Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Escola de Ciências Ricardo Filipe Duarte da Cruz Indução Indução Indução Indução e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do Stresse tresse tresse tresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico em em em em Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Milho Milho Milho Milho Setembro de 2006
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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades ...
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Universidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do Minho Esco l a de C iênc i as
Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoInduçãoInduçãoIndução e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do Stressetressetressetresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico emememem Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de MilhoMilhoMilhoMilho
Setembro de 2006
Universidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do Minho Esco l a de C iênc i as
Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoInduçãoInduçãoIndução e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico emememem Variedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de Milho
Tese de Mestrado Biologia do Stresse em Plantas Trabalho efectuado sob a orientação de Professor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da Silva ProfProfProfProfessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunha
Setembro de 2006
É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.COMPROMETE.COMPROMETE.COMPROMETE.
“Have courage for the great sorrows of life and patience for the small ones;
and when you have laboriously accomplished your daily task,
go to sleep in peace.
God is awake.”
Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 ---- 1885) 1885) 1885) 1885)
Agradecimentos
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
Ao Professor Jorge Marques Silva por me ter sugerido o tema deste trabalho, e me ter
acolhido prontamente na Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa. Agradeço-lhe
também a liberdade que me permitiu ao longo do trabalho e a discussão dos problemas que
foram surgindo. Agradeço-lhe ainda a leitura cuidadosa e com espírito crítico do presente
manuscrito.
À Professora Ana Cunha pela disponibilidade e pelo acompanhamento ao longo de
todo o trabalho, em especial o realizado na Universidade do Minho. Agradeço-lhe também
pela leitura cuidadosa e crítica do presente manuscrito.
Ao Professor Pedro Fevereiro e ao Engenheiro Silas Pego pelo apoio ao projecto e o
auxílio na obtenção das sementes.
À Professora Anabela Bernardes da Silva pelo auxílio prestado na determinação das
actividades da PEPC e EM-NADP.
À Professora Celeste Arrabaça pelo auxílio prestado na determinação das actividades
da RuBisCO.
Ao Banco Português de Germoplasma Vegetal, Braga, pelas sementes das diferentes
variedades portuguesas de milho.
À Ana Elisabete, à Ana Sofia, à Elsa Elias e ao André Costa pela ajuda imprescindível
que me ofereceram ao longo de todo o trabalho, quer na utilização dos aparelhos, quer na
metodologia aplicada. Também quero agradecer-lhes a amizade e o apoio ao longo do
trabalho.
À Alexandra Marques pela discussão dos problemas que foram surgindo, pela amizade
e apoio que demonstrou.
À Cátia Nunes pela ajuda preciosa na quantificação dos aminoácidos livres e prolina,
na Universidade do Minho.
À funcionária Manuela Lucas pela ajuda preciosa, pela amizade e apoio que sempre
demonstrou.
A todos os docentes da Secção de Fisiologia e Bioquímica Vegetais pelo ambiente e
apoio que demonstraram ao longo do trabalho.
Agradeço à minha família, à Leonor e a todos os meus amigos pelo apoio nos momentos de
maior dificuldade.
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
II
Resumo
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
III
ResumoResumoResumoResumo
Este trabalho teve como objectivo geral, na primeira fase, caracterizar as estratégias de
resposta ao stresse hídrico, com ênfase no metabolismo fotossintético, em seis variedades portuguesas de milho (Zea mays L.) e, na segunda fase, aprofundar o conhecimento sobre o comportamento fisiológico das duas variedades com respostas mais contrastantes. Utilizaram-se dois sistemas de indução de stress, um rápido e um lento, e recorreu-se, na primeira fase, à medição das trocas gasosas através da análise de gases por radiação infra-vermelha e de fluorescência modulada da clorofila a. Nas duas variedades seleccionadas para a segunda fase, estudou-se adicionalmente a resposta do aparelho fotossintético ao stress hídrico sob diferentes regimes de PPFD e diferentes concentrações de CO2. Analisaram-se também as actividades das principais enzimas do metabolismo fotossintético (RuBisCO, PEPC, EM-NADP) e a variação do teor em prolina.
Nos ensaios de indução lenta do stresse ocorreu uma diminuição de todos os parâmetros de trocas gasosas (A, E, gs, WUE) nas seis variedades. Destacaram-se as variedades PB260 e PB269, como aquelas onde os parâmetros sofreram uma diminuição progressiva e mais lenta, e a variedade PB369, onde os efeitos negativos do stresse hídrico se fizeram sentir de forma mais abrupta, com uma diminuição rápida dos valores. As variedades recuperaram os valores iniciais da maioria dos parâmetros após irrigação, exceptuando-se a variedade PB369 cuja recuperação se deu de forma mais lenta. Nos ensaios de fluorescência da clorofila a, verificou-se uma diminuição de vários parâmetros (Fv/Fm, ΦPSII, qP, ETR) ao longo do stresse lento e do stresse rápido. Por outro lado, qN aumentou em todas as variedades, à excepção de PB269, na qual não variou. Comparando os ensaios dos dois tipos de stresse, verificou-se que os parâmetros fisiológicos que diminuíram o fizeram de forma mais marcante no stresse rápido, em todas as variedades. As variedades PB269 e PB369 foram seleccionadas como sendo a mais e a menos tolerante ao stresse hídrico, respectivamente.
A partir das determinações dos potenciais hídricos constatou-se que a variedade PB269 conseguiu manter um potencial hídrico mais elevado do que a variedade PB369 em condições de stresse hídrico semelhantes e que possui uma parede celular mais elástica, permitindo a manutenção da turgescência até THR mais baixos apresentando-se esta como uma boa estratégia de tolerância ao stresse hídrico.
Através da decomposição do parâmetro de fluorescência qN, verificou-se que houve um aumento de qE com a intensificação do stresse hídrico, na variedade PB369. Por outro lado, na variedade PB269 houve a manutenção deste parâmetro até THR de cerca de 50%, indicando uma maior capacidade de manter activos os processos fotossintéticos sem recorrer a processos de amortecimento não-fotoquímicos.
Nos ensaios enzimáticos, observou-se que em ambas as variedades houve diminuição das actividades enzimáticas da RUBISCO, PEPC e EM-NADP com a diminuição do THR, nos ensaios de stresse lento. Contudo, nos ensaios de stresse rápido tal diminuição só aconteceu na RUBISCO, mantendo-se as actividades das outras enzimas constantes.
Os dados parecem indicar que ambas as variedades possuem uma reserva de prolina que poderá ter sido rapidamente mobilizada no período de recuperação do stresse, principalmente na variedade PB269.
No seu conjunto, os resultados obtidos parecem mostrar que existe um espectro alargado de respostas fisiológicas face ao stresse hídrico que, a ter uma base genética de elevada hereditabilidade e estabilidade, poderão constituir uma base de selecção em futuros programas de melhoramento.
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
IV
Abstract
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
V
Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in
Portuguese Maize CultivarsPortuguese Maize CultivarsPortuguese Maize CultivarsPortuguese Maize Cultivars
AbstractAbstractAbstractAbstract
This work aims for the identification of several aspects of water stress physiological
response strategies in different Portuguese maize cultivars (Zea mays L.), in a first stage, and expand the knowledge of the most tolerant and less tolerant cultivars physiological responses to water stress. The responses were studied under two water stresse regimes – slow stress and rapid stress – relevant in field conditions, and in the recovery process after irrigation. In the first part of the work, a preliminary characterization of six cultivars was made measuring gas exchange with an infrared gas analyser and chlorophyll a fluorescence. In the second part of the work, a deeper characterization of those two cultivars was made through the study of water relations and photosynthetic metabolism under different PPFD and external CO2 conditions, the enzymatic activities (RuBisCO, PEPC, NADP-ME) and proline content variation.
In slow stress, all the parameters of gas exchange (A, E, gs, WUE) suffered a reduction in all six cultivars. In PB260 and PB269, the reduction was made in a slower progressive way, and, in contrast, in PB369 the parameters declined abruptly. In general, the parameters recovered upon irrigation, with the exception of PB369, in which the recovery was slower. In rapid stress, the parameters responded in a similar but very fast way. PB369 was the only cultivar with a slower response. Chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, ΦPSII, qP, ETR) suffered a decrease, in slow and rapid stress. On the other hand, qN increased in all cultivars, with the exception of PB269, in which it maintained its values. Comparing slow and rapid stress, the parameters decreased faster in rapid stress, in all cultivars. PB269 and PB369 were selected as the cultivars more and less tolerant to water stress.
PB269 is able to maintain higher leaf water potential under water stress and as a more elastic cell wall that allows it to maintain turgescence at lower RWC, resulting in a good tolerance strategy to water stress.
The decomposition of the qN fluorescence parameter, showed a rise of the qE component, in PB369, with increased water stress. PB269 maintained this parameter to a RWC of 50%, indicating a suitable photosynthesis without activating major non-photochemical quenching processes. On the enzymatic assays, there was a decrease in the activities of RUBISCO, PEPC and NADP-ME, with RWC decrease, in slow stress. However, in rapid stress this decrease only occurred in RUBISCO. Both cultivars appear to have a proline reserve that could be easily mobilised during recovery, especially in PB269.
The data presented in this work appears to indicate the existence of a wide spectrum of physiological responses to water stress that, having a highly hereditable and stable genetic background, can establish the basis of future plant breeding programs.
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
VI
Índice
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
VII
ÍndiceÍndiceÍndiceÍndice
Agradecimentos ………………………………………………………………………………………………….. I Resumo ………………………………………………………………………………………………….……... III Abstract ………………………………………………………………………………………………….…….... V Índice ………………………………………………………………………...………………………………... VII Símbolos e Abreviaturas …………………………………………………………………………………….... IX p 1. Objectivos e Abordagem do Problema ……………………………………………………………………… 1 p 2. Introdução Geral ............................................................................................................................................... 3 2.1. Descrição Botânica do Milho .……………..………………...….……………………………………….…. 3 2.2. O Milho na Economia Mundial e em Portugal ……………....…..……………….…………………….…… 4 2.3. Relações Hídricas em Plantas ……………………………………………………………………………….. 4 2.4. Stresse Hídrico nas Plantas ………………………………………………………………………………….. 6 2.4.1. Aspectos Gerais ……………...…………………………………………………………………………….. 6 2.4.2. Respostas Estomáticas ao Stresse Hídrico ……………………………………………………………….... 8 2.4.3. Metabolismo do Carbono e Efeitos do Stresse Hídrico na Fotossíntese ………………………………...… 9 2.5. Estratégias de Sobrevivência à Seca ……………………………………………………………………….. 14 2.5.1. Aspectos Gerais ……...………………………………………………………………………………….... 14 2.5.2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na Resposta ao Stresse Hídrico …………….…. 15 2.5.3. Solutos Compatíveis e Ajustamento Osmótico …………………………………………………………... 19 2.6. Técnicas de Melhoramento e Selecção para Tolerância ao Stresse Hídrico ……………...……...………… 24 p 3. Metodologia Geral ……………………………………………………………………………………..……. 29 3.1. Material Vegetal ……………………………………………………………………………………………. 29 3.2. Indução do Stresse Hídrico ………………………………………………………………………..……….. 30 3.3. Relações Hídricas ………………………………………………………………………………………...… 30 3.3.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha …………………………………………….………… 30 3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo ………………………………………………………………….. 31 3.4. Medição das Trocas Gasosas por Análise de Gases por Radiação Infra-Vermelha (IRGA) …...………….. 31 3.5. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………...……………………...………..…………. 33 3.6. Medição da Libertação de O2 ………………………………………………………………………………. 36 3.7. Medição de Actividades Enzimáticas …………………………………………………………………….... 37 3.8. Análise Estatística ………………………………………………………………………………………….. 37 p 4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho …………………………………. 39 4.1. Introdução …………………………………………………………………………………………………... 39 4.2. Metodologia ………………………………………………………………………………………………... 39 4.2.1. Material Vegetal …………………………………………………………………………………………. 39 4.2.2. Relações Hídricas ………………………………………………………………………………………… 39 4.2.3. Medição das Trocas Gasosas …………………………………………………………………………….. 39 4.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………………………………………………..… 41 4.3. Resultados e Discussão …………………………………………………………………………………..… 42 4.3.1. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 42 4.3.2. Trocas Gasosas ………………………………………………………………………………………...…. 47 4.3.2.1. Stresse Lento ………………………………………………………………………………………….... 48 4.3.2.2. Stresse Rápido ………………………………………………………………………………………….. 59 4.3.3. Fluorescência Modulada da Clorofila a ………………………………………………………………….. 68 4.3.3.1. Stresse Lento ………………………………………………………………………………………….... 68 4.3.3.2. Stresse Rápido ……………………………………………………………………………………….…. 75 4.4. Conclusões ……………………………………...………………………………………………………….. 83 4.4.1. Conclusões das Trocas Gasosas ………...………………………………………………………………... 83 4.4.2. Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila a ………………………...………………………... 83 4.4.3. Conclusões da Fase I ……………………………………………………………….…………………….. 84 p
Índice
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
VIII
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico …..... 85 5.1. Introdução ………………………………………………………………………………………………..…. 85 5.2. Metodologia ………………………………………………………………………………………………... 85 5.2.1. Material Vegetal ………………………………………………………………………………………….. 85 5.2.2. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 85 5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha ……………………………………….…………….. 85 5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas ………………………………………………………... 86 5.2.2.3. Estabelecimento de Curvas Pressão/Volume …………………………………………………………... 86 5.2.3. Medição das Trocas Gasosas …………………………………………………………………………...… 87 5.2.3.1. Curvas A/PPFD ………………………………………………………………………………………… 87 5.2.3.2. Curvas A/CO2a ………………………………………………………………………………………….. 87 5.2.3.3. Determinação da Libertação de O2 …………………………………………………………...………… 88 5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………………………………………………..… 88 5.2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides ……………………………………………………………… 89 5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas ………………………………………………………………. 89 5.2.6.1. Extracção ……………………………………………………………………………………………….. 90 5.2.6.2. Ribulose-1,5-Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (RuBisCO) ………………………………………..… 90 5.2.6.3. Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC) ……………………………………………………………...… 91 5.2.6.4. Enzima Málica Dependente de NADP (EM-NADP) …...…………………………………………….... 91 5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel …………………………………………………………………….…. 91 5.2.8. Quantificação de Solutos Compatíveis …………………………………………………………………... 92 5.2.8.1. Extracção ……………………………………………………………………………………………….. 92 5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina ……………………………………………………….. 92 5.3. Resultados e Discussão …………………………………………………………………………………….. 93 5.3.1. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 93 5.3.2. Trocas Gasosas ………………………………………………………………………………………...…. 96 5.3.2.1. Curvas A/PPFD ………………………………………………………………………………………… 96 5.3.2.2. Curvas A/CO2a ………………………………………………………………………………………. 105 5.3.2.3. Libertação de O2 ………………………………………………………………………………………. 112 5.3.3. Fluorescência Modulada da Clorofila a ……………………………………………………………….... 114 5.3.4. Clorofilas Totais e Carotenóides ………………………………………………………………………... 125 5.3.5. Metabolismo do Carbono ……………………………………………………………………………… 128 5.3.5.1. Ribulose-1,5-Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (RuBisCO) ………………………………………… 129 5.3.5.2. Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC) ………………………………………………………………. 133 5.3.5.3. Enzima Málica Dependente de NADP (EM-NADP) ……...………………………………………….. 136 5.3.6. Solutos Compatíveis …………………………………………………………………………………..… 137 5.3.6.1. Aminoácidos Livres ………………………………………………………………………………… 138 5.3.6.2. Prolina ………………………………………………………………………………………………. 140 5.3.7. Conclusões da Fase II ………………………………………………………………………………….... 142 p 6. Conclusões Gerais …………………………………………………………………………………………. 145 p 7. Referências Bibliográficas ……………………………………………………………………………….... 147 p
Símbolos e Abreviaturas
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
IX
Símbolos e AbreviaturasSímbolos e AbreviaturasSímbolos e AbreviaturasSímbolos e Abreviaturas
A taxa fotossintética
A/CO2a taxa fotossintética em função da concentração externa de CO2
A/PPFD taxa fotossintética em função da densidade de fluxo fotónico fotossintético
ABA ácido abcísico
Apot potencial fotossintético
ATP adenosina trisfosfato
ATPase ATP sintase
C3 metabolismo fotossintético cujo primeiro composto estável formado possui 3
átomos de carbono
C4 metabolismo fotossintético cujo primeiro composto estável formado possui 4
átomos de carbono
Ca clorofila a
Ca2+ ião cálcio
Cb clorofila b
Ca+b clorofila total
CA1P 2-carboxiarabinitol-1-fosfato
Ci concentração interna de CO2
CO2 dióxido de carbono
CO2a concentração externa de CO2
Cx+c carotenóides totais
DMSO dimetilsulfóxido
DTT ditiotritol
E taxa transpiratória
EDTA ácido etilenodiamina tetracético
EM-NADP enzima málica dependente de NADP
Eq. equação
ETR taxa de transporte de electrões no PSII
Fm fluorescência máxima
Fm’ fluorescência máxima medida à luz
Fo fluorescência basal
Fo’ fluorescência basal medida após iluminação
Fv fluorescência variável
Símbolos e Abreviaturas
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
2.12.12.12.1.... Descrição Botânica Descrição Botânica Descrição Botânica Descrição Botânica do Milho do Milho do Milho do Milho
Durante séculos os investigadores interrogaram-se sobre a origem geográfica do
milho. Actualmente, todos estão de acordo que a região de origem desta espécie é o Novo
Mundo, seja no México, na América Central ou na América do Sul.
A espécie de milho que hoje utilizamos é incapaz de sobreviver sem a intervenção do
Homem, uma vez que não possui mecanismos de disseminação, nem órgãos de resistência. É
uma espécie relativamente recente, com alguns milhares de anos, tendo surgido
provavelmente a partir do período em que o Homem iniciou o desenvolvimento da
agricultura.
O milho pertence à Divisão Magnoliophyta, Classe Liliopsida, Ordem Poales, e
Família das Poaceae (também conhecida como Gramineae).
É uma espécie muito polimórfica, apresentando populações muito precoces, em que a
maturação é atingida em 60-70 dias, e populações muito tardias, que exigem 10 a 11 meses.
Também o número de folhas por planta pode variar entre 8 e 48, a altura do caule entre 60
centímetros e 6 metros e a dimensão da espiga entre 2,5 e 30 centímetros (Floyd et al., 2002).
Embora existam grandes diferenças morfológicas entre as populações de milho, todas
as variedades cultivadas têm características morfológicas comuns, nomeadamente os órgãos
vegetativos (raízes, caule, folhas) e os órgãos reprodutores (panícula e espigas).
