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Klinik für Orthopädie und Sportorthopädie
der Technischen Universität München
Klinikum rechts der Isar
(Direktor: Univ.-Prof. Dr. R. Gradinger)
In vitro Verhalten der Matrixmetalloproteinase-9
nach hydrostatischer Hochdruckbehandlung
Johannes Schauwecker
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der
Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors
der Medizin genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. D. Neumeier
Prüfer der Dissertation:
1. apl. Prof. Dr. W. Mittelmeier
2. Univ.-Prof. Dr. M. Schmitt
Die Dissertation wurde am 11.10.2004 bei der Technischen
Universität
München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am
17.11.2004
angenommen.
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Meinen Eltern und meinem Großvater Heinz
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Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungen und Einheiten 9
1. Einleitung 11
2. Material und Methoden 14
2.1 Physikalische Grundlagen 14
2.2 Hochdruckanlage 16
2.3 Material und Geräte 18
2.3.1 Probengefäße 18
2.3.2 Photometer 19
2.3.3 Zymographieapparatur 20
2.3.4 Weitere Materialien und Geräte 20
2.4 Puffer und Lösungen 21
2.5 Untersuchtes Enzym 22
2.5.1 Isolierte humane Matrixmetalloproteinase-9 22
2.5.2 Rekombinante humane Matrixmetalloproteinase-9 23
2.5.3 In vitro Aktivierung der Matrixmetalloproteinase-9 23
2.6 Verdünnungsreihen der Matrixmetalloproteinase-9 23
2.7 Hochdruckbehandlung der Matrixmetalloproteinase-9 25
2.7.1 Allgemeines 25
2.7.2 Herstellung der Untersuchungsproben 26
2.7.3 Druckbehandlung 26
2.7.4 Analyse der Untersuchungsproben 27
2.8 Messung der Matrixmetalloproteinase-9-Aktivität 27
2.8.1 Grundlagen 27
2.8.2 Durchführung 28
2.8.3 Auswertung 29
-
2.9 Zymographischer Nachweis der Matrixmetalloproteinase-9
29
2.9.1 Grundlagen 29
2.9.2 Herstellung der Untersuchungsproben 30
2.9.3 Durchführung 31
2.9.4 Auswertung 33
2.10 Statistik 34
3. Ergebnisse 35
3.1 Verdünnungsreihen der Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9)
35
3.1.1 Isolierte MMP-9 – Activity-Assay 35
3.1.2 Rekombinante MMP-9 – Activity-Assay 36
3.2 MMP-9 nach hydrostatischem Hochdruck (HHD) 37
3.2.1 Herstellerangaben für MMP-9 Activity-Assay 37
3.2.2 Standardkurve für MMP-9 Activity-Assay 37
3.2.3 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay 38
3.2.4 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay 43
3.2.5 Isolierte MMP-9 nach HHD – Zymographie 48
3.2.6 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Zymographie 48
3.3 Zymographischer Nachweis der MMP-9 49
3.3.1 Pro-MMP-9 49
3.3.2 Aktivierte MMP-9 50
3.3.3 Pro-MMP-9 und aktivierte MMP-9 inkubiert in EDTA-Puffer
50
3.3.4 Pro-MMP-9 und aktivierte MMP-9 inkubiert in PMSF-Puffer
51
4. Diskussion 52
4.1 Rekonstruktion von Knochendefekten 52
4.2 Extrakorporale Tumordevitalisierung 55
4.3 Hochdrucktechnologie 56
4.4 Matrixmetalloproteinasen 58
4.4.1 Matrixmetalloproteinasen allgemein 58
4.4.2 Matrixmetalloproteinase-9 63
4.5 Diskussion der Ergebnisse 66
4.6 Ausblick 73
-
5. Zusammenfassung 75
6. Literaturverzeichnis 76
Anhang 94
Ergebnisdaten 94
Danksagung 99
Lebenslauf 100
-
6
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Schema der
Druckeinwirkung........................................................
14
Abb. 2 Phasendiagramm von
Wasser.......................................................
15
Abb. 3 Hochdruckanlage Aufsicht
.............................................................
17
Abb. 4 Hochdruckanlage
Steuereinheit.....................................................
18
Abb. 5 Probengefäße und Parafilm
......................................................... 19
Abb. 6 Gelapparatur mit
Powersupply.......................................................
20
Abb. 7 96-Well-Mikrotiterplatte mit Verdünnungsreihen
............................ 24
Abb. 8 Verdünnungsreihe isolierte
MMP-9................................................ 35
Abb. 9 Verdünnungsreihe rekombinante MMP-9
...................................... 36
Abb. 10 Herstellerangaben für MMP-9
Activity-Assay................................. 37
Abb. 11 Standardkurve für MMP-9
Activity-Assay....................................... 37
Abb. 12 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 1. Messung
............. 38
Abb. 13 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 2. Messung
............. 38
Abb. 14 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 3. Messung
............. 39
Abb. 15 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 4. Messung
............. 39
Abb. 16 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 5. Messung
............. 40
Abb. 17 Isolierte MMP-9 nach HHD – „keine
Aktivierung“........................... 40
Abb. 18 Isolierte MMP-9 nach HHD – „Aktivierung nach
HHD“................... 41
Abb. 19 Isolierte MMP-9 nach HHD – „Aktivierung vor HHD“
..................... 42
Abb. 20 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 1.
Messung... 43
Abb. 21 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 2.
Messung... 43
Abb. 22 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 3.
Messung... 44
Abb. 23 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 4.
Messung... 44
Abb. 24 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 5.
Messung... 45
-
7
Abb. 25 Rekombinante MMP-9 nach HHD – „keine Aktivierung“
................ 45
Abb. 26 Rekombinante MMP-9 nach HHD – „Aktivierung nach HHD“
........ 46
Abb. 27 Rekombinante MMP-9 nach HHD – „Aktivierung vor
HHD“........... 47
Abb. 28 Isolierte MMP-9 nach HHD – Zymographie
................................... 48
Abb. 29 Rekombinante MMP-9 nach HHD –
Zymographie......................... 49
Abb. 30 Pro-MMP-9 –
Zymographie............................................................
49
Abb. 31 Aktivierte MMP-9 –
Zymographie...................................................
50
Abb. 32 MMP-9 inkubiert in EDTA-Puffer –
Zymographie........................... 50
Abb. 33 MMP-9 inkubiert in PMSF-Puffer – Zymographie
.......................... 51
Abb. 34 Proteinstruktur der Matrixmetalloproteinasen
................................ 60
-
8
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Zusammensetzung des
Trenngels................................................. 31
Tab. 2 Zusammensetzung des
Sammelgels............................................. 31
Tab. 3 Puffer und Lösungen für die
Zymographie..................................... 32
Tab. 4 Familie der Matrixmetalloproteinasen
............................................ 59
Tab. 5 Substrate der Matrixmetalloproteinase-9
....................................... 63
-
9
Abkürzungen und Einheiten
Abb. Abbildung
APMA p-Aminophenylmercuric acid
BSA bovines Serumalbumin
bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
CaCl2 Calciumchlorid
δ Differenz
ddH2O doppelt deionisiertes Wasser
d.h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FGF Fibroblast Growth Factor
HHD hydrostatischer Hochdruck
HIV Human Immunodefficiency Virus
IGF Insulin-like Growth Factor
IL Interleukin
K Kelvin
Kap. Kapitel
kDa Kilo-Dalton
l Liter
M Mol
-
10
mA Milli-Ampère
max. maximal
mg Milligramm
min Minute(n)
mm Millimeter
mM Milli-Mol
MMP Matrixmetalloproteinase(n)
MPa Mega-Pascal (1 MPa = 10 bar = 106 Newton/m2)
µm Mikrometer
NaCl Natriumchlorid
ng Nanogramm
PBS Phosphate-Buffered Saline
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PVC Polyvinylchlorid
SDS Sodiumdodecylsulfat
Tab. Tabelle
TEMED N‘,N‘,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
TGF Transforming Growth Factor
TIMP Tissue Inhibitor of Matrixmetalloproteinases
TNF Tumornekrosefaktor
uPA Urokinase-type Plasminogen Activator
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
W Watt
z.B. zum Beispiel
ZnCl2 Zinkchlorid
-
1. Einleitung 11
1. Einleitung
Während kleinere Knochendefekte bereits mit
zufriedenstellenden
biologischen und biomechanischen Ergebnissen rekonstruiert
werden können,
ist die Versorgung großer segmentaler Defekte, wie sie bei
Knochentumoren
entstehen, schwierig und geht häufig mit Komplikationen
einher.
Sämtliche Verfahren zur Defektrekonstruktion nach
Knochenresektionen, bei
denen kein autologer Knochen verwendet wird, sind mit mehr oder
weniger
großen Nachteilen verbunden. Gute Ergebnisse im Sinne einer
biologischen
Lösung würden sich mit dem entnommenen Knochensegment selbst
erreichen
lassen, was aber eine vollständige Inaktivierung der Tumorzellen
und eine
weitgehende Erhaltung der biologischen und biomechanischen
Eigenschaften
voraussetzt.
Bisher werden klinisch oder experimentell zur
Tumordevitalisierung von
Knochen thermische und radioaktive Verfahren eingesetzt, die
eine einzeitige
Reimplantation des autologen Knochensegmentes ermöglichen, sich
aber
allesamt negativ auf die biologischen und biomechanischen
Eigenschaften des
Knochens auswirken [Urist et al.: 1974, 586-593; Knaepler et
al.: 1991, 194-
199].
Eine Alternative zur Behandlung von tumorbefallenen
Knochensegmenten
könnte hydrostatischer Hochdruck (HHD) sein. Durch
hydrostatischen
Hochdruck wird die Replikationsfähigkeit von pro- und
eukaryontischen Zellen,
Tumorzellen eingeschlossen, nachhaltig ausgeschaltet [Diehl et
al.: 2003,
1851-1855], ohne dass es zu negativen Veränderungen der
Biomechanik des
Knochens kommt [Steinhauser et al.: 2004, eingereicht].
Ziel des gesamten Forschungsprojektes ist es, ein
betroffenes
Knochensegment onkologisch korrekt en bloc steril vom Patienten
zu
entnehmen. Nachdem makroskopische Tumoranteile debridiert worden
sind,
werden durch extrakorporale Behandlung mit HHD Tumorzellen
bzw.
Mikroorganismen devitalisiert. Anschließend erfolgt zur
Defektrekonstruktion
die orthotope Reimplantation des genau passenden autologen
Segmentes.
Dies könnte als neues und überlegenes Verfahren zur
Tumordevitalisierung in
-
1. Einleitung 12
der orthopädischen Chirurgie eine vielversprechende
Therapieoption
darstellen.
Die Hochdrucktechnologie (statischer hydrostatischer Hochdruck
bis
1000 MPa) wird bisher in der Medizin nicht eingesetzt. Zur
Haltbarmachung
von Lebensmitteln (z.B. Konfitüren und Säfte) wird das Verfahren
bereits seit
ca. 100 Jahren untersucht und seit ca. 20 Jahren industriell
verwendet
[Cheftel: 1995, 75-90].
Für die Etablierung des Hochdruckverfahrens in der Medizin ist
es notwendig,
die Veränderung von mechanischen, biologischen und
biochemischen
Eigenschaften infolge HHD-Behandlung zu kennen.
Aufgrund der besonderen Bedeutung der Matrixmetalloproteinase-9
für den
physiologischen und pathologischen Knochenstoffwechsel
untersucht die
vorliegende Arbeit den Einfluss von hydrostatischem Hochdruck
auf das
Protein bzw. das enzymatische Profil.
