ESPECIALIZACION EN BIOQUIMICA CLINICA MODULO DE METODOS DE SEPARACION ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL II ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS Presentado por: Hernán Mauricio Rivera Escobar PROFESOR: DR. JAIME CASAS MATEUS Bogotá, 16 de septiembre de 2008
ESPECIALIZACION EN BIOQUIMICA CLINICA MODULO DE METODOS DE SEPARACION ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL II
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS
Presentado por: Hernán Mauricio Rivera Escobar
PROFESOR: DR. JAIME CASAS MATEUS
Bogotá, 16 de septiembre de 2008
INTRODUCCIÓN
1. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LAS DISLIPIDEMIAS: Las dislipemias o dislipoproteinemias son trastornos en el metabolismo lipoproteico que pueden conducir a la aterosclerosis, a veces prematura, o a
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ESPECIALIZACION EN BIOQUIMICA CLINICA MODULO DE METODOS DE SEPARACION
ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL II
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS
ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS
Presentado por: Hernán Mauricio Rivera Escobar
PROFESOR: DR. JAIME CASAS MATEUS
Bogotá, 16 de septiembre de 2008
INTRODUCCIÓN 1. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LAS DISLIPIDEMIAS: Las dislipemias o
dislipoproteinemias son trastornos en el metabolismo lipoproteico que pueden conducir a
la aterosclerosis, a veces prematura, o a la pancreatitis. El aumento del colesterol-LDL y/o
disminución del colesterol-HDL predisponen al desarrollo de la aterosclerosis, así como
niveles de triglicéridos mayores a 1000 mg/dl incrementan el riesgo de pancreatitis.
Fenotipo Anormalidad lipídica Anormalidad lipoproteica Aspecto del suero
• Skoog Douglas A. Principios de Analisis Instrumental. Quinta Edicion. Editorial
McGraw Hill. 2001.
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS SERICAS EN PAPEL ACETILADO
INTRODUCCION
IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LAS PROTEINAS SERICAS. La electroforesis de proteínas séricas es un examen que mide aproximadamente los tipos de proteínas en la parte liquida (suero) de una muestra.
Frecuentemente se solicita para detectar e identificar proteínas monoclonales (una producción excesiva de una inmunoglobulina específica). También se solicita para detectar, diagnosticar y monitorizar el tratamiento y la evolución de condiciones asociadas a proteínas anómalas, incluyendo el mieloma múltiple y algunas otras enfermedades relacionadas.
El siguiente esquema ilustra los grupos y subgrupos de proteínas presentes en el humano:
Cada una de estas proteínas ocupa un espacio y cumple una función importante en el organismo del ser humano. A continuación se enuncian y se muestran las principales características.
ALBUMINA: Su principal función es la estabilización del volumen sanguíneo y la regulación del intercambio de fluidos vasculares.
Es responsable del 75% de la presión osmótica, transporta pigmentos, colorantes y drogas, contribuyendo a su excreción solubilidad y difusión a los tejidos. Casi todas las enfermedades muestran cierto grado de depresión de albúmina. Valores marcadamente bajos indican enfermedad hepática, renal o sistémica significativa.
Las proteínas individuales, con excepción de la albúmina, generalmente no se miden; sin
embargo, sí se miden las fracciones o grupos de proteínas. Los niveles de las fracciones
se pueden calcular aproximadamente mediante las mediciones de la proteína sérica total
y multiplicada por el porcentaje relativo de cada fracción de la proteína del componente.
ALFA 1 ANTITRIPSINA: Normalmente responsable por 70% de la fracción Alfa-1 Inhibe
a la tripsina; cuando está deprimida, los pacientes sufren enfisema pulmonar y cirrosis
juvenil
ALFA - 1 GLICOPROTEINA ACIDA. Normalmente es responsable por menos del 30%
de la fracción Alfa 1pero generalmente es responsable de la elevación de esta fracción.
Se encuentra elevada en enfermedades inflamatorias crónicas y degenerativas y muy
elevadas en varias enfermedades malignas.
ALFA - MACROGLOBULINA (α 2 M): Responsable del 25% del valor de la fracción alfa-
2 elevada en síndrome nefrótico, gastroenteropatías con pérdida de proteínas, cirrosis
hepática y diabetes mellitus.
