INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas) ¿Porqué es necesario? ¿Cómo se hace? Aplicaciones (ejemplos) Bioseguridad
Jan 13, 2016
INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS(Evolución experimental de rutas)
¿Porqué es necesario?
¿Cómo se hace?
Aplicaciones (ejemplos)
Bioseguridad
Dos grupo de compuestos
Biogénicos (Se degradan)
Xenobióticos
(No se degradan)
Biotransformantes
Recalcitrantes
COOH COOH
CL
COOH
CLCL
Mineralización Biotransformación Recalcitrancia
A) B) C)Substrato
Crecimiento
Producto
0 1 2 0 0 11 22
Tiempo (Unidades)
¿Porqué?
Muchos compuestos tóxicos YA son degradados por cepas naturales.
Sin embargo, y para algunos compuestos concretos (organoclorados, organofosforados), la velocidad de degradación por organismos naturales es muy baja.
Para moléculas muy complejas (y de aparición reciente en la naturaleza), NO es de esperar que UNA SOLA cepa tenga TODA la ruta necesaria para degradarla.
En estos casos, se plantea
CONSTRUIR CEPAS MEJORADAS para expandir las características naturales
CONSTRUCCIÓN DE RUTAS HÍBRIDAS
AMPLIAR RUTA PREEXISTENTE
Identificar pasos NO permisivos o cuello de botellaReclutar enzimas isofuncionales
Mutagenizar y seleccionar enzimas con más amplio espectro de sustrato
Añadir pasos a ruta preexistente
Eliminar actividades NO deseadas
"Adecuación" del regulador
CONSTRUIR RUTA NUEVA
Diseñar secuencia de pasos enzimáticos necesarios
Reclutar las enzimas de distinta fuente
Ingeniería de rutas
Objetivo final: MEJORAR LAS CEPAS BACTERIANAS• Ganancia de función• Modificación de función• Pérdida de función
Pasos limitantes más frecuentes:Especificad de las enzimasFallo en la activación por el regulador
Metodología: -MUTAGÉNESIS (para ganancia o pérdida de función)
- al azar (requiere selección posterior)- dirigida
-TRANSFERENCIA DE GENES- CONJUGACIÓN y recombinación - TRANSFORMACIÓN
- y recombinación (ADN libre se integra en el cromosoma)- plásmidos (unidades replicativas independientes)
-SELECCIÓN EN QUIMIOSTATOS
¿Cómo?
Rif- B
La bacteria donadora B,sensible a rifampicina, lleva plásmido con genes que metabolizan el catecol
Rif+
A
La bacteria receptora A,resistente a rifampicina, no puedecrecer con catecol
Rif+ Rif-A B
CONJUGACIÓN
Rif-Rif+Rif+A A B
SELECCIÓN (Rif + catecol)
DONADORARECEPTORA
TRANSCONJUGANTE
genA (o varios genes)
oriV
Ap
+
TRANSFORMACIÓN
Bacteria
Plásmido manipulado
Electrochoque o CaCl2 + Selección
A
Proteína A
Bacteria con función adicional
B
A
C
D
E
A
C
D
E
A
C
D
E
BB B
A’A’
S
HORIZONTAL VERTICAL
EVOLUCIÓN DE RUTAS CATABÓLICAS
EJEMPLO 1
ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE ALTAS CONCENTRACIONESDE NITRATO EN EFLUENTES DE FABRICACIÓN DE EXPLOSIVOS Producción de DNEG Aguas residuales con alta carga de nitrato
• Aislamiento de organismos tolerantes a altas concentraciones de nitrato.
• Caracterización.
• Establecimiento de las condiciones óptimas para la eliminación de nitrato.
• Optimización del proceso (económica):Dilución de las aguas.Suministro de nutrientes.Fuente de carbono exógena.
• Mejora genética de la cepa.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
10 g de suelo en medio mínimoGLICEROL/NITRATO
SIEMBRA (24, 48, 72 H)
40 TIPOS DIFERENTES
PURIFICACIÓN
CULTIVO PURO
SELECCIÓN
Se analizan los 40 clones:Tiempo de generación (velocidad de crecimiento)Tolerancia a nitratoEficiencia de eliminación de nitrato
Klebsiella oxytoca
En glicerol
“Clon 15”
En etilenglicol
“Clon AH1”
Arthrobacter globiformis
NO3¯ NO2
¯ NH4+
N orgánico
Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa
nasA nasB
2e¯ 6e¯
Baja acumulación de nitrito
tiempo (h)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
10 20 30
nit
rito
(m
M)
NO3¯ NO2
¯ NH4+
Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa
nasA nasB
2e¯ 6e¯
10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20 30
tiempo (h)
amo
nio
(m
M)
tiempo (h)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
010 20 30
nit
rito
(m
M)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
010 20 30
tiempo (h)
amo
nio
(m
M)
NO3¯ NO2
¯ NH4+
Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa
nasA nasB
2e¯ 6e¯
nasB
KpnI KpnI
Plac oriT
pUPE2
9.552 kb
R R
Gen nasB de K. pneumoniae
EJEMPLO 2
DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DE TNT (para aplicar en fábrica de explosivos)Explosivo militar y civilAlmacenado desde la segunda guerra mundial (Alemania, USA). En desuso.Pérdidas en los embalajes de almacenamiento, desertización-
Enriquecimiento y aislamiento de cepas (C1S1, Clon A)Selección de C1S1. TNT sólo es fuente de nitrógeno.Selección de ClonA (crecimiento rápido en TNT).
