UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRSFACULTAD DE INGENIERAINGENIERA
AMBIENTALGESTIN II/2013
INGENIERA BIOQUMICAPRQ-216 L
INFORME DE PROYECTO
DETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL RUMENDE LA VACA QUE
DEGRADAN CELULOSA
Docente: M. Sc. Ing. Virginia Rojas Mercado
Estudiantes: Aguilar Coria Ximena Gabriela Marin Antezana
Katherine Stephanie
Fecha: 4 de Diciembre
INFORME DE PROYECTODETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL
RUMEN DE LA VACA QUE DEGRADAN CELULOSA
1. ANTECEDENTES
La celulosa es el principal componente de la pared celular de
los vegetales, es el elemento ms abundante de la biomasa terrestre,
y es uno de los materiales ms utilizados por el hombre desde los
tiempos remotos. Esta fibra natural, es utilizada como materia
prima para la fabricacin de diversos objetos de uso cotidiano, por
lo que se producen grandes cantidades de residuos con este
material; se estima que la biosfera recibe hasta 1015 toneladas
anuales de celulosa en forma de desechos biolgicos.La celulosa no
es digerible ni aprovechable por el hombre, sin embargo, los
rumiantes que son animales fibrosos, pueden digerir grandes
cantidades, gracias a la accin de microorganismos como bacterias y
hongos presentes en el rumen. Estos microorganismos son capaces de
degradar los componentes fibrosos, principalmente celulosa,
hemicelulosa y pectina, a travs de diferentes mecanismos, que de
manera efectiva los convierte en compuestos sencillos como cidos
grasos y alcoholes.El aislamiento e identificacin de
microorganismos, con actividad celuloltica representan un
importante recurso, para la disminucin del impacto ambiental
producido por los residuos vegetales, y la generacin por medio de
stos residuos, de productos fermentables como el etanol, que podra
convertirse en un biocombustible.Siendo una gran contribucin para
el desarrollo sostenible de los biocombustibles, a travs del
aprovechamiento de residuos.
2. OBJETIVO
2.1. Objetivo General:
Aislar las principales bacterias del rumen de bovinos
procedentes de mataderos del departamento de La Paz que degradan
celulosa.
2.2. Objetivos Especficos:
Obtener muestras de rumen bajo condiciones estriles para
posteriormente utilizarlas como punto de partida de este proyecto.
Preparar y utilizar agares especficos para el aislamiento de los
microorganismos objetivo. Aislar los microorganismos a partir del
rumen de vaca para causar una mayor degradacin de aserrn.
3. JUSTIFICACIN
Actualmente en el mundo se procesa una gran cantidad y
diversidad de residuos de celulosa, como resultado de actividades
en la agricultura y la industria. Entre los residuos con alto
contenido de celulosa encontramos los generados por explotacin
forestal como el aserrn y de explotacin agrcola como la quinua,
estos residuos a pesar de ser altamente estables y poseer un gran
potencial energtico, no tienen uso alternativo a gran escala.Los
mtodos actuales de disposicin de los residuos forestales, el largo
periodo para degradarse y el inadecuado manejo, generan un alto
impacto en el ambiente.Lo mencionado anteriormente, es un
importante argumento para el desarrollo y estudio de alternativas,
que permitan identificar mtodos para degradar y aprovechar la
celulosa de los residuos. El uso de microorganismos con actividad
celuloltica, constituye una opcin viable en la solucin de la
problemtica de los residuos vegetales no aprovechados.
4. PROCEDIMIENTO
4.1. Toma de muestras
Las muestras de lquido ruminal se recolectarn en envases
estriles de 50 ml. y jeringas de 20 ml. Se recolectaran en forma
aleatoria cuatro muestras de lquido ruminal fresco evitando tocar
las paredes del estmago y trasladadas inmediatamente al laboratorio
del IIDEPROQ.
4.2. Diagrama de Flujo
El aserrn debe tener un tamao menor a 2 mm.Segn especificaciones
anterioresEn tubos ependorfEn tres envases esterilizados de 100ml.
Directamente del estmago del vacuno.