No milho, existem dois sistemas radiculares: um seminal ou provisório e um coronário
ou definitivo. As raízes seminais são as primeiras a formar-se permitindo à planta
desenvolver-se até formar as raízes coronárias, as quais permitem também fixar a planta ao
solo (Floyd et al., 2002).
O caule do milho é formado por nós e entrenós, variando o número de nós entre 8 e
48. Ao nível de cada nó estão inseridos uma folha e um gomo axilar. Quando os gomos
axilares da base do caule se desenvolvem dão origem a rebentos que, tal como o pé principal,
também são formados de caule, folhas e inflorescências (Floyd et al., 2002).
Num pé de milho as folhas apresentam dimensões diferentes. As folhas da base são
pequenas. O engrossamento do caule provoca a ruptura dos vasos que as alimentam fazendo
com que elas deixem de ser funcionais. As folhas inseridas na zona mediana do caule (ao
nível da inserção das espigas) são as mais longas e mais largas. No terço superior do caule, as
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
4
folhas vão diminuindo de dimensão à medida que a sua inserção se aproxima da panícula
(Floyd et al., 2002).
2.2.2.2.2.2.2.2. O Milho na Economia MO Milho na Economia MO Milho na Economia MO Milho na Economia Mundial e em Portugalundial e em Portugalundial e em Portugalundial e em Portugal
Actualmente, o milho é cultivado em diversos pontos do planeta, desde países como
Canadá e Rússia até ao Brasil e países africanos; desde locais situados abaixo do nível do mar
junto do Mar Cáspio até aos 3600 metros de altitude nos Andes peruanos; desde zonas semi-
áridas onde a precipitação anual não ultrapassa 250 milímetros até às regiões onde ela
ultrapassa os 1000 milímetros; em regiões com Verão muito curto (Canadá) e nas de Verão
permanente (Equador). Nenhuma outra cultura tem uma distribuição geográfica tão vasta
(CIMMYT, 2001).
Depois do trigo e do arroz, o milho é o cereal mais cultivado, com uma produção de
mais de 400 milhões de toneladas por ano, sendo os EUA o maior produtor mundial, com
cerca de 40% da produção (CIMMYT, 2001).
Em Portugal, a área cultivada é de cerca de 180.000 hectares. Os milhos mais
cultivados são os híbridos, calculando-se que ocupem cerca de 71,4 % da área global da
cultura. A cultura do milho decorre no período da Primavera-Verão, quando as temperaturas
são mais elevadas, sendo a temperatura óptima para o crescimento do milho de 24 a 30ºC
(Syngenta, 2004). Este facto levanta sérios problemas ao cultivo de milho, dado que estas
temperaturas, associadas ao aumento da evapotranspiração e à diminuição dos recursos
hídricos no solo, limitam a água disponível para a planta durante o seu desenvolvimento o que
é determinante para garantir uma boa produtividade.
2.32.32.32.3. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em Plantaslantaslantaslantas
A água é o líquido mais abundante à face da Terra, tendo uma função muito
importante nas plantas como responsável pela dissolução e transporte de iões e moléculas e
influenciando também a estrutura de proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos e outros
constituintes da membrana celular. A água forma o ambiente no qual ocorre a maioria das
reacções celulares, e participa directamente em muitas reacções bioquímicas (Taiz e Zeiger,
2002).
As células vegetais, quando completamente desenvolvidas, possuem um enorme
vacúolo constituído de uma solução aquosa de natureza diversa, restando apenas 5 a 10% do
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
5
volume celular para o citoplasma. A água constitui cerca de 80 a 95% da massa dos tecidos
vegetais em crescimento. Por outro lado, estruturas como a madeira, constituída
essencialmente por células mortas, contém quantidades baixas de água. As sementes possuem
5 a 15% de água, estando entre os tecidos vegetais com menor quantidade de água, embora na
germinação necessitem de absorver enormes quantidades (Taiz e Zeiger, 2002).
As plantas estão continuamente a absorver e a perder água, grande parte dela perdida
por transpiração foliar, através dos estomas, à medida que o CO2, necessário para a
fotossíntese, é absorvido da atmosfera.
O fluxo de água também é um meio importante de adquirir os minerais existentes no
solo através da absorção nas raízes. O movimento de água é conduzido por difusão simples ou
fluxo de massa, ou através de uma combinação destes dois mecanismos de transporte, em
resposta a uma diferença de potencial hídrico (Steudle e Peterson, 1998; Steudle, 2000). A
difusão acontece devido ao constante movimento térmico das moléculas, que ocorre na
presença de um gradiente de concentrações. Por outro lado, existe o movimento em fluxo de
massa, ao longo do contínuo solo-planta-atmosfera (Wei et al., 1999; Lawlor, 2002).
Actualmente, a manutenção deste fluxo é explicada por dois modelos complementares, o
modelo da pressão radicular, segundo o qual a água ascende na planta devido a uma pressão
provocada pela entrada de água nas raízes, e o modelo de tensão-coesão-adesão, segundo o
qual a coluna de água ascende devido às propriedades específicas das moléculas de água,
referidas no nome do modelo (Kramer e Boyer, 1995).
A água é absorvida pelas raízes e o seu movimento pode ocorrer através de duas vias
possíveis: apoplástica (ao longo dos espaços intercelulares) e simplástica (atravessando
paredes celulares e membranas plasmáticas e depois difundindo-se pelos plasmodesmos)
(Steudle e Peterson, 1998). No caso das células, designa-se por osmose a difusão de água
através de membranas, dependendo de um gradiente da energia livre da água através da
membrana, normalmente medido como diferença de potencial hídrico (Taiz e Zeiger, 2002).
A concentração de solutos no citosol e vacúolo e a pressão hidrostática exercida pela
membrana plasmática na parede celular são os dois factores principais que afectam o
potencial hídrico, embora, à medida que a distância vertical aumenta, a gravidade também
possa desempenhar um papel importante. Os componentes do potencial hídrico (Ψw) podem
ser resumidos na expressão Ψw = Ψs + Ψp + Ψg, onde Ψs corresponde ao potencial osmótico
(efeito dos solutos na energia livre da água), Ψp corresponde à pressão hidrostática ou de
turgescência, e Ψg corresponde ao efeito da gravidade no movimento da água (nas plantas de
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
6
maiores dimensões aumenta cerca de 0,1 MPa / 10 m) (Taiz e Zeiger, 2002). O potencial
hídrico é normalmente um bom indicador do estado hídrico da planta.
Ao contrário das células animais, as células vegetais podem suportar uma elevada
pressão intracelular, denominada pressão de turgescência, resultante da presença da parede
celular. Esta pressão é necessária para diversos processos fisiológicos, nomeadamente a
elongação celular, as trocas gasosas nas folhas, o transporte floémico, e diversos processos de
transporte membranar. A pressão de turgescência também contribui para a manutenção da
rigidez e da estabilidade mecânica em tecidos vegetais não-lenhificados.
2.42.42.42.4. Stresse . Stresse . Stresse . Stresse HHHHídrico nídrico nídrico nídrico nas Pas Pas Pas Plantaslantaslantaslantas
As plantas estão frequentemente expostas a stresses ambientais que podem resultar em
défice hídrico, toxicidade por cálcio e outros metais, deficiência em iões e fotoinibição, entre
outras.
A reduzida disponibilidade de água é um dos factores ambientais mais importantes na
regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas e uma das principais causas para a
redução do rendimento das colheitas que afectam a maioria das zonas cultivadas por todo o
mundo. À medida que os recursos hídricos para utilização agronómica se vão tornando cada
vez mais limitantes, o desenvolvimento de linhas de plantas tolerantes à seca tem surgido
como um objectivo importante a atingir (Stoop et al., 1996; Hare et al., 1999; Jiang e Zhang,
2002; Bruce et al., 2002).
Durante o ciclo de vida de uma planta ocorrem frequentemente períodos de défice
hídrico nos solos e/ou na atmosfera, mesmo fora de regiões áridas/semi-áridas, como foi
documentado nas florestas decíduas temperadas (Burghardt e Riederer, 2003) ou nas florestas
tropicais (Asner et al., 2004).
Na natureza, as plantas podem estar sujeitas a dois tipos de stresse hídrico de acordo
com a sua duração, podendo ser de longo prazo (de dias a semanas ou meses) ou curto prazo
(de horas a dias) (Chaves et al., 2003). As respostas das plantas à escassez de água são
complexas, envolvendo alterações adaptativas e/ou efeitos deletérios. Em condições naturais,
estas respostas podem ser sinergistica ou antagonisticamente modificadas por sobreposição de
outros stresses, como é o caso do stresse salino (Xiong et al., 2002).
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
7
As plantas terrestres também podem estar sujeitas à desidratação durante a exposição a
temperaturas baixas (Hare et al., 1999), uma vez que a água pode não estar disponível na
forma líquida para ser absorvida pelas raízes e, também, devido à diminuição da absorção
radicular, nestas condições, mesmo quando está disponível.
Algumas das diferenças entre espécies, no que respeita ao crescimento e
sobrevivência, podem ser atribuídas a diferentes capacidades para a aquisição de água,
transporte e acumulação, e não a diferenças drásticas do metabolismo num determinado
estado hídrico. No entanto, a regulação do metabolismo fotossintético também está
dependente de factores como as limitações da difusão de CO2 na folha, repartição na alocação
de carbono para órgãos não-fotossintéticos e moléculas de defesa, ou mudanças na
bioquímica da folha, que podem ser afectados pelo stresse hídrico (Chaves et al., 2002).
Em condições de défice hídrico, também ocorre o aumento da produção de radicais
livres de oxigénio nas plantas, e a acumulação de solutos compatíveis poderá ter algum efeito
protector contra danos oxidativos nas proteínas, interagindo com os grupos que as constituem
(Iturbe-Ormaetxe et al., 1998).
As respostas iniciais ao stresse hídrico permitem a sobrevivência imediata. No entanto,
para que a planta seja capaz de suportar o stresse imposto é necessária uma aclimatação, a
qual produz novas capacidades metabólicas e/ou estruturais mediadas pela alteração da
expressão génica (Sharp et al., 2004).
As respostas fisiológicas ao stresse ambiental têm que ser activadas antes de
ocorrerem danos significativos nos tecidos afectados (Hare et al., 1999). Contudo, é a
resposta integrada ao nível da planta inteira, incluindo a assimilação de carbono e a alocação
de fotoassimilados para diferentes partes da planta e a capacidade reprodutora, que vai
determinar a sobrevivência e persistência em condições de stresse ambiental (Chaves e
Oliveira, 2004).
Para providenciar uma base sólida às estratégias de melhoramento da produção vegetal
é necessário uma melhor caracterização dos receptores moleculares envolvidos na percepção
do stresse e dos eventos moleculares que especificam a expressão da tolerância ao stresse
(Hare et al., 1999).
Os grandes avanços na área da genómica permitiram um enorme progresso na
caracterização de genes individuais e das suas respostas específicas ao stresse, de modo a
determinar a cascata de eventos que estarão associados a vias de sinais inter- e intracelulares
do défice hídrico, como é o caso do ácido abcísico (ABA) (Griffiths e Parry, 2002). Contudo,
como a maioria dos esforços são dirigidos para a transformação genética das plantas (Casas et
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
8
al., 1993), as abordagens fisiológicas tradicionais são negligenciadas. Até agora, foram
desenvolvidas poucas variedades com maior tolerância ao stresse ambiental. Contudo, no
mesmo período de tempo, o conhecimento das respostas fisiológicas aumentou
substancialmente (Heuer, 2003).
2222.4.4.4.4.2.2.2.2. Respostas . Respostas . Respostas . Respostas EstomáticasEstomáticasEstomáticasEstomáticas ao Stresse H ao Stresse H ao Stresse H ao Stresse Hídricoídricoídricoídrico
Os estomas ocupam um papel central nas trocas gasosas, funcionando como o controlo
a curto prazo da perda de água por transpiração e da assimilação do CO2 pelas plantas (Jones,
1998).
Foram identificadas duas respostas gerais (Tipo I e Tipo II) da fotossíntese ao stresse
hídrico, que se distinguem pelo conteúdo relativo de água foliar abaixo do qual surgem os
efeitos não-estomáticos (metabólicos) (Lawlor, 2002). Contudo, durante a imposição gradual
de défices hídricos moderados (normalmente até –1,8 MPa durante um período de 15 dias ou
mais), as respostas baseiam-se quase exclusivamente na limitação da condutividade
estomática (gs) (Cornic e Fresneau, 2002; Yordanov et al., 2003).
Quando os défices hídricos se desenvolvem, um dos primeiros acontecimentos a tomar
lugar nas plantas é o fecho estomático, em resposta a um declínio da turgescência da folha
e/ou do seu potencial hídrico (Yordanov et al., 2003), ou ainda em resposta ao aumento da
concentração de ABA no fluxo transpiratório (Sharp e LeNoble, 2002; Chaves et al., 2003).
Este encerramento permite evitar a desidratação da planta e fenómenos de cavitação, os quais
poderiam comprometer a sobrevivência das plantas. A diminuição do CO2 intracelular, após o
fecho estomático, e a consequente baixa eficiência do uso da luz pode induzir, a longo prazo,
uma regulação da maquinaria fotossintética, no sentido de se adequar ao carbono disponível
(Chaves et al., 2002).
À medida que a seca progride, nas plantas cultivadas no campo, o fecho estomático
ocorre por períodos cada vez mais longos, durante o dia, tendo início a meio da manhã
(Tallman, 2004). Esta diminuição da condutância estomática tem como efeito simultâneo a
redução da assimilação de carbono e das perdas de água no período de maior défice de
pressão de vapor entre a folha e a atmosfera, e leva a uma optimização da assimilação de
carbono, em relação à disponibilidade de água (Jones, 1998).
Foi encontrada claramente uma dependência do ciclo diurno no que respeita à resposta
estomática, tendo em conta a humidade do ar e ao estado hídrico da folha numa dada hora
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
9
(Tallman, 2004), sugerindo que algumas das alterações diurnas na função estomática podem
resultar de processos metabólicos com um ritmo circadiano.
2.42.42.42.4....3333. . . . Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na
FFFFotossínteseotossínteseotossínteseotossíntese
As plantas terrestres apresentam uma enorme diversidade de formas e estratégias
adaptativas aos desafios impostos pelo meio ambiente. Também ao nível dos processos
fotossintéticos demonstram esta variabilidade. As principais vias fotossintéticas denominam-
se C3 e C4, devido ao facto de se ter observado que o primeiro produto estável da fixação de
CO2 era uma molécula com três e quatro átomos de carbono, respectivamente (Ehleringer e
Cerling, 2002). Existe uma terceira via fotossintética denominada CAM (de crassulacean
acid metabolism) em que há uma fixação do carbono durante o período nocturno, altura em
que os estomas estão abertos, ao contrário do que acontece com as outras duas vias
fotossintéticas (Lüttge, 2004).
A fotossíntese C3 é um processo com várias etapas nas quais o CO2 atmosférico é
fixado em moléculas orgânicas estáveis, ocorrendo praticamente em todas as células do
mesófilo das folhas. No primeiro passo, a ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase
(RuBisCO) cataliza a reacção de carboxilação de uma molécula de ribulose-1,5-bisfosfato
(RuBP) com uma molécula de CO2 para formar duas moléculas de fosfoglicerato. Contudo, a
RuBisCO também apresenta afinidade para o O2, iniciando uma via metabólica – conhecida
por fotorrespiração – levando à perda de carbono e energia (Taiz e Zeiger, 2002; Ehleringer e
Cerling, 2002).
A fotossíntese C4 representa uma modificação bioquímica da fotossíntese C3, de modo
a reduzir a actividade oxigenásica da RuBisCO, aumentando a concentração de CO2 junto
desta enzima. Nas plantas C4, a fotossíntese C3 encontra-se restrita às células da bainha dos
feixes vasculares (Fig. 2.1). É nas células do mesófilo nas quais se encontra a enzima
fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC), a qual fixa o HCO3- (a partir do CO2 numa reacção
levada a cabo pela anidrase carbónica) e PEP em oxaloacetato, um ácido C4 que se difunde
para as células da bainha do feixe vascular, onde é descarboxilado (Ehleringer e Cerling,
2002).
A descarboxilação deste composto e a sua introdução na via C3 normal é realizado de
três formas, consoante o tipo de planta C4: através da enzima málica dependente de NADP
(EM-NADP) (como é o caso do milho) (Fig. 2.1); através da enzima málica dependente de
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
10
NAD (EM-NAD) (como é o caso de Flaveria trinervia); e através da enzima
fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) (como é o caso de Panicum maximum) (Edwards et
al., 2001; Walker et al., 2002). No entanto, esta divisão tem sido vista como uma
simplificação do que realmente acontece, dado que o milho também possui uma actividade
descarboxilativa considerável pela enzima PEPCK (Wingler et al., 1999) e na espécie
Panicum maxicum a descarboxilação também é realizada pela enzima EM-NAD (Walker et
al., 2002).
Independentemente da forma como é descarboxilado o composto C4, a actividade
elevada da PEPC conduz a uma elevada concentração de CO2 junto da RuBisCO, limitando a
actividade fotorrespiratória (Ehleringer e Cerling, 2002).
Fig. 2.1 – Esquema da via fotossintética nas plantas C4, do subtipo EM-NADP, como é o caso do
milho (adaptado de Taiz e Zeiger, 2002).
As plantas C4, como o milho, têm sido documentadas como melhor adaptadas a
condições de défice hídrico devido a uma resistência estomática mais elevada, apresentando,
uma melhor eficiência do uso de água e a capacidade de manter a actividade fotossintética em
condições de baixo potencial hídrico (Bruce et al., 2002). O milho é capaz de tolerar um nível
mais elevado de stresse e manter o crescimento das suas raízes e partes aéreas a níveis de
stresse que são inibitórios para plantas C3, como o trigo (Triticum aestivum) (Siddique et al.,
1999; Nayyar, 2003).
Quando o stresse hídrico é imposto lentamente, como acontece normalmente em
condições naturais, pode ocorrer uma redução na capacidade bioquímica de assimilação e
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
11
utilização de carbono, juntamente com restrições na difusão gasosa (Chaves et al., 2002).