CaracterizaciónFuentes de carbono óptima.Temperatura.Requerimiento de oxígeno.Crecimiento con TNT.Actividades enzimáticas.Crecimiento en aguas de la factoría.Metabolismo.
Cultivo contínuo
No utiliza el TNT como fuente de carbono.Construcción de cepas híbridas
Clon A
C H 3
NO2NO2
NO2
TNT
CO2 + H2O
NO2¯
CH3
tolueno
Plásmido TOL de P. putida
CH3
tolueno
COOH
benzoato
OH
OH
catecol
CO2 + H2O
Transferir plásmido TOL al Clon A
C H 3
NO2NO2
NO2
TNTNO2¯
CH3
tolueno
COOH
benzoato
OH
OH
catecol
CO2 + H2O
ClonA + TOL
Cre
cim
ien
to
ClonA
TNT como fuente de C y N
Tiempo (días)
0 3 6 9
EJEMPLO 3
MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOSObjetivo: Conseguir una cepa capaz de degradar p-nitrotolueno
Las Enzimas de la ruta upper de degradación de tolueno de P. putida TOL puede llevar el p -nitrotolueno hasta nitrobenzoato.
El activador XylR NO reconoce a p-nitrotolueno como activador.Ruta meta NO puede llevar el nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.
Necesitamos:Alterar el regulador XylR para que SÍ reconozca p-nitrotolueno y sea capaz de poner en marcha la ruta. Encontrar el segundo segmento de la ruta: nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.
CH3
Nitro-tolueno
NO2
+Pr1 Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu
+ -
tolueno
+Ps2
3-metilbenzoato
Pm
upper meta
Reguladores
+
pWW0 (ruta meta)
P. putida mt-2
ELEMENTO DE CONTROL:Regulación metabólica en TOL
4NT
A B C D
85Pro Ser
135Asp Asn
172Glu Lys
Mutagénesis química
Regulador - 3-MBA 4NT
XylR 180XylR6 1150XylR49 1500XylR7 150
105019002600900
11021103380 400
CH3
NO2
CH2OH
CH3
P. putida 2440(pWW0Pm)
CH3
NO2
CH2OH
NO2
CHO
NO2
COOH
NO2
P. fluorescens 410PRif(pWW0Pm) + xylR6
COOH
NO2
CH2OH
NO2
CH3
NO2
CHO
NO2
COOH
NO2
COOH
NHOH
NH3
COOH
OHOH
CO2+H2O
Rotura delanillo
X
P. fluorescens410P
COOH
NHOH
NH3
COOH
OHOH
CO2+H2O
COOH
NO2
Rotura delanillo
EJEMPLO 4
Ruta TOL de P. putida puede degradar muchos derivados alquilados del benzoato, pero no etilbenzoato.
Las limitaciones son:El etilbenzoato NO es efector del regulador XylS no se activa la ruta.La catecol 2,3-dioxigenasa se INACTIVA con etilcatecol.
EstrategiaMutagenizar el regulador XylS para que pueda reconocer etilbenzoatoMutagenizar la cateco 2,3 dioxigenasa para que pueda “romper” etilcatecol
EXPANSIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADAR ALQUILAROMÁTICOSEL CASO DEL ETILBENZOATO
COOH
CH2CH3
xylS*
xylE*
COOH
CH3
3-metilbenzoato
Efector +Sustrato
CH3
OHOH CO2
+H2O
COOH
CH2CH3
No es efectorNo es sustrato
CH2CH3
OHOH
COOH
CH2CH3 xylE
COOH
CH2CH3 CH2CH3
OHOH CO2
+H2O
E HPm
pJLR100Ap
E H
Ap TetpBR322
EcoRI-HindIIILigación
E HPm
pJLR200
TetAp
Km
xylSpNM 185
Ap
Pm
Tc
pJLR 200
E.coli (pNM 185) (pJLR 200)
Ap
Pm
Tc
pJLR 200
xylS4
Km
pRD4
Ap,Km,Tc,4EB,EMS
.
..
..
...
Ap,Km Ap,Km,Tc Ap,Km,Tc,4EBTc-r en 3MB
Tc-s en 4EB
L
pERD4
KmxylS4
DE
pWW0
P.putida (pWW0) (pRD4)
.
