1 ÍNDICE GENERAL Página Portada I Carta de Aprobación II Agradecimientos III Dedicatoria IV Resumen V Índice general 1 Índice de Tablas 2 Índice de Figuras 3 1. Introducción 7 1.1. Antecedentes 10 1.2. Objetivos 22 1.3. Hipótesis 23 2. Metodología 24 2.1. Cultivo algal, extracción del polisacárido sulfatado y preparación del arsenito de sodio. 24 2.2. Selección de los participantes 25 2.3. Obtención, siembra y fijación de leucocitos 26 2.4. Tinción y lectura de Laminillas 31 3. Resultados 35 4. Discusión 46 5. Conclusión 49 6. Literatura citada 50
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1
ÍNDICE GENERAL
Página
Portada I
Carta de Aprobación II
Agradecimientos III
Dedicatoria IV
Resumen V
Índice general 1
Índice de Tablas 2
Índice de Figuras 3
1. Introducción 7
1.1. Antecedentes 10
1.2. Objetivos 22
1.3. Hipótesis 23
2. Metodología 24
2.1. Cultivo algal, extracción del polisacárido sulfatado y preparación
del arsenito de sodio.
24
2.2. Selección de los participantes 25
2.3. Obtención, siembra y fijación de leucocitos 26
2.4. Tinción y lectura de Laminillas 31
3. Resultados 35
4. Discusión 46
5. Conclusión 49
6. Literatura citada 50
2
7. Glosario 56
8. Anexos 58
8.1. Solicitud de la Revisión del Protocolo de Investigación 58
8.2. Aceptación del Protocolo de Investigación por el Comité de Ética
del Hospital Militar Regional, El Ciprés, B.C.
59
8.3. Consentimiento Informado 60
8.4. Formato de Examen Médico 64
3
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I Factores de Riesgo para Cáncer 11
Tabla II Tratamientos a los que se sometieron los leucocitos 32
Tabla III Estadística básica del índice de proliferación celular en
los 16 tratamientos
35
Tabla IV Análisis de varianza del NaAsO2 y el PSS sobre el índice
de proliferación celular
36
Tabla V Comparación múltiple por Tukey’s por el NaAsO2 sobre
el índice de proliferación celular
38
Tabla VI Estadística básica del número de Mn en los 16
tratamientos
39
Tabla VII Análisis de varianza de las diferentes concentraciones
del NaAsO2 y el PSS sobre el numero de Mn
40
Tabla VIII Comparación múltiple por Tukey’s por el factor del
NaAsO2.sobre el numero de Mn.
42
Tabla IX Comparación múltiple por Tukey’s por el factor del
NaAsO2 a una concentración de 100µM sobre el número
de Mn.
43
Tabla X Comparación múltiple por Tukey’s por el factor del PSS a
sobre el número de Mn.
44
4
Tabla XI Comparación múltiple por Tukey por el factor del PSS a
una concentración de 1mgL-1.
45
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Mecanismos carcinogénicos del arsénico 14
Figura 2 Obtención del alga verde U. clathrata, selección y cultivo 24
Figura 3 Extracción de sangre por venopunción en el brazo 26
Figura 4 Siembra e incubación de los leucocitos 27
Figura 5 Bloqueo de la proliferación celular 28
Figura 6 Resuspensión del cultivo celular 29
Figura 7 Lavado del botón celular. 30
Figura 8 Tinción y lectura de las laminillas 31
Figura 9 Fotografías de leucocitos normales 34
Figura 10 Fotografías de leucocitos con micronúcleos. 34
Figura 11 Efecto del PSS sobre el índice nuclear 37
Figura 12 Efecto del NaAsO2 sobre el índice nuclear 37
Figura 13 Efecto combinado del PSS sobre el número de Mn 40
Figura 14 Efecto combinado del NaAsO2 sobre el número de Mn 41
6
Figura 15 Efecto combinado del PSS y NaAsO2 sobre el número de
Mn
39
7
1. INTRODUCCIÓN
El cáncer es la primera causa de muerte en el mundo, y en México es la
tercera causa de muerte arrebatándole la vida a más de 61 mil personas por
año (INEGI, 2008). De acuerdo al consenso de la evidencia científica, los
principales factores de riesgo para desarrollar cáncer son la herencia, el
contacto con sustancias químicas, infecciones, rayos X y alteraciones del
sistema inmunológico (Wattenberg, 1985). El 90% de los canceres son
originados por sustancias químicas (Anand et al., 2008). Dentro de las
principales sustancias químicas donde se ha documentado ampliamente su
efecto carcinogénico por daño al genoma celular o genotoxicidad, se
encuentran los metaloides como el arsénico, mercurio y cromo (Pradosh et al.,
2002).
El arsénico es considerado el carcinógeno más potente al que se expone el
ser humano y se encuentra en el ambiente: en la tierra, en el aire, en los
alimentos y principalmente, en el agua que se obtiene de pozos profundos
(Pradosh et al., 2002).
Respecto a él agua, la norma de la Organización Mundial de la Salud (OMS)
establece que la cantidad máxima permisible de arsénico para consumo
humano es de 50 µgL-1 (Mukherjee et al., 2007). En México, la norma oficial
mexicana NOM-127SSA-1-1994 no permite niveles máximos de 25 µgL-1. Sin
embargo, en estados como Baja California Sur, Chihuahua, Coahuila, Durango,
8
Guanajuato, Hidalgo y Morelos, donde el agua se obtiene principalmente de
pozos profundos, presentan concentraciones superiores a la norma. En un
estudio recientemente realizado en los estados de Durango y Coahuila, en el
norte de la República Mexicana, se encontró que el agua de su red de
abastecimiento tiene un nivel de 4.1 mgL-1, esto significa que los niveles están
164% por encima de la norma oficial vigente (Fuentes-Díaz, 2005). Por ello, las
personas que consumen agua con altos niveles de arsénico desarrollan
enfermedades como hiperqueratosis y cáncer de piel, vejiga, hígado y
pulmones (Salnikow y Zhitkovich, 2009). La exposición al arsénico en estas
poblaciones humanas inducen alteraciones cromosómicas y daño directo sobre
la cadena del Ácido Desoxirribonucleico (ADN) induciendo la proliferación de
células cancerígenas (Pradosh et al., 2002).
Investigaciones recientes demuestran que existen sustancias con
características quimiopreventivas, antioxidantes o antigenotóxicas, es decir, que
previenen o inhiben el desarrollo de cáncer provocado por sustancias químicas.
Entre estos se encuentra algunas plantas terrestres como: el té verde, que se
extrae de la planta Camelia sinensis (Glei et al., 2006); también la curcumina,
un compuesto natural que se utiliza en India y se obtiene de la planta Curcuma
lunga (Sutapa et al., 2007); el acido ascórbico, conocido como vitamina C, que
se encuentra en la mayoría de los cítricos; el tocoferol o vitamina E, que se
encuentra en el germen de trigo y la yema de huevo y los carotenoides, que se
encuentran en frutas y verduras como el jitomate, uva, sandía y durazno (Anand
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et al., 2008). Se sabe también que algunas algas marinas también muestran
tener efectos antigenotóxicos, antitumorales y/o antioxidantes, un ejemplo de
esto son las algas rojas Symphyocladia latiuscula, Rhodomela confervoides,
Polysiphonia urcedata, Gloiopeltis furcata y Kappaphycus srtriatum (Huarnao,
2004), las algas pardas Leathesia difformes, Punctaria latifolia y Scytosiphon
lomentaria y el alga verde Ulva pertusa (Xu et al., 2004; Qi et al., 2005). En
algunas algas pardas, sus polisacáridos sulfatados demuestran tener efectos
antigenotóxicos, como se ha demostrado en Fucus vesiculosus (Leite-Silva et
al., 2007).
Adicionalmente, pruebas de laboratorio demuestran que las algas verdes de
la familia Ulvaceae, presentan polisacáridos muy similares a los que se
encuentran en algas pardas. Meza-Soria (2008), demuestra que Ulva clathrata
posee 11% de polisacáridos sulfatados en su materia orgánica (Hernández-
Garibay et al., 2006). Es por ello que con esta investigación, se evaluaron las
características antigenotóxicas de los polisacáridos de U. clathrata similares a
los que han sido descritos en otras especies del genero Ulvaceae (Qi et al.,
2005; Xu et al., 2004).
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1.1 ANTECEDENTES
Cáncer es el crecimiento tisular patológico originado por una proliferación
continua de células anormales. Produce una enfermedad por su capacidad para
elaborar sustancias con actividad biológica nociva, potencial invasión y
destrucción de los tejidos adyacentes o a distancia. El cáncer, que puede
originarse a partir de cualquier tipo de célula de los diferentes tejidos del
organismo, no es una enfermedad única, sino un conjunto de enfermedades con
manifestaciones y curso clínico muy variable, en función de la localización y de
la célula de origen. El cáncer es, en esencia, un proceso genético que se
presenta como resultado de una serie de mutaciones secuenciales en el
genoma y cambios epigenéticos que conduce a la malignización de las células
que se multiplican de forma irregular y con alteraciones en su morfología
(Encarta. 2008, Instituto Nacional de Cáncer, EUA. 2005, Kim y Hahn, 2007).
Ciertos factores como la herencia (predisposición genética), infecciones
Vogel F. (1978) Genetic aspects of induced mutation. Human Genetic 1(suppl.):
141-147.
Warner M., Smith M. Kalman D. l (1994) Increased micronuclei in exfoliated
bladder cells of individuals who chronically ingest arsenic-contaminated water in
Nevada. Cancer Epidemiology, biomarkers and prevention, 3, 583-590.
Wattenberg, L. (1985) Chemoprevention of Cancer. Cancer Research, 45, 1-8.
Wu T.M., Hsu Y.T., Sung M.S. Hsu Y.T. Lee T.M.(2009) Expression of genes
involved in redox homeostasis and antioxidant defense in a marine macroalga
Ulva fasciata by excess copper. Aquatic Toxicology Jul 19 (Epub)
Xu, N., Fan, X., Yan, X., and Tseng, C.K. (2004). Screening marine algae from
China for their antitumor activities. Journal of Applied Phycology, 16: 451-456.
Yangthong M., Hutadilok- towatana N., Phromkunthong W. (2009) Anitoxidant
activities four edible seaweeds southern coast of Thailand. Plant Food Human
Nutrition, 64 (3):218-23.
Zhou, J. Hu, N., Wu, Y., Pan, Y. and Sun C. (2008). Preliminary studies on the
chemical characterization and antioxidant properties of acidic polysaccharides
from Sargassum fusiforme. Journal of Zhenjiang University Science B. 9 (9):
721-727.
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7. GLOSARIO
Antigenotóxico: Inhibe o revierte el daño de los agentes genotóxicos
Antioxidante: Sustancia que protege las células de los daños que causan los
radicales libres.
Arsénico: Elemento químico de la tabla periódica símbolo As y peso atómico
33. Metaloide quebradizo de color gris y brillo metálico.
Biomarcadores: Los marcadores biológicos son los cambios medibles
bioquímicos, fisiológicos o morfológicos, que se asocian a la exposición a un
tóxico.
Biomonitoreo: Valoración de la exposición humana a químicos ambientales a
través de la medición de esos químicos o sus metabolitos en sangre, orina,
saliva o tejido.
Cáncer: Es un conjunto de enfermedades ocasionado por la proliferación
continua de células con mutaciones secuenciales en el genoma que conduce a
la malignización.
Carcinogénico: Substancia o agente que causa o induce el desarrollo cáncer.
Clastogénico: Son agentes físicos, químicos o biológicos capaces de inducir
alteraciones cromosómicas.
Células exfoliadas: Células que se descaman, natural o artificialmente, de las
mucosas (oral, vejiga, cervicouterinas)
Ciclosporina: Es un medicamento inmunosupresor utilizado en pacientes con
transplante de órganos.
Citocalasina B: Molécula aislada del hongo Helminthosporum dematoideum,
que inhibe la polimerización de actina, impidiendo la citocinesis celular a través
de la imposibilidad de crear el anillo microfilamentoso para la partición celular.
Esta molécula no afecta a las fibras del huso ni a la división del núcleo,
permitiendo la observación de células monodivididas o binucleadas.
Citóxico: Sustancia toxica para las células.
Cocarcinogenesis: Agente que actúa en células precondicionadas para
desarrollar cáncer.
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Doxirubicina: Antibiótico antraciclino que ejerce sus efectos sobre las células
cancerosas e inhibiendo su proliferación celular.
Fitohemaglutinina: Es la fracción proteica de los frijoles rojos Phaseolus
vulgaris, que aglutina eritrocitos y leucocitos e induce a la mitosis de diferentes
líneas celulares.
Fucoidan: Polisacárido sulfatado que se encuentra en las algas cafés
Genotóxico: Factores capaces de producir alteración en los genes. Bajo este
término se incluyen los agentes que interaccionan tanto directa como
indirectamente, con el ADN provocando mutaciones, y los que interfieren en
algunos procesos enzimáticos de la reparación, o en la génesis o polimerización
del material proteico involucrado en la segregación cromosómica.
In vitro: Experimento científico en un tubo de ensayo o en un ambiente
controlado fuera del organismo vivo bajo condiciones controladas en un
laboratorio.
In vivo: Experimento científico que se realiza dentro de un organismo vivo
Micronúcleos: cuerpos citoplasmáticos esféricos, detectados en interfase, más
pequeños y morfológicamente idénticos al núcleo celular. Se originan a partir de
fragmentos acéntricos o cromosomas enteros que se retrasan en la división
celular y fallan en su incorporación a los núcleos hijos. Dado que los MN
pueden ser expresados solamente en células que han completado un ciclo de
división celular, se desarrolló un método que permite la identificación de dichas
células por su aspecto binucleado cuando se bloquea la citocinesis mediante el
agregado de citocalasina-B, un inhibidor del ensamblaje de los microfilamentos.
Mutagénico: Sustancia o agente que causa mutaciones
Mutaciones: Alteración o cambio en la información genética de un ser vivo
Proliferación celular: Aumento del número de células como resultado del
crecimiento y multiplicación celular.
Quimiopreventivo: Sustancia naturales o sintéticas utilizadas para tratar de
reducir el riesgo de cáncer, retardarlo o evitar su regresión.
Ulvan: Polisacárido sulfatado derivado de las algas verdes.
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8. ANEXOS
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA POSGRADO EN ECOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
Facultad de Ciencias Marinas
Instituto de Investigaciones Oceanológicas Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias de la Salud
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPAR EN UN ESTUDIO DE
INVESTIGACIÓN
“EFECTOS ANTIGENOTÓXICOS DE LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS
EL ALGA VERDE Ulva clathrata EXPUESTOS A ARSENITO DE SODIO”
INVESTIGADORES: Dilayaxi Cárdenas Bautista, Dr. Isaí Pacheco Ruíz, M.C. Evarista Arellano García, Dra Raquel Muñiz Salazar, M.C. Raúl C. Baptista Rosas. LUGAR: Ensenada, Baja California NOMBRE DEL PARTICIPANTE: ___________________________________ A usted se le está invitando a participar en este estudio de investigación médica. Antes de decidir si participa o no, debe conocer y comprender cada uno de los siguientes apartados. Este proceso se conoce como consentimiento informado. Siéntase con absoluta libertad para preguntar sobre cualquier aspecto que le ayude a aclarar dudas al respecto. Una vez que haya comprendido el estudio y si usted desea participar, entonces se le pedirá que firme esta forma de consentimiento, del cual se le entregará una copia firmada y fechada. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO El arsénico es una sustancia química que se encuentra en la tierra, el aire y el agua; principalmente en el agua que se extrae de los pozos profundos. Cuando las concentraciones de arsénico son mayores a las permitidas por la norma de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (50µgL-1), puede inducir a que las células humanas se transformen en células cancerosas. Algunos extractos algales inhiben el daño inducido por el arsénico y es por eso que se busca que el extracto del alga verde Ulva clathrata sirva como terapéutico para contrarrestar el daño provocado por el arsénico. OBJETIVO DEL ESTUDIO A usted se le está invitando a participar en un estudio de investigación que tiene como objetivo determinar si los extractos del alga verde Ulva clathrata conocidos como polisacáridos inhiben los daños genotóxicos (cáncer) del arsenito de sodio en leucocitos humanos.