Matrixmetalloproteinasen (MMP) sind eine Familie von mindestens
25
proteolytischen Enzymen mit einem zentralem Zinkatom, die für
die meisten
Auf- und Abbauvorgänge an der Extrazellulärmatrix
(Remodeling)
verantwortlich sind. MMP beeinflussen die Proliferation,
Morphogenese und
Apoptose von Zellen sowie deren Migration, Gewebeinvasion und
zahlreiche
weitere Funktionen [Vu et al.: 2000, 2123-2133].
Physiologisch sind MMP bereits in der Embryogenese an
zahlreichen
enzymatischen Prozessen beteiligt [Vu et al.: 2000, 2123-2133].
Deutlich
erhöhte Konzentrationen finden sich bei der Wund- und
Knochenheilung
[Holmbeck et al.: 1999, 81-92; Armstrong et al.: 2002,
12-18].
Pathologisch spielen MMP eine wichtige Rolle bei der Tumorgenese
und
Tumorneoangiogenese [Stetler-Stevenson et al.: 1993, 1434-1441],
bei
Arthritiden [Zucker et al.: 1994, 2329-2333] sowie bei
aseptischen
Endoprothesenlockerungen [Takagi: 1996, 3-29; Diehl et al.:
2004, 711-715].
Die Matrixmetalloproteinase-9 gehört zur Untergruppe der
Gelatinasen und hat
eine Schlüsselfunktion bei ossären Resorptions- und
Umbauvorgängen
[Okada et al.: 1995, 311-322; Rice et al.: 1997, 479-486;
Delaisse et al.: 2000,
223-234]. Pathologische Bedeutung hat MMP-9 bei sämtlichen
osteolytischen
Defekten aufgrund ihrer Überexpression in Osteoklasten [Reponen
et al.:
-
1. Einleitung 13
1994, 1091-1102]. Weiterhin findet sich bei Osteosarkomen eine
deutlich
erhöhte MMP-9-Konzentration, wodurch Tumorinvasion und
Metastasierung
unterstützt werden [Peng et al.: 2002, 745-750].
Ein möglicher Anstieg der MMP-9-Konzentration bzw. –aktivität
durch die
HHD-Therapie würde einem Einwachsen des reimplantierten
Knochensegmentes infolge verstärkter osteolytischer Vorgänge
entgegenwirken.
Untersuchungen müssen klären, welchen Einfluss die
HHD-Behandlung auf
die Konzentration bzw. Aktivität von MMP-9 hat. Es soll gezeigt
werden, dass
sich die MMP-9 Konzentration bzw. Enzymaktivität infolge einer
HHD-Therapie
nicht wesentlich verändert.
-
2. Material und Methoden 14
2. Material und Methoden
2.1 Physikalische Grundlagen
Für den verwendeten hydrostatischen Hochdruck gelten die
Gesetzmäßigkeiten von Druck in Flüssigkeiten.
Das Pascalsche Prinzip besagt, dass sich Druck in einer
Flüssigkeit
ungehindert nach allen Seiten und auf die Wände des Behälters in
gleicher
Größe verteilt [Tipler: 1994, 347]. Darauf beruht auch die
Isostatik, welche
besagt, dass die Ausbreitung von Druck in Flüssigkeit
gleichmäßig und ohne
relevante zeitliche Verzögerung erfolgt. Dies gilt auch für eine
untersuchte
Substanz, die in keinem direkten Kontakt mit dem
druckübertragenden
Medium steht, sofern das die Probe umgebende Material flexibel
ist.
Nach diesen beiden Gesetzen ist Druck bis zu einer bestimmtem
Viskosität
des Druckmediums gleichmäßig und ohne zeitliche Verzögerung auf
die
gesamte Untersuchungsprobe wirksam. Es kann also davon
ausgegangen
werden, dass der Druck im gesamten Probengefäß gleichgroß ist
und dem in
der Druckkammer indirekt gemessenen Druck entspricht.
Abb. 1: Schema der Druckeinwirkung
Das Volumen ist die am stärksten von Druck beeinflusste
physikalische Größe.
Wichtig für das Verständnis druckinduzierter Einflüsse auf
physikalische und
chemische Reaktionen ist dabei das Prinzip von Le Chatelier und
Braun: Wird
auf ein System im Gleichgewicht durch Änderung der äußeren
Bedingungen
Kraft
Probe
Medium
-
2. Material und Methoden 15
ein Zwang bzw. eine Störung ausgeübt, reagiert das System mit
einer
Gleichgewichtsverschiebung derart, dass die Wirkung dieser
Störung
möglichst gering ist [Meschede: 2004, 266]. Das bedeutet, dass
physikalische
und chemische Vorgänge (Phasenübergang, molekulare
Transformation,
chemische Reaktion), die mit einer Volumenverringerung
einhergehen, unter
HHD bevorzugt ablaufen, während umgekehrt Vorgänge, die mit
einer
Volumenzunahme verbunden sind, vermindert ablaufen.
Volumenveränderungen aufgrund innerer Strukturveränderungen
von
Proteinen beeinflussen die Gleichgewichtskonstante der
reversiblen oder
irreversiblen Denaturierungsreaktion sowie die
Reaktionsgeschwindigkeit von
enzymatischen Reaktionen [Heremans et al.: 1998, 353-370].
Flüssigkeiten werden bei hohem Druck in unterschiedlichem
Maße
komprimiert und zeigen unterschiedliche Phasenübergänge. Für
Untersuchungen bis 600 MPa ist Wasser geeignet. Bis zu einem
Druck von
208 MPa senkt HHD den Gefrierpunkt von Wasser um bis zu 22 K
[Wagner:
1994, 515-525]. Oberhalb von 625 MPa liegt Wasser bei
Temperaturen
über 0 °C bereits eisförmig vor [Bridgman: 1912, 441-558;
Tauscher: 1995, 3-
13], so dass in höheren Druckbereichen ölartige Druckmedien
verwendet
werden müssen.
Abb. 2: Phasendiagramm von Wasser [Tauscher: 1995, 3-13]
Im Gegensatz zu Gasen ist der Volumenverlust von Flüssigkeiten
unter Druck
nur relativ gering. Das bei den Untersuchungen verwendete
Druckmedium
Wasser weist im Vergleich zu den meisten organischen
Flüssigkeiten eine
sehr niedrige Kompressibilität auf. Im Temperaturbereich von 0
bis 20 °C wird
für Wasser eine Kompressibilität von ca. 7% bei 200 MPa bzw. 12%
bei
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 200 400 600 800 1000
Druck (MPa)
Tem
pera
tur (
°C)
eeiissfföörrmmiigg
ffllüüssssiigg
-
2. Material und Methoden 16
400 MPa angegeben [Knorr: 1999, 485-491]. Von der gleichen
Kompressibilität kann bei den untersuchten Enzymlösungen
ausgegangen
werden.
Der druckinduzierte Temperaturanstieg ist abhängig vom
verwendeten
Druckmedium und der Ausgangstemperatur. Der für die
vorliegenden
Untersuchungsbedingungen (Druckmedium Wasser,
Ausgangstemperatur
5 °C) Temperaturanstieg von 1-2 K pro 100 MPa [Makita: 1992,
87-95; Knorr:
1999, 485-491] ist zum einen in Bezug auf die vorliegenden
Untersuchungen
zu vernachlässigen und wird zum anderen durch einen
Heiz-Kühl-
Thermostaten korrigiert.
2.2 Hochdruckanlage
Alle Untersuchungen wurden mit der Hochdruckanlage der Firma
SITEC
Sieber Engineering AG, Zürich, Schweiz (Modell 765.0050)
durchgeführt.
Der Betriebsdruck ist mit 400 MPa angegeben. Als Druckmedium
dient
Wasser, da es aufgrund seiner geringen, dem
Untersuchungsmedium
ähnlichen Viskosität eine schnelle und gleichmäßige
Druckübertragung auf die
Untersuchungsprobe gewährleistet. Weitere Vorteile von Wasser
als
Druckmedium sind die einfache Handhabung und die günstige
und
umweltverträgliche Verfügbarkeit.
Der Druck wird anfangs manuell mittels einer Handpumpe erzeugt.
Ab einem
Druck von ca. 50 MPa wird der Druckaufbau von einer
Spindelpresse
übernommen, die von einem Elektromotor (1600 W Nennleistung, 4
ml
Hubvolumen, 100 mm Hub) angetrieben wird. Die Geschwindigkeit
des
Elektromotors und somit die Druckaufbauzeit sind konstant ca.
100 MPa/min.
Die aus Edelstahl gefertigte Druckkammer zur Aufnahme der
Untersuchungsproben hat ein Volumen von 50 ml und ist
vollständig mit
Wasser gefüllt. Sie ist mit einem Heizmantel zur
Temperaturvariation und
einem 4 cm dicken Stahlmantel umgeben. Die Druckkammer wird von
oben
befüllt und mit einem druckstabilen Schraubverschluss
abgedichtet.
Im System zwischen Spindelpresse und Druckkammer befindet sich
ein
Drucksensor, der mit der Schaltmesseinheit verbunden ist und den
Druck auf
1 bar (entspricht 0,1 MPa) genau misst.
-
2. Material und Methoden 17
Die Anlage verfügt über fünf spezielle Hochdruckventile, die zum
einen das
System gegenüber dem Umgebungsdruck abdichten und zum anderen
auch
eine Unterteilung innerhalb der Hochdruckanlage ermöglichen.
Abb. 3: Hochdruckanlage Aufsicht
P1: Spindelpresse, P2: Handpumpe, B1: Druckkammer, B2:
Überdruckbehälter, TC: Heiz-
Kühl-Thermostat, V1-5: Ventile
In die Hochdruckanlage ist ein Heiz-Kühl-Aggregat integriert,
das je nach
Druckmedium Temperaturen von -25 °C bis 120 °C in der
Druckkammer
herstellen kann (mit Wasser zwischen 1 °C und 50 °C). Die
gewünschte
Untersuchungstemperatur kann direkt am Heiz-Kühl-Aggregat
eingestellt
werden. Der eingestellte Wert wird permanent mit dem Istwert,
der von einem
Thermostat in der Druckkammer gemessen wird, abgeglichen. Die
Temperatur
wird über die gesamte Druckdauer konstant gehalten.
Über einen Druckausgleichsbehälter kann der Druck zum einen nach
Ende der
Druckhaltephase kontrolliert abgelassen werden. Zum anderen ist
er durch
eine auf 450 MPa eingestellte Berstscheibe mit dem Drucksystem
verbunden
und dient so zum Druckabfall bei unkontrollierten Druckspitzen,
um Schäden
am System zu vermeiden. Der Druckausgleichsbehälter wird auch
zum
Befüllen der Anlage mit Druckmedium verwendet.
Foto: B. Frey
-
2. Material und Methoden 18
An der Steuereinheit ist es möglich, Zieldruckwerte für den
Automatikbetrieb
einzustellen, aktuelle Druck- und Temperaturwerte im System
genau
abzulesen und die Hochdruckanlage manuell oder im
Automatikbetrieb zu
bedienen.
Abb. 4: Hochdruckanlage Steuereinheit
2.3 Material und Geräte
2.3.1 Probengefäße
Verwendet wurden Nalgene® Cryogenic Vials (Nalge Company,
Rochester,
NY, USA, Art. 5000-0012). Diese Gefäße, hergestellt für das
Einfrieren von
Substanzen in flüssigem Stickstoff, waren in Vorversuchen am
stabilsten und
auch hinsichtlich Volumen gut geeignet.