Diferenças na resposta da fotossíntese à concentração interna de CO2 (Ci) indicam que a
necessidade bioquímica de CO2 é regulada em função da diminuição da disponibilidade de
CO2, associada ao fecho dos estomas induzido pela seca (Tallman, 2004). Existem dados
experimentais que demonstram que a diminuição das taxas de assimilação de CO2
encontradas em folhas sujeitas a stresse hídrico não pode ser revertida simplesmente
aumentando o fornecimento externo de CO2, indicando que o stresse hídrico também deve
afectar o metabolismo do mesófilo (Lawlor, 2002; Parry et al., 2002; Tang et al., 2002;
Cornic e Fresneau, 2002). Esta resposta do mesófilo torna-se progressivamente mais
importante com o aumento da deficiência em água (Parry et al., 2002).
Numa experiência de campo com videiras, a assimilação de CO2 foi significativamente
limitada devido ao fecho dos estomas, à medida que a seca se instalava durante o período de
Verão, mas também houve uma redução na actividade de diversas enzimas do ciclo de Calvin
(Maroco et al., 2002).
Foi demonstrado que os efeitos do défice hídrico na capacidade fotossintética do
tremoceiro dependiam da temperatura da folha e da luz incidente (Chaves et al., 1992 in
Chaves et al., 2002). Foram obtidos dados semelhantes em diversas solanáceas, mostrando
que a fotossíntese era significativamente menos inibida por temperaturas acima dos 38-40ºC
em plantas desidratadas comparadas com plantas bem regadas (Havaux, 1992).
Numa experiência com duas espécies de Quercus não se encontraram diferenças
significativas nas taxas de assimilação de carbono quando estas se comparavam entre plantas
em situação de humidade suficiente no solo e plantas sujeitas a um stresse hídrico moderado
no início de Julho. Contudo, no fim do Verão quente e seco (Setembro), as trocas gasosas, a
meio do dia, na azinheira (Quercus ilex L.) eram menos reduzidas que as observadas no
sobreiro (Quercus suber L.) (Faria et al., 1998 in Chaves et al., 2002). Isto sugere um efeito
menos severo do stresse hídrico na primeira relativamente ao último. De facto, foram
observados valores significativamente mais elevados de potencial hídrico nas folhas no fim do
Verão de 1999 na azinheira (-1,52 MPa) quando comparado com os -2,38 MPa medidos no
sobreiro. Uma das hipóteses é a de que as raízes da azinheira eram capazes de retirar água de
camadas de solo mais profundas, permitindo a esta espécie manter o influxo de água e taxas
de assimilação de carbono mais elevadas nas folhas, por um período de tempo mais longo, do
que as do sobreiro (Chaves et al., 2002).
No final da época seca (Setembro), foi observada uma diminuição da fotossíntese na
azinheira e no sobreiro, comparativamente com o início do Verão (Julho). Durante o período
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
12
mais quente do dia, ocorreu uma diminuição da fotossíntese, associada a uma diminuição do
rendimento quântico do fotossistema II. Neste período do dia, a assimilação de carbono estava
limitada pela diminuição da condutância estomática, podendo aquela ser vista como um
importante mecanismo protector contra a foto-oxidação e, portanto, contra a seca nestas
árvores. Esta regulação da fotossíntese resulta de uma dissipação térmica do excesso de
energia de excitação nos cloroplastos, como foi mostrado pelo aumento do amortecimento
não-fotoquímico (NPQ) em Setembro quando comparado com Julho (Chaves et al., 2002).
Noutras espécies, sabe-se que a seca rigorosa diminui a quantidade da proteína
RuBisCO (Vu et al., 1987). A quantidade de RuBisCO nas folhas é controlada pela sua taxa
de síntese e degradação. Mesmo sob stresse hídrico, a holoenzima da RuBisCO é
relativamente estável, com um tempo de semi-vida de vários dias (Webber et al., 1994 in
Parry et al., 2002). Contudo, o stresse hídrico no tomate (Bartholomew et al., 1991), em
Arabidopsis (Williams et al., 1994 in Parry et al., 2002) e no arroz (Vu et al., 1999 in Parry et
al., 2002) leva a uma rápida diminuição na abundância de transcritos da subunidade menor da
RuBisCO (rbcS), o que pode indicar uma diminuição na sua síntese (Marques da Silva e
Arrabaça, 2004b).
Em alguns estudos, o potencial fotossintético (Apot), medido em condições saturantes
de CO2, não é afectado por uma pequena diminuição do teor hídrico relativo (THR) mas
torna-se progressivamente mais inibido, e menos estimulado por elevadas concentrações de
CO2, abaixo de um determinado valor de THR (resposta Tipo I). Noutros estudos, Apot e a
estimulação da taxa fotossintética por elevadas concentrações de CO2 diminui
progressivamente à medida que THR diminui (resposta Tipo II) (Lawlor, 2002).
Diversos estudos sugeriram que a diminuição da capacidade fotossintética resulta da
insuficiente regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) (Giménez et al., 1992). Se isto é
provocado ou não pela diminuição da síntese de ATP na fase fotoquímica continua a ser
discutido (Gunasekera e Berkowitz, 1993; Tezara et al., 1999; Lawlor, 2002).
Embora a actividade da RuBisCO possa não ser a principal limitação do metabolismo
cloroplastidial, os efeitos do stresse hídrico na quantidade e actividade da RuBisCO não
podem ser ignorados. No estudo de Tezara et al. (1999), a disponibilidade de ATP diminuiu,
tendo sido identificada como um factor chave na tolerância ao stresse hídrico. No entanto, as
alterações nos níveis de ATP foram inferiores às verificadas para a actividade da RuBisCO,
em potenciais hídricos baixos, quando a assimilação de CO2 estava muito reduzida.
A actividade da RuBisCO é regulada para ajustar à capacidade da folha em regenerar
RuBP, sendo modulada in vivo quer pela reacção com CO2 e Mg2+ para carbamilar o resíduo
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
13
de lisina no local catalítico, quer pela ligação de inibidores no local catalítico (Parry et al.,
2002). A ligação dos inibidores à RuBisCO carbamilada previne a catálise, enquanto que a
ligação do substrato RuBP na enzima não-carbamilada previne a carbamilação do resíduo de
lisina que é essencial para a actividade. A libertação de tais compostos tão fortemente ligados
necessita da participação da RuBisCO activase e da hidrólise de ATP (Zhang e Portis, 1999).
Enquanto que a medição da actividade da RuBisCO imediatamente após a extracção
(actividade inicial) reflecte a actividade in vivo, a carbamilação potencial (actividade total)
pode ser determinada incubando os extractos com elevadas concentrações de CO2 e Mg2+
antes do ensaio. Contudo, a carboxilação máxima potencial (actividade máxima) apenas é
revelada se forem dados passos para, em primeiro lugar, remover quaisquer inibidores que
estejam ligados aos locais activos (Parry et al., 2002). A maioria dos inibidores pode ser
removido in vitro através de altas concentrações de sulfato (Parry et al., 1997).
No tabaco (Nicotiana tabacum L.), a seca diminuiu a actividade inicial e total da
RuBisCO. A diminuição da actividade aparenta ser o resultado de uma diminuição do Kcat
aparente e não de uma alteração do estado de activação. Também têm sido observadas
diminuições semelhantes na Kcat da RuBisCO em resposta ao stresse hídrico de longa duração
no trevo (Medrano et al., 1997 in Parry et al., 2002).
Foi demonstrado que a ligação do inibidor CA1P à RuBisCO protege a enzima da
degradação proteolítica (Khan et al., 1999). A RuBisCO que se encontra activa na
carboxilação da RuBP é relativamente resistente à degradação por proteases; por outro lado, a
RuBisCO não-carbamilada com locais activos disponíveis é muito susceptível à proteólise. As
interacções com inibidores podem apresentar vantagens in vivo, de modo a prevenir a
degradação por proteases da RuBisCO não activa.
Como já foi mencionado, a libertação dos inibidores de ligação forte necessita da
participação da RuBisCO activase e da hidrólise de ATP (Zhang e Portis, 1999). A remoção
dos inibidores pela RuBisCO activase pode ser impedida porque, como já foi sugerido por
alguns trabalhos, as concentrações de ATP são reduzidas por acção da seca (Lawlor, 2002).
Além disso, a RuBisCO activase é susceptível a temperaturas elevadas (Crafts-Brandner e
Salvucci, 2000) que podem estar associadas ao stresse hídrico.
No trigo, a diminuição do THR não conduziu ao aumento dos inibidores de ligação
forte. Este resultado contradiz estimativas indirectas da percentagem de locais catalíticos
bloqueados por inibidores (calculados a partir das actividades máxima e total), o qual sugeria
que um número elevado de locais deveriam estar bloqueados por inibidores. Esta discrepância
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
14
pode ser explicada por outros factores, dado que o trigo não contém grandes quantidades de
CA1P (Servaites et al., 1986).
Existem dois mecanismos a ser considerados em relação à diminuição da actividade da
RuBisCO. Primeiro, a RuBisCO reverte a um estado de baixa actividade in vitro através de
uma mudança conformacional (Schmidt et al., 1984). No entanto, a hipótese deste mecanismo
ter um papel regulador in vivo tem recebido pouca atenção. A segunda hipótese é a inibição da
RuBisCO por ligação da RuBP aos locais não-carbamilados (Parry et al., 2002).
Em resumo, em condições de campo, quando o stresse hídrico moderado se
desenvolve lentamente, a diminuição do CO2 intracelular após o fecho estomático
aparentemente induz, a longo prazo, a regulação da maquinaria fotossintética, nomeadamente
da RuBisCO, de modo a ajustar ao fluxo de carbono disponível (Chaves et al., 2002).
2.52.52.52.5.... Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à Secaecaecaeca
A adaptação das plantas à seca tem sido classificada em três estratégias: escapar, evitar
e tolerar (Chaves et al., 2003). No entanto, estas estratégias não são mutuamente exclusivas e,
na prática, as plantas combinam uma variedade de tipos de resposta (Ludlow, 1989 in Chaves
et al., 2003).
As plantas que escapam à seca exibem um elevado grau de plasticidade no seu
desenvolvimento, sendo capazes de completar o seu ciclo de vida antes da ocorrência do
défice hídrico. Estas estratégias têm como base o sucesso reprodutivo antes do stresse se
agravar, sendo de particular importância nas plantas de locais áridos, em que há combinação
de ciclos de vida curtos com elevadas taxas de crescimento e de trocas gasosas, maximizando
o aproveitamento dos recursos hídricos, florescendo e produzindo sementes antes que as
reservas de água se esgotem (Chaves et al., 2002, 2003). Outro mecanismo para um sucesso
reprodutivo consiste em mobilizar parte dos recursos para o desenvolvimento de frutos,
mecanismo associado à capacidade da planta em armazenar reservas em alguns órgãos (caules
e raízes) e mobilizá-los para a produção de frutos, resposta bem documentada em algumas
plantas cultivadas, como os cereais (Gebbing e Schnyder, 1999; Bruce et al., 2002) e alguns
legumes (Chaves et al., 2002). Esta capacidade aumenta em plantas sujeitas à seca (Rodrigues
et al., 1995).
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
15
As plantas também podem superar as condições de seca evitando a desidratação dos
tecidos, enquanto mantém o potencial hídrico nos tecidos o mais elevado possível, ou
tolerando um potencial hídrico baixo no tecido. A desidratação é evitada em plantas anuais ou
perenes e está associada com uma variedade de características adaptativas. Estas envolvem
diminuição das perdas de água e maximização da tomada de água. As perdas de água podem
ser minimizadas pelo fecho dos estomas, por redução da superfície de contacto com a
atmosfera através do enrolamento das folhas (Price et al., 2002), através de uma camada
densa de tricomas aumentando a reflexão (Werker, 2000), através de ângulos fechados das
folhas, ou diminuindo a área da copa através da redução do crescimento e da queda das folhas
mais velhas. A tomada de água é maximizada ajustando o padrão de alocação de carbono,
nomeadamente aumentando o investimento na formação de raízes (Jackson, 2002). Foram
obtidos aumentos significativos na produção de espécies agrícolas, cruzando-as com plantas
de regiões semi-áridas, resultando num melhoramento da profundidade de enraizamento
(Blum, 1984 in Chaves et al., 2003).
A dormência parcial das plantas como sobrevivência à estação seca é outra estratégia
encontrada. A tolerância extrema à desidratação encontra-se nas denominadas plantas da
ressurreição, bem como em alguns fetos, plantas não-vasculares (musgos), algas e líquenes.
As folhas das plantas da ressurreição podem equilibrar com o ar perto de 0-2% (v/v) de
humidade relativa e ainda conseguirem recuperar totalmente a sua actividade fisiológica após
re-hidratação (Chaves et al., 2003).
2.52.52.52.5....2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na
RRRResposesposesposesposta ao Stresse Hta ao Stresse Hta ao Stresse Hta ao Stresse Hídricoídricoídricoídrico
Para além da diminuição dos recursos hídricos, a seca do solo também induz uma
diminuição de nutrientes, em particular o azoto (mas também o cálcio), com fortes efeitos
interactivos no crescimento e funcionamento da planta (Chaves et al., 2003). Esta é uma área
de investigação de grande importância, necessitando de métodos inovadores que permitem
distinguir os efeitos causados pelo défice hídrico dos efeitos causados pela deficiente nutrição
mineral, ambos causados pela seca.
Os ajustamentos da planta aos baixos recursos dos ambientes áridos incluem alteração
da estrutura foliar, aumento da proporção de assimilados mobilizados para as raízes (Poorter e
Nagel, 2000), reduzidas taxas de crescimento e baixas taxas de turnover dos órgãos (Enquist e
Niklas, 2002).
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
16
Enquanto que órgãos com curtos períodos de vida podem ser eliminados em resposta
ao stresse, órgãos com longos períodos de vida têm que optimizar o seu ganho em recursos.
Este é o caso da mudança de demografia foliar observado na espécie desértica perenial
Cryptantha flava, cujo período de vida foliar duplicou em condições de seca (Casper et al.,
2001). Esta resposta resulta em taxas de turnover foliar reduzidas e assim elevada eficiência
do uso de nutrientes. Isto também significa que as plantas podem compensar parcialmente
taxas de ganho de carbono mais reduzidas investindo menos na construção de novas folhas.
As folhas com maior longevidade necessitam sobreviver a períodos em que as
condições são mais hostis. Para tal, necessitam de diversas protecções que variam desde
características anatómicas/morfológicas, como a esclerofilia para resistir a climas extremos e
à herbivoria (Lucas et al., 2000; Burghardt e Riederer, 2003), uma densa camada de tricomas
como na oliveira (Olea europaea L.) para aumentar a reflectância da luz e manter a humidade
(Werker, 2000), ou ângulos foliares fechados (Lizana et al., 2006), até mecanismos
bioquímicos que permitem a dissipação do excesso de energia radiante (Young et al., 1997).
As folhas esclerófilas resistem a condições climáticas extremas e à herbivoria (Lucas
et al., 2000; Burghardt e Riederer, 2003), e são normalmente pequenas e grossas, possuindo
uma reduzida área foliar específica (SLA) e baixa concentração de azoto por unidade de
massa foliar. Uma diminuição na SLA também pode ocorrer nas plantas herbáceas como
resposta à seca, resultando num aumento no investimento de tecidos estruturais, o que permite
uma maior resistência a condições ambientais desfavoráveis (Chaves et al., 2003). Outras
protecções incluem mecanismos bioquímicos de dissipação de energia, como no caso do ciclo
das xantofilas (Young et al., 1997).
Folhas pequenas estão bem adaptadas à elevada luminosidade e à elevada temperatura
que existem na maioria das regiões áridas, porque o seu tamanho permite uma maior
dissipação do calor e um controlo eficaz das perdas de água através do fecho dos estomas
(Jarvis e McNaughton, 1986 in Chaves et al., 2003).
A senescência, que leva a uma diminuição da reserva de açúcares na planta, é um
factor importante na interrupção da formação do fruto, em condições de stresse hídrico.
Assim, os fenótipos com senescência retardada podem ser importantes em culturas onde o
rendimento seja limitado pelos recursos e a acumulação e utilização das reservas dos caules
seja insuficiente para suportar o crescimento do fruto em condições de seca. Contudo, nos
cereais, observa-se uma interacção interessante entre a disponibilidade hídrica e a
disponibilidade de azoto. Em condições de disponibilidade de água não-limitante, azoto
abundante atrasou a senescência mas reduziu o rendimento da produção de grão, enquanto
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
17
que em condições controladas ou suaves de seca no solo, elevada disponibilidade de azoto
aumentou a utilização dos hidratos de carbono armazenados e o rendimento da produção de
grão (Yang et al., 2000). As hormonas vegetais e açúcares também estão envolvidos na
regulação da senescência da parte aérea. Outros estudos revelaram que elevadas
concentrações de açúcares solúveis reprimem a expressão de genes associados à fotossíntese,
num processo em que as hexocinases estão envolvidas (Smeekens e Rook, 1997). Um efeito
importante da sobre-expressão de hexocinases é uma senescência acelerada (Dai et al., 1999).
Para além disso, a queda das folhas mais velhas contribui para a diminuição do gasto
de água, podendo ser visto como um programa de reciclagem no interior da planta, permitindo
a remobilização dos nutrientes armazenados nas folhas mais velhas para os caules ou folhas
mais jovens. Durante a indução da senescência pela seca, algumas proteases específicas da
seca são activadas, as quais não ocorrem no processo normal de envelhecimento, como é o
caso de algumas formas de proteases de cisteína (Solomon et al., 1999). Também existem
diferenças entre as espécies tolerantes e as susceptíveis nomeadamente no grau de
estimulação da actividade endoproteolítica (protease aspártica), sendo superior nas espécies
susceptíveis comparativamente com as tolerantes (Cruz de Carvalho et al., 2001 in Chaves et
al., 2003).
As folhas mais jovens que sobrevivem à seca apresentam, por vezes, taxas
fotossintéticas superiores (Ludlow, 1991) e maior conteúdo de RuBisCO por unidade de área
foliar (David et al., 1998 in Chaves et al., 2003) do que folhas de idade semelhante em
plantas bem regadas, no que pode ser chamado de suspensão do envelhecimento foliar. As
folhas sujeitas a stresse hídrico normalmente atingem a maturidade mais cedo, tornando-se
rapidamente numa fonte de carbono, ao contrário do que acontece nas folhas de plantas bem
regadas (Schurr et al., 2000).
A capacidade da planta captar água de um solo seco através do desenvolvimento de
outras características morfológicas, como raízes mais profundas e de uma maior exploração
do solo, ou através de um ajustamento osmótico são estratégias capazes de estabilizar e
aumentar o fluxo de assimilados encaminhados para as sementes em desenvolvimento (Bruce
et al., 2002).
Algumas das alterações metabólicas que ocorrem como resultado da seca são, elas
próprias, uma consequência da resistência do aparelho fotossintético à desidratação (Cornic,
2000).
