PRÁCTICA #1 Elaboración de un cariotipo 17-09-2013 Resumen Los cromosomas son el objeto de estudio de la Citogenética, por esto, se han desarrollado una serie de herramientas para el estudio de estas estructuras, como lo son los cariotipos. Estos permiten visualizar el patrón cromosómico de una especie expresado a través de un código, permitiendo dilucidar las alteraciones cromosómicas que pudiesen existir, tales como translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones, que pueden resultar en desórdenes genéticos. Tres extendidos cromosómicos de diferentes especies fueron analizados, utilizando los índices cromosomal, braquial y de homología; se determinó que pertenecían a un caballo doméstico (Equus caballus), un humano (Homo sapiens) y un mono capuchino (Cebus capucinus), disponiendo de su patrón de bandeo y número de cromosomas; se encontraron algunas anomalías cromosómicas y se representaron los respectivos ideogramas. Palabras claves: Citogenética, cariotipo, cromosoma, anomalía cromosómica, poliploidía, aneuploidía. 1. INTRODUCCIÓN La citogenética es el estudio de la estructura y las propiedades de los cromosomas, sus comportamientos durante la división de la célula somática (mitosis) y la división de las células germinales durante la reproducción (meiosis), así como su influencia sobre el fenotipo y los factores que provocan estos comportamientos (Hare & Singh, 1979). Los cromosomas, como vehículo genético, proveen la materia prima para muchas investigaciones genéticas, desde la construcción de mapas de genes y modelos de la organización cromosómica, hasta estudios sobre la función y disfunción de genes (Gosden, 1994). Es por esto, que ha debido desarrollarse una serie de herramientas para el estudio de estas estructuras, como lo son los cariotipos. Un cariotipo es un perfil organizado de los cromosomas de un organismo, donde estos son numerados según su tamaño de mayor a menor, que permite la visualización de alteraciones cromosómicas, tales como translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones, que pueden resultar en desórdenes genéticos. 1
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PRÁCTICA #1Elaboración de un cariotipo
17-09-2013
ResumenLos cromosomas son el objeto de estudio de la Citogenética, por esto, se han desarrollado una serie de herramientas para el estudio de estas estructuras, como lo son los cariotipos. Estos permiten visualizar el patrón cromosómico de una especie expresado a través de un código, permitiendo dilucidar las alteraciones cromosómicas que pudiesen existir, tales como translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones, que pueden resultar en desórdenes genéticos. Tres extendidos cromosómicos de diferentes especies fueron analizados, utilizando los índices cromosomal, braquial y de homología; se determinó que pertenecían a un caballo doméstico (Equus caballus), un humano (Homo sapiens) y un mono capuchino (Cebus capucinus), disponiendo de su patrón de bandeo y número de cromosomas; se encontraron algunas anomalías cromosómicas y se representaron los respectivos ideogramas.
La citogenética es el estudio de la estructura y las propiedades de los cromosomas, sus comportamientos durante la división de la célula somática (mitosis) y la división de las células germinales durante la reproducción (meiosis), así como su influencia sobre el fenotipo y los factores que provocan estos comportamientos (Hare &Singh, 1979). Los cromosomas, como vehículo genético, proveen la materia prima para muchas investigaciones genéticas, desde la construcción de mapas de genes y modelos de la organización cromosómica, hasta estudios sobre la función y disfunción de genes (Gosden, 1994). Es por esto, que ha debido desarrollarse una serie de herramientas para el estudio de estas estructuras, como lo son los cariotipos. Un cariotipo es un perfil organizado de los cromosomas de un organismo, donde estos son numerados según su tamaño de mayor a menor, que permite la visualización de alteraciones cromosómicas, tales como translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones, que pueden resultar en desórdenes genéticos. Existe un cariotipo característico para cada especie (The University of UTAH). Una ventaja de los cariotipos es la posibilidad de elegir entre diferentes técnicas de bandeo, lo que permitirá la
observación y diferenciación de regiones específicas del cromosoma, dependiendo del objetivo del estudio; por ejemplo, las bandas C localizan las regiones heterocromáticas del cromosoma, permitiendo observar la región centromérica entre otras con alta repetición (Pardue& Gall, 1970); mientras que las bandas G localizan regiones poco activas transcripcionalmente, que contienen una alta proporción de AT (Tecnología Médica). A pesar del diseño y desarrollo de nuevas técnicas de bandeo con mayor resolución, para análisis rutinarios la técnica de bandeo G sigue siendo la más utilizada y aceptada mundialmente (Seabright, 1971).