Die gewählten Probengefäße müssen für die Bedingungen in der
Druckkammer geeignet, d.h. aus stabilem Material gefertigt, aber
auch
verformbar sein. Besonders kritisch ist der
Verschlussmechanismus, der einer
hohen mechanischen Belastung standhalten muss. Es darf weder
Probenflüssigkeit austreten noch Flüssigkeit aus der Druckkammer
in das
Gefäß gelangen, da dies die Ergebnisse entscheidend verändern
würde.
Vorbereitende Untersuchungen mit tintengefärbten Lösungen in den
Gefäßen
Netzschalter
Ist-Temperatur
Automatikbetrieb
manueller Betrieb Ist-Druck Soll-Druck
Drehzahleinstellung der Spindelpresse
-
2. Material und Methoden 19
haben einen bis zur maximalen Druckstufe von 400 MPa dichten
Verschluss
gezeigt. Dabei wurde bei sämtlichen Versuchen der
Verschlussbereich
zusätzlich mit Parafilm (American National Can Company, Joplin,
MO, USA)
abgedichtet, um das Risiko eines Flüssigkeitsaustritts bzw.
–eintritts oder
eines möglichen Ablösens des Deckels während der Gefäßverformung
unter
Druck weiter zu minimieren.
Abb. 5: Probengefäße und Parafilm
Der geringen Verformung infolge Flüssigkeitskompression (siehe
Kap. 2.1)
können die verwendeten Gefäße standhalten, nicht aber der
starken
Verformung durch Kompression von Luft. Daher ist beim Befüllen
darauf zu
achten, dass sich keine Luft in den Gefäßen befindet, da diese
während der
Druckbehandlung sonst zerbrechen würden. Vollständig gefüllt
fassen die
Probengefäße ein Volumen von 2,3 ml.
2.3.2 Photometer
Die photometrischen Messungen erfolgten mit dem Multiscan
Ascent® (Version
1.3.1, Labsystems, Research Technologies, Helsinki, Finland,
Art. 1507 540).
Als dazugehörige Software wurde vom selben Hersteller die
Ascent® Software
(Version 2.4 für Multiskan Ascent® Art. 1507 550) verwendet.
-
2. Material und Methoden 20
2.3.3 Zymographieapparatur
Die elektrophoretische Auftrennung für die MMP-Zymographie
erfolgte in der
Gelapparatur Mini-Protean® 3 Cell (Bio-Rad, München,
Deutschland, Art. 165-
3301 + 165-3302). Zur Stromerzeugung wurde der Powersupply
Lightning Volt
(Owl Scientific, Portsmouth, NH, USA, Art. OSP-250L)
verwendet.
Abb. 6: Gelapparatur mit Powersupply
2.3.4 Weitere Materialien und Geräte
Im Folgenden werden alle weiteren Materialien und Geräte
aufgezählt, die im
Rahmen der vorliegenden Untersuchungen verwendet worden
sind:
• Computer (Intel Pentium II 266 MHz, Betriebssystem Microsoft
Windows®
98, Software: Microsoft Office 97)
• Digitalkamera (Yakumo® Mega Image IV, Software: Adobe
Photoshop 7.0)
• Eismaschine (Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen,
Deutschland)
• Vortex Mixer (NeoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH,
Heidelberg, Deutschland)
• Thermomixer (comfort 5355, Eppendorf AG, Hamburg,
Deutschland)
• Schüttel-Misch-Tisch (Titramax/Inkubator 1000, Heidolph
Instruments
GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland)
• Pipettierhilfe (Pipetus-Akku, Hirschmann Laborgeräte GmbH
& Co. KG,
Eberstadt, Deutschland)
-
2. Material und Methoden 21
• Reaktionsgefäße (0,6 und 2,0 ml, Biozym GmbH, Hamburg,
Deutschland)
• Eppendorf-Gefäße (unterschiedliche Volumina, Eppendorf AG)
• Eppendorf-Pipetten (unterschiedliche Volumina, Eppendorf
AG)
• Sterile Einmal-Glaspipetten (Falcon, unterschiedliche
Volumina, Becton
Dickinson Labware Company, Franklin Lakes, NJ, USA)
• Sterile PVC-Röhrchen (Falcon Blue Max, unterschiedliche
Volumina,
Becton Dickinson Labware Company)
2.4 Puffer und Lösungen
Im Folgenden werden sämtliche Puffer und Lösungen aufgezählt,
die im
Rahmen der vorliegenden Untersuchungen verwendet worden
sind:
• Ammonium-Persulfat >98% (Sigma, A-3678)
• APMA (p-Aminophenylmercuric acid) (Amersham Pharmacia
Biotech,
Buckinghamshire, England, Art. RPN 2634)
• Brij 35 (Sigma, Art. P-1254)
• Brillant Blau G Tabletten (50mg/Tablette) (Roth, Art.
9470.1)
• Bromphenol Blau (Sigma, Art. B-5525)
• BSA (bovines Serumalbumin) Fraktion V 96% (Sigma, Art.
A-4503)
• CaCl2 (Calciumchlorid) (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz,
Art. 21097)
• ddH2O (doppelt deionisiertes Wasser)
• Dimethylsulfoxid (Merck, Art. 8.02912)
• EDTA-Natrium (Ethylendiamintetraessigsäure) >99% (Roth,
Art. 8043.1)
• Enzympuffer (modifiziert nach Verheijen et al. [Verheijen et
al.: 1997, 603-
609]): Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,5), 1,5 mM Natriumchlorid,
0,5 mM
Calciumchlorid, 1 µM Zinkchlorid, 0,01% Brij 35
• Essigsäure 100% (Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ,
USA,
Art. 1.00063)
• Gelatine (Merck, Art. 1.04080)
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2. Material und Methoden 22
• Glycerin Rotipuran >99,5% wasserfrei (Carl Roth GmbH &
Co. KG,
Karlsruhe, Deutschland, Art. 3783.1)
• Glycin Rotipuran >99% (Roth, Art. 3908.1)
• Isopropanol reinst
• NaCl (Natriumchlorid) (Merck, Art. 1.06404)
• Natronlauge 1 mol/l (Merck, Art. 1.09137)
• PBS (Phosphate-Buffered Saline) 0,01 M, pH 7,4 (Sigma-Aldrich
Inc., St.
Louis, MO, USA, Art. P-3813)
• PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) (Sigma, Art. P-7626)
• Polyacrylamid Rotiphorese Gel 29:1 (40%) (Roth, Art.
A515.1)
• Salzsäure 1mol/l (Merck, Art. 1.09057)
• SDS (Sodiumdodecylsulfat) >99% (Sigma, Art. L-3771)
• TEMED (N‘,N‘,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin) (Sigma, Art.
T-9281)
• Tris-Puffer 99+% (Sigma, Art. T-8524)
• Triton X-100 (Sigma, Art. T-9284)
• ZnCl2 (Zinkchlorid) (Merck, Art. 1.08816)
2.5 Untersuchtes Enzym
2.5.1 Isolierte humane Matrixmetalloproteinase-9
Aus humanen Blutkonserven-Leukozyten isolierte MMP-9 wurde uns
von der
Arbeitsgruppe Prof. Dr. H. Tschesche, Fakultät für Chemie,
Universität
Bielefeld überlassen [Tschesche et al.: 1986, 125-131; Nitsch et
al.: 1990,
611-615; Tschesche et al.: 1992, 245-255; Hertfelder et al.:
1994, 441-447].
Das Protein wurde in PBS-Puffer gelöst, tiefgekühlt, in einer
Konzentration von
4 mg/ml geliefert. Die Enzymlösung wurde zunächst in 50
Portionen à 2 ml mit
einer Konzentration von 1 µg/ml und 20 Portionen à 2 ml mit
einer
Konzentration von 5 µg/ml aliquotiert und bei –80 °C
eingefroren. Jedes
Aliquot wurde nur ein Mal verwendet, um so ein wiederholtes
Auftauen und
Einfrieren des Enzyms zu vermeiden. Zum Verdünnen wurde ein
spezieller
-
2. Material und Methoden 23
Enzympuffer (siehe Kap. 2.4) verwendet, um unter anderem
Autoaktivierung
und Adhäsion des Enzyms an die Gefäßwand möglichst gering zu
halten.
2.5.2 Rekombinante humane Matrixmetalloproteinase-9
Verwendet wurde rekombinant hergestellte humane MMP-9
(Oncogene,
Boston, MA, USA, Art. PF038). Das Enzym wurde tiefgekühlt als
Lyophilisat
geliefert und ebenfalls in Enzympuffer (siehe Kap. 2.4) gelöst.
Es wurden 20
Aliquots à 1 ml mit einer Konzentration von 1 µg/ml hergestellt
und bei –80 °C
eingefroren.
2.5.3 In vitro Aktivierung der Matrixmetalloproteinase-9
Eine in vitro Aktivierung von MMP mit p-Aminophenylmercuric acid
(APMA) ist
weit verbreitet und gut erforscht [Okada et al.: 1992,
21712-21719; Nagase:
1997, 151-160; Brinckerhoff et al.: 2002, 207-214]. Auch der
zur
Versuchsauswertung verwendete Activity-Assay basiert auf einer
Aktivierung
mit APMA. Bei in dieser Arbeit verwendeter APMA handelt es sich
um 352 mg
(1 M) tiefgefrorene pulverförmige APMA, die in 1 ml
Dimethylsulfoxid gelöst
wurde. Vor jeder Anwendung wurden 10 µl davon in 10 ml des
jeweils
verwendeten Puffers gelöst, was als ready-to-use APMA bezeichnet
wird und
der in der Literatur empfohlenen Konzentration von 1 mM
entspricht [Braunhut
et al.: 1994, 13472-13479; Murphy et al.: 1995, 470-484]. Die
mit ready-to-use
APMA gemischten Enzymlösungen wurden für 1,5 h bei 37 °C
inkubiert.
2.6 Verdünnungsreihen der Matrixmetalloproteinase-9
Um für nachfolgende Untersuchungen mit MMP-9 optimale
Bedingungen zu
gewährleisten, wurden Messungen von Verdünnungsreihen
durchgeführt.
Dabei wurden zum einen verschiedene bekannte Konzentrationen
der
untersuchten Enzyme mit der Auswertungs-Standardkurve des
Herstellers
sowie der Verdünnungsreihe des vom Hersteller mitgelieferten
Enzyms
verglichen, um später Aussagen über Messergebnisse
unbekannter
Konzentration machen zu können. Zweitens wurden drei
unterschiedliche
Pufferlösungen untersucht: 1. Reiner PBS-Puffer, 2. PBS-Puffer
mit BSA (1%),
3. Enzympuffer (siehe Kap. 2.4).
-
2. Material und Methoden 24
Es wurden acht Eppendorfgefäße mit den Konzentrationen 2, 4, 8,
16, 32, 64,
128 und 256 ng/ml beschriftet und mit Ausnahme des
256-ng/ml-Gefäßes mit
500 ml PBS-Puffer gefüllt. Die Ausgangskonzentrationen der
zu
untersuchenden MMP-9 (isoliert 4 mg/ml, rekombinant 1 µg/ml)
wurden mit
PBS-Puffer auf eine Konzentration von 256 ng/ml verdünnt und 1
ml in das
vorbereitete Eppendorfgefäß gefüllt. Davon wurden 500 µl in
das
128-ng/ml-Gefäß abpipettiert und dieses 30 s auf dem Vortex
Mixer
geschüttelt. Von der 128-ng/ml-Probe wurden wiederum 500 ml
entnommen
und in das 64-ng/ml-Gefäß gegeben. Dieser Vorgang wurde
fortgesetzt, bis
sich im 2-ng/ml-Gefäß 1 ml Enzymlösung mit einer Konzentration
von 2 ng/ml
befanden. Analog dazu wurde eine zweite Verdünnungsreihe mit
einem PBS-
Puffer mit BSA (1%) und eine dritte mit einem speziellen
Enzympuffer (siehe
Kap. 2.4) angelegt.