Enquanto as árvores e os arbustos desenvolveram estratégias de tolerância e de evitar
o stresse, as plantas herbáceas e as anuais dependem maioritariamente do crescimento rápido
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
18
para escapar aos “stresses de Verão”, bem como das respostas rápidas da maquinaria
fotossintética e do metabolismo do carbono aos sinais iniciais do stresse, incluindo
armazenamento de reservas no caule ou nas raízes (Chaves et al., 2002).
A actividade da invertase aumentou sob stresse moderado e diminuiu drasticamente
com a imposição de um défice hídrico severo. A resposta particular da invertase pode estar
relacionada com o papel central desempenhado por esta enzima na modelação das respostas
da planta aos stresses biótico e abiótico (Roitsch et al., 2003).
O tremoceiro (Lupinus albus L.) sujeito a stresse hídrico mantém a sua produção de
sementes devido à sua capacidade de acumular temporariamente assimilados nas partes aéreas
que mais tarde são encaminhadas para as vagens, durante o estádio de formação das sementes
(Chaves et al., 2002). Essa capacidade do tremoceiro, confirma os dados anteriores de
Withers e Forde (1979 in Chaves et al., 2002) demonstrando que o stresse hídrico estimula a
capacidade de depósito das sementes e vagens.
No caso da azinheira e do sobreiro, a regulação da fotossíntese foi associada com o
aumento da actividade do ciclo das xantofilas e com a diminuição simultânea na concentração
de clorofila da folha, as quais foram observadas durante o período de Verão. Em videiras
sujeitas a precipitação natural após um período prolongado de seca, observou-se uma
diminuição do conteúdo em xantofilas e da eficiência dos centros de reacção abertos do PSII,
resultantes da diminuição da quantidade de proteínas e clorofila (Maroco et al., 2002).
O tremoceiro também é capaz de remover o excesso de energia luminosa através da
dissipação térmica, associada com um aumento da concentração de xantofilas – zeaxantina e
anteraxantina – à custa de violaxantina, como foi observado a meio do dia, especialmente em
plantas sujeitas a stresse hídrico (Chaves et al., 2002).
As temperaturas às quais a planta foi sujeita durante o crescimento também
influenciam a quantidade total de xantofilas relativamente à de clorofilas presentes, ocorrendo
os valores mais elevados em plantas cultivadas num regime de temperaturas mais baixas
(15ºC dia/10ºC noite) comparativamente com o que sucede em plantas cultivadas a
temperaturas mais elevadas (25ºC dia/20ºC noite). A presença de uma maior quantidade de
xantofilas nas plantas no regime de temperaturas mais baixas pode servir como um
mecanismo de protecção das folhas, comparativamente com as plantas cultivadas a
temperaturas mais elevadas, onde a concentração de clorofila é quase o dobro (Chaves et al.,
2002).
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
19
Apesar da enorme quantidade de informação acumulada, a compreensão das alterações
metabólicas e da forma como as diferentes vias comunicam entre si necessita de um maior
aprofundamento.
2.52.52.52.5....3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento OsmóticoOsmóticoOsmóticoOsmótico
O ajustamento osmótico faz parte dos mecanismos que evitam a seca mantendo a
turgescência, através do aumento e manutenção da quantidade de solutos compatíveis
intracelulares no citosol e vacúolo. Tem sido demonstrado que este mecanismo é de particular
importância entre todos os mecanismos adaptativos ao stresse hídrico (Bohnert et al., 1995;
Bohnert e Shen, 1999; Heuer, 2003; Nayyar, 2003; Marques da Silva e Arrabaça, 2004a).
Estudos realizados indicam que ajustamento osmótico mais elevado pode ser um dos
factores decisivos na tolerância ao stresse, oferecendo vantagens, no caso do milho. No caso
do trigo, planta que possui um ajustamento osmótico mais baixo, o desempenho é inferior em
condições de défice hídrico (Nayyar, 2003).
A importância da acumulação de solutos compatíveis já tinha sido reconhecida há
muito tempo (Jefferies et al., 1979).
O tipo de osmólitos e a capacidade de os acumular durante o stresse pode variar entre
diferentes tipos de plantas (Nayyar, 2003; Larher et al., 2003) e especificar diferentes
mecanismos adaptativos.
Muitos dos solutos compatíveis são osmorreguladores, isto é, metabolitos cuja alta
concentração celular reduz significativamente o potencial osmótico, e, portanto, são
considerados responsáveis pelo ajustamento osmótico. Também podem ter outras funções,
nomeadamente na protecção de enzimas e na estrutura das membranas e na eliminação de
ROS, designando-se neste caso de osmoprotectores (Bohnert e Shen, 1999).
As características dos bons osmoprotectores incluem ser hidrofílicos, não-tóxicos e
normalmente sem carga. Estas propriedades são semelhantes aos compostos usados como
crioprotectores para a preservação de células procariotas durante o congelamento (Cleland et
al., 2004). Existe um largo número de osmoprotectores orgânicos, incluindo o manitol, a
trealose, a prolina e a glicina betaína (Stoop et al., 1996; Cleland et al., 2004).
A maioria dos organismos aumentam a concentração celular de solutos compatíveis,
quando estão em perigo de desidratar, quer por efeito de seca quer pelo aumento da pressão
osmótica externa que acompanha, por exemplo, o aumento da salinidade dos solos (Delauney
e Verma, 1993). Os compostos que se acumulam são compatíveis com o metabolismo celular
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
20
normal em elevadas concentrações (Brown e Simpson, 1972 in Bohnert e Shen, 1999). A
adição de solutos compatíveis aumentou a estabilidade térmica de enzimas, e evitou a
dissociação do complexo gerador de oxigénio do PSII (Papageorgiou e Murata, 1995).
Um dos aspectos importantes no estudo dos solutos compatíveis é compreender a
mecânica da sua acção enquanto integrados numa resposta de toda a planta ao stresse, que
inclui a manutenção da homeostase dos iões e das relações hídricas, distribuição
carbono/azoto, alocação das reservas, ou armazenamento (e possivelmente difusão) de poder
redutor (Bohnert et al., 1995). O potássio, se disponível, pode funcionar como soluto
compatível em muitos organismos unicelulares (Bohnert e Shen, 1999). Se existir uma
concentração suficiente de potássio no solo, esta pode levar a uma exclusão do sódio mais
eficiente nas plantas superiores (Niu et al., 1995). Também aminoácidos e derivados de
aminoácidos, açúcares, polióis acíclicos e cíclicos, frutanos, e compostos quaternários de
azoto e enxofre agem frequentemente como solutos compatíveis (Delauney e Verma, 1993;
Vijn e Smeekens, 1999; Bohnert e Shen, 1999).
Foram propostos dois modelos para explicar os efeitos protectores ou estabilizadores
dos solutos compatíveis na estrutura e função das proteínas. O primeiro é denominado
“modelo de exclusão preferencial” (Arakawa e Timasheff, 1985), segundo o qual os solutos
compatíveis são largamente excluídos da película de hidratação das proteínas, que estabiliza a
estrutura da proteína ou promove as interacções proteína-proteína. Neste modelo, os solutos
compatíveis não disturbariam a água de hidratação das proteínas, mas iriam interagir com a
água presente no citosol. O segundo modelo, denominado “modelo da interacção
preferencial”, dá mais relevância às interacções entre os solutos compatíveis e as proteínas
(Schobert, 1977 in Bohnert e Shen, 1999). A película de hidratação das proteínas é crucial
para a sua estabilidade estrutural. Durante o défice hídrico, os solutos compatíveis podem
interagir directamente com os domínios hidrofílicos das proteínas e prevenir a sua
destabilização, ou podem substituir as moléculas de água na proximidade dessas regiões.
Embora os dois modelos possam parecer contraditórios, a verdadeira função dos solutos
compatíveis poderá ser explicada por ambos os modelos. As estruturas dos diferentes solutos
compatíveis poderiam suportar interacções hidrofóbicas, interacções de van-der-Waals, e
interacções de cargas, mas é necessário mais dados para comprovar estas hipóteses (Bohnert e
Shen, 1999).
Os solutos compatíveis também podem funcionar na remoção de ROS. As plantas e os
animais produzem radicais de oxigénio em resposta a uma variedade de stresses, entre os
quais os derivados de ataques patogénicos. Dados experimentais demonstraram que agentes
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
21
patogénicos fúngicos são protegidos pela síntese e excreção de manitol, provando-se que este
é capaz de remover ROS (Halliwell et al., 1988 in Bohnert e Shen, 1999).
Através de experiências que comparavam as capacidades de remoção de radicais por
diferentes solutos compatíveis, verificou-se que o manitol, o sorbitol, o glicerol, a prolina, o
ononitol e o pinitol eram capazes de o fazer, embora a diferentes concentrações in vitro,
enquanto que à glicina betaína não lhe foi atribuída esta função. A eficiência relativa destes
compostos para eliminar radicais parece dependente das suas constantes de reacção com
radicais hidroxilo (Bohnert e Shen, 1999).
Utilizando condições diferentes, como iluminação com luz forte, tratamento com metil
viologénio, geração de H2O2, e infiltração de DMSO, foi demonstrado que as plantas
contendo manitol nos seus cloroplastos apresentavam uma capacidade superior de manter
elevadas taxas de fixação de carbono e um menor branqueamento clorofilino (Shen et al.,
1997b). Experiências posteriores demonstraram que o manitol eliminava especificamente os
radicais hidroxilo mas não eliminava peróxido de hidrogénio ou radical de oxigénio (Shen et
al., 1997a)
Demonstrou-se que algumas enzimas do ciclo de Calvin eram predominantemente
afectadas por radicais hidroxilo. A fosforibulocinase (PRK), e provavelmente outras enzimas-
SH do ciclo de Calvin, demonstraram sensibilidade aos radicais hidroxilo, e a actividade da
PRK foi protegida pela presença de manitol (Shen et al., 1997a).
Assim, a síntese e transporte de solutos compatíveis permitem a protecção contra os
efeitos directos (por hidratação) e indirectos (por eliminação de radicais livres) do stresse
hídrico (Griffiths e Parry, 2002).
As vias que levam à sua síntese estão ligadas a vias do metabolismo geral com
elevadas taxas de fluxo. Exemplos disso são a via biossintética do manitol (Stoop et al.,
1996), a via biossintética da prolina (Delauney e Verma, 1993), a síntese de glicina betaína
(Hanson et al., 1985), e a via que conduz à formação de inositol metilado, D-pinitol (Ishitani
et al., 1996).
O manitol é um açúcar-álcool com grupos hidroxilo composto por seis carbonos, que
se encontra distribuído por todo o reino vegetal. Investigações têm demonstrado que as
espécies capazes de o metabolizar têm vantagens na tolerância ao stresse, nomeadamente um
aumento da tolerância ao stresse hídrico e salino (funcionando como um soluto compatível) e
também no papel que desempenha na resposta aos ataques de agentes patogénicos. Desta
forma, o manitol desempenha, aparentemente, um papel importante quer nas respostas ao
stresse biótico, quer nas respostas ao stresse abiótico.
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
22
Os açúcares osmoprotectores são a forma reduzida de açúcares da classe das aldoses e
cetoses. Devido à estrutura dos grupos hidroxilo reproduzir a estrutura da água, pensa-se que
estes compostos mantenham uma esfera de hidratação artificial em redor das macromoléculas
(Schobert, 1977 in Bohnert e Shen, 1999).
Alguns solutos, não respondem ao stresse por acumulação a níveis elevados mas são
protectores mesmo a baixas concentrações (Holmström et al., 1996 in Bohnert e Shen, 1999),
podendo estar envolvidos em mecanismos não-osmóticos, como por exemplo eliminação de
ROS. É exemplo disto a trealose.
A prolina e os compostos quaternários de amónio (QCA) (por exemplo, a glicina
betaína, colina, prolina betaína) são osmólitos chave que contribuem para o ajustamento
osmótico em muitas espécies cultivadas e acumulam-se sob condições de stresse ambiental
(Hare et al., 1999; Heuer, 2003; Nayyar, 2003; Larher et al., 2003). A prolina tem sido
implicada no alívio da acidose citoplasmática, na manutenção da relação NADP+/NADPH em
valores compatíveis com o metabolismo, como antioxidante compatível com proteínas, para
além do seu papel importante no desenvolvimento da planta em condições sem stresse (Hare
et al., 1999; Raymond e Smirnoff, 2002).
Foi demonstrado, no milho, que a prolina desidrogenase (PDH), a primeira enzima na
via oxidativa da prolina, é regulada durante o stresse hídrico mas não é afectada por
tratamentos com ABA, sugerindo uma regulação mediada pela seca e independente do ABA
(Dallmier e Stewart, 1992). Uma rápida indução da actividade da PDH, durante a recuperação
do stresse, é consistente com a importância da acumulação da prolina durante o stresse como
uma reserva de carbono, azoto e energia rapidamente mobilizável (Hare et al., 1999).
Foi sugerido que as alterações induzidas pelo stresse na síntese e degradação da
prolina podem afectar a expressão dos genes da planta, para além da visão mais clássica do
seu papel no ajustamento osmótico e nos efeitos metabólicos da sua acumulação (Hare et al.,
1999; Raymond e Smirnoff, 2002).
Estes dados sugerem que a PDH pode ser incluída nos alvos a seleccionar na
resistência à seca nas culturas pretendidas (Bruce et al., 2002).
Verificou-se que a aplicação exógena de prolina estimula o crescimento das células e
das plantas e melhora o metabolismo, em condições de stresse (Heuer, 2003). Contudo,
também foram descritos efeitos negativos (Manetas et al., 1986; Rodriguez e Heyser, 1988,
Lin e Kao, 2001). A aplicação exógena de prolina (100 mM) diminui a síntese de prolina em
células de milho em suspensão (Xin e Li, 1993). Tem sido demonstrada uma relação entre a
síntese de prolina e a tolerância à seca e ao stresse salino em plantas de tabaco que expressam
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
23
a enzima da via sintética da prolina, ∆1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) (Kishor et
al., 1995).
A glicina betaína é um osmoprotector muito comum que é utilizado por muitas
bactérias, bem como algumas Archaea halofíticas (Galinski e Trüper, 1994). Também é um
osmoprotector comum nos animais, nas plantas e outros eucariotas (Rhodes e Hanson, 1993
in Cleland et al., 2004). A glicina betaína é um crioprotector simples e útil que funciona para
uma vasta gama de organismos procariotas sob diferentes regimes de criopreservação
(Cleland et al., 2004).
Os QCA, como a glicina betaína, em baixas concentrações, podem melhorar a
tolerância ao stresse salino e ao frio, possivelmente por protecção dos complexos proteicos
fotossintéticos (Holmström et al., 2000), reduzindo a peroxidação lipídica das membranas,
estabilizando as enzimas e as membranas durante as condições de stresse (Bohnert e Shen,
1999; Sakamoto e Murata, 2000).
A aplicação exógena de glicina betaína aliviou os efeitos dos stresses hídrico, salino e
térmico (Harinasut et al., 1996, Agboma et al., 1997, Rajashekar et al., 1999 in Heuer, 2003).
Tal como na prolina, também existem dados sobre a resposta negativa à aplicação exógena de
glicina betaína (Kishitani et al., 2000 in Heuer, 2003).
Estudos realizados com aplicação de cálcio (Ca2+), revelaram que o milho apresentava
uma acumulação de prolina significativamente mais elevada enquanto que o trigo mostrou
relativamente uma maior acumulação de QAC’s (Nayyar, 2003).
As partes aéreas do milho sujeitas a stresse possuíam um maior Ψw, ajustamento
osmótico, taxa de elongação e menor perda de electrólitos, do que as de trigo. O Ca2+ elevou a
acumulação de osmólitos em ambas as plantas mas o ajustamento osmótico foi menos
sensível a ele. Na presença de Ca2+, o trigo mostrou significativamente maior acumulação de
osmólitos, maior Ψw, e maior taxa de elongação do que no milho. Os inibidores de Ca2+
reverteram parcialmente os efeitos do cálcio, indicando o seu envolvimento no controlo da
acumulação de solutos (Nayyar, 2003).
Tem sido atribuído ao Ca2+ o papel de mensageiro secundário e transdutor de sinal de
vários estímulos de stresse (Sanders et al., 1999). Também tem sido demonstrado o seu
envolvimento na ligação da percepção do stresse com as várias respostas celulares adaptativas
(Torrecilla et al., 2000). O Ca2+ tem sido implicado na protecção contra o stresse por
estabilização das membranas e reduzindo os danos oxidativos (Larkindale e Knight, 2002).
Tem sido sugerido que o aumento no Ca2+ citosólico induzido pelo stresse funciona como
gestor da osmorregulação, uma vez que um aumento no Ca2+ citosólico actua como regulador
2. Introdução Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
24
da síntese de prolina. A indução do transcrito para a enzima P5CS, em Arabidopsis, foi
inibida por bloqueadores de canais de Ca2+ (Knight et al., 1997).
Resumindo, a sobre-produção de prolina e QAC’s devido à aplicação de Ca2+ pode
aumentar a protecção contra o stresse como já foi defendido em estudos anteriores (Hare et
al., 1999; Raymond e Smirnoff, 2002).
Num futuro próximo, poderá recorrer-se à transformação genética para direccionar
diferentes solutos compatíveis para diferentes locais subcelulares para protecção da
ultraestrutura dos organitos e das enzimas, e para diferentes órgãos, levando a um aumento na
tolerância da planta ao stresse (Bohnert e Shen, 1999).
2.62.62.62.6.... Técni Técni Técni Técniccccas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção para Tolerância ao Tolerância ao Tolerância ao Tolerância ao
3.3.3.3.3333.1.1.1.1. Determinaç. Determinaç. Determinaç. Determinação do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativo da Folha da Folha da Folha da Folha
O estado hídrico das folhas foi avaliado através do teor hídrico relativo (THR), que
permite determinar a quantidade de água num determinado tecido em relação à quantidade
máxima que esse tecido pode conter. Este parâmetro foi calculado segundo a equação
seguinte (Catsky, 1960):
em que Pf é o peso do material fresco, Pt é o peso do material túrgido e Ps é o peso do
material seco. O peso fresco das amostras nas experiências de stresse lento foi determinado
por excisão de uma pequena porção da folha e pesagem imediata numa balança de precisão
(BP 210D, Sartorius, Germany). As amostras foram depois colocadas em caixas de Petri com
água desmineralizada durante aproximadamente 24 horas, até atingirem o ponto máximo de
hidratação. As amostras foram pesadas, tendo-se tido o cuidado de, previamente, retirar o
excesso de água por ligeira pressão em papel absorvente. Deste modo, obteve-se o peso
túrgido. Por fim, colocaram-se as amostras numa estufa a 80ºC (TV30, W. Memmert,
Pf – Ps THR (%) =
Pt – Ps × 100 (Eq. 1)
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
31
Schwabach, Germany), durante pelo menos 48 horas, obtendo desta forma o peso seco das
amostras.
