Inmovilización microbiana

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 págs. 23-34

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BBaarrrraaggáánn--HHuueerrttaa,, BBllaannccaa EEsstteellaa Laboratorio de Residuos Peligrosos. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Departamento de Ingeniería de Sistemas Ambienta-les, Instituto Politécnico Nacional.Av. Wilfredo Massieu S/N, Unidad Profesional Adolfo López Mateos México, DF. [email protected] Resumen El uso indiscriminado de sustancias toxicas y su disposición inadecuada ha generado graves problemas de contaminación ambiental y daños a la salud. Diversas estrategias han sido diseñadas para minimizar el impacto de estas sustancias, incluyéndose los procesos fisicoquímicos, fotoquímicos y biológicos. La gran diversidad de productos químicos en cuanto a su aplicación y por ende su estructura química ha provocado que sea imposible contar con métodos simples de tratamiento, por lo que se ha intentado inclu-so la combinación de técnicas para alcanzar los niveles máximos permisibles en normas ambientales o simplemente para reducir la toxicidad de algunos desechos peligrosos. Los procesos biológicos, que invo-lucran el uso de microorganismos como bacterias, hongos o algas con capacidad para degradar y/o atrapar sustancias toxicas, han sido utilizados para la biorremediación de sitios contaminados debido principal-mente a su bajo costo. La aplicación de la inmovilización en estos microorganismos presenta ciertas ven-tajas, como son una mayor resistencia a concentraciones altas de compuestos tóxicos, incremento en la actividad catalítica y la formación de microambientes necesarios para la degradación de compuestos re-calcitrantes. Palabras clave: Inmovilización, desechos tóxicos, biorremediación. Abstract The indiscriminate use of toxic substances and its inadequate disposal have generated serious problems of environmental pollution and damages to the health. Several strategies have been designed to reduce the impact of these substances, including the physicochemical, photochemical and biological processes, The great chemical agent diversity as far as its application and therefore its chemical structure has caused that it is impossible to have a simple methods of treatment, for this reason combination of techniques has been tried to even reach the permissible maximum levels in environmental norms or simply to reduce the toxicity of some dangerous wastes. Biological processes, that involves the use of microorganisms like bacteria, fungi or algae which displays the capacity to degrade and/or to catch toxic substances, have been used for bioremediation of polluted places because of their low cost. Application of immobilization of these microorganisms gives some advantages, as they have a greater resistance to high toxic compound concentrations, increase in their catalytic activity and promote the formation of necessary micro-environment for degrading of recalcitrant compound. Keyword: Immobilization, hazardous waste, bioremediation.

Inmovilización microbiana Garzón y Barragán

1. INTRODUCCIÓN. Los vertimientos de sustancias toxicas al medio ambiente, ha sido una problemática que desde hace algunas décadas ha llamado la atención de orga-nismos gubernamentales. Numerosas técnicas se han empleado con el fin de minimizar el impacto que estas causan a los ecosistemas. Con el fin de realizar procesos beneficiosos para el medio ambiente, se han implementado soluciones que implican el uso de microorganismos como bacterias, hongos y algas, los cuales tienen la capa-cidad de atrapar y/o degradar estas sustancias algu-nas veces hasta su mineralización. Algunas de las problemáticas que el uso de micro-organismos causa, es el crecimiento sin control de estos, o la pérdida casi total de la biomasa, así como la susceptibilidad que pueden tener a factores am-bientales como temperatura, pH, entre otros; de igual forma pueden tener menor resistencia a la misma sustancia que se quiera degradar (Cohen, 2001)(Korkoutas, et al. 2004). Para minimizar el impacto de estos factores en el desempeño de los sistemas biológicos y lograr un sistema más eficiente, se ha impulsado el uso de nuevas técnicas, entre ellas la inmovilización de la biomasa activa. La inmovilización celular puede ser definida como la ubicación física de células en un espacio o región específica, de forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una actividad catalítica deseada (Karel et al., 1985). Es un evento que se da naturalmente gracias a pro-cesos de adherencia a superficies o a otros micro-organismos, debido a estructuras celulares ó a sus-tancias que estos mismos segregan. De forma artifi-cial o inducida, puede darse por atrapamiento en los espacios o poros de fibras y geles, entre muchos. (Couto et al., 2004). Bajo muchas condiciones las células inmovilizadas tienen ventajas sobre las células libres y las enzimas inmovilizadas. El uso de células inmovilizadas permite la opera-ción de birreactores a velocidades de flujo que son independientes de la velocidad de crecimiento em-pleadas La estabilidad catalítica puede ser mayor para célu-las inmovilizadas que para células libres y algunos microorganismos inmovilizados toleran concentra-ciones más altas de compuestos tóxicos que su contraparte no inmovilizada (O´Reilly y Crawford, 1989).

2. INMOVILIZACIÓN DE MICROORGA-NISMOS

La inmovilización de microorganismos ha sido estudiada durantes las últimas décadas como la solución y el mejoramiento de sistemas de trata-miento de aguas, suelos y aires contaminados. Al-gunos de los aspectos más importantes considera-dos en esta técnica son expuestos a continuación, así como algunas aplicaciones ambientales. 2.1 Pre-requisitos para lograr una inmoviliza-ción.

Korkoutas y colaboradores (2004) indican que para lograr una inmovilización que sea eficaz para el proceso a realizar, se deben tener en cuenta que los espacios que se usarán como soporte de inmoviliza-ción cumplan con ciertos parámetros tales como la presencia de una superficie de adherencia amplia, que sea de fácil operación y regeneración; debe tener buena porosidad con el fin de permitir un intercambio constante de sustratos, productos, ga-ses, etc.; debe tener una buena estabilidad química, biológica, mecánica y térmica, así como resistente a enzimas, solventes ò cambios de presión. En cuanto a las células a inmovilizar, afirman que estas deben ser viables y deben mantener un meta-bolismo activo por periodos largos, así como su metabolismo no debe verse afectado por los proce-sos de inmovilización. 2.2 Ventajas de la inmovilización de células. La inmovilización de diferentes microorganismos en diversos soportes que van desde los biodegrada-bles como residuos orgánicos o agroindustriales, hasta aquellos de difícil o nula degradación como plásticos y fibras de vidrio han permitido el interés y el desarrollo de nuevas tecnologías debido a algu-nas ventajas que presentan como son:

Concentración de biomasa. Actividad metabólica Resistencia a la toxicidad

2.2. 1. Concentración de biomasa. Algunos estudios han demostrado que en ecosiste-mas acuáticos, la concentración de biomasa inmo-vilizada es superior a la encontrada en un sistema donde la biomasa se encuentra libre. (Cohen, Y., 2001) Esto posiblemente se deba a que en los sis-temas de agua, la biomasa puede ser arrastrada impidiendo que se mantenga o que aumente su concentración. Sin embargo, Kourkoutas y colaboradores (2004) reportan que en la inmovilización de levaduras en perlas de alginato de calcio, la concentración de


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biomasa adicionada no disminuye, pero tampoco aumenta, debido a que las células se encuentran atrapadas impidiendo su crecimiento y reproduc-ción. En la inmovilización de microalgas en perlas de alginato, la concentración de biomasa también se ve controlada, esto debido a que el espacio dentro de la perla no permite un aumento en la densidad celular; también explican como en este caso, la cantidad de luz que sea capaz de pasar a través de la perla será un factor indispensable para el incremento de la biomasa, así como la cantidad de nutrientes dispo-nibles para las micro-algas (Moreno, I., 2008). 2.2.2. Actividad metabólica Varios estudios han demostrado que el metabolismo de las células inmovilizadas es mucho mayor en comparación al presentado por células libres (Pol-prasert et al., 1989) (Angelova et al., 2000) (Nava-rro y Durand, 1977). El incremento en la actividad metabólica, puede deberse a diferentes factores; Madigan y colabora-dores (1997), afirman que gracias al incremento de la biomasa en el soporte, así como la concentración de nutrientes alrededor del soporte, permitirán que se presente este incremento. De igual forma debido a que tanto el soporte como la misma biopelícula que algunos de estos microor-ganismos forman, atrapan gran parte de los nutrien-tes y sustancias presentes en el medio, estos estarán más disponibles para las células inmovilizadas, que si estuvieran libres. (Cohen, Y., 2001). Senthilnathan y Ganczarczyk (1990), Lazarova y Manem, (1995) y Cohen (2001) han sugerido que al estar inmovilizados algunos microorganismos pue-den “encender” genes específicos que permiten un incremento en el metabolismo de estos. Se ha reportado que la disminución del pH al inter-ior de las perlas de alginato de calcio, permite un aumento en el metabolismo celular. La disminución del pH se debe a que la membrana citoplasmática incrementa la permeabilidad a protones, permitien-do que se de un consumo superior de ATP, lo cual se ve reflejado en el incremento del metabolismo (Galazzo y Bailey, 1990). 2.2.3. Resistencia a la toxicidad En un estudio reportado por Marrie y Costerton, (1981), en el cual realizaron pruebas con diferentes concentraciones de antisépticos, encontraron que aquellos microorganismos que eran capaces de formar algún tipo de aglomeración o biopelícula,

tenían mayor resistencia que aquellos que no la formaban. Este fenómeno, es atribuido a diferentes razones entre las cuales se encuentran las diferencias fi-siológicas entre los microorganismos inmovilizados y los de crecimiento libre; también es atribuido a la concentración de nutrientes alrededor de la matriz, lo cual permite que los microorganismos sobrevi-van a las altas concentraciones de compuestos tóxi-cos. Por último, la matriz de exopolisacáridos formada por los mismos microorganismos, reduce la difu-sión de las sustancias tóxicas hacia el interior de la biopelícula, gracias a la carga neutra o polianiónica que puede tener el tipo de exopolisacárido que sea, protegiendo así a los microorganismos que la com-ponen. (Lazarova y Manem 1995) (Naza, J., 2007) 3. TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS. Dependiendo de la forma en que se induce la inmo-vilización, esta se clasifica en: inmovilización pasi-va e inmovilización activa (Moreno, I., 2008) 3.1 Inmovilización pasiva Algunos microorganismos de forma natural tienden a formar aglomerados o unirse a superficies y cre-cer en ellas. Esta interacción con superficies puede darse por la presencia de estructuras celulares como la cápsula y las fimbrias en el caso de las bacterias, y en el caso de los hongos sus propias hifas. Durante la inmovilización pasiva puede darse un proceso de formación de biofilms el cual tan solo de un 15 – 25% corresponde a células vivas. El porcentaje restante esta compuesto por agua en su mayoría, exopolisacáridos (EPS), proteínas y ácidos nucleicos; estos 3 últimos compuestos son conoci-dos como sustancias poliméricas extracelulares (SPE). Son complejas estructuras, con sistemas de canales de agua y aireación, los cuales permiten el transporte de nutrientes, desechos, oxígeno, y agua, entre otros. Gracias a estos canales se generan dife-rentes gradientes de tensión de pH y oxígeno, lo cual permite que se desarrollen micronichos y di-versos grupos bacterianos (Korkoutas et al., 2004) La formación de la biopelícula se da en 4 pasos principalmente (Fig. 1). Durante el primer paso, las células perciben una superficie de adherencia y forman una unión activa reversible por medio de fimbrias, apéndices, pilis, o proteínas de superficie. Durante la segunda fase se produce un incremento de la biomasa celular, formando microcolonias alrededor del área de adherencia, así como la for-


mación de EPS permitiendo que sea una unión irreversible. La composición del exopolisacárido puede variar según el tipo de microorganismo o las condiciones ambientales, los principales componen-tes son alginato, N-acetil-glucosa-mina, glucosa, y galactosa. Durante el tercer paso, la biopelícula crece y madu-ra, permitiendo la adhesión de nuevas colonias bacterianas. Luego de la maduración, se da el último paso, en el cual células individuales o conglomerados se des-prenden de la biopelícula por erosión, abrasión o separación para formar nuevos conglomerados. (Nazar, J., 2007)

Fig. 1 Formación de biopelículas. Modificado de http://prometheus.mse.uiuc.edu/glossary/biofilms/ Gracias al mecanismo de quorum-sensing, se da una señalización al interior de biopelícula, permi-tiendo que se mantengan las condiciones dentro de la misma. Esta señalización se da mediante oli-gopéptidos y acil-homoserina-lactonas. (Nazar, J., 2007) Este tipo de inmovilización ha sido usada en mu-chos ensayos en diferentes tipos de matrices tanto naturales como sintéticas. Germeiner y colaboradores (1994), demostraron que los matrices orgánicos tienen mayor adsorción de la que pueden brindar las matrices sintéticas. Esto se debe a que los materiales orgánicos tienen mayor cantidad de grupos radicales como amino, carboxil, entre otros; así como una mayor cantidad de nutrientes, lo cual permite una adherencia y crecimiento más eficaz. (Cohen, Y., 2001) El estropajo, es una fibra vegetal proveniente del fruto de la Luffa, esta fibra es obtenida una vez se ha secado el fruto y se ha retirado el pericarpio del fruto (Fig. 2). El no ser tóxico, ni reactivo, así como su bajo costo, permite que sea usado ampliamente en la inmovili-zación de microorganismos como Chlorella soroki-

niana, Porphyridium cruentrum, Penicillium cyclo-pium, Funalia trogii, entre muchos, en la remoción de diversas sustancias tóxicas como metales, colo-rantes, sustancias cloradas, entre otras. (Mazmanci y Ûnyayar, 2005) Mazamanci y colaboradores (2005) reportan que al inmovilizar Funalia trogii en estropajo, y adicio-narla una vez inmovilizada a una solución con el colorante Negro Reactivo 5, este fue degradado hasta un 99% luego de 4 días, sin necesidad de adicionarle ninguna fuente de carbono o nitrógeno adicional. Igualmente estudios realizados por Patta-nasupong y colaboradores (2004), reportan el uso de este mismo soporte, así como el uso de fibras de coco para la inmovilización de un consorcio bacte-riano, el cual fue utilizado para la degradación de el fungicida Carbendazim (metil-2-benzimidazol carbamato; MBC). En este estudio se encontró que después de 4 días de cultivo se logró obtener una degradación del 95 y 80% del MBC, en cada uno de los soportes respectivamente; un porcentaje de degradación muy superior al obtenido por el con-sorcio bacteriano en crecimiento libre, el cual fue de tan solo un 12%.

Fig. 2 Esponja vegetal o estropajo (Luffa cilín-drica). http://cgi.ebay.it/LUFFA-CILINDRICA Castillo y González (2007), reportan que al inmovi-lizar la biomasa de Trametes versicolor en este mismo soporte, luego de cuatro días de exposición a una solución del colorante Negro Reactivo 5, se logró una decoloración del 92% y genera una remo-ción de 69.27% luego de tres ciclos repetitivos durante 12 días. Akhtar y colaboradores, (2004) reportan el uso de el estropajo como soporte de inmovilización para Chlorella sorokiniana, en la remoción del Niquel (II) de soluciones acuosas, demostrando una efecti-


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vidad superior a la mostrada por las células libres en un 25%, luego de 20 minutos de exposición. Asimismo, se ha utilizado la fibra de Agave tequi-lana Weber en la inmovilización de hongos y bacte-rias (Garzón , 2008) para la degradación de colo-rantes textiles de diferentes clases químicas (Fig. 3).

Fig. 3 Microscopía de barrido electrónico para la inmovilización de Klebsiella sp sobre fibra de Aga-ve tequilana Weber. A 2000x. En la degradación de pesticidas como el DDT, Barragán y colaboradores (2007) reportan el uso de granos de café como matriz de inmovilización de diferentes grupos bacterianos, los cuales crean micronichos microaerofílicos y anaerobios dentro de los poros del café, permitiendo así la degrada-ción total del DDT al no producirse intermediarios como el DDD y el DDE (Fig. 4).

Fig 4. Microfotografia mostrando la colonización bacteriana en los poros del grano verde de café. En el estudio realizado por Iqbal y Saeed (2006), Phanerochaete chrysosporium fue inmovilizado en fibra de madera de papaya, con el fin de remover

Zn(II) de una solución acuosa, donde luego de una hora removió 66.17mg/g del metal, un 41.93% mas que lo removido por el hongo en crecimiento libre; luego de un proceso de deserción se pudo recuperar un 99%, lo cual permitió la reutilización del soporte y el microorganismo inmovilizado. Otra aplicación que puede darse para la biomasa inmovilizada en fibras naturales, es en la utilización de esta en reactores de lecho empacado, en donde las matrices con biomasa inmovilizada es usada para la degradación de sustancias tóxicas como clorofenoles. En investigaciones realizadas, se reporta el uso de cubos de madera para la inmovili-zación de hongos de podredumbre blanca como Phanerochaete chrysosporium, donde el 4-cloro-fenol, fue degradado en un rango de 71.1 – 83 % en condiciones de ausencia de fuente de Carbono y Nitrógeno adicional. (Jin, et al., 1998) En cuanto a materiales sintéticos diversos estudios han demostrado el uso efectivo de diversos materia-les (Fig. 5) como vidrio o cerámicas porosas en algunos casos es adicionado Fe+3 , o ser tratados con policationes, quitosan u otros químicos con el fin de facilitar la colonización del soporte (Cohen, Y., 2001).

Fig. 5 Materiales diversos utilizados en la inmovili-zación de biomasa. Díaz y colaboradores (2002), luego de realizar un estudio sobre la degradación de petróleo por un consorcio de bacterias halotolerantes inmovilizadas en fibras de polipropileno, reportaron que el con-sorcio fue más efectivo estando inmovilizado, debi-do a la estabilidad brindada por el soporte y a que sus propiedades físicas permitieron un mayor apro-vechamiento del petróleo. También reportan como la estabilidad del soporte o del consorcio no se vio afectada pese a las condiciones de salinidad a las que fueron sometidos.

5μm5μm


Fig. 6 Microscopía de barrido electrónico para la inmovilización pasiva de T. versicolor en espuma de poliuretano a 200x. (Castillo & González, 2007) Fava y colaboradores (1996), informan los resulta-dos obtenidos al inmovilizar un consorcio bacteria-no identificado como ECO3, en tres diferentes soportes de inmovilización, los cuales fueron perlas de vidrio, perlas de sílice, y cubos de poliuretano, con el fin de observar la declorinación de bifenilos poco clorados. Terminado el estudio demostraron que la declorinación y degradacion de PCB incre-mentó al inmovilizar el consorcio ECO3. De igual forma se demostró que la biomasa inmovilizada en perlas de sílice tiene mayor capacidad de declorina-ción que la inmovilizada en vidrio y poliuretano; así como tienen mayor capacidad de reducción del PCB que el poliuretano pero la misma capacidad que las perlas de vidrio. Sin embargo la mayor concentración de biomasa fue inmovilizada por las perlas de vidrio, seguida por las perlas de sílice y los cubos de poliuretano, respectivamente; indican-do que la cantidad de biomasa inmovilizada no tenía una relación directa con la degradación y declorinación del PCB. El poliuretano al igual que el polivinil, son materia-les ampliamente usados en la inmovilización de microorganismos gracias a su resistencia a condi-ciones ambientales diferentes (Fig. 6). Se ha repor-tado el uso de estas sustancias en la inmovilización de Scenedesmus obliquus para la remoción de metales en agua (Urrutia, et al., 1995). Yamaguchi y colaboradores (1999) igualmente reportan el uso de espuma de poliuretano en la inmovilización de Prototheca zopfii, en la degradación de hidrocarbu-ros. La espuma de polivinil fue usada por Doronina y colaboradores, (2006) en la inmovilización de Pseudomonas esterophilus, para la biodegradación de 510 ppm de etilacetato y 520 ppm de metilace-tato, logrando una degradación del 100% de los dos

compuestos luego de cuatro días de contacto de la solución contaminada con la biomasa inmovilizada. Wang y Li, (2007) reportaba el uso de carbón acti-vado y de una membrana de un polímeto con el fin de inmovilizar una cepa aislada de suelo contami-nado, Pseudomonas putida. Se utilizó en un reactor, en el cual se puso en contacto con el medio y con-taminado con fenol. Luego de 24 horas el fenol fue removido y se demostró que dicho proceso se había dado en cuatro pasos. Adsorción por el soporte, remoción por biodegradación y por absorción de las membranas celulares, biodegradación por parte de las células inmovilizadas y las células en suspen-sión, y por último la bio-regeneración, donde la concentración de biomasa en el reactor aumentó. La degradación de fenoles fue superior al adicionar el carbón activado granular, esto debido a que el carbón activado aumento la capacidad de sorción de el fenol, así como facilito el transporte de este hacia las células. Mileva y colaboradores, (2008) reportan el uso de carbón activado para la inmovilización de Klebsie-lla oxytoca 8391, en la biodegradación de 1,2-dicloroetano. Se reporta como la inmovilización de K. oxytoca 8391 en carbon activado, aumenta nota-blemente la biodegradación del compuesto tóxico, así como brinda una mayor protección a el micro-organismo frente a las concentraciones tóxicas de este mismo compuesto. Igualmente gracias al mo-delo matemático creado y probado en este estudio, demuestran que la liberación de células inmoviliza-das es mínima y éstas no realizan biodegradación del 1,2-dicloroetano. El carbón activado también ha sido usado en biode-gradación de fenoles a concentraciones de 0.2, 0.4, y 0.6 g/L en aguas residuales. La degradación máxima fue realizada por Pseudomonas pictorum, quién produjo un porcentaje de degradación de 95.2%, a un pH de 7.6, una concentración de carbón de 1.12g/L, y una concentración de fenol de 0.229 g/L; este resultado se mantuvo constante, demostrando que P. pictorum inmovilizada es ca-paz de mantener un alto nivel de degradación du-rante un largo tiempo de colonización. (Annadurai, et al., 2000) Al realizar tratamiento de residuos en plantas de tratamiento industriales, uno de los métodos más implementado es el uso de digestores anaerobios; sin embargo para que sea un proceso realmente efectivo, es necesario mantener constante una alta concentración de biomasa. Dadas estas circunstan-cias, García y colaboradores (1997), realizaron un estudio donde se evaluó la efectividad de las perlas de vidrio poroso (SIRAN) en un reactor de lecho fijo, usado a condiciones termofílicas, para la de-gradación de las vinazas del vino. Luego del estu-