Abb. 7: 96-Well-Mikrotiterplatte mit Verdünnungsreihen
Die Untersuchungsproben wurden jeweils in zwei Wells auf die
Mikrotiterplatte
des MMP-9 Activity-Assay Systems aufgetragen (siehe Abb. 7) und
der Assay
wie beschrieben durchgeführt (siehe Kap. 2.8). Sämtliche
Untersuchungsproben wurden mit ready-to-use APMA aktiviert.
-
2. Material und Methoden 25
2.7 Hochdruckbehandlung der Matrixmetalloproteinase-9
2.7.1 Allgemeines
Es wurden MMP-9-Lösungen einer definierten Konzentration
hergestellt,
druckbehandelt und im Anschluss mittels Activity-Assay die
enzymatische
Aktivität gemessen.
Die Verdünnungsreihen haben für isolierte MMP-9 eine
Konzentration von
100 ng/ml und für rekombinante MMP-9 30 ng/ml als geeigneten
Messbereich
ergeben.
Aus der jeweils zu untersuchenden MMP-9 wurden drei
unterschiedliche
Proben hergestellt:
A: keine in vitro Aktivierung des Enzyms
B: In vitro Aktivierung des Enzyms nach Druckbehandlung
C: In vitro Aktivierung des Enzyms vor Druckbehandlung
Als Druckstufen wurden 200 und 400 MPa gewählt und zusätzlich
jeweils eine
nicht HHD-behandelte Kontrolle gemessen. Die Druckhaltezeit
(Plateaudauer)
betrug 10 min bei einer Temperatur in der Druckkammer von 5
°C.
Vorausgehende Untersuchungen haben gezeigt, dass sich die
Ergebnisse bei
5 °C, 20 °C (Raumtemperatur) oder 37 °C (Körpertemperatur) nur
in Bezug auf
eine bei höheren Temperaturen vermehrte Autoaktivierung
unterscheiden.
Deshalb wurde für die Untersuchungen eine Temperatur von 5 °C
gewählt.
Vor und nach der Druckbehandlung wurden die Untersuchungsproben
auf Eis
gelagert und die Untersuchungen ohne zeitliche Verzögerung
durchgeführt.
Einmal aufgetautes Enzym wurde nicht für weitere
Untersuchungen
verwendet.
Die Untersuchung wurde für beide Enzyme (isolierte und
rekombinante
MMP-9) jeweils fünf Mal wiederholt.
-
2. Material und Methoden 26
2.7.2 Herstellung der Untersuchungsproben
Zur Herstellung der Untersuchungsproben wurden zunächst die
benötigten
Enzymlösungsaliquots (isolierte bzw. rekombinante MMP-9,
Konzentration 1
µg/ml) aufgetaut. Für Proben A und B wurden 1 ml (0,3 ml)*
MMP-9-Lösung (1
µg/ml) mit 9 ml (9,7 ml)* Enzympuffer gemischt und 30 s auf dem
Vortex-Mixer
geschüttelt. Für Probe C wurden 0,5 ml (0,15 ml)* MMP-9 Lösung
mit 2 ml
(2,35 ml)* Enzympuffer und 2,5 ml ready-to-use APMA gemischt und
30 s auf
dem Vortex-Mixer geschüttelt. Somit hatten alle
Untersuchungsproben die
gewünschte Konzentration von 100 ng/ml (30 ng/ml)* MMP-9.
Es wurden 9 Probengefäße beschriftet (A Kontrolle, A 200 MPa, A
400 MPa,
analog für B und C) und mit den entsprechenden Lösungen
vollständig befüllt.
Die Proben der Gruppe C wurden anschließend zur Enzymaktivierung
für 1,5 h
bei 37 °C inkubiert, während die übrigen Proben auf Eis gelagert
wurden.
Für die zymographische Messung von hochdruckbehandeltem MMP-9
wurden
aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität der Verfahren zwei
separate
Untersuchungsproben aus Enzympuffer und isolierter MMP-9 (200
ng/ml) bzw.
rekombinanter MMP-9 (60 ng/ml) hergestellt. Diese beiden Proben
wurden
nicht in vitro aktiviert.
2.7.3 Druckbehandlung
Die Hochdruckanlage und das Heiz-Kühl-Aggregat wurden 30 min
vor
Versuchsbeginn eingeschaltet und auf 5 °C temperiert. Sobald die
gewünschte
Temperatur erreicht ist, kann die Druckkammer mit den
Untersuchungsproben
bestückt und dicht verschlossen werden.
Vor dem Druckaufbau wurde darauf geachtet, dass sich im
System
ausreichend Flüssigkeit befindet und gegebenenfalls über den
Überdruckbehälter destilliertes Wasser bis zur Kontrollmarke
nachgefüllt. Die
Ventile 4 und 5 (siehe Abb. 3) waren während der gesamten
Untersuchungsdauer dicht verschlossen und das Ventil 2
vollständig geöffnet.
Zunächst wurde die Handpumpe mehrmals betätigt, um die
Flüssigkeit im
System gleichmäßig zu verteilen. Danach wurde das Ventil 3
dicht
verschlossen.
*Angaben in Klammern beziehen sich auf rekombinante MMP-9
-
2. Material und Methoden 27
Mit der Handpumpe wurde ein Vordruck von ca. 50 MPa aufgebaut
und
danach das Ventil 1 verschlossen. Anschließend wurde an der
Schalteinheit
der gewünschte Zieldruck eingestellt und die Automatik
gestartet. Die
elektromotorisierte Spindelpresse stellte den gewünschten Druck
her und hielt
ihn über die vorgegebene Druckdauer (10 min) konstant.
Die Druckbehandlung kann in Druckaufbauphase, Durckhaltephase
(Plateau)
und Druckabbauphase eingeteilt werden. Die für die
vorliegenden
Untersuchungen angegebene Zeitdauer von 10 min bezieht sich auf
die
Druckhaltephase, d.h. die Zeitmessung wurde nach Erreichen des
Zieldrucks
gestartet und vor dem Druckabbau gestoppt. Es wurde darauf
geachtet, dass
Druckaufbau- und Druckabbaugeschwindigkeit bei allen
Untersuchungen
konstant ca. 100 MPa/min waren. Der Druck wurde abgebaut, indem
die
Spindelpresse nach Abschalten der Automatik per Druckknopf
zurückgefahren
wurde. Der verbleibende Restdruck wurde manuell über das Ventil
3
abgelassen. Ein kontrollierter und langsamer Druckabbau (ca. 100
MPa/min)
war dabei sehr wichtig, damit die Probengefäße ihre Ausgangsform
erreichen
konnten, ohne zu bersten. Sobald der Druck vollständig entwichen
war,
konnten die Druckkammer geöffnet und die Proben entnommen
werden.
2.7.4 Analyse der Untersuchungsproben
Die Untersuchungsproben A, B und C wurden jeweils in zwei Wells
auf die
Mikrotiterplatte des MMP-9 Activity-Assay Systems aufgetragen
und der Assay
wie im folgenden Kapitel beschrieben durchgeführt.
Die für die Zymographie vorgesehenen Untersuchungsproben wurden,
wie in
Kap. 2.9 beschrieben, auf zwei Gele aufgetragen und
analysiert.
2.8 Messung der Matrixmetalloproteinase-9-Aktivität
2.8.1 Grundlagen
Die quantitative Bestimmung der MMP-9-Aktivität erfolgte mit
dem
BIOTRAK® MMP-9 Activity-Assay System (Amersham Pharmacia
Biotech,
Buckinghamshire, England, Art. RPN 2634) nach dem Protokoll von
Verheijen
et al. [Verheijen et al.: 1997, 603-609].
-
2. Material und Methoden 28
Der Assay bestimmt spezifisch MMP-9. Dabei kann sowohl aktives
MMP-9
einzeln als auch die Gesamtmenge MMP-9 quantitativ nachgewiesen
werden.
Die Mikrotiterplatte ist mit einem spezifischen monoklonalen
MMP-9-Antikörper
beschichtet, der an eine Domäne des Enzyms bindet, die sowohl
die Proform
als auch die aktive Form besitzen [Fujimoto et al.: 1994,
79-88]. Nach
Komplexierung von aktivem MMP-9 bzw. Aktivierung des
komplexierten MMP-
9 wird die Proform des Detektionsenzyms proteolytisch in seine
aktive Form
gespalten. Dabei ist die Aktivierungssequenz des
Detektionsenzyms spezifisch
für MMP-9. Aufgrund eines chromogenen Peptidsubstrates, das an
das aktive
Detektionsenzym bindet, kann eine photometrische Messung bei
einer
Wellenlänge von 405 nm erfolgen [Capper et al.: 1999, 8-9].
Anhand einer
Standardkurve kann die Konzentration in den Untersuchungsproben
bestimmt
werden. Bei dem mitgelieferten MMP-9-Standard handelt es sich
nach
Angaben des Herstellers um humane rekombinant hergestellte MMP-9
aus
HT-1080 Fibrosarkomzellen [Okada et al.: 1992, 21712-21719].
2.8.2 Durchführung
Die Mikrotiterplatte wurde 1 h vor Auftragen der Proben aus
dem
Tiefkühlschrank genommen. Für die Standardreihe wurden 6
Eppendorfgefäße
mit Konzentrationen 1, 2, 4, 8, 16 und 32 ng/ml beschriftet und
mit Ausnahme
des 32-ng/ml-Gefäßes mit 300 µl des mitgelieferten Assay-Puffers
gefüllt. In
das 32-ng/ml-Gefäß wurde 600 µl des MMP-9-Standards pipettiert.
Davon
wurden 300 µl in das 16-ng/ml-Gefäß abpipettiert und das Gefäß
30 s auf dem
Vortex Mixer geschüttelt. Von der 16-ng/ml-Probe wurden wiederum
300 ml
entnommen und in das 8-ng/ml-Gefäß gegeben. Dieser Vorgang
wurde
fortgesetzt, bis sich im 1-ng/ml-Gefäß 600 µl Enzymlösung mit
einer
Konzentration von 1 ng/ml befanden. In die ersten beiden Wells
der
Mikrotiterplatte wurden je 100 µl Assay-Puffer als Nullprobe der
Standardreihe
pipettiert. Danach wurden von der Standardreihe und den
Untersuchungsproben je 100 µl in weitere Wells pipettiert.
Sämtliche
Untersuchungsproben wurden analog der Abb. 7 doppelt
aufgetragen. Die
Mikrotiterplatte wurde mit dem Deckel abgedeckt und bei 4 °C für
18 h
inkubiert.
-
2. Material und Methoden 29
Anschließend wurde die gesamte Flüssigkeit aus der
Mikrotiterplatte entfernt
und die Wells vier Mal mit einem zum Assay gehörenden
Waschpuffer
gewaschen. Danach musste die Platte gut abgetropft werden, damit
sich keine
Flüssigkeit mehr in den Wells befand. In alle Wells der
Standardreihe und alle
Wells der Gruppe B wurde je 50 µl ready-to-use APMA pipettiert,
in alle
übrigen belegten Wells je 50 µl Assay-Puffer. Die
Mikrotiterplatte wurde 30 s
geschüttelt und anschließend bei 37 °C für 1,5 h inkubiert. Drei
min vor Ende
der Inkubationszeit wurde das Detektionsenzym mit dem
Detektionssubstrat
im Verhältnis 1:1 gemischt, 30 s auf dem Vortex-Mixer
geschüttelt und sofort je
50 µl davon in alle belegten Wells pipettiert. Die
Mikrotiterplatte wurde 30 s
geschüttelt und direkt im Anschluss bei 450 nm Wellenlänge im
ELISA-Reader
gelesen, was die Absorbtions-Ausgangswerte (t0) ergab. Die
Mikrotiterplatte
wurde bei 37 °C für 1 h inkubiert, danach 30 s geschüttelt und
dann wiederum
bei 405 nm gelesen, was die Absorbtions-Messwerte nach 1 h (t1)
ergab.