Nas experiências de stresse rápido o procedimento foi semelhante, tendo, contudo,
sido utilizados os próprios segmentos da folha analisada para determinação do THR. Os
fragmentos foram pesados ao longo da experiência para ulteriormente se determinar os
correspondentes THR ao longo da experiência.
Foi determinada, sempre que necessário, a área das amostras com um medidor de
áreas (CI-202 Portable Leaf Area Meter, CID, Inc., Camas, Washington, USA).
3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo
O teor hídrico do solo (THS) foi calculado como a percentagem de massa de água em
relação à massa do solo (Costa, 1985). O solo foi sendo pesado ao longo de vários dias e a
quantidade de água medida com um higrómetro comercial (Ubbink, modelo 2125050,
Holanda), correlacionando a escala do aparelho com o THS para uma mais prática inferência
sobre o estado hídrico do solo ao longo das experiências. Para se obter a percentagem de água
no solo, procedeu-se à sua pesagem após um período de 72 horas numa estufa a 104ºC. O
THS máximo corresponde à sua capacidade de campo, em que o solo se encontra saturado,
após eliminação do excesso de água.
3.3.3.3.4444. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas por por por por Análise de Gases por Análise de Gases por Análise de Gases por Análise de Gases por
A fotossíntese é um dos processos fisiológicos mais estudado nas plantas, sendo
necessário técnicas que permitam quantificar as trocas gasosas que ocorrem nos tecidos
vegetais. A importância de tais métodos no estudo das alterações fisiológicas em plantas
sujeitas a stresses ambientais é notória, permitindo uma avaliação do estado em que se
encontra a planta.
O desenvolvimento recente ao nível da electrónica permitiu a criação de sistemas
altamente complexos e sofisticados que fazem medições muito precisas. Simultaneamente,
desenvolveram-se as técnicas de processamento digital que permitem, com rapidez e precisão,
adquirir dados de uma forma fácil.
Os critérios para decidir qual é o método mais adequado para uma determinada
experiência incluem o gás a ser medido (O2 ou CO2), o meio em que as medidas vão ser
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
32
realizadas (aquoso ou gasoso), o nível de actividade metabólica da amostra e a resolução do
aparelho, a gama de concentrações do gás a que a amostra vai ser sujeita (capacidade do
analisador), se as respostas são ou não rápidas (tempo de resposta do aparelho), a necessidade
de medições contínuas ou pontuais (sistemas abertos ou fechados), e se a amostra pode ou não
ser sujeita a um método de análise destrutivo (Hunt, 2003).
Os resultados deveriam ser avaliados utilizando uma combinação das tecnologias
disponíveis, combinando a fluorescência com as técnicas de trocas gasosas, preferencialmente
em associação com medidas grosseiras de O2 feitas utilizando um espectrómetro de massa
(Haupt-Herting e Fock, 2002).
O analisador de gases por radiação infra-vermelha (IRGA, do inglês Infra Red Gas
Analyser) consiste num sistema que permite realizar medições das trocas gasosas num sistema
aberto. Esta técnica segue o princípio de medição de gases por infra-vermelhos não-
dispersivos (NDIR, em inglês), o qual permite medições de moléculas heteroatómicas (como
o CO2), através da absorção da radiação infra-vermelha em bandas específicas do espectro das
moléculas de gás. Desta forma, quanto maior a concentração de CO2, maior a quantidade de
radiação infravermelha absorvida pelas moléculas, logo menor a quantidade de radiação que
chega ao detector de Luft. A principal banda de absorção do CO2 é nos 4,25 µm com picos
secundários nos 2,66 µm, nos 2,77 µm e nos 14,99 µm (Hill e Powell, 1968 in Hunt, 2003).
Na calibração deve ser determinado o zero e também a quantidade de CO2 presente na
atmosfera. Actualmente, assume-se o valor de 370 ppm de CO2, como o valor atmosférico
(Hunt, 2003).
É necessário ter em conta a temperatura e a pressão a que se realiza a experiência
porque afectam a quantidade molar de CO2 por unidade de volume de ar (mol.m-3). O vapor
de água também poderá interferir com a medição, um vez que possui um pico nos 2,7 µm,
perto de um dos picos do CO2. Deve ser utilizado perclorato de magnésio para retirar a água,
mas não gel de sílica uma vez que este interfere com a quantidade de CO2 presente (Hunt,
2003).
Para uma medição correcta, é preciso ter em conta a taxa de fluxo que atravessa a
câmara, dado que as taxas de troca gasosa de CO2 dependem dela. Isto pode ser facilmente
obtido através da utilização de fluxómetros que permitam a medição e regulação do fluxo.
As taxas fotossintéticas são normalmente expressas em termos de µmoles de CO2 por
unidade de tempo e por um outro parâmetro da amostra (normalmente biomassa ou área).
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
33
Esta técnica da medição da troca gasosa do CO2 é utilizada em quase todos os estudos
fotossintéticos, uma vez que as alterações deste gás são proporcionalmente superiores ao do
O2 e assim mais fáceis de medir com precisão.
Neste trabalho foram utilizados dois modelos de IRGA (LCPro+ e LCA-2, ADC – The
Analytical Development Co., Ltd., Hoddesdon, England) no stresse lento da fase I, tendo sido
utilizado apenas o modelo LCPro+, nas restantes experiências.
As taxas das trocas gasosas e das condutâncias estomáticas foram calculadas
automaticamente no modelo LCPro+, e recorrendo às equações de von Caemmerer e Farquhar
(1981) e Long e Hallgren (1985, 1993) para o modelo LCA-2, de acordo com o descrito em
Marques da Silva (1999), e a eficiência do uso de água (WUE) foi calculada pela razão entre a
taxa fotossintética e a taxa transpiratória.
3.3.3.3.5555. Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência Modulada Modulada Modulada Modulada da Cda Cda Cda Clorofilalorofilalorofilalorofila aaaa
A fluorescência da clorofila a tornou-se numa das técnicas mais úteis nas áreas de
investigação da Fisiologia Vegetal e Ecofisiologia. Actualmente, muita da investigação em
fotossíntese, sobretudo em condições de stresse, inclui dados da fluorescência (Fracheboud et
al., 1999; Hymus et al., 1999; Maxwell e Johnson, 2000).
A energia luminosa absorvida pelas moléculas de clorofila in vivo pode ter três
destinos possíveis: pode ser utilizada para conduzir a fotossíntese (processo fotoquímico);
pode ser dissipada sob a forma de calor (processos não-fotoquímicos); ou pode ser reemitido
como luz (fosforescência ou fluorescência da clorofila). Existe competição entre estes três
processos (Maxwell e Johnson, 2000).
Através da medição da fluorescência da clorofila a, podem recolher-se informações
acerca da eficiência dos processos fotoquímicos e não-fotoquímicos. Actualmente, muitos
sistemas de medição utilizam luz de excitação modulada, permitindo ler apenas a
fluorescência resultante da excitação pela luz utilizada, podendo as medições ocorrer na
presença de luz ambiente. Estes aparelhos denominam-se por fluorómetros PAM (Pulse
Amplitude Modulated).
Embora a quantidade total de fluorescência da clorofila a seja muito pequena em
condições in vivo, representando apenas 3 ou 4% do total de luz absorvida (Björkman e
Demmig-Adams, 1995), a sua medição é muito simples. O pico de emissão de fluorescência
na zona do vermelho longínquo possui um comprimento de onda maior que o da luz
absorvida. Assim, o rendimento pode ser determinado expondo a folha a uma radiação
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
34
fotossinteticamente activa de comprimento de onda definido e medindo a quantidade de luz
(fluorescência) emitida. Estas medições são apenas relativas, e qualquer análise necessita de
uma forma de normalização (Maxwell e Johnson, 2000).
Kautsky e os seus colaboradores descobriram que após a transferência de material
fotossintético do escuro para a luz, havia um aumento no rendimento da fluorescência da
clorofila a durante o período de cerca de 1 segundo. Este aumento tem sido descrito como
uma consequência da redução de aceitadores de electrões na via fotossintética, a jusante do
PSII, nomeadamente a plastoquinona, em particular a QA. Quando o PSII recebe luz e QA
recebe um electrão, não pode aceitar outro até ser passado para o transportador de electrões
posterior (QB). Durante este período de tempo, diz-se que o centro de reacção está fechado.
Em qualquer altura, a presença de uma proporção de centros de reacção fechados leva a uma
redução global da eficiência fotoquímica e ao correspondente aumento no rendimento da
fluorescência (Maxwell e Johnson, 2000; Hunt, 2003).
Em plantas adaptadas às escuras (todos os centros de reacção abertos) pode medir-se a
fluorescência basal (Fo) do sistema fazendo incidir na amostra uma luz de medição de PPFD e
frequência suficientemente baixa para não produzir actos fotoquímicos ou processos não
fotoquímicos. Se esta amostra for sujeita a um pulso saturante de luz actínica (entre 5000 e
10000 µmol fotões.m-2.s-1) durante 0,8 segundos, os centros de reacção ficam
momentaneamente fechados e, uma vez que os processos de dissipação de energia são
competitivos, tem-se um rendimento máximo da fluorescência (Fm). A expressão (Fm-Fo)/Fm,
normalmente referida como Fv/Fm, representa a eficiência máxima da conversão de energia
pelos centros de reacção abertos dos PSII. Este valor é altamente conservado, sendo cerca de
0,8 em plantas não sujeitas a stresse (Maxwell e Johnson, 2000; Hunt, 2003) e indica que é
necessária a energia de 9-10 fotões absorvidos para a produção de uma molécula de O2 na
fotossíntese (Walker e Osmond, 1986 in Hunt, 2003). Uma redução neste valor indica que o
PSII foi danificado devido a factores ambientais ou à aplicação de inibidores (Maxwell e
Johnson, 2000).
Normalmente, demora alguns minutos até a fluorescência atingir um estado de
equilíbrio (F’), quando o sistema é iluminado por luz actínica. Se a amostra for então sujeita a
um novo pulso de luz saturante, o rendimento da fluorescência aumenta até um valor máximo
(Fm’) inferior ao valor máximo (Fm) obtido durante o período em que a amostra esteve no
escuro. A expressão (Fm’-F’)/Fm’ representa o rendimento quântico efectivo do fotossistema II
(ΦPSII) (Genty et al., 1989). As medições da fluorescência permitem também a medição da
taxa de transporte de electrões (ETR) dada pela expressão ETR = ΦPSII × PPFD × 0,5 × 0,84,
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
35
em que o factor 0,5 corresponde à fracção de fotões que chega ao PSII (relativamente ao PSI)
e o factor 0,84 corresponde à fracção de luz incidente que é absorvida pela folha.
Durante o primeiro segundo de iluminação, há um aumento do rendimento da
fluorescência da clorofila a. Contudo, a partir daí o nível de fluorescência volta a diminuir até
um valor constante. Este fenómeno denomina-se amortecimento da fluorescência e pode ser
explicado por dois processos. O primeiro refere-se ao aumento na taxa de transporte de
electrões no PSII, devido, sobretudo, à activação induzida pela luz de enzimas envolvidas no
metabolismo do carbono e à abertura dos estomas. Este amortecimento é denominado
amortecimento fotoquímico, do qual se pode calcular o coeficiente de amortecimento
fotoquímico (qP) que é dado pela expressão (Fm’–F’)/(Fm’–Fo’) onde Fo’ corresponde à
fluorescência basal mínima obtida quando a luz actínica é desligada. Simultaneamente, existe
um aumento na eficiência da conversão de energia em calor. Este processo é denominado
amortecimento não-fotoquímico, calculando-se o coeficiente de amortecimento não-
fotoquímico (qN) que é dado pela expressão (Fm–Fm’)/(Fm–Fo’) (Müller et al., 2001). Por sua
vez, o amortecimento não-fotoquímico pode ser dividido em três componentes (Quick e Stitt,
1989): qE, que corresponde ao amortecimento de alta energia, resultante da energização dos
tilacóides devido ao aumento do gradiente de pH transmembranar; qT, que corresponde ao
amortecimento de transição do estado energético I para o estado energético II e que resulta da
fosforilação das proteínas dos complexos antena do PSII (LHCII); e qI, que corresponde ao
amortecimento fotoinibitório. De entre os três, qE é o maior componente de qN (Quick e Stitt,
1989). Numa planta típica, alterações nestes dois processos, qP e qN, estarão completas em
cerca de 15-20 minutos e um estado estacionário é atingido, embora o tempo necessário para
alcançar este estado possa variar significativamente entre espécies de plantas (Maxwell e
Johnson, 2000; Hunt, 2003).
Este é um método bastante vantajoso para avaliar o estado de uma planta uma vez que
é uma técnica não-invasiva, não havendo necessidade de destruir a amostra durante as
medições.
Neste trabalho foram utilizados dois fluorómetros PAM, um modelo mais simplificado
na fase I (PAM 210, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany) e um modelo mais complexo
na fase II (PAM 101 Chlorophyll Fluorometer, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany). Os
detalhes da sua utilização são descritos na metodologia dessas fases.
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
36
3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O2222
O eléctrodo de oxigénio de fase gasosa consiste num aparelho com um cátodo de
platina e um ânodo de prata ligados por um electrólito contendo KCl. Este conjunto está
separado da amostra por uma membrana permeável ao oxigénio. Aplica-se uma voltagem de
cerca de 0,7 V de modo a que o O2 seja reduzido a H2O2 (sendo depois reduzido a iões
hidroxilo) no cátodo de platina. Os quatro electrões necessários para a ocorrência desta
redução são fornecidos pela oxidação do ânodo de prata, formando-se cloreto de prata. O
fluxo entre o ânodo e o cátodo é directamente proporcional à concentração de O2 que se forma
nos cloroplastos da amostra (Hunt, 2003).
A câmara é fechada de modo a que o O2 se acumule na amostra durante a fotossíntese.
Esta técnica também pode ser utilizada para estudar a respiração, na qual se observa, neste
caso, uma depleção de O2.
A inclinação da curva fornece uma medida da taxa de troca gasosa para o O2, a partir
da qual se pode calcular a taxa fotossintética através da área da amostra. A calibração do
instrumento é realizada acertando o zero através da utilização de N2 e um valor máximo
saturando a câmara com O2.
Outro factor a ter em atenção é a temperatura a que se conduz a experiência, uma vez
que a solubilidade do O2 e a permeabilidade da membrana variam com este factor. Também é
importante ter especial cuidado com a membrana do eléctrodo uma vez que é muito sensível e
poderá comprometer as medições se estiver em mau estado (Hunt, 2003).
Pode-se medir as trocas de O2 num disco foliar que é selado na câmara. O eléctrodo
situa-se na parte inferior do disco, enquanto se fornece luz actínica na parte superior. Nas
paredes da janela da câmara circula água de modo a controlar a temperatura. Uma vez que o
volume da câmara é muito pequeno, fornece-se CO2 à câmara através de uma solução de
bicarbonato de potássio.
É necessário determinar o volume da câmara, injectando um volume de ar com uma
seringa. A alteração do sinal do eléctrodo de O2 pode ser utilizado para calcular o volume da
câmara, uma vez que depende na quantidade de O2 na seringa e na pressão do O2 (valores
conhecidos) (Hunt, 2003).
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
37
3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas
Num estudo envolvendo enzimas é necessário que a sua actividade seja preservada.
Desta forma é necessário haver uma paragem rápida da actividade metabólica, para evitar que
enzimas proteolíticas actuem sobre a enzima cuja actividade se pretende determinar (Marques
da Silva e Arrabaça, 2004b). Uma das formas de assegurar que tal acontece é congelar a
amostra em azoto líquido.
Também o processo de extracção das enzimas é um dos passos cruciais para a
avaliação da sua actividade, uma vez que é necessário manter as condições fundamentais de
funcionamento, de modo a minimizar perda de actividade. No entanto, a extracção de enzimas
solúveis, como é o caso da RuBisCO (EC 4.1.1.39), da PEPC (EC 4.1.1.31) e da EM-NADP
(EC 1.1.1.82), envolve sempre a ruptura da parede celular, normalmente através de
esmagamento manual em almofariz. No caso da RuBisCO de plantas C4, o problema agrava-
se uma vez que está localizada nas células da bainha do feixe vascular, as quais apresentam
uma parede celular mais espessa (Edwards e Walker, 1983 in Marques da Silva, 1999).
Assim, é necessário que o meio de extracção possua condições que permitam manter a
conformação estrutural das enzimas. Factores como o pH, temperatura, presença de agentes
quelantes, como o EDTA, e concentração salina necessitam ser controlados no meio de
extracção.
Neste trabalho experimental, as enzimas RuBisCO, PEPC e EM-NADP foram isoladas
a partir de um extracto comum. A actividade da RuBisCO foi determinada por incorporação
de carbono radioactivo (14C), procedendo-se à sua medição num contador de cintilações,
permitindo calcular o carbono fixado num determinado período de tempo. Por outro lado, as
actividades da PEPC e da EM-NADP foram determinadas por espectrofotometria (ver 5.2.6).
3.3.3.3.8888. Análise E. Análise E. Análise E. Análise Estatísticastatísticastatísticastatística
O tratamento estatístico dos resultados foi realizado recorrendo a análise e comparação
de modelos de regressão e análise de variâncias (ANOVA), recorrendo ao software GraphPad
Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., USA).
Para cada par de variáveis, foram efectuadas uma regressão linear e uma regressão
quadrática, escolhendo o mais indicado através da realização de um teste F, admitindo sempre
um α de 0,05. Nas curvas de resposta da taxa fotossintética líquida à PPFD foi utilizada a
equação de Platt et al. (1980).
3. Metodologia Geral
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
38
As curvas ajustadas foram apresentadas nos gráficos, com a respectiva equação, o
coeficiente de determinação e o nível de significância (p). Nos casos de ajuste da função
quadrática, é indicado o nível de significância em relação à função linear.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
39
4. Fase I 4. Fase I 4. Fase I 4. Fase I –––– Análise Análise Análise Análise Preliminar Preliminar Preliminar Preliminar ddddeeee Seis VariedadesSeis VariedadesSeis VariedadesSeis Variedades
Portuguesas Portuguesas Portuguesas Portuguesas de Milhode Milhode Milhode Milho
O THR e o THS foram determinados segundo o descrito em 3.3.1. e 3.3.2..