Introducir las cajas Petri a la bolsa y sellar bienSolo aquellas
que presenten crecimiento, si fuese as esperar 24 horas ms
5. MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales
CANTIDADMATERIALCARACTERSTICA
20Caja Petri
1Incubadora
1Termmetro de Mercurio0-100 C
1Esptula
1Varilla de Vidrio
3Matraz Erlenmeyer con tapa rosca500 ml
1Matraz aforado250 ml
2Matraz aforado100 ml
1Vidrio reloj
5Vasos de precipitado100 ml
1Recipiente hermticamente cerrado
2Cepillos
1Hornilla Elctrica
2Pipeta graduada10 ml
2Pipeta graduada1 ml
1Autoclave
1Garrafa
1Piseta
1Balanza elctrica
10Tubos ependorf15 ml
1Centrifugadora
Reactivos
REACTIVOS
alcohol
Agua destilada
Aserrn
Agar- Agar
cido ctrico
Bicarbonato de sodio
Muestras de lquido de Rumen de Vaca
Triptosa
Cloruro sdico
Infusin de corazn
Agua peptonada
Papel filtro
6. CRONOGRAMA
ACTIVIDAD
l23456789
JVSDLMMJV
Obtencin del lq. ruminal
Filtrado del lq. ruminal y esterilizacin.
Esterilizacin del aserrn
Esterilizacin de tubos
Preparacin del agar
Incubacin del medio de cultivo
Aislamiento de las cepas obtenidas
Incubacin de cepas aisladas en cajas Petri con papel filtro
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da
COLORDA
Trabajo
Das no hbiles
Das de incubacin
7. VARIANTES DEL PROCESOPrimera etapa de aislamiento Los cambios
que se realizaron en la preparacin del medio fueron:Para la
preparacin de 250 ml de medio se utilizaron los siguientes
reactivos en las siguientes relaciones:
ReactivoMasa utilizada (g)
Infusin de cerebro y corazn9.25
Triptona0.185
Agar-Agar1.0
NaCl0.0925
Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante
15 minConjuntamente se autoclabaron 50 g de aserrn en un embase
separado.
Preparacin del inoculoPara la preparacin del inculo se tomaron
muestras del lquido ruminal de vaca, provenientes del altiplano (La
Paz, Oruro, de 3 animales, estas muestras fueron tomados en frascos
de vidrio color mbar previamente esterilizados.Las muestras tomadas
se mantuvieron a temperaturas de 20 C en frascos hermticamente
cerrados durante 3 das, pasado este tiempo se procedi a centrifugar
con la ayuda de tubos Eperndorf a 250 rpm durante 15 min. El lquido
obtenido libre de slidos suspendidos se utiliz como inoculo.
Volumen del inoculo (ml)10 ml
Preparacin del CO2Para obtener un medio anaerobio se utilizaron
las siguientes cantidades de los compuestos:Reactivocantidad
cido ctrico3.46 g
Bicarbonato de sodio4.54 g
Agua destilada20 ml
Segunda etapa de aislamiento
Los cambios que se realizaron en la preparacin del medio
fueron:Para la preparacin de 150 ml de medio se utilizaron los
siguientes reactivos en las siguientes relaciones:
ReactivoMasa utilizada (g)
Infusin de cerebro y corazn3.5
Triptona0.162
Agar-Agar0.7999
NaCl0.0112
Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante
15 minSe procedi tambin a la preparacin de los papeles filtro para
nueve cajas petri en vez del aserrn como fuente de celulosa.
Preparacin de Agua PeptonadaPara la segunda etapa de aislamiento se
inocularon los m.o. hallados a profundidad, y para enjuagar los
mismos se realiz la toma de muestra con agua peptonada de la cual
se utiliz las siguientes cantidades:Para un volumen de 100 ml:
ReactivoMasa utilizada (g)
Agua Peptonada1.5
8. CLCULOSDATOS OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE Primera etapa de
aislamientoCantidades del medio y del aserrn utilizados por caja
petri:
ReactivoCantidad Utilizada
Volumen de medio25 ml
Masa de aserrn1 g
Solo 6 cajas petri tuvieron resultados Segunda etapa de
aislamientoLas cantidades utilizadas de medio y agua peptonada por
caja petri:
ReactivoCantidad Utilizada
Volumen del medio16 ml
Volumen de Agua peptonada10 ml
Las masas de los papeles filtro colocados en cada caja al inicio
y despus de la incubacin fueron:
# de Caja PetriMasa inicial del papel filtro (g)Masa final del
papel filtro (g)T (d)
10,80460,80461
20,92400,92281
30,80260,80212
40,81740,81652
50,82710,82712
60,73250,73253
70,84140,83703
80,89840,89803
90,89160,89123
PROCESAMIENTO DE DATOS En la segunda etapa se puede ver que la
masa consumida de celulosa fue:
# de Caja PetriMasa inicial del papel filtro (g)Masa final del
papel filtro (g)Masa consumida (g)
10,80460,80460
20,92400,92280,0012
30,80260,80210,0005
40,81740,81650,0009
50,82710,82710
60,73250,73250
70,84140,83700,0044
80,89840,89800,0004
90,89160,89120,0004
9. RESULTADOS Primera etapa: Foto 1. Medio de cultivo
inoculado
Foto 2. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr
Foto 3. Caja Petri despus de la incubacin
Foto 4. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr. que presenta
m.o. de color blanquecino
Segunda etapa:El promedio de lo consumido por el microorganismo
en funcin del tiempo es:
t (d)Masa de celulosa promedio (g)
10,0006
20,0005
30,0013
Grfica 1. Masa de celulosa consumida versus tiempo de
incubacin.