HAPTOGLOBINA: Normalmente responsable por 25% del valor de alfa -2. La
anormalidad observada más comúnmente es una elevación de su valor. Es una proteína
de fase aguda, y se eleva inespecíficamente en presencia de inflamación, necrosis o
destrucción tisular. Sin embargo por evaluación del grado de elevación, cambios en otras
fracciones e historia clínica, se pueden inteligentemente considerar un diagnóstico
diferencial. Valores bajos se observan en anemias hemolíticas.
TRANSFERRINA: Normalmente un 60% de beta-1 importante en el transporte de hierro
y en la regulación y control de su absorción
BETA LIPOPROTEINA: Normalmente responsable por 60% de beta -2 Transporta la
mayor parte de lípidos séricos. Debido al bajo contenido proteico (25%), marcados
cambios reflejan poca alteración en el valor de Beta- 2.
IgA: Normalmente responsable del 12% del valor de gamma. Esta fracción puede
estimarse observando el grado de depresión entre beta-2 y gamma. Sus componentes
mejor conocidos son antitoxina, aglutininas, antibacterianas, isoaglutininas y
crioaglutininas. Se observa marcadamente elevada en cirrosis hepática y
moderadamente elevada en endocarditis bacteriana sub-aguda, tiroiditis autoinmune,
linfogranuloma venéreo y varias enfermedades del colágeno.
IgG: Normalmente responsable del 85% del valor de gamma. Una buena forma de
estimarla es observando la altura del pico gamma. Un poco a la derecha del centro.
Contiene anticuerpos contra bacterias, virus y toxinas. Elevación se observa en
numerosas enfermedades sub-agudas crónicas inflamatorias y proliferativas, incluyendo
neumonías, tuberculosis, cistitis, pielitis, colecistitis, endocarditis, procesos poli artríticos,
enfermedades del colágeno, triquinosis, mononucleosis infecciosa, psitacosis, tifus, sífilis
y hepatitis viral. Estas elevaciones se observan en todas las curvas y no deben
confundirse con aquellas que se muestran en una sola zona estrecha y que representa
gamopatías monoclonales.
HEMOPEXINA, C´3, IgM: Muchas otras proteínas afectan la apariencia de la pendiente
de los picos, algunas de ellas son hemopexina, C´3 eIgM.
Como se menciono anteriormente, las fracciones proteicas del suero que se separan
por electroforesis en acetato de celulosa son la albúmina y las globulinas α1, α
2, β y γ.
En condiciones normales, los porcentajes de cada fracción que se obtiene con el
análisis densitométrico de las tiras, son los siguientes:
PROTEÍNAS SÉRICAS %
Albúmina 53-67
Globulinas α1 2,5-5
Globulinas α2 7-13
Globulinas β 9-14
Globulinas γ 10-21
1. ILUSTRAR EL PROCESO DE SEPARACION ELECTROFORETICA DE PROTEINAS SERICAS SOBRE PAPEL ACETILADO.
MATERIAL Y REACTIVOS Material - Tiras de acetato de celulosa - Placa de vidrio - Papel de filtro - Aplicador - Cubeta de electroforesis - Pinzas - Fuente de poder Reactivos -Tampón: ácido bibarbiturico + H2O dla - pH=8,6
5.4019 g dietilbarbiturico sódico 300 ml acido barbitúrico H2O destilada, desionizada -Solución de tinción: Rojo ponceau -Solución transparentadora: ácido acético en metanol 15% (v/v) -Solución de lavado: acido acético en agua, 5% V/V -Suero de pacientes de Hospital Universitario San Ignacio l. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PREPACION
Fabricar la solución tampón (pH=8.6)
Agregar 30 ml de sln tampón hasta el tope
en la cámara electroforética
Cortar una tira de acetato de celulosa por
la mitad
Sumergir la tira en la solución tampón 10
minutos con la parte opaca hacia arriba
Retirar y quitar el exceso de humedad con
papel filtro
Colocar la tira en la cámara sobre el
armazón y tensar con las pinzas
Medir 10ul de suero (muestra o control) y
patrón (albumina 6% p/v) y descargar
(sembrar) en cada pozo en la cámara de
aplicación
Tomar las muestras con el aplicador
Sembrar sobre la tira de papel tensada
sobre el armazón de la cámara
electroforética
Verificar que los extremos de la tira queden
sumergidos en el buffer
EJECUCION, TINCION, Y TRANSPARENTACION
Conectar los electrodos y ajustar los
tiempos (con el timer) y voltaje, esperar 20
minutos
Una vez transcurrido el tiempo, quitar el
voltaje y desconectar
Retirar la tira del armazón, y retirar el
exceso de buffer ( con papel de filtro)
Sumergir la tira en el colorante rojo
ponceau por 10 minutos, y se debe retirar
el exceso con papel de filtro
Sumergir la tira en una solución de lavado
(HAc 5% V/V), durante 10´, agitando para
remover el exceso de colorante y secar con
papel de filtro
Retirar el proceso 3 veces en total
Transparentar con el acido acético 15%
V/V en metanol, por 20 segundos
Colocar sobre placa de vidrio, y secar a
60°C, por 5-10´
Realizar el densitometrado de las bandas.