4.4.4.4.2.2.2.2.3333. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas
Através da análise de gases no IRGA foi possível determinar vários parâmetros que
permitem caracterizar as trocas gasosas, como a taxa fotossintética (A), taxa transpiratória
(E), condutância estomática (gs) e a pressão parcial de CO2 no espaço intercelular (Ci), nas
folhas das seis variedades portuguesas de milho.
As medições nesta fase foram efectuadas em dois modelos de IRGA (LCPro+ e LCA-
2), ambos do mesmo fabricante (ADC – The Analytical Development Co., Ltd., Hoddesdon,
England). Inicialmente seria apenas utilizado o modelo LCPro+, mas devido a avaria deste
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
40
iniciou-se ulteriormente a utilização do modelo LCA-2. Deste modo, nas experiências de
stresse lento foram utilizados os dois modelos, enquanto que nas experiências de stresse
rápido foi apenas utilizado o modelo LCPro+.
Embora o modelo LCPro+ possua registo automático e controlo dos parâmetros
integrados, o modo de funcionamento dos dois IRGA é semelhante, à excepção de alguns
detalhes: no modelo LCPro+, a fonte luminosa era um LED que se colocava no topo da
câmara, enquanto que, no modelo LCA-2, a fonte de luz era a de um projector de slides
(Sawyer’s 302 Automatic, Belgium); a humidade e a temperatura no interior da câmara eram
controladas no modelo LCPro+, algo que não acontecia com o modelo LCA-2, embora fosse
possível a sua monitorização.
Os ensaios foram efectuados sob condições atmosféricas de CO2 (actualmente situa-se
próximo de 370 ppm). Para determinar a PPFD adequada a utilizar nesta fase, foi efectuado
um ensaio preliminar em várias plantas com o modelo LCPro+. A taxa fotossintética máxima,
sem fotoinibição visível na fotossíntese aparente, foi obtida com 870 µmol fotões.m-2.s-1 (ver
4.3.2.). Também foi determinado o período mínimo de iluminação das folhas para se atingir a
fotossíntese máxima, sendo este de 20 minutos. Contudo, foi utilizado nas experiências um
período de 30 minutos de iluminação para garantir a activação das enzimas do metabolismo
do carbono. Quando foi utilizado o modelo LCPro+, foi também seleccionada uma humidade
de 10 mbar e uma temperatura de 21ºC (correspondia a cerca de 25ºC ao nível da folha).
Nas experiências de stresse lento, foram utilizadas folhas não destacadas, procedendo-
se à sua medição de 2 em 2 dias, ao longo de duas semanas. Apenas era destacada uma
pequena porção dessa folha para determinação do THR (segundo o descrito em 3.3.1.).
Nas experiências de stresse rápido, a primeira medição era efectuada na folha ainda
intacta, tendo sido realizadas ao longo de um dia. As medições posteriores foram efectuadas
na mesma área da folha mas já destacada da planta (fragmento com cerca de 8 cm de
comprimento), de modo a obter tecidos com diferentes níveis hídricos. No final da
experiência, o fragmento foi tratado segundo o descrito em 3.3.1..
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
41
4.4.4.4.2.42.42.42.4. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofila aaaa
As medições da fluorescência modulada da clorofila a foram efectuadas utilizando o
fluorómetro PAM 210 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany) ligado a um computador
possuindo o software de registo de dados DA-TEACH v1.11 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich,
Germany).
O método utilizado foi idêntico nas experiências de stresse lento e de stresse rápido,
tendo sido utilizada a mesma folha analisada no IRGA.
Para medir a variação da área complementar (normalizada) à fase rápida da curva de
Kautsky, adaptou-se a folha ao escuro durante 10 minutos. Utilizou-se o Triggered Mode do
software mencionado, com as seguintes definições: o pulso de luz saturante com nível 10
(correspondendo à PPFD máxima obtida neste fluorómetro de 3500 µmol fotões.m-2.s-1,
considerando-se os pulsos de luz saturante suficientemente fortes para ocorrer o fecho dos
centros de reacção), luz de medição com nível 10, e os parâmetros de gain e damp
seleccionados para 1. Dado que o fabricante do PAM não indica os valores absolutos das
intensidades da luz de medição foi assumido que a luz de medição utilizada é suficientemente
fraca para manter os centros de reacção abertos.
Para determinar os vários parâmetros de fluorescência, utilizou-se o Saturated Pulse
Mode do software mencionado. Novamente, colocou-se a folha na escuridão, durante 5
minutos. Após este período de tempo, foi fornecido um pulso de luz saturante, de modo a
determinar o rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm).
Para determinar o rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII), a taxa de transporte
electrónico (ETR) e os coeficientes de amortecimento fotoquímico (qP) e não-fotoquímico
(qN) no software foi fornecida à folha uma luz actínica (nível 9, que corresponde a uma PPFD
de 840 µmol fotões.m-2.s-1, próxima à utilizada no IRGA), durante 30 minutos, período após o
qual se deu um pulso de luz saturante.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
42
4.3. Resultados4.3. Resultados4.3. Resultados4.3. Resultados e Discussão e Discussão e Discussão e Discussão
Os ensaios realizados durante a primeira fase do trabalho permitiram a selecção de
duas variedades de milho distintas na sua resposta ao stresse hídrico, sendo uma tolerante e a
Os valores de A nas experiências de stresse rápido são mais baixos em todas as
variedades quando comparados com os valores das experiências de stresse lento (Fig. 4.6).
Tal facto poderá estar relacionado com um curto período em que as plantas estiveram sujeitas
a temperaturas mais elevadas devido a avaria da câmara de crescimento. Alterando desta
forma as condições de crescimento, as plantas procederam a um ligeiro fecho dos estomas
(valores inferiores aos do stresse lento observados na Fig. 4.14), e, como tal, partindo de A
mais baixas também poderão ter-se anulado a THR mais altos. Com esta reserva, procedeu-se
à análise dos dados obtidos.
Nas experiências de stresse rápido verificou-se que A aparente se anulava a THR entre
60 e 70% nas diferentes variedades, à excepção de PB64 em que isso sucedeu a THR de cerca
de 85% (ver caixas da Fig. 4.13). Observa-se que, neste caso, a fotossíntese diminuiu mais
rapidamente que nas experiências de stresse lento (Fig. 4.6), sobretudo devido a um rápido
fecho dos estomas nestas condições (Fig. 4.14).
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
60
AD3R
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = 4,684 – 0,305x+ 0,003702x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)
PB64
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB260
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 17,2 + 0,2763x (r2 = 0,84 ; p < 0,01)
PB269
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)A
(µµ µµ
mo
l C
O2.m
-2.s
-1)
y = 2,923 – 0,2474x+ 0,003161x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)
PB304
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = 12,86 – 0,6169x+ 0,006596x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,01)
PB369
50 60 70 80 90 100
-5
0
5
10
15
20
THR (%)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 15,38 + 0,2578x (r2 = 0,70 ; p < 0,01)
Fig. 4.13 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função do teor hídrico relativo (THR),
nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
Relativamente à gs, e também como acontece em relação a A (Fig. 4.13), a mesma
anula-se a THR de cerca de 60-70% para todas as variedades, à excepção de PB64, que
diminui abruptamente até um THR na ordem dos 85% e depois mantém-se sem se anular (Fig.
4.14). Observa-se um rápido fecho dos estomas com a diminuição do THR, a partir do qual os
valores permanecem praticamente nulos, o que evita a perda de água através das folhas, nos
períodos de maior défice hídrico (Raschke, 1970).
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
61
AD3R
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,1487 – 0,005555x+ 5,4142e-5x2 (r2 = 0,88 ; p < 0,05)
PB64
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,975 – 0,02559x+ 0,0001691x2 (r2 = 0,69 ; p < 0,05)
PB260
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,2519 – 0,009277x + 8,3765e-5x2 (r2 = 0,88 ; p < 0,05)
PB269
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,165 – 0,005727x + 5,084e-5x2 (r2 = 0,94 ; p < 0,05)
PB304
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,1702 – 0,006466x + 6,1748e-5x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,05)
PB369
40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
THR (%)
gs (
mo
l.m
-2.s
-1)
y = 0,1132 – 0,003909x + 3,5903e-5x2 (r2 = 0,72 ; p < 0,05)
Fig. 4.14 – Variação da condutância estomática (gs) em função do teor hídrico relativo (THR), nas
experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
Pode observar-se na Fig. 4.15, a diminuição de E com a diminuição do stresse hídrico,
muito semelhante a gs. De salientar as relativamente elevadas E da variedade PB64 mantidas a
baixos THR devido ao não anulamento da gs.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
62
AD3R
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol.
m-2
.s-1
)
y = 2,023 – 0,07554x + 0,0007849x2 (r2 = 0,96 ; p < 0,05)
PB64
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol.
m-2
.s-1
)
y = 14,23 – 0,3733x + 0,002504x2 (r2 = 0,70 ; p < 0,05)
PB260
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol.
m-2
.s-1
)
y = 2,716 – 0,1089x + 0,001091x2 (r2 = 0,91 ; p < 0,05)
PB269
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol.
m-2
.s-1
)
y = 2,688 – 0,09357x + 0,0008661x2 (r2 = 0,96 ; p < 0,05)
PB304
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol
m-2
s-1
)
y = 2,456 – 0,09103x + 0,0009155x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,01)
PB369
40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
E (
mm
ol
m-2
s-1
)
y = 0,7149 – 0,03273x + 0,0004125x2 (r2 = 0,75 ; p < 0,05)
Fig. 4.15 – Variação da taxa transpiratória (E) em função do teor hídrico relativo (THR), nas
experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
Na Fig. 4.16 está representada a variação de Ci em função do THR, onde se observa
que até valores de THR próximos de 70-80%, Ci pouco varia (valores assinalados com caixas
nos gráficos). Este facto poderá estar relacionado com o facto de A e gs covariarem até este
valor de THR. Abaixo desse valor, à medida que o THR diminui observa-se um aumento de
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
63
Ci, relacionado com os dados já referidos anteriormente (ver Fig. 4.9) Apenas na variedade
PB64, tal facto não se observa, em parte por não se terem obtido THR mais reduzidos, mas
também poderá resultar do facto de gs não se anular e o CO2 respirado ser libertado para o
exterior, não ocorrendo acumulação deste.
AD3R
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 2639 – 55,16x + 0,3079x2 (r2 = 0,82 ; p < 0,05)
PB64
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 762,8 – 5,731x (r2 = 0,74 ; p < 0,01)
PB260
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 3553 – 75,86x + 0,4261x2 (r2 = 0,67 ; p < 0,05)
PB269
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 3531 – 76,96x + 0,4351x2 (r2 = 0,93 ; p < 0,01)
PB304
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 3082 – 67,03x + 0,3751x2 (r2 = 0,84 ; p < 0,05)
PB369
40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
THR (%)
Ci (p
pm
)
y = 3305 – 69,44x + 0,9091x2 (r2 = 0,91 ; p < 0,05)
Fig. 4.16 – Variação da concentração interna de CO2 (Ci) em função do teor hídrico relativo
(THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes
plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
64
Relativamente à WUE, verificou-se sempre uma anulação da mesma para THR de
cerca de 70-75%, à excepção da variedade PB64 em que tal sucedeu a THR de 80% (Fig.
4.17). Esta variedade parece ter alguma sensibilidade ao stresse hídrico por indução rápida.
Todas as variedades apresentaram uma WUE de 5-6 µmol CO2 / mmol H2O perto da
hidratação total, semelhante às registadas por Kang e Zhang (2004) no milho, à excepção das
variedades PB304 e PB369 que possuem uma WUE ligeiramente mais elevada (8 µmol CO2 /
mmol H2O).
AD3R
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
PB64
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
PB260
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
PB269
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
PB304
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
PB369
50 60 70 80 90 100
-15
-10
-5
0
5
10
THR (%)WU
E
( µµ µµm
ol
CO
2 /
mm
ol
H2O
)
Fig. 4.17 – Variação da eficiência do uso da água (WUE) em função do teor hídrico relativo
(THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes
plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
65
Os valores negativos de WUE observados no gráfico resultam de existirem valores
negativos de A, provavelmente resultantes de respiração celular a stresse hídrico mais elevado
(THR foliar perto de 50%), associados a uma reduzida mas presente transpiração (Fig. 4.15).
AD3R
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 2,554 + 179,8x – 595,8x2 (r2 = 0,98 ; p < 0,05)
PB64
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 1,889 + 118,7x (r2 = 0,98 ; p < 0,01)
PB260
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 0,5647 + 149,8x – 512,8x2 (r2 = 0,95 ; p < 0,05)
PB269
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 1,645 + 180,2x – 659,8x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,05)
PB304
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 1,383 + 132,3x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)
PB369
0.1 0.2
-5
0
5
10
15
20
gs (mol.m-2.s-1)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
y = – 1,617 + 159x (r2 = 0,96 ; p < 0,01)
Fig. 4.18 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs), nas
experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
Comparando A com gs verifica-se que as variedades AD3R, PB260 e PB269
apresentam uma relação polinomial de segundo grau, enquanto que as variedades PB64,
PB304 e PB369 apresentam uma relação linear (Fig. 4.18). As primeiras conseguem manter
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
66
níveis de A mais ou menos constantes até uma determinada gs, o que indica uma maior
tolerância ao stresse hídrico, enquanto que as últimas diminuem a sua A consoante a gs,
perdendo em parte produtividade e demonstrando uma maior sensibilidade ao stresse hídrico.
De notar também que, tal como no stresse lento, as funções aplicadas não cruzam a
origem, ou seja, quando A se anula, os estomas não estão totalmente fechados, podendo
indicar algumas limitações a nível do mesófilo ou não-estomáticas (ver Fig. 4.11) (Lawlor,
2002), embora possa resultar da uma A real tão baixa que é “mascarada” pelo CO2 respirado.
AD3R
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB64
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB260
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB269
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB304
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
PB369
250 500 750 1000
-5
0
5
10
15
20
Ci (ppm)
A (
µµ µµm
ol
CO
2.m
-2.s
-1)
Fig. 4.19 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a concentração interna de CO2 (Ci),
nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
67
Na Fig. 4.19 verifica-se que, quando A varia, os valores de Ci se mantém constantes
num determinado intervalo (cerca de 130-230 ppm), tal como sucedia no stresse lento (Fig.
4.12). No entanto, quando A se anula, os valores de Ci aumentam para valores que chegam a
ser o triplo dos verificados em condições de hidratação total ou stresse moderado,
provavelmente devido a um aumento da respiração (Lawlor e Cornic, 2002).
A análise dos parâmetros das trocas gasosas nos ensaios de stresse rápido permitem
observar uma rápida resposta das variedades portuguesas de milho ao período do dia
correspondente a um maior défice hídrico e défice de pressão de vapor (Marques da Silva e
Arrabaça, 2004b). Uma resposta mais rápida a uma diminuição brusca do THR foliar é
fundamental para que as perdas de água sejam minimizadas e as plantas mantenham o seu
estado hídrico constante. Para tal é necessário uma optimização da regulação estomática por
parte das plantas de modo a que também as limitações não-estomáticas sejam minimizadas
com a perda de água (Raschke, 1970). Especificamente, na variedade PB64, gs e E não se
anulam e, portanto, pode desidratar mais facilmente a meio do dia. Por outro lado, nas
variedades PB260 e PB269, gs diminui num determinado intervalo sem ocorrer diminuição de
A e, desta forma, da produtividade.
Esta resposta rápida verificou-se em todas as variedades de milho. Os parâmetros
analisados (A, E, gs, WUE) anularam-se de uma forma mais rápida do que nos ensaios de
stresse lento. No caso do Ci, houve uma manutenção dos valores até um determinado THR
seguido de um aumento, tal como aconteceu no stresse lento.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
68
4.3.3. Flu4.3.3. Flu4.3.3. Flu4.3.3. Fluorescência Moduorescência Moduorescência Moduorescência Modulada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofila aaaa
4.3.34.3.34.3.34.3.3.1.1.1.1. . . . Stresse LentoStresse LentoStresse LentoStresse Lento
Na Fig. 4.20 está representada a variação da área complementar (normalizada pela
fluorescência basal) à fase rápida da curva de Kautsky, em função do THR, que nos permite
inferir sobre a dimensão do pool de quinonas (Lazár, 1999).
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000
250
500
750
1000
1250
THR (%)
(mV
*ms)/
(F0*1
000)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
Fig. 4.20 – Variação da área complementar (normalizada) à fase rápida da curva de Kautsky em
função do teor hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos
de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
69
Verifica-se que, à medida que o THR diminui, o pool de quinonas também diminui.
Pode observar-se que nas variedades AD3R, PB64 e PB304 a variação é maior, enquanto que
nas variedades PB260, PB269 e PB369 essa variação é menor. Na variedade PB260, só em
stresse intenso (THR entre 30 e 50%) é que a diminuição é visível.
Após a irrigação, a variedade AD3R demonstrou maior dificuldade na recuperação do
parâmetro, enquanto nas restantes variedades recuperou para valores próximos dos iniciais.
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000.2
0.4
0.6
0.8
THR (%)
Fv/F
m
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
Fig. 4.21 – Variação do rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) em função do teor hídrico
relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de
diferentes plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
70
Relativamente ao Fv/Fm, verifica-se um valor perto de 0,8 unidades relativas perto da
hidratação total, descrito para a maioria das espécies vegetais em condições de ausência de
stresse (Fracheboud et al., 1999; Nogués e Baker, 2000; Maxwell e Johnson, 2000) (Fig.
4.21).
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
THR (%)
ΦΦ ΦΦP
SII
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
Fig. 4.22 – Variação do rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII) em função do teor hídrico
relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de
diferentes plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
71
Até a um THR de 80% (stresse baixo), este parâmetro mantém-se constante entre as
0,7 e 0,8 unidades relativas. Com a diminuição do THR (agravamento do stresse), há um
decréscimo deste parâmetro até às 0,6 unidades relativas. As variedades AD3R e PB304
foram as únicas que apresentaram valores inferiores a este. No caso de AD3R, apresentou
valores inferiores a este no intervalo de THR de 50-70% (stresse moderado), e no caso de
PB304 apresentou um único ponto inferior a este para um THR de cerca de 40% (stresse
intenso). Tal facto indica um efeito negativo nos centros de reacção do PSII, provavelmente
devido a degradação dos componentes (van Wijk et al., 1994; Mattos et al., 1999; Maxwell e
Johnson, 2000). De qualquer modo, este parece ser um parâmetro bastante robusto e pouco
sensível a estes níveis de stresse testados.