En este trabajo, se realizó y analizó el cariotipo de 3 especies diferentes: Humano (Homo sapiens), caballo (Equus caballus) y mono capuchino (Cebus capucinus). El cariotipo humano normal consiste en 23 pares de cromosomas, siendo autosomas los primeros 22 y sexuales el último par. Como lo es normal en los mamíferos, las hembras humanas generalmente tienen 2 cromosomas sexuales X, mientras que los machos presentan un cromosoma X y uno Y. Los cromosomas humanos pueden ser separados en 7 grupos según su longitud y la posición de su centrómero activo: El grupo A consiste en los cromosomas 1, 2 y 3, los cuales tienen mayor tamaño y cuyo centrómero se ubica cerca del centro; el grupo B
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contiene a los cromosomas 4 y 5, que son submetacéntricos; el grupo C consiste en los cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y X, que tienen un tamaño mediano y son metacéntricos o submetacéntricos. El grupo D contiene a los cromosomas 13, 14 y 15, los cuales son acrocéntricos y contienen satélites; el grupo E consiste en los 16, 17 y 18, que son relativamente cortos; el grupo F con los cromosomas 19 y 20, que son metacéntricos cortos. Por último, el grupo G contiene a los cromosomas 21 y 22, que son subtelocéntricos y también contienen satélites. El cromosoma Y no contiene secuencias satélite (Laux, 2002).
El caballo es un mamífero perisodáctilo domesticado de la familia de los équidos. Es un herbívoro solípedo de gran porte, cuello largo y arqueado, poblado por largas crines(Wilson & Reeder, 2005). El cariotipo estándar de un caballo contiene 32 pares de cromosomas. Más del 90% de las aberraciones cromosómicas de los caballos se presenta en el par sexual. Las yeguas con cromosomas sexuales XY son bastante comunes en algunas razas de caballos, lo que les produce infertilidad; también se produce un buen número de yeguas con cromosomas sexuales XO o XXX(Christensen).
El Cebus capucinus es un primate perteneciente a la familia Cebidae del genero Cebus y que son mejor conocidos como maiceros. Los Cebus capucinus suelen ser animales de tamaño medio que pesan entre 1.5-4 kg. La mayor distribución se encuentra en la región oriente de la cordillera oriental llegando a la zona de las guyanas y al oriente del Ecuador, Perú y Bolivia y al norte de Paraguay y Argentina. Su cariotipo normal contiene 27 pares de cromosomas. (Defler, 2003; Carnegie, Fedigan, & Ziegler,2011). Los estudios en cariotipos de los primates pertenecientes a Cebus, han sido de mucha ayuda en diversas ramas de la biología pues se considera este género como la muestra más antigua que describe a la perfección algunas técnicas de digestión enzimática y evidencia la alta presencia de heterocromatina que ha permitido evaluar el desarrollo de su composición. (Martínez et al. 2002). En el transcurso del presente trabajo se evaluaron caracteres correspondientes a la especie Cebus capucinus encontrando gran cantidad de polimorfismos en sus cromosomas.2. MATERIALES Y MÉTODOS
Para realizar esta práctica se utilizaron tres imágenes (Figura 1, 2, y 3) de un frotis de cromosomas de un individuo desconocido, proporcionadas por la monitora.
Figura 1. Extendido cromosómico #1 (foto DSCN9303)
Figura 2. Extendido cromosómico #2 (foto29)
Figura 3. Extendido cromosómico #3 (foto 4)
Para elaborar correctamente el cariotipo, se contó primeramente el número de cromosomas con el fin de determinar de qué organismos se trataba y si el individuo al que correspondía la imagen presentaba alguna anomalía cromosómica numérica. Luego se localizó el centrómero de cada uno de ellos, y con esta información se halló el índice centromérico (IC), el índice braquial (IB), la longitud relativa (Lr) y el índice de homología (IH) (Ecuaciones 1, 2, 3, 4).
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IC i=Lp ,i
LT ,i
× 100(1)
IBi=Lq ,i
Lp , i
(2 )
IH i=Lp , i
LT ,i
Lq ,i(3)
Lr , i=LT ,i
Lthf
x 100(4)
Donde Lp es la longitud del brazo corto del cromosoma y Lq la del largo. Estas medidas fueron tomadas con el programa GIMP. Con los valores de IC e IB se clasificaron morfológicamente los cromosomas según la tabla 1.
Basados en los datos obtenidos, y en la observación de cada cromosoma, se conformaron las parejas, y posteriormente se realizó el ideograma del cariotipo resultante.
3. RESULTADOS
Extendido #1 Los resultados de las mediciones de cada brazo de los cromosomas de este extendido, pueden verse en el anexo 1.1, donde se muestran además los índices calculados y la clasificación morfológica de los cromosomas. Según el número de cromosomas obtenido, el cariotipo del extendido #1 es de un Equus caballus, 2n=64 (XX). En este anexo puede verse también el cariotipo obtenido y su respectivo ideograma (anexo 1.2).
Extendido #2 Las medidas obtenidas a partir de los cromosomas de este extendido pueden verse en el anexo 2.1, además, se muestran los cálculos de los índices y la clasificación
cromosómica morfológica. Según lo obtenido, el cariotipo del extendido #2 corresponde a Homo sapiens 2n=47 XXX, rob (13; 14) (q10; q10), es decir, con translocación Robertsoniana y síndrome del Triple X. Igualmente, el anexo 2 contiene el cariotipo propuesto y su respectivo ideograma (anexo 2.2).
Extendido #3 Los resultados para los parámetros de longitud y los cálculos derivados de los mismos se encuentran en el anexo 3.2. De los resultados anteriores y luego de análisis de bandeo y similitud se consiguió obtener un cariotipo propuesto, de un Cebus capucinus hembra como el que se muestra en el anexo 3; además, el anexo 3.3 muestra el ideograma obtenido.
4. DISCUSIÓN
En el extendido #1 se contaron 64 cromosomas con bandas R-replicativas, número que coincide con el de la especie Equus caballus (caballo domestico); al comparar los cromosomas del extendido con los parámetros establecidos por la ISCNH (1997), pudimos corroborar sin duda alguna la primera suposición eliminando la posibilidad de la existencia de una aneuploidía.Debido a la poca calidad de la imagen, el ideograma se construyó suponiendo tinción homogénea, pero aun así el bandeo fue muy útil a la hora de identificar los pares homólogos. Para la clasificación morfológica de los cromosomas, se utilizó el IC, ya que parece ser más apropiado que el IB en este caso particular y aunque algunos pares cromosómicos se encuentren en diferentes grupos, en todos los casos los índices son bastante similares. Creemos que la única anormalidad existente en este cariotipo es un polimorfismo en el primer cromosoma del par 27, aunque no tomamos el riesgo de afirmarlo considerando el estado de la foto.
Para la organización del cariotipo a partir de la imagen del extendido #2 inicialmente se hizo un conteo del número de cromosomas en la imagen, dando como resultado un total de 46 cromosomas, lo que inicialmente permitía pensar que se trataba de un ser humano normal, luego se procedió a calcular el IC e IB para poder clasificar por grupos los cromosomas, los resultados del análisis de índice centromérico y braquial mostraron que varios de los cromosomas no concordaban con la clasificación de un cariotipo de un humano normal con lo cual se empezó a suponer que íbamos a encontrar algún tipo de anomalías cromosómicas en el cariotipo de este individuo. Con la
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información inicial de IC e IB, se procedió a “emparejar” de forma manual los cromosomas para ir formando el cariotipo, se buscaron primeramente los cromosomas sexuales para lograr identificar el género del individuo y se encontraron 3 cromosomas X, lo cual significaba que teníamos el extendido cromosómico de una mujer con síndrome de triple X (superhembra) (Alteraciones DelCariotipo). Este síndrome se describe según la nomenclatura como Homo sapiens 2n=47 XXX, pero nuestro extendido era 2n = 46, por tanto aunque ya teníamos identificada una aneuploidía sexual, debíamos tener además alguna alteración cromosómica que disminuyera el número de cromosomas; una translocación Robertsoniana (Chang & Chao, 2013) de algún cromosoma acrocéntrico, pues en este tipo de translocaciones se produce una fusión de cromosomas, se pierden los brazos cortos de dos cromosomas no homólogos y los largos se unen por el centrómero, formando un cromosoma único. Esta tipo de translocación afecta mayoritariamente a los cromosomas 13, 14, 15, 21,22 y cuando se presenta, los brazos cortos se suelen perder en divisiones celulares posteriores. Como los portadores de estas translocaciones pierden material genético no esencial, son fenotípicamente normales, pero sólo tienen 45 cromosomas en cada célula. Revisando las bandas de los cromosomas acrocéntricos del extendido, se encontró que teníamos específicamente una translocación Robertsoniana de los cromosomas 13 y 14 (figura 4). Detectadas finalmente todas las anomalías del extendido dado, se procedió basándonos en las bandas, el IC, el IB y un poco de juicio empírico personal a organizar finalmente el cariotipo de este individuo dándonos como resultado lo siguiente: homo sapiens. 46, XXX, rob (13; 14) (q10; q10) (Nomenclatura de la citogenética humana), es decir, una mujer con trisomía del cromosoma X y una translocación Robertsoniana simétrica de los cromosomas 13 y 14 (ver anexo 2).