2.8.3 Auswertung
Zunächst wurde für alle Wells die Differenz zwischen t1- und
t0-Werten
gebildet. Da jede Probe in zwei Wells gemessen worden ist,
wurden die
Mittelwerte aus den zusammengehörenden Differenz-Wertepaaren
gebildet.
Um für die weitere Verwendung und graphische Darstellung ganze
Werte zu
erhalten, wurden alle Mittelwerte mit 1000 multipliziert. Die
für die Ergebnisse
angegebenen Werte der Enzymaktivität sind folglich definiert als
mittlere
Differenz der Absorption bei 450 nm (mean δAbsorbtion405 x
1000). Die
gemessene Absorption steigt proportional zur Erhöhung der
Enzymaktivität, so
dass anhand der Absorbtionsmesswerte auf die Höhe der
MMP-9-Aktivität
geschlossen werden kann.
2.9 Zymographischer Nachweis der Matrixmetalloproteinase-9
2.9.1 Grundlagen
Die MMP-Zymographie ist ein elektrophoretisches Verfahren
zur
Identifizierung proteolytischer Formen dieser Enzyme. Es ist
möglich, aufgrund
der unterschiedlichen Molekülgröße aktives von inaktivem Enzym
zu
unterscheiden und grobe quantitative Aussagen zu machen.
-
2. Material und Methoden 30
Zuerst erfolgt eine elektrophoretische Trennung von Proteinen
auf einem
denaturierenden, aber nicht reduzierenden gelatinehaltigen
Polyacrylamidgel.
Dabei wird durch Zusatz von Sodiumdodecylsulfat (SDS) eine
ladungsunabhängige Auftrennung der Proteine nach
Molekulargewicht
erreicht. Anhand eines definierten Proteinstandards, der in eine
Bahn
aufgetragen wird, kann das Molekulargewicht der untersuchten
Proben
abgelesen werden. Am Ende der Laufzeit werden die Proteine
renaturiert und
in einem dem untersuchten Enzym entsprechenden
Aktivierungspuffer
inkubiert. Nach Färbung des Gels erscheinen die Stellen mit
proteolytischer
Aktivität durchsichtig, da hier die Gelatine von aktivem Enzym
zersetzt worden
ist [Hawkes et al.: 2001, 399-410].
Diese Art der Zymographie ist eine gut erforschte und häufig
angewendete
Technik zur qualitativen und semiquantitativen Detektion von
MMP-9 und mit
einem bis in den Picogramm reichenden Nachweisbereich sehr
sensitiv
[Kleiner et al.: 1994, 325-329; Pucci-Minafra et al.: 2001,
419-427]. Die
Proform von MMP-9 hat ein Molekulargewicht von 92 kDa, während
aktives
MMP-9 infolge der proteolytischen Abspaltung mit 84 kDa leichter
ist
[Nakashima et al.: 1998, 694-700; Woessner et al.: 2000, 2; Muhs
et al.: 2003,
8-15]. Während der Elektrophorese werden Proform und aktive Form
von
MMP-9 folglich in unterschiedliche Banden aufgetrennt und
zersetzen bei
nachfolgender Aktivierung an unterschiedlichen Stellen die im
Gel vorhandene
Gelatine.
Zum Nachweis, dass es sich bei den verwendeten Enzymen um
MMP-9
gehandelt hat, wurde, wie vielfach in der Literatur beschrieben,
je eine
Zymographie mit einem Hemmstoff für Metalloproteinasen (EDTA)
und einem
Hemmstoff für Serin- und Cysteinproteinasen (PMSF)
durchgeführt
[Deutscher: 1990, 83-89; Yao et al.: 1996, 15580-15589].
2.9.2 Herstellung der Untersuchungsproben
Es wurden zuerst die nötigen Enzymlösungsaliquots der zu
untersuchenden
Enzyme aufgetaut:
1. isolierte MMP-9 (1 µg/ml)
2. rekombinante MMP-9 (1 µg/ml))
3. Standard MMP-9 aus MMP-9 Activity-Assay (64 ng/ml)
-
2. Material und Methoden 31
Durch Verdünnung mit Enzympuffer wurden folgende
Untersuchungsproben
gewünschter Konzentration hergestellt.
Für Gele 1,3 und 4:
• Lösung isolierte MMP-9 (200 ng/ml)
• Lösung rekombinante MMP-9 (64 ng/ml)
• Lösung Standard MMP-9 (64 ng/ml)
Für Gel 2:
• Lösung isolierte MMP-9 (200 ng/ml) mit ready-to-use APMA
(33%)
• Lösung rekombinante MMP-9 (64 ng/ml) mit ready-to-use APMA
(33%)
• Lösung Standard MMP-9 (64 ng/ml) mit ready-to-use APMA
(33%)
Für Gel 3 und 4 als Positivkontrolle:
• Lösung rekombinante MMP-9 (128 ng/ml)
Alle APMA-haltigen Untersuchungsproben wurden vor dem
weiteren
Bearbeiten zur Enzymaktivierung für 1,5 h bei 37 °C
inkubiert
Vor dem Auftragen auf die Gele wurden sämtliche Proben im
Verhältnis 4:1
mit Probenpuffer gemischt und 30 s auf dem Vortex-Mixer
geschüttelt.
2.9.3 Durchführung
Durchführung und verwendete Substanzen basierten auf den Angaben
von
Hawkes et al. [Hawkes et al.: 2001, 399-410].
Polyacrylamid Rotiphorese Gel 29:1 (40%) 2,5 ml 1,5 M
Tris-Puffer pH 8,6 2,5 ml Gelatine 100,0 µl SDS (10%ige Lösung)
100,0 µl ddH2O 4,75 ml Ammonium-Persulfat (10%ige Lösung) 50,0 µl
TEMED 5,0 µl Tab. 1: Zusammensetzung des Trenngels (Angaben für
zwei Minigele à 8,0 cm x 7,3 cm, Stärke 0,75 mm)
Polyacrylamid Rotiphorese Gel 29:1 (40%) 1,25 ml 0,5 M
Tris-Puffer pH 6,8 2,5 ml SDS (10%ige Lösung) 100,0 µl ddH2O 6,1 ml
Ammonium-Persulfat (10%ige Lösung) 50,0 µl TEMED 5,0 µl Tab. 2:
Zusammensetzung des Sammelgels (Angaben für zwei Minigele à 8,0 cm
x 7,3 cm, Stärke 0,75 mm)
-
2. Material und Methoden 32
Proben-Puffer: 250 mM Tris-Puffer, 275 mM SDS, in ddH2O mit 40%
Glycerin und 0,2% Bromphenol Blau, pH 6,8
Laufpuffer: 25 mM Tris-Puffer, 200 mM Glycin, 3,5 mM SDS, in
ddH2O
Inkubationspuffer 1: 50 mM Tris-Puffer, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl,
in ddH2O mit 2,5% Triton X-100, pH 7,5
Inkubationspuffer 2: wie Inkubationspuffer 1, aber ohne Triton
X-100
EDTA-Puffer 1: 50 mM Tris-Puffer, 200 mM NaCl, 100 mM
EDTA-Natrium, in ddH2O mit 2,5% Triton X-100, pH 7,5
EDTA-Puffer 2: wie EDTA-Puffer 1, aber ohne Triton X-100
PMSF-Puffer 1: 50 mM Tris-Puffer, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 100
mM PMSF, in ddH2O mit 2,5% Triton X-100, pH 7,5
PMSF-Puffer 2: wie PMSF-Puffer 1, aber ohne Triton X-100
Färbelösung: ddH2O mit 30% Isopronanol, 10% Essigsäure und 0,2%
Brillant blau G
Entfärbelösung: ddH2O mit 10 % Isopropanol und 10 %
Essigsäure
Tab. 3: Puffer und Lösungen für die Zymographie
Nachdem alle notwendigen Substanzen hergestellt worden waren,
wurden
zunächst zwei gelatinehaltige 12%ige Polyacrylamid-Trenngele
(siehe Tab. 1)
hergestellt, ca. 6 cm hoch in die Gießapparatur eingefüllt und
60 min
polymerisieren gelassen. Das Sammelgel (siehe Tab. 2) wurde
gemischt, bis
zur Oberkante auf das Trenngel gegossen, mit einem Kamm zum
Formen der
Probenkammern versehen und 45 min polymerisieren gelassen.
Nachdem die
Gele vollständig polymerisiert waren, wurden sie aus der
Gießapparatur
entfernt und in der Elektrophoresekammer eingespannt. Die
Elektrophoresekammer wurde zur Hälfte mit Laufpuffer gefüllt, so
dass die
Gele vollständig bedeckt waren.
Jedes Gel bietet Platz für 10 Untersuchungsproben. Aus Gründen
der
Übersicht wurden nur die Bahnen 2, 4, 6 und 8 belegt. In die
Geltasche der
Bahn 2 wurden 18 µl Proteinstandard (Precision Protein
Standards, Firma
Bio-Rad, München, Deutschland, Art. 161-0372) pipettiert. Von
den
Untersuchungsproben wurden jeweils 18 µl in die entsprechenden
Geltaschen
4, 6 und 8 aufgetragen.
Es wurde für ca. 2,5 h bei 20 mA Gleichstrom elektrophorisiert.
Anhand des
mitlaufenden Proteinstandards war erkennbar, auf welcher Höhe
sich der zu
-
2. Material und Methoden 33
erwartende Molekülgrößenbereich von MMP-9 zwischen 75 und 100
kDa
befand.
Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die Gele vorsichtig von
den
Glasplatten abgelöst und 2 x 15 min unter Schwenken bei 20 °C
in
Inkubationspuffer 1 inkubiert. Der Inkubationspuffer 1 wurde bis
auf 2 ml
abgegossen und Inkubationspuffer 2 dazugegeben. Nach 15 min
Schwenken
bei Raumtemperatur wurden die Gele in Inkubationspuffer 2 bei 37
°C für 19 h
inkubiert.
Nach dem Ende der Inkubationszeit wurde der Puffer abgegossen
und die
Gele mit ddH2O 3 Mal gewaschen. Die Gele wurden ausreichend
mit
Färbelösung bedeckt und 1,5 h unter Schwenken gefärbt. Im
Anschluss wurde
die Färbelösung abgegossen und Entfärbelösung dazugegeben.
Die
nachfolgende Entfärbung wurde unter Schwenken und mehrmaligem
Erneuern
der Entfärbelösung solange durchgeführt, bis ein
zufriedenstellendes Bild der
Banden erkennbar war.
Bei den zymographischen Untersuchungen zur Enzymhemmung mit
EDTA
bzw. PMSF wurden lediglich die Inkubationspuffer für die
Untersuchungsproben verändert (siehe Tab. 3) und zusätzlich
eine
Positivkontrolle (rekombinante MMP-9 32 ng/ml) in normalem
Inkubationspuffer inkubiert. Alle übrigen Substanzen sowie der
Ablauf waren
identisch.
2.9.4 Auswertung
Die Gele wurden aus der Entfärbelösung genommen und nass auf
eine
Durchlichtplatte in einer Fotokammer gelegt. Mittels
Digitalkamera wurden die
Gele fotografiert und auf dem Computer gespeichert. Anhand
des
mitgelaufenen Proteinstandards konnte die Molekülgröße der
untersuchten
Proteine abgelesen werden. Anhand der Stärke der entfärbten
Banden ließen
sich ungefähre Aussagen über die Quantität machen.
-
2. Material und Methoden 34
2.10 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit der Software SPSS
(Version 11.5,
SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Dargestellt wurden die absoluten Ergebniswerte und daran
anschließend
jeweils aus den fünf Einzeluntersuchungen zusammengefasst der
Mittelwert
und das 95%-Konfidenzintervall.
Als Signifikanzniveau wurde α = 0,05 gewählt und bei p-Werten
kleiner als
0,05 von statistischer Signifikanz gesprochen.
Die Ausdrücke Mittel und Mittelwert werden analog verwendet und
bezeichnen
das arithmetische Mittel.
-
3. Ergebnisse 35
3. Ergebnisse
3.1 Verdünnungsreihen der Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9)
3.1.1 Isolierte MMP-9 – Activity-Assay
Abb. 8: Verdünnungsreihe isolierte MMP-9
Die im Folgenden verwendete Angabe der Enzymaktivität entspricht
der im
Activity-Assay gemessenen Absorption (siehe Kap. 2.8.3).
Die gemessenen Aktivitätswerte des Activity-Assay
MMP-9-Standards zeigten
nahezu keine Unterschiede gegenüber den vom Assay-Hersteller
angegebenen Werten. Die untersuchte isolierte MMP-9 ergab
verglichen mit
dem Standard weniger als 50% Enzymaktivität bei gleicher
Konzentration.
Bezüglich der drei unterschiedlichen Pufferlösungen waren die
Aktivitätswerte
der MMP-9 in Enzympuffer am höchsten. MMP-9 in reinem PBS-Puffer
zeigte
0
100
200
300
400
500
600
700
800
2 4 8 16 32 64 12 25
MMP-9 (ng/ml)
Enzy
mak
tivitä
t
Herstellerangaben Standardkurve MMP in PBS
MMP in PBS/BSA MMP in Enzympuffer
6 8
-
3. Ergebnisse 36
deutlich niedrigere Aktivitätswerte verglichen mit den beiden
anderen
verwendeten Pufferlösungen.
3.1.2 Rekombinante MMP-9 – Activity-Assay
Abb. 9: Verdünnungsreihe rekombinante MMP-9
Die Ergebnisse der rekombinanten MMP-9 unterschieden sich hier
nur
geringfügig von denen der isolierten MMP-9. Die Enzymaktivität
von
rekombinanter MMP-9 war jedoch bei gleicher Konzentration
insgesamt höher
als die von isolierter MMP-9. Bezüglich der drei
unterschiedlichen
Pufferlösungen zeigte rekombinante MMP-9 in Enzympuffer
ebenfalls die
höchsten Aktivitätswerte.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
2 4 8 16 32 64 12 25
MMP-9 (ng/ml)
Enzy
mak
tivitä
t
Herstellerangaben Standardkurve MMP in PBS
MMP in PBS/BSA MMP in Enzympuffer
8 6
-
3. Ergebnisse 37
3.2 MMP-9 nach hydrostatischem Hochdruck (HHD)
3.2.1 Herstellerangaben für MMP-9 Activity-Assay
Abb. 10: Herstellerangaben für MMP-9 Activity-Assay
3.2.2 Standardkurve für MMP-9 Activity-Assay
Abb. 11: Standardkurve für MMP-9 Activity-Assay
Bei jeder Messung von MMP-9 wurde eine Standardkurve
(Verdünnungsreihe
mit rekombinanter Standard-MMP-9 des Assay-Herstellers)
mitgemessen.
Beispielhaft ist eine Verdünnungsreihe dargestellt. Die
gemessenen
Aktivitätswerte entsprechen nahezu den vom Hersteller
angegebenen Werten.
0100200300400500600700
0 5 10 15 20 25 30 35MMP-9 (ng/ml)
Enzy
mak
tivitä
t
0100200300400500600700
0 5 10 15 20 25 30 35MMP-9 (ng/ml)
Enzy
mak
tivitä
t
-
3. Ergebnisse 38
3.2.3 Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay
1. Messung
Abb. 12: Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 1.
Messung
2. Messung
Abb. 13: Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 2.
Messung
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 39
3. Messung
Abb. 14: Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 3.
Messung
4. Messung
Abb. 15: Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 4.
Messung
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 40
5. Messung
Abb. 16: Isolierte MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 5.
Messung
Zusammenfassung „keine Aktivierung“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
110
100
90
80
70
60
50
Abb. 17: Isolierte MMP-9 nach HHD – „keine Aktivierung“
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 41
Die im Folgenden zusammengefasste Darstellung der Ergebnisse
erfolgt über
die prozentuale Veränderung der Enzymaktivität, ausgehend von
der nicht
HHD-behandelten Kontrolle (Wert entspricht 100%). Dargestellt
sind jeweils
der Mittelwert und das 95%-Konfidenzintervall.
Bei nicht artifiziell aktivierter isolierter pro-MMP-9 zeigte
sich gegenüber der
Kontrollgruppe eine geringfügige Verminderung der Enzymaktivität
bei
200 MPa im Mittel auf 81%, die statistisch signifikant war (p =
0,043). Die
ebenfalls geringfügige Verminderung der Aktivität im Mittel auf
80% bei
400 MPa war jedoch nicht statistisch signifikant (p =
0,077).
Zusammenfassung „Aktivierung nach HHD“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
130
120
110
100
90
Abb. 18: Isolierte MMP-9 nach HHD – „Aktivierung nach HHD“
Bei nach HHD-Behandlung artifiziell aktivierter isolierter MMP-9
zeigte sich
gegenüber der Kontrollgruppe eine im Mittel um 14% erhöhte
Enzymaktivität
nach 200 MPa (p = 0,011). Bei 400 MPa war die Aktivität im
Mittel um 20%
erhöht (p < 0,001). In beiden Fällen war die Erhöhung
statistisch signifikant.
-
3. Ergebnisse 42
Zusammenfassung „Aktivierung vor HHD“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
110
100
90
80
70
60
50
Abb. 19: Isolierte MMP-9 nach HHD – „Aktivierung vor HHD“
Bei vor HHD-Behandlung artifiziell aktivierter isolierter MMP-9
zeigte sich
gegenüber der Kontrollgruppe bei 200 MPa eine
Aktivitätsverminderung im
Mittel auf 76% (p = 0,002). Bei 400 MPa war die Aktivität im
Mittel auf 66%
vermindert (p < 0,001). In beiden Fällen war die Verminderung
statistisch
signifikant.
-
3. Ergebnisse 43
3.2.4 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay
1. Messung
Abb. 20: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 1.
Messung
2. Messung:
Abb. 21: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 2.
Messung
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 44
3. Messung
Abb. 22: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 3.
Messung
4. Messung
Abb. 23: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 4.
Messung
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 45
5. Messung
Abb. 24: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Activity-Assay, 5.
Messung
Zusammenfassung „keine Aktivierung“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
1000
800
600
400
200
0
Abb. 25: Rekombinante MMP-9 nach HHD – „keine Aktivierung“
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400Druck (MPa)
Enzy
mak
tivitä
t
keine Aktivierung Aktivierung nach HHD Aktivierung vor HHD
-
3. Ergebnisse 46
Die im Folgenden zusammengefasste Darstellung der Ergebnisse
erfolgt über
die prozentuale Veränderung der Enzymaktivität ausgehend von der
nicht
HHD-behandelten Kontrolle (Wert entspricht 100%). Dargestellt
sind jeweils
der Mittelwert und das 95%-Konfidenzintervall.
Bei nicht artifiziell aktivierter rekombinanter pro-MMP-9 zeigte
sich gegenüber
der Kontrollgruppe eine deutliche Erhöhung der Enzymaktivität
bei 200 MPa
(Mittelwert 506%, p = 0,03) und 400 MPa (Mittelwert 571%, p =
0,004). In
beiden Fällen war die Aktivitätserhöhung statistisch
signifikant.
Zusammenfassung „Aktivierung nach HHD“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
400
300
200
100
0
Abb. 26: Rekombinante MMP-9 nach HHD – „Aktivierung nach
HHD“
Bei nach HHD-Behandlung artifiziell aktivierter rekombinanter
MMP-9 zeigte
sich gegenüber der Kontrollgruppe eine Verdoppelung (Mittelwert
212%) der
Enzymaktivität bei 200 MPa (p < 0,001). Bei 400 MPa war die
Aktivität im
Mittel um 286% erhöht (p = 0,003). In beiden Fällen war die
Erhöhung
statistisch signifikant.
-
3. Ergebnisse 47
Zusammenfassung „Aktivierung vor HHD“
555N =
Druck (MPa)
4002000
Enzy
mak
tivitä
t (%
)
400
300
200
100
0
Abb. 27: Rekombinante MMP-9 nach HHD – „Aktivierung vor HHD“
Bei vor HHD-Behandlung artifiziell aktivierter rekombinanter
MMP-9 zeigte sich
gegenüber der Kontrollgruppe bei 200 MPa eine
Aktivitätssteigerung im Mittel
um 44% (p = 0,058). Bei 400 MPa war die Aktivität im Vergleich
zur
Kontrollgruppe doppelt so hoch (Mittelwert 202%, p < 0,064).
In beiden Fällen
waren die Veränderungen statistisch nicht signifikant.
-
3. Ergebnisse 48
3.2.5 Isolierte MMP-9 nach HHD – Zymographie
Abb. 28: Isolierte MMP-9 nach HHD – Zymographie
Bei der zymographischen Untersuchung von isolierter MMP-9 fanden
sich bei
der Kontrollgruppe wie auch nach HHD-Behandlung mit 200 MPa eine
starke
Bande im Bereich von pro-MMP-9 (92 kDa) sowie eine schwächere
Bande im
Bereich der aktiven MMP-9 (84 kDa) und eine sehr schwache Bande
bei
ca. 70 kDa. Nach HHD-Behandlung mit 400 MPa fanden sich
ebenfalls eine
starke Bande bei 92 kDa, die Bande im Bereich von 84 kDa war
jedoch nur
schwach erkennbar. Zusätzlich fand sich bei 400 MPa eine
schwache Bande
von 70 kDa.
3.2.6 Rekombinante MMP-9 nach HHD – Zymographie
Abb. 29: Rekombinante MMP-9 nach HHD – Zymographie
proMMP-9aktives MMP-9
0 200 400Druck (MPa)
150
kDa
100
75
50
150
kDa
100
75
50
proMMP-9aktives MMP-9
0 200 400Druck (MPa)
-
3. Ergebnisse 49
Bei der zymographischen Untersuchung von rekombinanter MMP-9
fanden
sich bei der Kontrollgruppe eine starke Bande im Bereich von
pro-MMP-9
(92 kDa) sowie eine schwächere Bande im Bereich von aktiver
MMP-9
(84 kDa). Nach HHD-Behandlung mit 200 MPa zeigte sich ebenfalls
eine
starke Bande bei 92 kDa sowie eine schwache Bande bei 84 kDa.
Zusätzlich
fand sich eine sehr schwache Bande bei ca. 70 kDa. Nach
HHD-Behandlung
mit 400 MPa fanden sich ebenfalls eine starke Bande bei 92 kDa
und zwei
schwache Banden im Bereich von 84 kDa und ca. 70 kDa.
