1 INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE Azotobacter chroococcum C26 ORIANA LISBETH ORTEGA SIERRA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito para optar al título de Microbiólogo Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2012
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INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBETH ORTEGA SIERRA TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2012
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INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBTEH ORTEGA SIERRA
APROBADO
________________________ ________________________ Ingrid Schuler PhD. Janeth Arias MSc, MEd. Decana Académica Directora de Carrera
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INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBTEH ORTEGA SIERRA
APROBADO
________________________ ___________________________ Ruth Bonilla Buitrago PhD. Daniel Fernando Rojas, MSc. Directora Codirector ___________________________ Adriana Matiz Jurado
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NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a la
moral Católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
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TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION………………………………………………………………… 6
2. JUSTIFICACION Y PLNTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………… …… 9
3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal……………………… …… 11
3.2 El género Azotobacter………………………………………………… …… 11
3.3 Conservación en polímeros…………………….................................. …… 12
4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………… …….. 13
4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS…………………………………………………. 13
5. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………… 13
5.1 Microorganismo y condiciones de cultivo…………………………… ……... 13
5.2 Preparación de célula de Azotobacter………………………………… ……. 14
5.3 Evaluación de la influencia del estado fisiológico, el polímero y la temperatura sobre la viabilidad de Azotobacter chroococcum C26………………………………………………………………………………….. 14
Ea: energía de activación, A: factor pre- exponencial de Arrhenius; ΔS: la entropía estándar de activación; ΔH: entalpía
estándar de activación; ΔG: energía libre de Gibbs.
Cuando las células vegetativas fueron conservadas se encontró que el polímero ejerce
una actividad protectiva sobre las celulas disminuyendo la energía de activación
necesaria para que se inicie el proceso de degradación. Cuando las células
vegetativas fueron conservadas en carragenina, alginato y HPMC la energía de
activación se incrementó en 197%, 144% y 70%, respectivamente, comparado con el
control. En el caso de las células maduras la energía de activación fue incrementada
30% cuando las células se conservaron en HPMC con respecto al control de BPS, sin
embargo no se observaron diferencias cuando se conservaron las células en alginato.
Finalmente, las células enquistadas solo presentaron un aumento en la energía de
activación cuando se conservaron en alginato. Estos resultados sugieren que el estado
fisiológico presenta preferencias particulares sobre el tipo de polímero empleado.
Cuando comparamos entre los tres estados fisiológicos conservados en BPS, los
resultados mostraron que la energía de activación fue mayor cuando las células se
encontraban en estado maduras y quistes que en estado fisiológico vegetativas. Este
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resultado muestra que las células de Azotobacter per se son más resistentes a medida
que se hace más viejas o se diferencian en células denominadas quistes. El valor de la
energía deactivación se incrementó en 62,7% y 33,1% para maduras y quistes, con
respecto a las células vegetativas. Es interesante resaltar, que las células maduras
presentaron una energía de activación mayor que las células enquistadas las cuales,
como se mencionó previamente, son más tolerantes a las condiciones ambientales
adversas, en particular a la desecación. Este resultado soporta las observaciones
previamente descritas donde se mencionaba que las células enquistadas tuvieron una
acelerada muerte celular en la mayor temperatura. Esto da lugar a la generación de
tres hipótesis: 1) los quistes de Azotobacter C26 no son resistentes a la desecación, 2)
no llegaron a la madurez necesaria, o 3) el agente inductivo residual ejerció toxicidad
sobre las células conservadas. Pero como ya se mencionó, se requiere de mayor
investigación para evaluar estas hipótesis.
De modo general, y soportando los resultados presentados en la Tabla S1, en
promedio las células vegetativas tuvieron una mejor interacción con los polímeros lo
cual fue evidente por un mayor aumento en la energía de activación comparado con
los otros estadios fisiológicos. Aún más, la energía libre Giggs la cual discutiremos a
continuación fue mayor, es decir se requiere de una mayor inversión de trabajo por
parte del entorno para que se dé a cabo la reacción, esto es la degradación térmica de
las células. También fue posible inferir que de manera general las células en estado
vegetativo fueron más tolerantes a las condiciones impuestas, lo cual fue evidente por
mayores energías de activación (Tabla 1).