10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Primera etapa de
Aislamiento:Como se podr apreciar en las fotos 4 y 2 se puede
apreciar levemente la presencia de microorganismos de color
blanquecino, de forma esfrica los cuales se encuentran en
superficie, de las 10 cajas Petri sembradas con el lquido ruminal
solo se pudo detectar en 6 la presencia de microorganismos, las
restantes 4 no presentaron variacin alguna despus de la inoculacin
como se podr apreciar en la foto 3, la cual es idntica a la
fotografa 1. Segunda etapa de aislamiento:Como se podr apreciar en
los datos obtenidos la variacin de las masas de los papeles filtro
por tiempo se tiene los siguientes resultados:
Primer daEn el primer da se realiz la medicin de la masa de
papel de 2 cajas petri en las cuales se pudo apreciar que en la
primera caja no hubo consumo alguno de celulosa del papel filtro,
mientras que la segunda caja petri si hubo consumo de de
celulosa.
Segundo daEn el segundo da se realiz la medicin de la masa de
papel de 3 cajas petri, pudindose apreciar en las primeras 2 un
consumo de masa pequeo, menor que al del primer da, y en la ltima
caja no se tubo consumo de celulosa.
Tercer daEn el tercer y ltimo da de incubacin se pudo aprecia
una cala petri sin cambio de masa del papel utilizado como fuente
de celulosa, y en las restantes tres cajas se pudo apreciar un
cambio de masa del papel en dos de ellas menores a los resultados
de los anteriores das y en una de ellas un consumo bastante alto en
comparacin con los dems datos.
11. CONCLUSIONES Para la primera etapa de aislamiento de
microorganismos se logr separar un tipo de microorganismos esto se
evidenci por la formacin de burbujas en el agar, la turbidez del
medio, y por la leve identificacin de m.o. blanquecinos. Sin
embargo no se obtuvo la presencia de los m.o. en todas las cajas
petri inoculadas slo en 3 de estas. Para la segunda etapa de
aislamiento de microorganismos se evidenci el leve consumo de
celulosa contenido en el papel, sin embargo se pudo apreciar que la
masa consumida por los mismos fue baja y en algunos casos nula.
Tambin se pudo notar que en la segunda etapa, algunas de las cajas
petri no presentaron crecimiento alguno de m.o. esto debido
probablemente a la falta de algn nutriente en el medio, o en este
caso a la falta de CO2 puesto que la inoculacin se realiz a
profundidad y no en superficie sin contacto con CO2.
12. RECOMENDACIONES Se pudo apreciar que la presencia de ciertos
componentes o la falta de otros en el medio puede afectar el
crecimiento y desarrollo de los m.o. Un factor muy importante a
tomar en cuenta es la temperatura de incubacin y el pH del medio a
utilizarse, en nuestro caso las temperaturas de incubacin fueron
bajas por lo cual el desarrollo de los microorganismos en algunos
casos fue nula. Si se desea utilizar como fuente de celulosa aserrn
es aconsejable que este se encuentre lo ms finamente molido y se
recomienda tamizar para obtener una mejor fuente de celulosa.
13. BIBLIOGRAFA
Bravo Mara Amparo. (n.d.). Bacterias Anaerobias (Versin
Digital). Universidad del Cauca. Facultad de Ciencias de la
Salud.
Mateo-Snchez Jos, Cobos-Peralta Mario A., Trinidad-Santos
Antonio, Cetina-Alcal Vctor, y Vargas-Hernndez Jess. (2002.).
AISLAMIENTO DE BACTERIAS RUMINALES DEGRADADORAS DEL ASERRN.
Obtenido el 14 de Noviembre del 2013
de:www.produccion-animal.com.ar Guerrero A. (2011). Aislamiento de
Bacterias Ruminales degradadoras de celulosa (Versin Digital).
Univesidad Politecnica Salesiana. Cuenca.