3.3 Zymographischer Nachweis der MMP-9
3.3.1 Pro-MMP-9
(Gel 1)
Abb. 30: Pro-MMP-9 – Zymographie
Alle drei MMP-9 zeigten starke Banden im Bereich von pro-MMP-9
(92 kDa).
Bei isolierter MMP-9 und Standard-MMP-9 des Assay-Herstellers
fand sich
außerdem eine schwache Bande im Bereich von aktiver MMP-9 (84
kDa), die
bei rekombinanter MMP-9 nicht erkennbar war. Isolierte MMP-9
zeigte eine
schwache Bande im Bereich von 120 kDa.
proMMP-9aktives MMP-9
150
kDa
100
75
50
isoliert rekombinant Standard MMP
-
3. Ergebnisse 50
3.3.2 Aktivierte MMP-9
(Gel 2)
Abb. 31: Aktivierte MMP-9 – Zymographie
Es zeigten sich bei allen drei MMP-9 Banden im Bereich von
aktiver MMP-9
(84 kDa). Bei rekombinanter MMP-9 und Standard-MMP-9 des
Assay-
Herstellers fand sich eine weitere Bande im Bereich von
pro-MMP-9 (92 kDa),
die bei isolierter MMP-9 nicht eindeutig abgrenzbar war.
Standard MMP-9
zeigte eine dritte Bande im Bereich von 70 kDa und isolierte
MMP-9 eine
schwache Bande im Bereich von 120 kDa.
3.3.3 Pro-MMP-9 und aktivierte MMP-9 inkubiert in
EDTA-Puffer
(Gel 3)
Abb. 32: MMP-9 inkubiert in EDTA-Puffer – Zymographie
proMMP-9aktives MMP-9
150
kDa
100
75
50
isoliert rekombinant Standard MMP
proMMP-9aktives MMP-9
150
kDa
100
75
50
isoliert rekombinant Standard MMP
-
3. Ergebnisse 51
Keines der untersuchten MMP-9 ließ sich nach Inkubation in
EDTA-Puffer
zymographisch nachweisen. Die Positivkontrolle zeigte eine
deutlich Bande im
Bereich von pro-MMP-9 (92 kDa) und aktivem MMP-9 (84 kDa).
3.3.4 Pro-MMP-9 und aktivierte MMP-9 inkubiert in
PMSF-Puffer
(Gel 4)
Abb. 33: MMP-9 inkubiert in PMSF-Puffer - Zymographie
Nach Inkubation aller untersuchter MMP-9 in PMSF-Puffer zeigte
sich ein
ähnliches Bild wie in Gel 1. Es fanden sich bei allen MMP-9
deutliche Banden
im Bereich von pro-MMP-9 (92 kDa). Bei isolierter MMP-9 und
Standard
MMP-9 des Assay-Herstellers zeigte sich auch im Bereich von
aktivem MMP-9
(84 kDa) eine Bande.
150
kDa
100
75
50
proMMP-9aktives MMP-9
isoliert rekombinant Standard MMP
-
4. Diskussion 52
4. Diskussion
4.1 Rekonstruktion von Knochendefekten
Knochentumoren sind eine Hauptursache für große knöcherne
Defekte und
stellen ein zentrales Problem in der orthopädischen Versorgung
dar. Der bei
bösartigen Tumoren erforderliche Sicherheitsabstand bedeutet
zusätzlich die
Resektion von großen Teilen mechanisch erhaltenen und biologisch
gesunden
Gewebes.
Zur Rekonstruktion von Knochendefekten sind derzeit im
wesentlichen fünf
unterschiedliche Verfahren etabliert: Mechanische Endoprothesen,
die
Distraktionsosteosynthese sowie artifizieller, allogener oder
autogener
Knochenersatz.
Die Versorgung mit großen mechanischen Endoprothesen ist
operationstechnisch sehr anspruchsvoll und hat auch bei bester
Versorgung
meist eine auf maximal 20 Jahre begrenzte Haltbarkeit bzw.
Standzeit, was
besonders bei jungen Patienten zahlreiche Revisionen erfordert
[Horowitz et
al.: 1993, 280-286; Mittermayer et al.: 2001, 167-177]. Nicht
selten kommt es
zu Komplikationen wie Infektionen, aseptischen
Prothesenlockerungen und
periprothetischen Frakturen [Natarajan et al.: 2003, 334-337].
Bei Kindern ist
aufgrund des wachsenden Knochens eine endoprothetische
Versorgung noch
komplizierter als bei ausgewachsenen Personen.
Die segmentale Unterbrechung der knöchernen Kontinuität kann
auch durch
eine Distraktionsosteosynthese therapiert werden. Das Verfahren
ist sehr
langwierig und mit einer hohen Komplikationsrate verbunden
[Faber et al.:
1991, 327-332; Hosny et al.: 2003, 303-306].
Die Versorgung mit synthetisch hergestellten artifiziellen
Knochenersatzmitteln
(teilweise xenogenen Ursprungs) wie z.B.
Kalziumphosphatkeramiken
überzeugt durch gute osteokonduktive Eigenschaften und zeigt
zufriedenstellende Ergebnisse bei kleinen Defekten [Mittelmeier
et al.: 1998,
126-135]. Bei großen knöchernen Substanzverlusten ist die
Stabilität jedoch
nicht ausreichend [Mittelmeier et al.: 1996, 1087-1092].
-
4. Diskussion 53
Die Versorgung mit Fremdtransplantaten (allogener Knochenersatz)
erzielt
teilweise gute biologische Ergebnisse. Es besteht aber das
Risiko von
immunologischen Reaktionen (Transplantatabstoßung) [Hallfeldt et
al.: 1992,
313-318] und Erregerübertragung (z.B. Bakterien, HIV oder
Hepatits C)
[Simonds et al.: 1992, 726-732; Sutherland et al.: 1997,
215-222]. Sogar die
Übertragung von Tumorzellen wurde beschrieben [Palmer et al.:
1999, 333-
335]. Durch verschiedene chemische, thermische oder
strahlentechnische
Sterilisationsverfahren wird das Infektionsrisiko zwar in
unterschiedlichem
Maße vermindert, kann aber nie ganz ausgeschlossen werden. Ein
weiteres
Problem der bisher gängigen Sterilisationsverfahren ist die
negative Wirkung
auf die biologischen und biomechanischen Eigenschaften des
Knochens
[Sorger et al.: 2001, 66-74] auf die im Folgenden näher
eingegangen wird.
Zahlreiche chemische Sterilisationsverfahren wie z.B. die
Behandlung mit
Formaldehyd, Alkohol oder Peressigsäure wurden erprobt. Probleme
der
Substanzen sind die unzureichende Eindringtiefe in den Knochen,
die
unvollständige mikrobizide Wirkung, potentiell kanzerogene,
mutagene oder
toxische Nebenwirkungen sowie eine nur begrenzt mögliche
Entfernung der
Desinfektionslösungen vor der Implantation [Knaepler et al.:
1994, 1052-1057].
Bei thermischen Devitalisierungstechniken lassen sich das
Autoklavieren
(134 °C unter Dampfdruck) und Verfahren mit niedrigeren
Temperaturen (z.B.
Lobator-System, Firma Telos, Deutschland [Hofmann et al.: 1996,
498-508])
unterscheiden. Die entkeimende Wirkung beruht auf der
Koagulation von
Proteinen und der Zerstörung von Nukleinsäuren und zeigt meist
gute
Ergebnisse [Knaepler et al.: 1992, 477-484], wobei einige Keime
wie z.B.
Hepatits-B-Viren gegenüber Temperaturen unter 100 °C resistent
sind
[Knaepler et al.: 1994, 1052-1057]. Während der Knochen durch
Autoklavieren
bis zu 85% seiner Stabilität einbüßt sind es bei langsamem
Erhitzen auf nur
80 °C immer noch 20% Stabilitätsverlust [Knaepler et al.: 1994,
44-49;
Viceconti et al.: 1996, 63-68]. Infolge thermischer Behandlung
verschlechtert
sich die osteoinduktive Potenz des Knochens, weshalb das
Einwachsverhalten
allogener thermisch behandelter Transplantate negativ bewertet
wird [Zoricic
et al.: 2002, 121-128].
Sterilisationsverfahren mittels ionisierender Strahlung (Beta-
oder
Gammastrahlung) wurden vielfach untersucht und beruhen auf der
Zerstörung
-
4. Diskussion 54
von Nukleinsäuren. Um eine sichere Keim- bzw.
Tumorzellinaktivierung zu
gewährleisten sind sehr hohe Strahlendosen notwendig [Knaepler
et al.: 1994,
72-73]. Mit ionisierender Strahlung behandelte Knochensegmente
verfügten im
Vergleich zu unbehandeltem Knochen über eine deutlich
schlechtere
biomechanische Stabilität und biologische Potenz [Urist et al.:
1974, 586-593;
Sugimoto et al.: 1991, 492-497; Knaepler et al.: 1991, 194-199].
Weiterhin wird
die Bildung toxischer Metabolite und freier Radikale mit
mutagenen
Eigenschaften diskutiert [Knaepler et al.: 1994, 1052-1057].
Autogene Knochentransplantate, also körpereigenes Gewebe, haben
die
besten biologischen Eigenschaften und erzeugen keine
immunologischen
Reaktionen wie Transplantatabstoßung oder Allergien. In der
Regel wird dabei
zur Defektrekonstruktion Knochengewebe an einer anderen Stelle
des Körpers
entnommen. Davon zu unterscheiden ist die Verwendung des
betroffenen
Knochensegmentes selbst mit einer orthotopen Reimplantation.
Die Entnahme von Knochen an einer anderen Stelle des Körpers,
z.B.
Beckenkammspongiosa oder Teile der Fibula, erfordert einen
Zweiteingriff und
ist aufgrund der begrenzten Substanzmenge nur bis zu einer
bestimmten
Defektgröße möglich [Rueger: 1998, 72-79]. Außerdem ist ein
Zweiteingriff bei
einigen Patienten aufgrund des instabilen Allgemeinzustandes gar
nicht
möglich. Sämtliche zusätzlichen operativen Eingriffe sind mit
entsprechenden
Risiken und Folgen im Sinne einer Entnahmemorbidität verbunden.
Zu nennen
sind beispielsweise Blutungen, Thromboembolien,
Nervenverletzungen,
Schmerzen oder Infektionen [Summers et al.: 1989, 677-680;
Banwart et al.:
1995, 1055-1060]. Desweiteren sind die Operationsdauer
verlängert und die
Kosten erhöht.
Eine autologe Knochentransplantation bei Patienten mit
Knochentumoren, also
die Resektion des tumorbefallenen Knochensegmentes mit
anschließender
extrakorporaler Devitalisierung der Tumorzellen und
orthotoper
Reimplantation, bietet den Vorteil der fehlenden
zusätzlichen
Entnahmemorbidität, der meistens sehr guten anatomischen
Passgenauigkeit
und des Verzichts auf Fremdmaterial. Entscheidend für die
Einheilung des
Transplantats sind, neben der vollständigen Abtötung maligner
Tumorzellen,
die biomechanischen und biologischen Veränderungen infolge des
gewählten
Behandlungsverfahrens.
-
4. Diskussion 55
4.2 Extrakorporale Tumordevitalisierung
Bisher wurden klinisch oder experimentell zur
extrakorporalen
Tumordevitalisierung von Knochen thermische und radioaktive
Verfahren
untersucht. Beide Techniken bieten den Vorteil der einzeitigen
Reimplantation
des autologen Knochensegmentes, wirken sich aber negativ auf
die
biologischen und biomechanischen Eigenschaften des Knochens
aus.