La energía libre de Gibbs relaciona la entropía y la entalpia de un sistema,
entendiéndose entropía como el grado de desorden o aleatoriedad y la entalpia como
la energía interna no invertible en trabajo. Cuando el ΔG = 0 se dice que el sistema
está en equilibrio, cuando ΔG < 0 quiere decir que el proceso se da espontáneamente,
mientras que cuando el ΔG > 0 el proceso requiere de energía para realizarse. Los
resultados obtenidos ilustran esta relación, para que la degradación de las células se
dé se require que el entorno proporcione energía al sistema. En el caso de los
microtubos donde se conservó, la energía es aportada en forma de calor el cual
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proviene del ambiente en el cual se conservaron los tratamientos. En el caso de la
temperatura de 30 °C la energía que invierte el entorno en el tratamiento es mayor que
en las otras temperaturas (Tabla 2), de modo que se invierte una mayor energía para
que la reacción se dé, cuando se supera la energía de activación las células empiezan
a degradarse y en consecuencia el recuento disminuye. Krumnow et al. (2009)
reportan que el único factor que se asocia con la degradación térmica no es la
temperatura a la cual se preservan los tubos sino también el tiempo de exposición el
cual se relaciona con la cantidad neta de entrada de calor al sistema.
Fig. 7 Correlación termodinámica de los tratamientos en A. chroococcum C26 Compensación entalpia-entropía para
degradación de estados fisiológicos: células vegetativas (A), células maduras (B) y células enquistadas(C) en
diferentes tratamientos.
Como se revela en el estudio la energía asociada con el cambio de la entropía se
correlaciona con el cambio de entalpia en un fenómeno conocido como entalpia-
entropía que se refiere esencialmente a la relación específica lineal encontrado que
existe entre el cambio en entalpía y la variación de entropía en muchos procesos
biológicos (Dunitz, 1995). Este proceso de compensación se caracteriza por generar
un grafico lineal de ΔH frente al ΔS (Fig. 7). En nuestro estudio experimental esta
relación se ve evidenciada para cada estado fisiológico de A. chroococcum,
observándose un comportamiento de cambio de entalpia positivo, indicando que la
degradación de cada tipo de célula está asociado a la absorción de calor como ha sido
reportado en otros estudios (Sorokulova et al. 2008). El valor de ΔH para los
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tratamientos vegetativas-carragenina, vegetativas-alginato y enquistadas-alginato
fueron altos si se les compara con los tratamientos conservados con BPS y otros
estudios como los realizados por Sorokulova et al. (2008) donde se presenta el ΔH de
formulaciones de esporas de Bacillus subtilis con energías de activación en el rango
entre 10-20 kcal/mol.
Nuestras investigaciones han mostrado que la conservación de células de Azotobacter
chroococcum C26 con los ciertos polímeros puede incrementar considerablemente la
tolerancia de las células a condiciones extremas, además fue posible evidenciar que el
estados fisiológico expone un papel clave en esta tolerancia. Estos hallazgos son muy
importantes especialmente puesto que permiten el desarrollo de nuevas técnicas de
conservación que no requiere sofisticación. La interpretación termodinámica de los
resultados proporcionó una visión más holística que permite identificar de forma más
directa cómo las variables del entorno pueden afectar un tipo de sistema abierto como
el trabajado en este estudio.
7. CONCLUSIONES
Los resultados de este estudio permitieron evidenciar que tanto el estado fisiológico, el
tipo de polímero y la temperatura de almacenamiento juegan un papel clave sobre la
viabilidad de Azotobacter a lo largo del tiempo. El experimento fue interpretado en
términos de la viabilidad celular a lo largo del tiempo, y en términos termodinámicos lo
cual permitió establecer una relación entre la energía que el sistema recibe y la
degradación celular. Con base en los resultados se estableció que el mejor método
para la conservación fue aquel que implicó el uso de células vegetativas y carragenina.
En términos de viabilidad se observó que el recuento no disminuyó significativamente a
través del tiempo y en términos termodinámicos se demostró que la energía de
activación es superior a la de los otros tratamientos. Adicionalmente, fue posible
observar que la viabilidad fue similar cuando se conservaron las células a 4 y 22 C, por
lo cual es posible desarrollar un método de conservación con polímeros a temperatura
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ambiente. El desarrollo de este tipo de tecnologías es importante pues permite
mantener la viabilidad de las células a lo largo del tiempo sin la necesidad emplear
equipos especializados o condiciones astringentes de conservación. En consecuencia,
la estabilidad de las células es posible mantenerla a través del tiempo con un poca
inversión económica y de infraestructura.