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dio llegaron a la conclusión de que gracias a las características del soporte como los diferentes ta-maños de poro que presenta, así como su amplia superficie favorecen la adhesión del microorganis-mo al soporte. Observaron que durante la coloniza-ción de este soporte, sin importar el microorganis-mo, se diferencia claramente tres pasos: una fase de latencia, una de formación de la biopelícula, y una final de estabilización de la biopelícula. Sin embar-go al presentarse un sistema de alimentación por cargas la fase de latencia inicial se ve reducida a unas pocas horas y facilita la estabilización de la población bacteriana, logrando que la biomasa llegue a una concentración del 93% de los sólidos volátiles al finalizar el proceso; este valor supera la inmovilización lograda en procesos de inmoviliza-ción en (GAC) carbón activado granular reportados por Fox (1990). Adicionalmente afirman que la colonización del soporte se dará de las partes más internas como grietas y poros, hacia la superficie; este proceso puede darse gracias a que estas irregularidades de la superficie proporcionan protección a los microor-ganismos facilitando la adhesión inicial de estos al soporte. Reportes similares sobre la forma de colonización de los soportes, fueron dados por Barragán y cola-boradores (2007a) donde indica, como la coloniza-ción sobre GAC se dio desde la parte interna hacia la externa facilitando la creación de micro-ambientes anaeróbicos (que facilitaron la degrada-ción de colorantes textiles hasta su mineralización, al darse ambientes aerobios y anaerobios en el mismo soporte.

Fig 7. Crecimiento de Pseudomonas sp dentro de los poros de carbón activado a 10, 000x (Barragán, 2004). 3.2 Inmovilización activa Dentro de las técnicas de inmovilización activa, o inmovilización artificial pueden distinguirse el ataque químico, atrapamiento en geles de políme-

ros naturales o sintéticos, y el uso de agentes flocu-lantes. (Moreno-Garrido, 2008). Los agentes floculantes se usaron inicialmente con el fin de sedimentar partículas suspendidas, evitan-do así el uso de técnicas como la centrifugación. Actualmente pueden usarse con el fin de permitir que células que por su naturaleza propia no tienden a aglomerarse, lo hagan, permitiendo así el atrapa-miento de otras sustancias suspendidas en el medio (Kourkoutas, et al., 2004).

En cuanto a agentes floculantes, el quitosano ha sido, por excelencia, el compuesto más usado (Mo-reno-Garrido, 2008). El quitosano (Fig 8), es un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribui-das aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (uni-dades deacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina\ (unidad acetilada), el cual es extraído de la quitina. Posee una carga positiva, y es soluble e medios ácidos. (Kean, et al., 2005)

Fig. 8 Estructura química de la Quitina y del Quito-sano. http://www.tecsup.edu.pe/webuds/web/publicacion/publicacion7/index.htm

Presenta grupos aminos cargados positivamente, los cuales le permiten tener una alta afinidad por partí-culas cargadas negativamente. Es un medio comúnmente usado en bio-remediación de aguas residuales con altos contenidos de metales a través de la inmovilización de algas (Moreno-Garrido, 2008). Este tipo de inmovilización es muy variable, factores como composición de la pared celular, pH, oxígeno disuelto y la composición del medio, puede hacer que la cantidad de células cambie.

El atrapamiento en una matriz porosa, es uno de los procesos más utilizados. Este puede darse en polímeros sintéticos (resinas, acrillamidas, poliure-tanos), proteínas (gelatina, colágeno, albúmina de huevo), o polisacáridos naturales (agares, carragre-nanos o alginatos) (Moreno-Garrido, 2008). Consis-te en la inmovilización de células dentro de una matriz, la cual impide la difusión de las células en


el medio, pero permite el paso de metabolitos y nutrientes (Kourkoutas, et al., 2004). El procedimiento general para el atrapamiento de las moléculas en gotas de polímeros, consiste es suspender el microorganismo a inmovilizar en una solución líquida que contiene los monómeros de la macromolécula. Para la gelificación de esta mezcla se usan diferen-tes métodos de acuerdo a la naturaleza del polímero a usar. Entre los métodos a usar se encuentran la disminución o aumento de temperatura, la gelifica-ción ionotrópica de macro-moléculas con cationes multivalentes, y otros métodos químicos como la adición de las gotas a un buffer enfriado en hielo o en diferentes soluciones químicas (Cohen, Y., 2001). Este tipo de inmovilización, puede tener como problema que las células libres del medio se ubi-quen sobre la superficie de la esfera y degraden esta permitiendo la liberación de la biomasa inmoviliza-da. Para solucionar este problema, se ha implemen-tado el uso de esferas de gel con un núcleo interno que contiene las células inmovilizadas (Fig. 9) y una capa externa protectora que impide su libera-ción. (Ramon-Portugal et al., 2003) (Kourkoutas, et al., 2004). Algunas de las ventajas que ofrece este tipo de inmovilización, es que permite la inmovilización de una alta concentración de biomasa, ofrece una alta resistencia a sustancias tóxicas presentes en el me-dio, permite la inmovilización de diferentes espe-cies de microorganismos, separados físicamente unos de otros, entre muchos (Cohen, Y., 2001). La inmovilización de células en este tipo de matri-ces ha sido ampliamente aplicada en biorremedia-ción (Tabla 1).