Após a iluminação das folhas, o ΦPSII apresentou, perto da hidratação total, um valor
próximo de 0,35 nas variedades AD3R, PB260, PB304 e PB369 e próximo de 0,25 nas
variedades PB64 e PB269, decrescendo à medida que o THR diminuía (Fig. 4.22). As
variedades AD3R, PB64, PB304 e PB369 são aquelas em que este decréscimo foi mais
acentuado, mesmo em stresse moderado (THR entre 50% e 80%). PB64 foi a variedade que
apresentou um valor de ΦPSII superior ao inicialmente observado, após irrigação. Por outro
lado, em PB260 e PB269 o decréscimo não foi tão marcado durante o stresse moderado, e só
PB260 apresentou variações significativas em stresse intenso (THR inferior a 50%). Este
parâmetro é assim um bom indicador do estado geral da fotossíntese quando comparado com
a evolução de A (ver Fig. 4.6).
O parâmetro qP indica-nos que, perto da hidratação total, existe um maior
amortecimento fotoquímico nas variedades AD3R, PB260, PB304 e PB369 (perto de 0,7) e
menor nas variedades PB64 e PB269 (perto de 0,6) (Fig. 4.23). À medida que o THR diminui,
qP também diminui fornecendo uma indicação da energia utilizada para as reacções
fotoquímicas (Maxwell e Johnson, 2000). Esta diminuição, também observada por Tezara et
al. (2003) em Lycium nodosum e por Ögren (1990) em Salix sp., é mais visível nas variedades
AD3R e PB304, enquanto que nas restantes variedades a variação é muito menor. Apenas na
variedade PB260 ocorre uma diminuição mais acentuada para THR inferiores a 50% (stresse
intenso), e nas variedades PB269 e PB369 o parâmetro praticamente não varia nos intervalos
de THR considerados na Fig. 4.23. Na maioria das variedades analisadas, estes dados indicam
que não há alterações na dissipação da energia fotoquímica, indicando uma integridade da
cadeia transportadora de electrões até THR de cerca de 50%, sendo apenas afectada para
stresse hídrico intenso. Após irrigação, o parâmetro recuperou para valores perto dos iniciais
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
72
em todas as variedades, chegando em alguns casos a apresentar valores superiores (variedades
PB64 e PB260).
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000.4
0.6
0.8
1.0
THR (%)
qP
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
Fig. 4.23 – Variação do coeficiente de amortecimento fotoquímico (qP) em função do teor hídrico
relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de
diferentes plantas.
O parâmetro qN possuía, perto da hidratação total, um valor entre 0,75 e 0,8 para todas
as variedades (Fig. 4.24). Em todas as variedades este parâmetro sofreu uma evolução
semelhante à do parâmetro qP mas em sentido oposto, ou seja, naquelas variedades em que
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
73
ocorreu variação (AD3R e PB304), esta ocorre no sentido de aumentar ligeiramente o seu
valor, tal como em Lycium nodosum (Tezara et al., 2003). Assim, também a variedade PB260
só demonstra um ligeiro aumento do parâmetro para THR superiores a 50% e as variedades
PB269 e PB369 praticamente não sofrem alterações.
Fig. 4.24 – Variação do coeficiente de amortecimento não-fotoquímico (qN) em função do teor
hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas
de diferentes plantas.
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000.6
0.7
0.8
0.9
1.0
THR (%)
qN
(un
idad
es r
ela
tivas)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
74
Estes dados são coerentes com os anteriores na medida em que quando a cadeia de
electrões é afectada pelo stresse hídrico, o excesso de energia é dissipada por processos não-
fotoquímicos, de modo a proteger a integridade da folha (Horton et al., 1994). Após irrigação
o parâmetro regressou aos valores iniciais em todas as variedades.
AD3R
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB64
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB260
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB304
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
30 40 50 60 70 80 90 1000
30
60
90
120
150
THR (%)
ET
R (
µµ µµm
ol.
m-2
.s-1
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
Fig. 4.25 – Variação da taxa de transporte electrónico (ETR) em função do teor hídrico relativo
(THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes
plantas.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
75
Na ETR verifica-se uma diminuição acentuada nas variedades AD3R e PB304 e nas
restantes variedades uma diminuição menos acentuada, implicando uma redução do transporte
de electrões com a diminuição do THR, que poderá resultar de uma diminuição do
metabolismo fotossintético do carbono (Fig.4.25) (Maxwell e Johnson, 2000).
Apenas na variedade PB260 se verifica uma diminuição mais acentuada para stresse
hídrico intenso (THR inferior a 50%). Na variedade PB269 a variação é muito pequena,
apresentando valores superiores de ETR após irrigação. Estes dados estão de acordo com os
dados de A obtidos nos ensaios de trocas gasosas (Fig. 4.6). No entanto, na variedade PB369
observam-se valores elevados de ETR, mesmo durante a imposição do stresse e que parecem
contradizer os valores de A observados. Tal facto poderá estar relacionado com um aumento
do transporte de electrões cíclico em torno do PSII devido à reduzida actividade do ciclo de
Calvin, aliviando o excesso de energia em redor do PSII, já observado em girassol (Laisk et
al., 2006).
Após irrigação, o parâmetro recuperou para valores perto dos iniciais, tendo as
variedades PB64 e PB269 apresentado valores superiores aos observados inicialmente.
4.4.14.4.14.4.14.4.1. . . . Conclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas Gasosas
Relativamente às variedades analisadas, destacam-se as variedades AD3R, PB260 e
PB269 como aquelas que apresentam características de uma maior tolerância ao stresse
hídrico e a variedade PB369 como a que possui maiores dificuldades neste tipo de stresse.
A variedade AD3R apresenta uma WUE elevada, com A elevada perto da hidratação
total. No entanto, após a irrigação, embora tenha recuperado o THR, não conseguiu recuperar
A para os valores iniciais, antes de se ter iniciado o período de stresse.
A variedade PB260 apresenta um bom desempenho durante a imposição do stresse
lento moderado e intenso, tolerando THR baixos. No entanto, após irrigação, apresenta
dificuldades em recuperar, quer os valores de THR quer os valores de A, gs e E.
A variedade PB269 apresenta uma elevada WUE, A e gs durante o stresse lento e em
condições de ausência de stresse, demonstrando uma elevada produtividade, que se traduziu
em plantas de elevado porte. Após irrigação, apresenta uma boa recuperação dos parâmetros,
mesmo com THR inferiores aos registados na ausência de stresse.
Por outro lado, a variedade PB369 apresenta um mau desempenho durante a
imposição do stresse hídrico, com baixos valores de A e gs, e, após a irrigação, demonstra
uma má recuperação dos parâmetros avaliados.
4.4.4.4.4.24.24.24.2. . . . Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila aaaa
A forma como as plantas responderam ao stresse rápido foi diferente da forma como
responderam ao stresse lento. Na primeira situação, a planta reage rapidamente e de forma
brusca às novas condições que lhe são impostas. Todas as variedades parecem reagir de uma
forma semelhante. Na segunda situação, a planta sofrendo um processo de adaptação,
passando por uma fase de aclimatação, variando os parâmetros de forma quase sempre mais
suave. Notam-se também maiores diferenças entre as variedades.
No primeiro caso é necessário uma reacção rápida e que é certamente resultante de
mecanismos constitutivos ou mesmo de danos, enquanto que, no segundo caso, a reacção ao
stresse lento vai resultar mais de mecanismos induzidos e de um efeito cumulativo.
4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho
Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho
84
4.4.4.4.4.4.4.4.3.3.3.3. Conclusõe Conclusõe Conclusõe Conclusõessss da Fase I da Fase I da Fase I da Fase I
A avaliação de todos os parâmetros analisados permitiu a escolha das variedades que
mais se destacaram pelas suas respostas contrastantes ao stresse hídrico.
Por um lado, as variedades PB260 e PB269 mostraram ser as que melhor toleravam o
stresse hídrico, adaptando as trocas gasosas com a diminuição do THR e apresentando uma
redução progressiva dos parâmetros, nomeadamente a taxa fotossintética líquida e a
condutividade estomática, semelhante ao grupo de resposta ao stresse de tipo I (Lawlor e
Cornic, 2002). No entanto, uma vez que PB260 não recuperou no parâmetro da WUE optou-
se pela variedade PB269 como a mais tolerante ao stresse hídrico.
Por outro lado, a variedade PB369, demonstrou, desde cedo, ser a mais susceptível ao
stresse hídrico nas experiências de stresse lento, apresentando sintomas de dano a THR mais
elevados do que as restantes variedades. O comportamento desta variedade enquadra-se no
modelo referido neste trabalho como “tudo-ou-nada”, que consiste na manutenção dos
parâmetros até um valor crítico de THR, a partir do qual ocorria uma diminuição drástica
desses mesmos parâmetros, passando de um patamar de valores para outro, semelhante ao
grupo de resposta ao stresse de tipo II (Lawlor e Cornic, 2002). Também durante o período de
recuperação apresentou maiores dificuldades em regressar aos valores iniciais dos parâmetros
analisados. Por estas razões, foi seleccionada como a variedade mais susceptível ao stresse
hídrico.
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
85
5. Fase II 5. Fase II 5. Fase II 5. Fase II –––– Estudo Estudo Estudo Estudo ComparaComparaComparaComparativo Aprofundadtivo Aprofundadtivo Aprofundadtivo Aprofundado do do do dasasasas Duas Duas Duas Duas
Variedades Variedades Variedades Variedades Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídricoao Stresse Hídricoao Stresse Hídricoao Stresse Hídrico
5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha da Folha da Folha da Folha
O THR foi determinado segundo o descrito em 3.3.1..
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
86
5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas
O potencial hídrico das folhas foi determinado psicrometricamente, ao longo da
experiência de stresse lento, através do psicrómetro HR-33T (Wescor, Logan, USA),
equipado com câmaras C-52 (Wescor, Logan, USA) e ligado a um registador LKB REC101
Retirou-se da região analisada pelo IRGA e pelo fluorómetro, um disco de folha com 5
mm de diâmetro, tendo sido colocado no interior da câmara do psicrómetro, onde permaneceu
durante 30 minutos (tempo de equilíbrio). Durante este período de tempo, o potencial hídrico
da amostra vai entrar em equilíbrio com o da atmosfera da câmara, assumindo-se que a água
perdida pela amostra não é suficiente para afectar o potencial hídrico da folha (Marques da
Silva, 1999).
Nesta experiência foram utilizadas as mesmas plantas da experiência de determinação
das curvas A/PPFD (descritas em 5.2.3.1.).
5.2.2.3. 5.2.2.3. 5.2.2.3. 5.2.2.3. Estabelecimento de Estabelecimento de Estabelecimento de Estabelecimento de Curvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/Volume
As curvas pressão/volume permitiram averiguar as relações hídricas em folhas das
variedades portuguesas PB269 e PB369 de milho não sujeitas a stresse hídrico, tendo sido
utilizado para tal o psicrómetro HR-33T (Wescor, Logan, USA), equipado com câmaras C-52
(Wescor, Logan, USA) e ligado a um registador LKB REC101 (Pharmacia LKB
Biotechnology AB, Uppsala, Sweden).
Cortaram-se folhas totalmente expandidas, dividindo-se em cinco fragmentos, cada
um pesado numa balança de precisão. Os fragmentos foram hidratados até à saturação,
flutuando-os em água destilada durante 12 horas, à temperatura ambiente e sob condições de
luminosidade reduzida.
Retirou-se de um dos fragmentos um disco com 5 mm de diâmetro (com a ajuda de um
furador) e colocou-se na câmara do psicrómetro, durante 30 minutos (tempo de equilíbrio). Os
restantes fragmentos foram colocados em contacto com a atmosfera do laboratório, em
processo de desidratação. De um dos fragmentos não se retiraram discos, tendo sido utilizado
como controlo para cálculo do THR (ver 3.3.1.), sendo pesado antes e após cada medição do
psicrómetro, assumindo-se como idêntico aos restantes fragmentos. Os parâmetros hídricos
foram calculados segundo Matos (1990).
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
87
5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas
Os ensaios com o IRGA LCPro+ foram realizados em condições semelhantes às
descritas anteriormente (ver 4.2.3.), à excepção da fonte de luz externa (KL1500 LCD, Schott
AG, Mainz, Germany) e das diferentes concentrações de CO2, controladas pelo próprio
IRGA. As plantas foram ensaiadas a seis concentrações de CO2 diferentes (100, 200, 370,
700, 1000 e 1400 ppm), iniciando-se nos 370 ppm, por um período de 15 minutos, e as
seguintes por períodos de 9 minutos. Inicialmente, a concentração ia aumentando até aos 1400
ppm, com posterior diminuição até aos 100 ppm.
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
88
As plantas foram ensaiadas a cada 3 dias durante duas semanas, correspondendo ao
início, meio e fim do stresse, e ao meio e fim da recuperação.
Durante este ensaio, foram recolhidos fragmentos de material vegetal para
determinação da libertação de O2 (ver 5.2.3.3.).
As limitações estomáticas (Ls) e não-estomáticas (Lns) foram determinadas utilizando a
equação Ls = 100 × (A0 – A) / A0, em que A0 é a taxa fotossintética medida a Ci de 370 ppm e
A é a taxa fotossintética medida a CO2a de 370 ppm, e a equação Lns = 100 × (AC – AS) / AC,
em que AC é a taxa fotossintética de folhas controlo para Ci de 800 ppm e AS é a taxa
fotossintética de folhas sujeitas a stresse hídrico para Ci de 800 ppm (Jones, 1985; Geber e
Dawson, 1997; Tezara et al., 2003).
5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O2222
A libertação de O2 foi efectuada sob condições saturantes de CO2 (aproximadamente
7%) recorrendo a um eléctrodo de fase gasosa (LD2, Hansatech Instruments Ltd., Norfolk,
UK) à temperatura controlada de 25ºC e sob uma PPFD de 850 µmol fotões.m-2.s-1 fornecida
por uma fonte luminosa (LS2, Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK). Foram recolhidas
porções da folha analisada, ao longo do período de stresse lento, de modo a preencher a
câmara do eléctrodo. O peso fresco foi determinado numa balança de precisão (BP 210D,
Sartorius, Goettingen, Germany) e a área num medidor de áreas (CI-202 Portable Leaf Area
Meter, CID, Inc., Camas, Washington, USA). Nesta experiência foram utilizadas as mesmas
plantas do ensaio da determinação das curvas A/CO2a (descritas em 5.2.3.2.).
5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila aaaa
A medição da fluorescência modulada da clorofila a foi efectuada recorrendo ao
A medição da razão Fv/Fm foi determinada aplicando um pulso de luz saturante
(KL2500 LCD, Schott AG, Mainz, Germany), após as folhas estarem 10 minutos na
escuridão.
No ensaio das curvas A/PPFD, após a última PPFD, a luz era desligada e iniciava-se
uma série de pulsos saturantes no escuro. Durante 4 minutos aplicou-se os pulsos com
intervalos de tempo de 40 segundos, durante os 10 minutos seguintes com intervalos de 100
segundos e durante os últimos 5 minutos com intervalos de 200 segundos. O amortecimento
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
89
de alta energia (qE), o amortecimento da transição de estado (qT) e o amortecimento
fotoinibitório (qI) foram calculados segundo Quick e Stitt (1989).
5.5.5.5.2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides
Na determinação de clorofilas e carotenóides foram utilizados os fragmentos de folha
provenientes dos ensaios de determinação da libertação de O2 (ver 5.2.3.3.).
Os fragmentos de folha foram colocados em tubos de ensaio contendo 10 ml de
metanol absoluto, durante 72 horas, período necessário à extracção dos pigmentos das folhas.
As amostras foram lidas nos comprimentos de onda 470 nm, 652 nm e 665 nm num
espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam, Waltham, USA), contra um branco
de metanol absoluto.
Para a determinação da quantidade de clorofilas (Ca, Cb, Ca+b) e carotenóides (Cx+c)
foram utilizadas as seguintes equações (Lichtenthaler, 1987):
5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas
Nesta fase do trabalho experimental foram avaliadas as actividades de três enzimas
fundamentais no metabolismo fotossintético do carbono das duas variedades de milho: as
duas enzimas carboxilativas fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) e a ribulose-1,5-bisfosfato
carboxilase/oxigenase (RuBisCO) e uma descarboxilativa, a enzima málica dependente de
NADP (EM-NADP).
Para além do ensaio de stresse lento, foi também realizado um ensaio de stresse rápido
(ver 3.2.), durante o qual foram recolhidas amostras das folhas analisadas para posterior
análise das actividades enzimáticas.
Todas as amostras foram congeladas em azoto líquido e armazenadas numa arca
congeladora a –70ºC (DLT-13V-85V12, Harris Manufacturing, Co., Asheville, USA).
As actividades enzimáticas foram determinadas à temperatura de 25ºC ± 1ºC, devido
ao facto de ter sido esta a temperatura de crescimento das plantas.
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
Na enzima PEPC foi determinada a actividade em condições fisiológicas e a
actividade máxima, adaptada a partir da metodologia de Donkin e Martin (1980).
A actividade em condições fisiológicas foi determinada num meio composto por
HEPES-KOH 50 mM pH 7,2, MgCl2 10 mM, NaHCO3 10 mM, PEP 2,5 mM e 12 unidades
de malato desidrogenase (MDH), utilizando-se 20 µl de extracto. A reacção foi iniciada com
20 µl de NADH 10 mM. A actividade foi determinada a um comprimento de onda de 340 nm
no espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam, Waltham, USA), com agitação.
A actividade máxima foi determinada de modo semelhante, utilizando um meio
composto por HEPES-HOH 50 mM pH 8,0 e PEP 10 mM, mantendo-se as restantes
condições.
5.2.6.4. 5.2.6.4. 5.2.6.4. 5.2.6.4. Enzima Málica DEnzima Málica DEnzima Málica DEnzima Málica Dependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EM----NADP)NADP)NADP)NADP)
Na EM-NADP apenas foi determinada a actividade máxima, segundo o descrito em
Simon (1987).
A actividade máxima foi determinada num meio composto por HEPES-KOH 50 mM
pH 8,0, MgCl2 30 mM, DTT 2,5 mM e L-malato 10 mM, utilizando-se 50 µl de extracto. A
reacção foi iniciada com 20 µl de NADP+ 25 mM. A actividade foi determinada a um
comprimento de onda de 340 nm no espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam,
Waltham, USA), com agitação.