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DESCRIPCIÓN A usted se le está invitando a participar en este estudio con la donación de 20 ml de sangre. A la sangre donada de cada uno de las personas que acepten a participar en esta investigación, se le realizara un estudio genotóxico que consiste en: Cultivar las células sanguíneas que provengan de personas saludables como usted y a las cuales se le agregaran extractos de el alga conocida con el nombre científico Ulva clathrata para probar si estos extractos previenen de sufrir daño cuando se les agrega un agente carcinogénico conocido (arsénico), con el propósito de avanzar en el desarrollo de medicamentos y medidas terapéuticas para enfermos de cáncer. El estudio experimental se realizara en el Laboratorio de Genotoxicología Ambiental de la Facultad de Ciencias de la UABC. BENEFICIOS DEL ESTUDIO Actualmente existen medicamentos como el Fucoidan, el cual es un polisacárido sulfatado que inhibe el crecimiento de células cancerígenas y que se obtiene a partir de las algas pardas. En las algas verdes (ulvales) encontramos el ulvan como polisacárido sulfatado y tiene entre el 5 y 11% de su materia orgánica. Si los polisacáridos sulfatados del alga verde actúan de la misma forma inhibiendo la formación de células canceríngenas, en un futuro otros pacientes pueden beneficiarse con una nueva alternativa de tratamiento a base de algas verdes. PROCEDIMIENTO DEL ESTUDIO En caso de aceptar participar en el estudio se le realizaran algunas preguntas personales, hábitos, antecedentes médicos y laborales y datos sobre la salud de familiares más cercanos. En caso de aceptar, se le tomaran sus signos vitales (presión arterial, frecuencia cardiaca, peso, estatura) y una muestra de 20ml de sangre periférica mediante punción en la vena de su brazo en ayuno, por lo que deberá tomarse la muestra por la mañana y sin haber ingerido ningún alimento. Esta sangre se utilizará para probar los efectos benéficos del polisacárido sulfatado en un laboratorio especializado, con la técnica de bloqueo de citocinesis y conteo de micronúcleos RIESGOS ASOCIADOS CON EL ESTUDIO El estudio consta de 3 fases:
1) Historia clínica y la toma de signos, talla y peso. 2) Obtención de 20ml de sangre. 3) Cultivo de leucocitos a partir de las muestras de sangre y valorar el
efecto antigenotóxico de los polisacáridos sulfatados. La extracción de sangre se hará con una aguja nueva y esterilizada la que se tomara por personal se salud capacitado. El procedimiento es similar al que se
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realiza en un laboratorio cuando usted le ordenan unos análisis de sangre; este procedimiento es rutinario no tiene algún tipo de riesgo para la salud. En caso de que usted desarrolle algún efecto adverso secundario o requiera de otro tipo de atención, esta se le brindará en los términos que siempre se han ofrecido. ACLARACIONES Su decisión de participar en el estudio es completamente voluntaria. No habrá ninguna consecuencia desfavorable para usted, en caso de no aceptar la invitación. Si decide participar en el estudio puede retirarse en el momento que lo desee, aun cuando el investigador responsable no se lo solicite, informando las razones de su decisión, la cual será respetada en su totalidad. No tendrá que hacer gasto alguno durante el estudio, es decir el estudio es GRATIS. En el transcurso del estudio usted podrá solicitar información actualizada sobre el mismo, al investigador responsable. La información obtenida en este estudio, utilizada para la identificación de cada paciente, se mantendrá con estricta confidencialidad por el grupo de investigadores. Usted también tiene acceso a la Comisión de Investigación y Ética del Hospital Militar Regional El Ciprés, ubicado en Carretera Transpeninsular km 114, Ensenada Baja California, 22780. Si considera que no hay dudas ni preguntas acerca de su participación, puede, si así lo desea, firmar la Carta de Consentimiento Informado anexa a este documento.
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CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO Yo, __________________________________________________________ leí
y comprendí la información anterior y mis preguntas se respondieron de manera
satisfactoria. Se me informo y entendí que los datos se obtengan en el estudio
pueden ser publicados o difundidos con fines científicos. Convengo en participar
en este estudio de investigación. Recibiré una copia firmada y fechada de esta