Fig. 9 Modelo de inmovilización en matriz porosa. Blanco y colaboradores (1999), describen el uso de un polímetro sintético, el polisulfano, y una resina epóxica, para la inmovilización de células de Phormidium laminosum, una cianobacteria con la capacidad de absorber metales pesados como Cu (II), Ni (II) y Zn (II). Bandhyopadhyay y colaboradores (1999), reportan el uso de gotas de alginato de calcio, en la inmovi-

lización de una cepa de Pseudomonas putida MTCC1194, para la biodegradación de fenol. Chitiva y colaboradores (2003), también reportan el uso de Pseudomonas spp., en la biodegradación del fenol. Como matrices de inmovilización se usaron polímeros de poliuretano (inmovilización pasiva), alginato y una mezcla con alginato y alcohol poli-vinílico (inmovilización activa); estos se compara-ron entre sí y contra un cultivo de células libres. Gracias a la adición de un polímero con grupos OH- en el gel de alginato, y a su interacción con los grupos amino de la pared celular del microorganis-mo, se permitió una mayor concentración celular e esta matriz, pero la degradación de fenol no se vio aumentada lo cual indica que la concentración de biomasa, no es proporcional a la biodegradación la cual fue de 100% para todos los matrices. Las perlas de alginato han sido reportadas en la inmovilización de Pseudomonas sp., para la degra-dación de p-Cresol (O´reilly, et al. 1989), de etil-benceno (Parameswarappa, et al., 2008). La inmovilización de Pseudomonas luteola fue estudiada por Chang y colaboradores (2001), en la degradación del colorante Rojo reactivo 22. P. luteola, fue inmovilizada en tres diferentes matri-ces, Alginato de calcio (CA), κ-carragenano (CGN) y poliacrilamida (PAA). En comparación con las células libres, las células de P.luteola inmovilizadas tienen mayor resisten-cia a las variaciones de pH y oxígeno disuelto pre-sentando además una mayor estabilidad al ser usa-das durante varios ciclos de decoloración. Pese a que se presenta una buena decoloración en el tratamiento realizado con células inmovilizadas en alginato de calcio y κ-carragenano, la inmoviliza-ción en poliacrilamida, es mejor que en células libres, alginato de calcio y κ-carragenano. Pseudomonas putida, inmovilizada en alginato de calcio, carragenano y agar; fue usada en la biode-gradación de cianidas, cianatos y tiocianatos de amonio y dióxido de carbono, producidas en la minería y extracción de metales. El mejor índice de biodegradación, fue reportado por las células de P.putida inmovilizadas en alginato de calcio, mine-ralizándose los compuestos hasta NH3 y CO2. (Chapatwala, et al., 1998).


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Las gotas de alginato de calcio, también pueden ser utilizadas en la inmovilización de cepas fúngicas. Domínguez y colaboradores (2005) reportan el uso de esta matriz en la inmovilización de Trametes versicolor, para la decoloración de colorantes sinté-ticos textiles. Los resultados obtenidos indican que luego de 40 días de operación de la biomasa inmovilizada en un reactor, las bio-partículas mantuvieron su forma y consistencia y no presentaron problemas de opera-ción. Igualmente reportaron altos porcentajes de decoloración en un tan solo 24 horas, 96% para Índigo y 69% para rojo de fenol. Ramsey y colaboradores usan este mismo trata-miento en la remoción de Amaranto, Negro Reacti-vo 5, Azul Reactivo 19 y Negro Directo 22, donde la decoloración de las soluciones con estos com-puestos fue casi completa; sin embargo notaron que las perlas que fueron colonizadas podían fracturase fácilmente. Otro polímetro usado para la inmovilización de microorganismos por atrapamiento, es el agar. El agar puede ser usado en esferas o en fibras. Un consorcio de microorganismos conformado por un grupo bacteriano oxidador del fenol, Methanoth-rix y un microorganismo metanogénico degradador de H2 fueron inmoviliza-dos en filamentos delgados de agar, previamente tratados con CO2 y N2 para hacer anaeróbica la matriz. Luego de tratar una solución que contenía una con-centración de fenol, durante un mes, este fue con-vertido en CH4 y CO2. La inmovilización protegió el consorcio de la toxicidad que altas concentracio-nes de fenol pueden producir; de esta forma con-centraciones de 500μg/mL disminuyó la tasa de