5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel
A quantificação da proteína solúvel foi determinada pelo método de Bradford (1976),
utilizando placas de ELISA, tendo sido lidas no espectrofotómetro MPRA4 Microplate reader
(DuPont, Newton, USA). A recta de calibração foi efectuada utilizando BSA. Esta
quantificação permitiu expressar as actividades enzimáticas por unidade de proteína solúvel.
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
92
5.2.8. Qua5.2.8. Qua5.2.8. Qua5.2.8. Quantificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveis
A quantificação de solutos compatíveis, em particular a prolina (Živković et al., 2005),
foi efectuada nas amostras recolhidas nos ensaios de stresse lento para determinação das
curvas A/PPFD e num ensaio independente de stresse lento. Foi também realizado um ensaio
de stresse rápido (ver 3.2.), durante o qual foram recolhidas amostras para posterior análise.
As amostras foram congeladas em azoto líquido e armazenadas a –70ºC numa arca
As amostras recolhidas durante os ensaios foram maceradas num almofariz arrefecido
em azoto líquido. Adicionou-se 5 ml de etanol 85% (v/v) e verteu-se o extracto para um
gobelé, onde permaneceu durante 30 minutos. Filtrou-se o extracto e recolheu-se num tubo de
ensaio.
5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina
Antes do início dos ensaios de quantificação de aminoácidos livres e de prolina, foram
realizadas várias curvas de calibração utilizando soluções de L-leucina (Fluka, Sigma-
Aldrich, Germany) e L-prolina (Fluka, Sigma-Aldrich, Japan) em etanol 85% (v/v), com
concentrações entre 0 e 200 µg.ml-1.
Para a quantificação dos aminoácidos livres e de prolina nas amostras adicionou-se em
tubos Eppendorf 200 µl de extracto, 500 µl de tampão citrato 0,2 M (pH 5,0) contendo
SnCl2.H2O 0,75 mM e 500 µl de solução 4% ninidrina (Fluka, Sigma-Aldrich, Chec
Republic) em etilenoglicol. Foram realizadas três réplicas para cada amostra. Agitaram-se os
tubos no vórtex e colocaram-se num banho de água a ferver durante 20 minutos, tendo o
cuidado de fechar apenas parcialmente as tampas (de modo, a não aumentar demasiado a
pressão dos tubos). Arrefeceram-se os tubos em gelo e diluíram-se as amostras em 5 ml de
água-propanol 1:1 (v/v). Após 15 minutos, leu-se a absorvância das amostras no comprimento
de onda 570 nm para os aminoácidos livres e 440 nm para a prolina, num espectrofotómetro
UV-Visible 1-E Cary (Cary System, Varian Inc., Palo Alto, USA) utilizando o sistema Cary
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
125
Durante a recuperação verificou-se que PB269 apresentou algumas dificuldades em
recuperar para os valores iniciais, embora PB369 tenha recuperado quase totalmente o seu
perfil de ETR em resposta a um gradiente de luz.
Na Fig. 5.23, não foram representados os pontos obtidos a PPFD de 1300 µmol
fotões.m-2.s-1, uma vez que eram nulos e não estavam concordantes com as taxas
fotossintéticas registadas durante este ensaio para aquela gama de PPFD, pelo que terá
ocorrido uma interferência entre o fluorómetro e o PPFD elevado que foi utilizado (Maxwell
et al., 1999).
Desta forma, verifica-se que o stresse hídrico afecta grande parte da componente
química e fotoquímica da fotossíntese nas duas variedades, embora PB269 tenha claramente
surgido como a variedade mais tolerante, apresentando uma estratégia de redução progressiva
da fotossíntese com a diminuição do THR, por dissipação de energia não-fotoquímica
desencadeado pelo aumento da concentração de protões no lúmen dos tilacóides na presença
de luz (qE), principalmente em stresse moderado. Por outro lado, a variedade PB369
apresentou sérias dificuldades durante o stresse hídrico, com danos no PSII a THR mais
elevados (redução de Fv/Fm e aumento de qI) do que em PB269.
5.3.5.3.5.3.5.3.4444. . . . Clorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e Carotenóides
A quantificação das clorofilas e carotenóides totais foi realizada nas amostras
recolhidas durante o ensaio das curvas A/CO2a, e, desta forma, o período de stresse e a
recuperação na câmara climatizada foram efectuadas em condições idênticas.
Na Fig. 5.24 está representada a variação da clorofila a em função do THR. Observa-
se, em ambas as variedades, um valor de cerca de 3 mg.g-1 peso seco perto da hidratação total.
Na variedade PB269, ocorreu uma diminuição para cerca de 2 mg.g-1 peso seco para um THR
de cerca de 60%, e durante a recuperação permanece entre 1-2 mg.g-1 peso seco. Estes níveis
reduzidos de clorofila a durante a recuperação poderão ser, em parte, responsáveis pela fraca
recuperação desta variedade (ver Fig. 5.9). Por outro lado, na variedade PB369, só se obteve
uma medição abaixo de THR de 80%, não ocorrendo qualquer variação significativa entre o
período de stresse e o de recuperação.
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
126
Fig. 5.24 – Variação da clorofila a em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das
experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.
Na Fig. 5.25 está representada a variação da clorofila b em função do THR.
Fig. 5.25 – Variação da clorofila b em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das
experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.
Na variedade PB269, ocorre uma ligeira descida da clorofila b de 0,50 mg.g-1 peso
seco para 0,25 mg.g-1 peso seco, com a diminuição do THR. Após irrigação, permanece em
torno deste último valor. Na variedade PB369, tal como na clorofila a, não se verificam
alterações, dado que só existe um ponto abaixo do THR de 80%.
Na Fig. 5.26 está representada a variação da clorofila total com o THR.
PB269
60 70 80 90 1000
1
2
3
4
5
THR (%)
Clo
rofi
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(mg
.g-1
peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
60 70 80 90 1000
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3
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THR (%)
Clo
rofi
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peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB269
60 70 80 90 1000.00
0.25
0.50
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THR (%)
Clo
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(mg
.g-1
peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
60 70 80 90 1000.00
0.25
0.50
0.75
1.00
THR (%)
Clo
rofi
lab
(mg
.g-1
peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
127
Fig. 5.26 – Variação da clorofila total em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das
experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.
Embora estes dados não sejam estatisticamente significativos, observa-se uma
variação semelhante à observada para a clorofila a, dado que a clorofila b apresenta valores
muito mais baixos e não apresenta variações significativas.
Durante períodos de stresse hídrico, a diminuição do conteúdo em clorofilas é comum,
tendo sido observada quer em milho (Alberte et al., 1977), quer em trigo (Loggini et al.,
1999). Tal facto deve-se à exposição das clorofilas a agentes de degradação, como ROS, com
a diminuição da quantidade de água presente nas células e do próprio desequilíbrio entre a
fase fotoquímica e a fase química (Loggini et al., 1999).
Dependendo do nível de stresse a que as plantas estão sujeitas, poderá haver maior ou
menor degradação de clorofila. No entanto, a variedade PB269 consegue suportar stresses
hídricos elevados mantendo alguma actividade fotossintética, mas não conseguindo impedir a
degradação da clorofila, o que vai implicar alguns problemas na recuperação.
Por outro lado, na azinheira e no sobreiro, espécies tipicamente mediterrânicas, ocorre
uma diminuição da clorofila, durante o Verão, de forma a regular a fotossíntese em condições
de baixos recursos hídricos e elevada radiação solar (Maroco et al., 2002).
Na Fig. 5.27 está representada a variação dos carotenóides totais com o THR.
PB269
60 70 80 90 1000
1
2
3
4
5
THR (%)
Clo
rofi
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l
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peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
60 70 80 90 1000
1
2
3
4
5
THR (%)
Clo
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l
(mg
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peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
128
Fig. 5.27 – Variação dos carotenóides totais em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo
das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.
A variedade PB269 apresenta um valor de carotenóides totais de cerca de 1,7 mg.g-1
peso seco em folhas totalmente hidratadas, enquanto PB369 apresenta um valor de 1,4 mg.g-1
peso seco. Com a diminuição do THR, em PB269, os carotenóides diminuem até cerca de 1
mg.g-1 peso seco. Em PB369, não se observam quaisquer diferenças significativas até THR de
85%.
Durante o período de recuperação, PB369 não sofre quaisquer alterações
significativas. Por outro lado, em PB269, os carotenóides totais diminuem para cerca de 0,5
mg.g-1 peso seco, durante o período de recuperação. Tal facto pode revelar mecanismos
diferentes de resposta ao stresse hídrico, nomeadamente algumas alterações nas vias
metabólicas dos carotenóides, que podem levar, em parte, à produção de ABA, com
consequente aumento da tolerância ao stresse hídrico (Schwartz et al., 1997; Borel et al.,
2001).
5.3.55.3.55.3.55.3.5. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono
As actividades das principais enzimas do metabolismo fotossintético das duas
variedades de milho seleccionadas foram determinadas a partir de amostras recolhidas durante
o ensaio de determinação das curvas A/PPFD. Durante este ensaio, as câmaras climatizadas
sofreram uma avaria durante o período de recuperação, aumentando a temperatura dos 25ºC
para os 38ºC, pelo que é necessário ter este facto em conta na análise e discussão dos dados
obtidos.
PB269
60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
Caro
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óid
es t
ota
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peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
PB369
60 70 80 90 1000
1
2
3
THR (%)
Caro
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ota
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(mg
.g-1
peso
seco
)
Stresse (∆)
Recuperação (�)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
Na Fig. 5.33 está representada a variação da actividade inicial da PEPC em função do
THR.
Perto da hidratação total, a variedade PB269 apresenta uma actividade inicial da PEPC
de cerca de 30 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel, inferior à observada na variedade PB369
(cerca de 40 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel). No entanto, verifica-se que, com a
diminuição do THR, a actividade inicial da PEPC vai diminuindo até atingir o valor de 10
µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel para THR na ordem dos 30%. Isto não está de acordo
com o observado para o milho, em que a actividade da PEPC se mantém ou chega a aumentar
em condições de stresse moderado, a qual tem sido relacionada com o aumento da
concentração de prolina, através do aumento dos seus percursores (Jeanneau et al., 2002).
PB269
25 50 75 1000
20
40
60
THR (%)
Ac
tiv
açã
o d
a R
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%)
PB369
25 50 75 1000
20
40
60
THR (%)
Ac
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aç
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da
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Bis
CO
(%
)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
134
Fig. 5.33 – Variação da actividade inicial da PEPC em função do teor hídrico relativo (THR), ao
longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
Durante a recuperação, tal como já foi verificado nas actividades da RuBisCO, a
actividade inicial da PEPC de ambas as variedades permanece constante no valor observado
no final do período de stresse.
Na Fig. 5.34 está representada a variação da actividade máxima da PEPC em função
do THR.
Fig. 5.34 – Variação da actividade máxima da PEPC em função do teor hídrico relativo (THR), ao
longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.
A variedade PB269 apresenta, perto da hidratação total, uma actividade máxima da
PEPC de cerca de 40 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel. Na variedade PB369, o valor da
actividade total da PEPC é superior (50 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel). Em ambas as
variedades, há uma diminuição da actividade total com a diminuição do THR, atingindo os 15
PB269
25 50 75 1000
10
20
30
40
50
THR (%)
Ac
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EP
C
(µµ µµm
ol P
EP
.hr-1
.mg
-1 p
rote
ína)
Stresse (∆; - -): y = 4,161 + 0,2432x (r2 = 0,59 ; p < 0,05)
Recuperação (�)
PB369
25 50 75 1000
10
20
30
40
50
THR (%)
Ac
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ida
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icia
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a P
EP
C
(µµ µµm
ol P
EP
.hr-1
.mg
-1 p
rote
ína)
Stresse (∆; - -): y = 0,06901 + 0,4057x (r2 = 0,83 ; p < 0,01)
Recuperação (�)
PB269
25 50 75 1000
10
20
30
40
50
60
70
THR (%)
Ac
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idad
e m
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ima
da
PE
PC
(µµ µµm
ol P
EP
.hr-1
.mg
-1 p
rote
ína)
Stresse (∆; - -): y = 2,992 +0,3476x (r2 = 0,89 ; p < 0,01)
Recuperação (�)
PB369
25 50 75 1000
10
20
30
40
50
60
70
THR (%)
Acti
vid
ad
e m
áxim
a d
a P
EP
C
(µµ µµm
ol P
EP
.hr-1
.mg
-1 p
rote
ína)
Stresse (∆; - -): y = 7,812 + 0,4423x (r2 = 0,85 ; p < 0,01)
Recuperação (�)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
135
µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel na variedade PB269 e os 20 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína
solúvel na variedade PB369, para THR de 30%.
No período de recuperação, mais uma vez, a actividade máxima da PEPC permaneceu
inalterada nos valores registados no final do período de stresse.
Nos ensaios de stresse rápido, verificam-se, tal como nas actividades da RuBisCO,
diferenças significativas em relação aos ensaios de stresse lento.
Na Fig. 5.35 está representada a variação das actividades inicial e máxima da PEPC
em função do THR, no ensaio de stresse rápido.
Fig. 5.35 – Variação das actividades inicial (∆) e máxima (�) da PEPC em função do teor hídrico
relativo (THR), ao longo das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas
de diferentes plantas.
Embora as diferenças observadas entre os valores das actividades da PEPC, entre as
duas variedades, sejam notórias, em nenhuma há alteração com a diminuição do THR. No
entanto, mais uma vez se relembra que as actividades observadas perto da hidratação total são
inferiores às observadas nas plantas do stresse lento devido ao facto de terem passado por dois
dias de temperaturas elevadas (38ºC) devido a avaria da câmara climatizada.
A regulação da enzima PEPC é efectuada essencialmente pela resposta a metabolitos
efectores, como a inibição pelo malato e a activação por açúcares fosfatados (Ting e Osmond,
1973; Doncaster e Leegood, 1987). Os efeitos destes metabolitos são modulados pela
fosforilação da enzima, a qual é reversível, dependente da luz e levada a termo pela enzima
PEPCK. Esta fosforilação leva a uma diminuição da sensibilidade à inibição pelo malato e a
um aumento da sensibilidade à activação pela glucose-6-fosfato (Jao e Chollet, 1992; Bailey
et al., 2000). Por outro lado, a actividade da enzima PEPCK está dependente da quantidade de
PB269
25 50 75 1000
10
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40
50
THR (%)
Ac
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Actividade inicial (∆)
Actividade máxima (�)
PB369
25 50 75 1000
10
20
30
40
50
THR (%)
Ac
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EP
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.mg
-1 p
rote
ína)
Actividade inicial (∆)
Actividade máxima (�)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
136
ATP presente, a qual diminui durante períodos de stresse hídrico (Tezara et al., 1999).
Também as curvas A/Ci (não representadas, mas muito semelhantes às curvas A/CO2a da Fig.
5.9), através da análise do seu declive inicial (eficiência de carboxilação), indicam algumas
propriedades cinéticas da enzima (Bailey et al., 2000). Desta forma, observa-se uma
diminuição do declive da curva à medida que o stresse hídrico aumenta, reflectindo uma
diminuição da actividade da PEPC. Na variedade PB269, existe alguma recuperação após
irrigação, enquanto que na variedade PB369 a recuperação não existe, continuando o declive
inicial do gráfico a diminuir.
5.3.5.3. 5.3.5.3. 5.3.5.3. 5.3.5.3. Enzima Málica Enzima Málica Enzima Málica Enzima Málica DDDDependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EM----NADP)NADP)NADP)NADP)
Na Fig. 5.36 está representada a variação da actividade da enzima málica dependente
de NADP em função do THR, no ensaio de stresse lento.
Fig. 5.36 – Variação da actividade máxima da EM-NADP em função do teor hídrico relativo
(THR), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de
diferentes plantas.
Ambas as variedades apresentam valores de actividade desta enzima de cerca de 15
µmol malato.h-1.mg-1 proteína solúvel, na hidratação total. No entanto, na variedade PB269,
há uma clara diminuição da actividade com a redução do THR até 5 µmol malato.hr-1.mg-1
proteína solúvel em THR de cerca de 30%. Em PB369, a variação não é significativa.
Durante a recuperação, PB269 mantém a actividade em 5 µmol malato.hr-1.mg-1
proteína solúvel, enquanto que em PB369 há uma diminuição até atingir o mesmo valor de
PB269
25 50 75 1000
5
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15
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THR (%)
Ac
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g-1
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Stresse (∆; - -): y = – 3,609 + 0,1982x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)
Recuperação (�)
PB369
25 50 75 1000
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Ac
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rote
ína)
Stresse (∆)
Recuperação (�; –): y = 16,84 – 0,1537x (r2 = 0,66 ; p < 0,05)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho
137
actividade a THR de 75%. No entanto, estes dados não permitem discutir a recuperação,
dadas as circunstâncias em que esta ocorreu.
A variação da actividade no ensaio do stresse lento contrasta claramente com a
variação obtida no ensaio de stresse rápido (Fig. 5.37). No ensaio de stresse rápido, a
actividade não sofre alterações estatisticamente significativas, mantendo-se constante em
ambas as variedades. No entanto, a actividade em PB269, na hidratação total, é cerca de
metade da verificada nos ensaios de stresse lento, o que pode indicar alguma perturbação
nesta variedade durante o crescimento das plantas.
Fig. 5.37 – Variação da actividade máxima da EM-NADP em função do teor hídrico relativo
(THR), ao longo das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de
diferentes plantas.
Esta manutenção da actividade da enzima málica no milho, em condições de stresse
rápido, já havia sido verificada por outros autores (Saccardy et al., 1996), e a expressão do
gene desta enzima em plantas de tabaco, melhorou consideravelmente a sua tolerância ao
stresse hídrico (Laporte et al., 2002). No entanto, as actividades observadas perto da
hidratação total são inferiores às observadas nas plantas do stresse lento pelas razões já
referidas.
5.3.65.3.65.3.65.3.6. . . . Determinação de Determinação de Determinação de Determinação de Solutos CompatíveisSolutos CompatíveisSolutos CompatíveisSolutos Compatíveis
A quantificação de aminoácidos livres e prolina, para averiguar a possível presença de
solutos compatíveis, foi realizada em três ensaios, dois de stresse lento e um de stresse rápido.
PB269
25 50 75 1000
5
10
15
20
THR (%)
Ac
tiv
ida
de d
a E
M-N
AD
P
(µµ µµm
ol
mala
to.h
r-1.m
g-1
pro
teín
a)
PB369
25 50 75 1000
5
10
15
20
THR (%)
Ac
tiv
ida
de
da
EM
-NA
DP
(µµ µµm
ol
ma
lato
.hr-1
.mg
-1 p
rote
ína)
5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico
Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho