por la mayor posibilidad de estimular los receptores GABAA (114,128). Tal es el
caso de la tiagabina y el vigabatrin dos frmacos antiepilpticos y neuroprotectores, que
actan inhibiendo el transportador de GABA, GAT-1 y la enzima GABA transaminasa,
respectivamente (127).
Durante el desarrollo de la EA ocurre un deterioro cognitivo severo, atribuido entre otros a
la disfuncin de las neuronas colinrgicas del ncleo basal de Meynert (129, 130) y de las
glutamatrgicas del hipocampo y la corteza (112). Ambos grupos neuronales pueden sufrir
un desbalance en sus respuestas excitatorias ocasionado por alteraciones bioqumicas, como
la disfuncin en los receptores GABAA (131). Estos receptores ejercen una importante
accin inhibitoria que ha sido ampliamente relacionada con el balance correcto entre la
inhibicin y la excitacin neuronal (132,133).
En los pacientes con EA se ha encontrado disminucin en la captacin de los ligandos
agonistas [H3]- flumazenil y [H3]-GABA, baja expresin de las subunidades 1 y 5 de
los receptores GABAA, as como de sus sitios de unin a benzodiacepinas. (112,131). En
cuanto al ciclo glutamina-glutamato en la EA se observan cantidades elevadas de glutamina
sintetasa (GS) (10), lo que indica una mayor sntesis de glutamina. Es posible que los
pacientes con EA presenten alteraciones en los niveles de amonio cerebral y que la enzima
glutaminasa se sobreexprese para lograr la detoxificacin produciendo glutamina, como se
mencion en la encefalopata heptica (134), o en otras situaciones de hiperamonemia
(102).
Durante la esquizofrenia se afectan muchas reas cerebrales relacionadas con dominios
cognitivos y comportamentales entre ellas la corteza, el hipocampo y el hipotlamo. En un
estudio postmorten se encontr disminucin de glutamato y aspartato en la corteza
prefrontal de pacientes esquizofrnicos y reduccin de glutamato en el hipocampo (135).
Otros trabajos sobre esquizofrenia reportaron aumentos en el nmero de aferencias
glutamatrgicas a nivel de la corteza del cngulo, prdida de neuronas no piramidales en la
corteza prefrontal y en el hipocampo, y sobrexpresin de receptores GABAA (136). El
aumento de fibras glutamatrgicas (excitatorias) podra ser la causa de la prdida de
neuronas no piramidales posiblemente GABArgicas (inhibitorias), porque tales clulas son
suceptibles a la excitotocicidad glutamatrgica, y al suceder sto ocurre una disminucin
del tono GABArgico corticolmbico por lo que la sobreexpresin de receptores GABAA
resultara siendo un efecto compensatorio (136).
Bajo condiciones de isquemia se utilizan, significativamente GABA, glutamato y glutamina
como agentes oxidantes para suplir los requerimientos energticos. En un estudio en ratas
sometidas a tratamiento de isquemia se demostr que luego de 1 y 24 horas de tratamiento,
la cantidad de glutamato, glutamina y GABA extracelular aument significativamente de 1,
94 y 3 mol/L a 200, 250 y 20mol/L respectvamente. Esto podra indicar que durante la
isquemia puede aumentar la cantidad de aminocidos disponibles para ser oxidados en el
TCA como un efecto de neuroproteccin o neurodegeneracin (137). Otro aminocido que
puede contribuir con la neuroproteccin es el lactato puesto que su biosntesis aumenta
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durante la isquemia, hipoglicemia o en fenmenos de excitotoxicidad, al parecer por un
mecanismo mediado por el glutamato (94, 122,138).
Varios autores afirman que los aminocidos cerebrales pueden entrar en el ciclo de Krebs y
ayudar a suplir los requerimientos energticos. Aminocidos tales como alanina, aspartato,
glutamato y leucina pueden contribuir a los reservorios de glucgeno en astrocitos pero a
una tasa muy baja de resntesis en comparacin con la glucosa. Los niveles de glucgeno en
astrocitos estn 100 y 10 veces por debajo de los reportados en hgado y msculo
respectivamente (108). En condiciones anormales como hipoxia, isquemia o hipoglicemia
se sntetiza glucgeno en los astrocitos como un mecanismo de neuroproteccin, pero se
acumula en otras condiciones anormales como coma diabtico, esclerosis tuberulosa y
uremia, como seal de disfuncin del metabolismo cerebral (77)
En la epilepsia tambin se han observado alteraciones del ciclo glutamato-glutamina. Las
resonancias de humanos con epilepsia reflejan aumento en la sntesis de glutamato y
disminucin en la sntesis de glutamina (139), pero contrario a esto, en cultivos de neuronas
y astrocitos se observ que la inhibicin de la sntesis de glutamina como de su
transportador por la MSO redujo la actividad neuronal epileptiforme (descargas elctricas
sbitas y desproporcionadas de las neuronas cerebrales) quiz por que la glutamina es el
principal precursor del glutamato. (140). En un estudio en ratones tratados con imipinem,
un antibitico betalactamico que puede inducir estados epileptognicos, se not
disminucin de convulsiones despus de la administracin del agonista del receptor
GABAA muscimol o del antagonista del receptor NMDA conocido como MK-801 (141).