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8. REFERENCIAS
Adesemoye AO, Torbert HA, Kloepper J W. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Allow Reduced Application Rates of Chemical Fertilizers. Microbial ecology. 2009; 58: 921- 929. Ahmad F, Ahmad I, Khan M.S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 2008; 163: 173—181 Amara, M.A.T. and Dahdoh, M.S.A. Effect of inoculation with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield and uptake of nutrients by wheat grown on sandy soil. Egyptian Journal of Soil Science. 1997; 37: 467–484. Arrhenlus, S. Uber die Reaktionsgeschwindigkeitbei der Inversion von Rohrzucker durch Sauren. Z. Physical Chemical 1889; 4: 226-248. Asgha H.N, Zahir Z.A, Arshad, M. and Khaliq A. Relationship between in vitro production of auxins by rhizobacteria and their growth promoting activities in Brassica juncea. L. Biology and Fertility of Soils 2002; 35: 231–237. Bernd H, ertesvag H, Valla S. A New Azotobacter vinelandii Mannuronan C-5-Epimerase Gene (algG) Is Part of an alg Gene Cluster Physically Organized in a Manner Similar to That in Pseudomonas aeruginosa. Journal of bacteriology. 1996; 178 (20):5884-5889. Biswas J.C, Ladha J.K. and Dazzo F.B. Rhizobia inoculation improves nutrient uptake and growth of lowland rice. Soil Science Society of America Journal. 2000; 64:1644–1650. Biswas J.C, Ladha J.K, Dazzo F.B, Yanni Y.G. and Rolfe B.G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice. Agronomy Journal. 2000; 92: 880–886. Bonartseva G.A, Myshkina V.L, Nikolaeva D.A, Kevbrina M.V, Kallistova A.Y, Gerasin V.A, Iordanskii A.L and Nozhevnikova A.N. Aerobic and anaerobic microbial degradation of Poly-β-Hydroxybutyrate produced by Azotobacter chroococcum. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2003; 109:285-301 Brotonegroro S. Nitrogen fixation and nitrogenase activity of Azotobacter chroococcum. Veenman and
Zonen. Wageningen. 1974, 76 p
Chung-Jey S, Reusch R and Sadoff L. Fatty acids in phospholipids of cells, cysts, and germinating cysts of Azotobacter vinelandii. Journal of bacteriology.1979; 137 (3): 1434-1436 Chen Y, Mei R, Lu S, Liu, L, Kloepper, J.W. 1994.The use of yield increasing bacteria as plant growth promoting rhizobacteria in Chinese agriculture. In Management of Soil Born Diseases ed. Gupta, V.K. and Utkhede, R. pp. 1–13 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C, Ait E. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Applied and environmental microbiology. 2005; 71 (9): 4951–4959. Damir O, Mladen P, Božidar S, Sr_an N. Cultivation of the bacterium Azotobacter chroococcum for preparation of biofertilizers. African Journal of Biotechnology. 2011; 10(16): 3104-3111
31
Denkova Z, Krastanov A, Murgov I. Immobilized lactic acid bacteria for application as dairy starters and probiotic preparations. The Journal of General and Applied Microbiology 2004; 50 (2): 107-14 Doyle M, Beuchat L, Montville T. Microbiología de los alimentos fundamentos y fronteras. Acribia. España.
2000, 326 p.
Dunitz J. Win some, lose some: enthalpy-entropy compensation in weak intermolecular interactions. Chemistry & Biology. 1995; 2:709-712
Gama S, Nuñez C, Segura D, Moreno S, Guzman J and Espin G. Azotobacter vinelandii Aldehyde
Dehydrogenase Regulated by 54: Role in Alcohol Catabolism and Encystment. Journal of bacteriology. 2001; 183 (21): 6169–6174 Hilali A, Przrost D, Broughton W.J, Antoun A. Effects the inoculationof souches de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii sur la croissance du bl’e dans deux sols du Marco. Canadian Journal of Microbiology. 2001; 47: 590–593.
Jackson LE, Burger M, Cavagnaro TR. Roots, nitrogen transformations and ecosystem services. Annual Review of Plant Biology 2008 ; 59:341–363
Funa N, Ozawa H, Hirata A, Horinonouchi S. Phenolic lipid synthesis by type III polyketide synthases is essential for cyst formation Azotobacter vinelandii. PNAS. 2006; 103 (16): 6356-6361.