2. EXPLICAR EL FUNDAMENTO DE LA SEPARACION ELECTROFORETICA DE PROTEINAS SERICAS SOBRE PAPEL ACETILADO
La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica. En el transporte electroforético, a la fuerza del campo eléctrico se opone la resistencia viscosa del medio, produciéndose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partículas. Cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) Carga eléctrico 2) Tamaño 3) Intensidad del campo eléctrico 4) Temperatura del medio Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO- y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoeléctrico (pI ó pHI), la proteína tiene carga neta cero. Por debajo de pI las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima del pI negativamente.
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. Para esta técnica se pueden utilizar tiras de acetato de celulosa, que son químicamente más homogéneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teñidas o reveladas, se puede realizar cálculo porcentual de las distintas fracciones utilizando un densitómetro, pero también se puede hacer por elusión. El acetato de celulosa es un termoplástico de dureza media alta y brillante, es incoloro,
presenta alta transparencia debido a que es amorfo. Tiene buena estabilidad a los rayos
UV y resistencia química moderada. Debido a que es altamente higroscópico puede tener
dificultades de cambios dimensionales en piezas moldeadas.
Las aplicaciones incluyen monturas de gafas, mangos de herramientas y pinceles. Las
películas se emplean para aplicaciones gráficas y artísticas principalmente.
La electroforesis y la cromatografía en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo,
mientras que la electroforesis separa las moléculas fundamentalmente en función de su
carga, la cromatografía lo hace en base a una amplia gama de características (ejemplos,
solubilidad en la cromatografía de reparto, polaridad en la de adsorción, carga en la de
intercambio iónico, etc.).
A continuación se muestra la formula estructural del acetato de celulosa.
Acetato de celulosa
Electroforesis análogas a las de proteínas y lipoproteínas, utilizando como soporte el
acetato de celulosa, se han aplicado también para la separación de isoenzimas del lactato
deshidrogenasa y la creatín-quinasa. En el siguiente esquema, se resume el proceso:
La electroforesis de proteínas séricas mediante este método, es muy útil en los
laboratorios clínicos por su fácil manipulación y su rápido desarrollo.
Mayor movilidad Mayor carga negativa Mayor movilidad
RESULTADOS DE LA PRÁCTICA
A continuación los resultados de 3 pacientes (M1, M2 y M3) y el patrón de albumina (P)
cada uno con su corrido electroforético.
De acuerdo a lo revisado anteriormente, en la electroforesis de proteínas séricas, la
ALBUMINA al tener punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más carga negativa y
avanza más rápido quedando más cerca del polo positivo.
3. PERFILES ELECTROFORETICOS DE PROTEINAS EN SUERO DE ADULTOS SANOS.
Las proteínas de suero se pueden separar mediante esta técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (Albúmina) y 7,4 (Gamma-globulinas). Al realizar la electroforesis con un tampón de pH = 8,6, todas las proteínas del suero tendrán carga negativa.
M1 M2 M3 P
(+)
(-)
La albúmina, al tener el punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más carga negativa y avanza más rápido, quedando más cerca del polo positivo que la gamma-globulina, que migran muy poco por ser el pH próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan situadas entre estas dos.