Otras investigaciones han demostrado una alta asociacin entre la sobreexpresin de los
receptores NMDA y la aparicin de ataques epilpticos (113). En ratones transgnicos que
sobreexpresan los subtipos de receptores adrenrgicos 1-AR (adrenergic receptores) se
observaron ataques epileptognicos, al parecer asociados con la sobreregulacin en el
RNAm de los genes que codifican para las subunidades de los receptores de glutamato
NMDA-NR1, AMPA-1, AMPA-2 y la disregulacin para los genes que codifican las
subunidades del receptor GABAA. Esto coincide con los hallazgos en los que se ha
comprobado que la disfucin de los receptores GABAA genera descargas paroxsticas o
abruptas de tipo epileptiforme (142).
Resulta de gran inters conocer el funcionamiento de sistema GABA-glutamato as como
las alteraciones o patologas asociadas a su disfuncin. La comprensin de los mecanismos
subyacentes permite crear nuevas vas para abordar el estudio de una enfermedad como la
rabia de cuya neuropatognesis se conoce muy poco.
2.5 Importancia de la rabia en Colombia
La rabia es una enfermedad que causa la muerte de aproximadamente 75.000 personas al
ao a nivel mundial (143). Esta patologa se produce por la infeccin de un virus
neurotrpico que se transmite a travs de la mordedura o contacto directo de mucosas o
heridas con saliva de un animal infectado (144). Adicionalmente se han documentado
infecciones a travs del trasplante de crnea de un donante muerto infectado por rabia y no
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diagnosticado (145), por aerosol en cuevas contaminadas de murcilagos (145, 147) y
accidentalmente en personal de laboratorio (143) No se han reportado transmisiones de
rabia por mordedura de humano a humano, aunque el virus se ha aislado de saliva de los
pacientes infectados (146,147).
En Colombia hay brotes de rabia en humanos, caninos, bovinos y especies silvestres,
particularmente en murcilagos. Entre 1992 y 2002, se registraron 1088 casos de rabia
urbana de los cuales 42 fueron en humanos y 1046 en perros (148). En los ltimos aos se
ha logrado reducir el nmero de casos de rabia humana producidos por perros pero se han
incrementado los generados por murcilagos (149,150). Entre mayo y julio del 2004, en el
departamento del Choc, se present un brote de rabia humana, transmitida por
murcilagos, con catorce muertes. En enero del 2005 ocurri un brote similar en las
comunidades de Pato y Nauca, en el Alto Baud, Choc, con tres nuevas vctimas (149).
Entre los aos 2006 y 2007 se presentaron cinco casos de rabia humana transmitida por
perros, cuatro provenientes de Santa Marta (151) y uno de Casanare (152). En los aos
2008 y 2009 se presentaron cinco nuevos casos de rabia humana, cuatro de ellos asociados
a murcilago hematfago y uno a insectvoro (153). En cuanto a la rabia animal entre los
aos 2004 y 2007 se produjo un aumento en la rabia canina y de zorros, con lo que se
evidenci que el comportamiento de la rabia en Colombia era similar al presentado en el
rea andina; gracias al control epidemiolgico se logr disminuir esta tendencia llegando a
un caso en el ao 2009, al parecer asociado por transmisin de murcilago a gato (153).
En el ao 2010 el sistema de vigilancia y control en salud pblica (SIVIGILA) report tres
casos, el primero en el municipio de San Luis, departamento del Tolima asociado a
mordedura de gato y los otros dos de pacientes del departamento de Santander; uno de ellos
originado por mordedura de murcilago y el otro al contacto con un gato enfermo infectado
por mordedura de murcilago (153). En el mismo ao no se report ningn caso de rabia en
caninos y solo se inform un caso de rabia en felinos al parecer de un gato (154).
En el 2011 no se report ningn caso de rabia en caninos y felinos pero si ocurri un
incremento notorio en la rabia de animales silvestres con un total de 90 focos de trasmisin
de los cuales el 83,15% de los animales afectados correspondieron a bovinos (152).
Entre los aos 2002 y 2011 se ha reportado un incremento notorio de rabia en bovinos, con
un total de 118 casos positivos para el ao 2011. Esto se puede explicar por el hecho de que
el ganado est ms expuesto a las mordeduras de murcilago y a que los murcilagos hayan
presentado migraciones, lo que aumenta las probabilidades de infeccin. Por esta razn es
necesario prender las
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