Figura 4. Trisomía de cromosoma X (izq.), translocación Robertsoniana (13; 14) (der)
La caracterización taxonómica de los individuos pertenecientes a Cebus ha sido un tema de bastantes
investigaciones y que ha dado pie a grandes debates debido a que en algunos territorios conviven varias especies pertenecientes a la misma familia y cuyos cambios en las características que los diferencian suelen ser leves: van desde una modificación en el color de la piel, o los ojos, hasta un cambio en el comportamiento según la edad. Los estudios citogenéticos han permitido realizar determinaciones filogenéticas, clasificaciones taxonómicas, diferencias entre los comportamientos de machos y hembras, entre otros muchos ítems relevantes en los estudio de primatología. Los genomas de los primates neotropicales han sido objeto de estudios a lo largo de muchos años, debido a la similitud que presentan muchos primates con los genomas humanos e inclusive han permitido hacer estudios y comparaciones citogenéticas en mamíferos como los roedores y equinos identificando las regiones repetitivas como los DNA satélites y determinar el incremento o la ausencia de estas regiones y la importancia que tendría dichas variaciones en las funciones biológicas (Nieves., et al., 2011; Nagamachi & Pieczarka,2008; RA, A, & VB, 2002).
La variabilidad genética de Cebus capucinus suele ser elevada, si se compara con el patrón de bandeo y la longitud cromosómica de otros primates de regiones tropicales cercanas al hábitat de esté (Ruiz, et al 2012).
5. CONCLUSIONES
El cariotipo muestra el número, forma, disposición de la cromatina, alteraciones numéricas y estructurales de los cromosomas. Es un método de diagnóstico y pronóstico importante para enfermedades y síndromes.
Es importante partir de un buen registro fotográfico de los extendidos cromosómicos para organizar el cariotipo, el uso de herramientas gráficas y material impreso facilita el apareamiento de los cromosomas homólogos. Es de gran importancia tomar muy bien las medidas para evitar confusiones más tarde.
REFERENCIAS
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Defler, T. (2003). Primates de Colombia. Conservación Internacional, 229- 236.Gosden, J. R. (1994). Chromosome analysis protocols. New Jersy: Humana Press.Hare, & Singh. (1979). Cytogenetics in Animal Reproduction. Slough. UK: Commonwealth Agricultural Bureaux.Laux, R. A. (2002). Health Line. Retrieved Septiembre 2013, from http://www.healthline.com/galecontent/karyotypeNagamachi, & Pieczarka. (2008). Phylogenetic studies of the genus Cebus (Cebidae-Primates) using chromosome painting and G-banding.
BMC Evolutionary Biology.Nieves., M., De Oliveira., E., Amaral., P., Nagamachi., C. Y., Pieczarka., J., Mühlmann., M., et al. (2011). nalysis of the heterochromatin of
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of Neotropical Mammalogy, 171-186.Seabright. (1971). A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet.Tecnología Médica. (n.d.). MENCIÓN MORFOFISIOPATOLOGÍA Y CITODIAGNÓSTICO. Retrieved Septiembre 3012, from
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Naranjo Elorza. S.E. Evaluación citogenética del caballo criollo colombiano, Universidad Nacional de Colombia,Facultad de Ciencias,Escuela de Biociencias, Medellín – Colombia. 2012
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ANEXO Anexo 1. Propuesta de cariotipo para el extendido #1 (Equus caballus 2n=64 (XX))
X 40,1 13,7 26,4 34,1645885 1,9270073 Submetacéntrico Submetacéntrico 9,01945137 12,4090979 X
X 42,5 16 26,5 37,6470588 1,65625 Submetacéntrico Metacéntrico 9,97647059 13,1517871 X
X 39 15,5 23,5 39,7435897 1,51612903 Submetacéntrico Metacéntrico 9,33974359 12,0686987 X
Anexo 2.2. Ideograma con bandas R-replicativas del set haploide humano. Representación de una translocación Robertsoniana y síndrome del triple X (superhembra) en cariotipo 2n= 46, XXX, rob (13; 14)
Anexo 3. Cariotipo de Cebus capucinus (2n=54 XX).
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Anexo 3.1. Extendido cromosómico Cebus capucinus con numeración aleatoria