Hemar Y, Hall C.E, Munro P.A, Singh H. Small and large deformation rheology and microstructure of k-carrageenan gels containing commercial milkprotein products. International Dairy Journal. 2002; 12: 371–381
Holt J.2000. Bergey´s manual to determinative bacteriology. Novena edicion. Baltimore. Maryland. Ed. Williams & Wilikins. USA. Pp 77, 105.
Kailasaphaty K. Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications. Current Issues in Intestinal Microbiology 2002; 3: 39-48.
Khalid A, Arshad M, Zahir Z. A. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. Journal of Applied Microbiology. 2004; 96: 473–480.
Krumnow A, Sorokulova I, Olsen E, Globa L, Barbaree J, Vodyanoy V. preservation of bacteria in natural polymers. Journal of Microbiological Methods 2009; 78: 18-194.
Murano E. Use of natural polysaccharides in the microencapsulation techniques. Journal of Applied Ichthyology. 1998; 14: 245-249.
Muñoz J, Bernal P, Duque E; Godoy P, Segura A, ramos J. Involvement of cyclopropane fatty acids in KT2440 to freeze-drying the response of Pseudomonas putida. Aplied and environmental microbiology. 2006; 72 (1): 472-477.
Lenart A. Ocurrence, characteristics and genetic diversity of Azotobacter chroococcum in various soils of Southern Poland. Polish Journal of Environmental Studies. 2012; 21 (2): 415-424.
Lin, L. P, Sadoff H L. Encystment and polymer production by Azotobacter vinelandii in the presence of b-hydroxybutyrate. Journal Bacteriology 1968; 98:1335-1341
32
Reusch R N, Sadoff H L. Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane. Nature
1983; 302: 268 - 270
Reusch R N and Sadoff H L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization. Journal Bacteriology. 1979; 139: 448-453.
Richardson A, Barea J, Mcneill A, Prigent C. Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms. Plant soil. 2009; 321: 305- 339.
Rokka S, Rantamaki P. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications. European Food Research and Technology. 2010; 231: 1-12
Sadoff H. L, Berke E, Loperfido B. Physiological Studies of Encystment in Azotobacter vinelandii. Journal of bacteriology. 1971; 105 (1): 185 189 Sadoff H. Encystment and Germination in Azotobacter vinelandii. Bacteriological reviews. 1975; 39 (4): 516-539 Safari AA, Sharifi Z. Land use Effect on the occurrence and distribution of Azotobacter in Hamadan soils, Iran. Proceedings of The Fourth International Iran & Russia Conference. 2004; 614-618
Segura D, Vite O, Romero Y, Moreno S, Castañeda M, Espin G. Isolation and characterizacion of Azotobacter vinelandii mutants impaired in alkylresorcinol synthesis: alkyilresorcinols are not essential for cyst desiccation resistance. Journal of bacteriology. 2009; 191 (9): 3142-3148.
Socolofsky MD, Wiss O. Cysts of Azotobacter. Journal Bacteriology. 1961; 81: 946-954.
Sorokulova I, Krumnow A, Pathirana S. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnology Progress. 2008; 24: 1147-1153
Sorokulova I, Watt J, Olsen E, Globa L, Moore T. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. Journal of Microbiological Methods 2012; 88: 140-146.
Stevenson LH, Socolofsky MD. Cyst formation and poly-β-hydroxybutyric acid accumulation in Azotobacter. Journal Bacteriology. 1966; 91: 304–310 Tejera N, Lluch C, Martinez M V, Gonzalez J. Isolation and characterization of Azotobacter and Azospirillum strains from the sugarcane rhizosphere. Plant and Soil. 2005; 270: 223–232 Thorne, P.S., Lange, J.L., Bloebaum, P., Kullman, G.J., 1994. Bioaerosol sampling in-field studies—can samples be express mailed? Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 55, 1072–1079 Verma S, Ladha J, Tripathi A. Evaluation of plant growth promoting and colonizationability of endophytic diazotrophs from deep water rice. Journal of Biotechnology 2001; 91: 127–141
Vessey J. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil. 2003; 255: 571–586.
Wyss O, Smith DD, Pope LM, Sokolofsky KE. Endogenous encystment of Azotobacter vinelandii. Journal Bacteriology.1969; 100: 475–479
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ANEXOS
Tabla S1. Análisis estadístico de las variables de estudio.