..
.. .
.
pWW0
D LE*
pERD4
KmxyylS4
P.putida (pWW0-EB)(pRD4)
4EB,EMS
4EB 3MB 4MB
3MB+4MB+4EB-
EJEMPLO 5
COMPETENCIA ENTRE CEPA MANIPULADA Y CONSORCIODegradación de naftalenosulfonato
Se pretende comparar la eficiencia de un consorcio con la de una cepa manipulada genéticamente.
Uno de los miembros del consorcio degrada naftaleno sulfonato hasta salicilato.El otro miembro del consorcio lleva salicilato hasta el ciclo de Krebs.La cepa manipulada puede mineralizar naftalenosulfonato
La velocidad degradadora de ambos sistemas es equivalente.
¿Cómo compiten?
CO2 + H2O
COOH
OH
OH
OH
OH
CHOCOOH
SO3H
OHOH
COOH
OH
Sphingomonas BN6
P. putida NCIB9816
Consorcio
Cepa manipulada
pWW60-3026
Sphingomonas BN6
Tiempo (días)
Nº
de
célu
las
1010
BN6
Cepa manipulada
P. putida
109
108
107
106
0 5 10 15
COMPETENCIA EN QUIMIOSTATO
B13B13Reclutamiento de labenzoate 1,2-dioxygenase
B13B13Reclutamiento adicional de la -lactona isomerase
3CB 4CB 4MB
3CC
OAA
TCA
3CB 4CB 4MB
3CC 4CC 4MC
OAA OAA -L
TCA TCA TCA
-L
3CB 4CB 4MB
3CC 4CC 4MC
OAA OAA º
TCA TCA
-L
CONSTRUCCIÓN DE CEPA CAPAZ DE DEGRADAR CLORO-Y METIL BENZOATOS
EXISTEN PROBLEMAS LEGALES
PARA LA LIBERACIÓN AL MEDIO
DE ORGANISMOS MANIPULADOS
GENÉTICAMENTE
NECESITAMOS SISTEMAS DE CONTROL
SISTEMAS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE
• Construcción de cepas de Pseudomonas putida portadoras de un sistema activo de contención biológica
• Caracterización del proceso de lisis en P. putida tras la inducción de la muerte celular
• Validación en microcosmos de las cepas construídas
OBJETIVO: queremos que la cepa manipuLada desaparezca una vez que ha cumplido su función: contención biológica.
ESTRATEGIA: diseñar un sistema de muerte programadaBuscar elemento matadorElegir elemento regularEnsamblar los componentes e introducirlos en la cepa de interés.
ELEMENTO REGULADOR ELEMENTO MATADOR
PGen regulador Gen letal
Señalexterna
SISTEMA ACTIVO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA
P
La proteína reguladora impide la expresión del gen letal
+
GENES MATADORES
• Nucleasas
• Proteínas tipo porinas
• Gen gef de E. coli
• Colapso del potencial de membrana
• Liberación de ARNasa periplásmica
• Permeabilización a iones Mg2+
• Gen E del fago X174
• Formación de túnel transmembrana
• Liberación del contenido citoplásmico
Gen gef
+Pr1 Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu
+ -
tolueno
+Ps2
3-metilbenzoato
Pm
upper meta
Reguladores
+
pWW0 (ruta meta)
P. putida mt-2
ELEMENTO DE CONTROL:Regulación metabólica en TOL
NO
SI
Supervivencia
Genmatador
ELEMENTO MATADOR
SISTEMA REGULADO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA
xyl S lac I PlacPm lac I
S
Placxyl S
S S3MB
I I I
I I
-+
ELEMENTO REGULADOR
Pm lac I
lacI
ori
nic
mob
Km
xylS
Pm
pCC10214.7 kb
2
R
P
gefO
R6K
RP4
Ap
tnp
I
Tc
pMCC297500 bp
ori
oriT
A1-04/03
R
R
ENSAMBLAJE DE LOS ELEMENTOS
Cepa de P. putida Elemento controlElemento matador
PA1-04/03 TcRgef
PmlacI
ori
nic
Km
xylS
pCC10214.7 kb
2
R
mobTelPA1-04/03R
genE
EEZ30
CMC12
Cepas contenidas biológicamente
00.01
0.1
1
0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20 24
Cepa control P. putida CMC12
Cre
cim
ien
to celu
lar (D
O6
60
nm
)
glucosa
glucosa
3MB
3MB
P. putida P. putida CMC4 (pWW0)CMC4 (pWW0) P. putida P. putida CMC12CMC12
P. putida P. putida CMC12CMC12
OTRAS TÉCNICAS DISPONIBLES
Ingeniería de proteína
DNA shuffling
Sistemas asociados a la raíz (rizorremedio)
Sistemas asociados a biofilms
EN TODOS LOS CASOS, HAY QUE CONOCER EL FUNCIONAMIENTO DE LOS SISTEMAS