degradación de los microorganismos en crecimiento libre, pero una concentración de 1000 μg/mL logró disminuir la tasa de degradación del fenol en mi-croorganismos inmovilizados. Una concentración de 2000 μg/mL logró inhibir totalmente la degrada-ción por parte de las células libres, pero las células inmovilizadas aun a esa concentración presentaban un alto índice de degradación. (Dwyer, et al., 1986). Gardin y colaboradores, (2001) reportan la co-inmovilización muy efectiva de microorganismos aerobios y anaerobios, en perlas de gel de κ-carragenano/gelatina (2%p/p), para la degradación de 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP). El tratamiento se dio en un reactor USB, en anaero-biosis, donde se controlaron las condiciones de temperatura y pH, entre otros. El 2,4,6-TCP fue degradado a 2,4-DCP y 4-CP. Las concentraciones residuales de este último, causaban la inhibición de una mineralización completa. En otro estudio realizado por Kabaivanova y cola-boradores (2008), son utilizadas perlas de agar como matriz para inmovilizar una cepa de Bacillus sp. termófila, con la cual lograron la degradación de nitrilos, producidas por industrias petro-químicas. Se logró una degradación del 93% de la 4-cianopirimidina, a altas temperaturas, a través de una nitrilasa termoestable, demostrando la efectivi-dad de este método de inmovilización para el trata-miento de aguas residuales provenientes de las industrias petroquímicas. Otros numerosos estudios han sido realizados para la biodegradación de sustancias tóxicas por méto-dos de atrapamiento en geles. Por ejemplo el uso de geles de poliacrilamida, alginato y agar para la inmovilización de células de Pseudomonas sp. en la degradación de naftaleno (Karegoudar, et al., 1998), o la biodegradación de pireno y fenantreno, por medio de Fusarium sp. inmovilizado en polivi-nil y alginato (Li, et al., 2005).

Características Polímetros naturales Polímeros sintéticos

Carragenano Ca -alginato PVA PCS PEG Solubilidad Alto Alto Bajo/nulo Bajo/nulo Bajo/nulo Biodegradabilidad Posible Posible Bajo Bajo Bajo Estabilidad Bajo Bajo Alto Alto Medio Difusibilidad Muy bueno Muy bueno Bueno Moderado -- Crecimiento Bueno Bueno Moderado Moderado Bueno Proceso de inmovili-zación Simple Simple Laborioso Laborioso Laborioso

Tabla 1. Comparación entre polímeros naturales (Carrageno y alginato) y polímeros sinté-ticos (PVA, polietilen glicol (PEG) y policarbomil sulfato (PCS)) usados en la inmoviliza-ción microbiana, aplicado en el tratamiento de aguas residuales domésticas. ( Modificado de Llenen, et al., 1996)


El uso de matrices de inmovilización se ha conver-tido en una solución a problemas de toxicidad de sustancias, al proteger a los microorganismos de-gradadores por medio de geles, ha mejorado la tasa de degradación al hacer esta más rápida, incremen-tando el metabolismo de las células inmovilizadas; ha disminuido la pérdida de biomasa al permitir la adhesión o atrapamiento no reversible de ésta: son estas razones principalmente las que han permitido que cada día sea incrementado el uso de estas técni-cas no solo en la biorremediación, sino también en diversos procesos ambientales e industriales, incen-tivando el estudio y trabajo de los mismos. El uso de residuos agroindustriales en este proceso ofrece ciertas ventaja sobre soportes convencionales, ya que al ser materiales de desecho son economicos, se promueve el uso sustentable del recurso y pueden servir además como fuente de nutrientes a los mi-croorganismos inmovilizados, incrementar en algu-nos casos su actividad catalítica o la producción de enzimas especificas. REFERENCIAS Akhtar, N., Iqbal, J., Iqbal, M., (2004), Re-moval and recovery of nickel (II) from aqueous solution by Loofa sponge immobilized biomass of Chlorella sorokiniana characterization studies. J. Hazard. Mater. 94: 108, 85.

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Inmovilización microbiana

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