Die qualitative osteointegrative Wirkung unterschiedlicher
Verfahren zur
Abtötung von Knochentumorzellen kann in Bezug auf
Osteoinduktion,
Osteokonduktion und Osteogenese charakterisiert werden.
Osteoinduktion
bedeutet die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen
zu
Vorläuferzellen des Knochen- bzw. Knorpelstoffwechsels und damit
Anregung
der Osteogenese [Reddi et al.: 1987, 207-212; Albrektsson et
al.: 2001, 96-
101]. Osteokonduktion beschreibt die Eigenschaft eines
Knochenersatzes, als
Leitschiene bzw. Grundgerüst für die vom umliegenden Gewebe
einwachsenden Knochenzellen zu fungieren [Parikh: 2002,
142-148].
Osteogenese bezeichnet die Neusynthese von Knochenmatrix
durch
Knochenzellen.
Die in Kap. 4.1 beschriebene Technik des Autoklavierens wurde
auch zur
Behandlung eines resezierten tumorbefallenen
Knochensegmentes
angewendet, konnte sich aber aufgrund zahleicher negativer
Veränderungen
der Knocheneigenschaften nicht durchsetzen [Sanjay et al.: 1997,
291-297;
Bohm et al.: 1998, 57-65]. Wie bereits dargestellt
verschlechtern sich die
biomechanischen Eigenschaften des Knochens durch Autoklavieren
(siehe
Seite 53). Auch die osteoinduktiven Eigenschaften von
autoklaviertem
Knochen sind ungenügend [Asada et al.: 1997, 392-395].
Häufig
beschriebende Komplikationen nach Reimplantation von
autoklavierten
Knochensegmenten sind Frakturen, Pseudarthrosen, Infektionen
und
Lockerungen des Osteosynthesematerials [Asada et al.: 1997,
392-395;
Sanjay et al.: 1997, 291-297].
Ionisierende Strahlung wird seit einigen Jahren vereinzelt zur
Behandlung von
tumorbefallenen Knochen eingesetzt [Bohm et al.: 2003, 355-365].
Bei
klinischen und experimentellen Untersuchungen zeigte sich eine
deutliche
Verschlechterung der biologischen und biomechanischen
Eigenschaften wie
z.B. eine Verminderung der mechanischen Stabilität, eine
verzögerte
-
4. Diskussion 56
Frakurheilung bzw. Transplantateinheilung und die fehlende
aktive
Knochenneubildung aufgrund mangelnder osteoinduktiver
Eigenschaften
infolge der Zerstörung der Bone Morphogenetic Proteins [Urist et
al.: 1974,
586-593; Sugimoto et al.: 1991, 492-497; Knaepler et al.: 1991,
194-199;
Voggenreiter et al.: 1996, 583-588; Araki et al.: 1999, 196-206;
Sys et al.:
2002, 174-178].
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die langfristig besten
Ergebnisse bei
der Versorgung großer knöcherner Defekte mit autologen
Knochentransplantaten erzielt werden könnten, indem bei
vorliegendem
Tumorbefall eine vollständige Inaktivierung von Tumorzellen
ohne
Verschlechterung der biologischen und biomechanischen
Eigenschaften
erreicht wird. Der ideale Knochenersatz lässt sich definieren
als steril,
tumorfrei, nicht toxisch oder immunologisch wirksam, mit hoher
biologischer
Potenz (osteogen und osteoinduktiv) bzw. körpereigen, mit guter
Festigkeit
bzw. Stabilität, einfach zu verarbeiten, passgenau,
kostengünstig und in
ausreichenden Mengen verfügbar. Bisherige Verfahrensweisen
erfüllen wie im
Vorigen dargestellt jeweils nur einen Teil der genannten
Kriterien.
Hydrostatischer Hochdruck könnte aufgrund vielversprechender
Ergebnisse
experimenteller Untersuchungen ein alternatives Verfahren
zur
Tumordevitalisierung darstellen.
4.3 Hochdrucktechnologie
Bereits vor 100 Jahren wurde erstmals der Versuch einer
Lebensmittelkonservierung mit hydrostatischem Hochdruck
(HHD)
beschrieben [Hite: 1899, 15-17]. Seit 25 Jahren wird die
Forschung besonders
in den USA und Japan weiter intensiviert und eine industrielle
Nutzung der
Hochdrucktechnologie (HHD bis 1000 MPa) zur Inaktivierung
von
Mikroorganismen in Lebensmitteln ermöglicht. Mittlerweile ist
eine Vielzahl
HHD-behandelter Lebensmittel, wie Fruchtsäfte, Marmeladen
und
Fleischprodukte auf dem Markt erhältlich [Watanabe et al.: 1991,
2175-2176;
Selman: 1992, 205-209; Cheftel: 1995, 75-90]. Gegenüber der
herkömmlichen
thermischen Behandlung zur Haltbarmachung von Lebensmitteln
(Pasteurisierung) sowie chemischen oder radioaktiven
Sterilisierungsverfahren
bietet die HHD-Technologie, die auch kalte Sterilisierung bzw.
Pascalisation
-
4. Diskussion 57
genannt wird, den Vorteil, dass Farb- und Aromastoffe sowie
Vitamine fast gar
nicht verändert werden. Somit stellt die Hochdrucktechnologie
ein wesentlich
schonenderes Verfahren zur Lebensmittelkonservierung und
Inaktivierung von
Mikroorganismen dar [Mertens: 1993, 100-104; San Martin et al.:
2002, 627-
645; Butz et al.: 2003, 233-236]. Eine druckinduzierte
Enzyminaktivierung
bewirkt außerdem eine verbesserte Lagerstabilität von
Aromastoffen [Lambert
et al.: 1999, 7-16; Knorr et al.: 2002, 311-318].
Vor fünf Jahren begannen an der Technischen Universität München
(Lehrstuhl
für Energie- und Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie und
Klinik für
Orthopädie) erstmals Untersuchungen zur möglichen Nutzung
der
HHD-Technologie im medizinischen und pharmazeutischen
Bereich.
Für die erfolgreiche Etablierung der Hochdrucktechnologie in der
Medizin ist
es zwingend notwendig, neben biomechanischen Veränderungen
auch
biologische und biochemische Auswirkungen von hydrostatischem
Hochdruck
zu kennen.
Vorangegangene Untersuchungen haben gezeigt, dass die
biomechanischen
Eigenschaften von Knochen und Sehnen nach HHD-Therapie
weitgehend
unverändert sind. Sehnen zeigten bei 200 und 400 MPa keine
signifikanten
Veränderungen [Diehl et al.: 2004, eingereicht]. Auch spongiöser
Knochen
blieb in seinen biomechanischen Eigenschaften unverändert,
ebenso kortikaler
Knochen bei 300 MPa. Erst bei 600 MPa zeigte kortikaler Knochen
ein um
lediglich 15% vermindertes E-Modul [Steinhauser et al.: 2004,
eingereicht].
Untersuchungen der HHD-Behandlung von Zellen haben deutliche
destruktive
Auswirkungen des Drucks gezeigt, wobei eukaryontische Zellen
empfindlicher
sind als prokaryontische [Hoover et al.: 1989, 99-107].
Sämtliche untersuchte
eukaryontische Zelllinien bzw. Tumorzelllinien ließen sich bei
Druckstufen
zwischen 150 und maximal 350 MPa zerstören bzw. inaktivieren
[Yamaguchi
et al.: 1997, 257-261; Diehl et al.: 2003, 1851-1855; Diehl et
al.: 2004, 369-
373]. Dabei scheinen Tumorzellen resistenter zu sein als die
zugehörigen nicht
entarteten Zellen [Dibb et al.: 1981, 169-176; Diehl et al.:
2003, 1851-1855].
Mikroorganismen zeigen bzgl. ihrer Druckresistenz eine große
Variationsbreite. Während die große Mehrheit schon bei niedrigen
Druckstufen
(30-300 MPa) zerstört bzw. inaktiviert wird, sind Prokaryonten
und Sporen
-
4. Diskussion 58
beschrieben, die Drücken bis 800 MPa standhalten [Hauben et al.:
1997, 945-
950; Seki et al.: 1998, 853-854]. HHD bewirkt eine Inaktivierung
bzw.
Zerstörung von Mikroorganismen durch Membranmodifikationen,
Inaktivierung
von Schlüsselenzymen und Inhibition der Proteinbiosynthese [Abe
et al.: 1999,
447-453]. Viren reagieren größtenteils schon auf niedrige
Druckstufen von
100-300 MPa sehr sensibel [Silva et al.: 1996, 166-175]. So
konnten
zahlreiche Viren wie z.B. Herpes Virus oder HIV durch Druck
inaktiviert
werden, was große Bedeutung für die Knochensterilisierung
sowie
Impfstoffherstellung haben könnte [Nakagami et al.: 1992,
255-261; Jurkiewicz
et al.: 1995, 6935-6937; Nakagami et al.: 1996, 475-476;
Meyer-Pittroff: 2003,
295-305]. Bei Bakterien kann die Drucksensibilität über
Veränderung der
Behandlungsparameter, wie z.B. Temperatursenkung oder
pH-Verschiebung,
beeinflusst werden [Bartlett: 1992, 479-496]. Bei mehrmalig
wiederholtem
Druckaufbau konnten Bakterien abgetötet werden, die gegenüber
einer
einmaligen Druckbehandlung mit der gleichen Druckstufe resistent
sind
[Vachon et al.: 2002, 345-352; Gollwitzer et al.: 2004,
eingereicht].
Nachdem bisher keine Verschlechterung der biomechanischen
Eigenschaften
durch HHD-Behandlung festgestellt werden konnte, wurden
weiterführend die
biologischen Auswirkungen von HHD untersucht.
Aufgrund der wichtigen Bedeutung für den physiologischen und
pathologischen Knochenstoffwechsel wurde in der vorliegenden
Arbeit das
Verhalten der Matrixmetalloproteinase-9 nach hydrostatischer
Hochdruckbehandlung untersucht.
4.4 Matrixmetalloproteinasen
4.4.1 Matrixmetalloproteinasen allgemein
Matrixmetalloproteinasen (MMP) sind eine Gruppe proteolytischer
Enzyme mit
großer Variationsbreite, die alle ein Zinkion als aktives
Zentrum besitzen. Vor
40 Jahren wurden MMP erstmals beschrieben [Gross et al.: 1962,
1014-1022],
mittlerweile sind 25 verschiedene MMP bekannt (siehe Tab. 4) und
sehr gut in
ihrer biologischen Funktion und biochemischen Struktur
untersucht. MMP sind
an fast allen proteolytischen Abbauvorgängen der
Extrazellulärmatrix beteiligt
[Parsons et al.: 1997, 160-166].
-
4. Diskussion 59
Bis vor einigen Jahren wurden die 25 bekannten MMP nach ihrer
Spezifität
bzgl. Extrazellulärmatrixbestandteilen in Kollagenasen,
Gelatinasen,
Stromolysine und Matrilysine eingeteilt [McCawley et al.: 2001,
534-540].
Tab. 4: Familie der Matrixmetalloproteinasen *zur Einteilung der
Strukturklassen siehe Abb. 34, **MMP-4, MMP-5 und MMP-6 wurden
anfangs als neue MMP beschrieben und haben sich später als
identisch mit MMP-2 bzw.
MMP-3 herausgestellt, +von MMP-18 und MMP-22 sind bisher keine
humanen Homologe
bekannt
Heute ist eine Einteilung in acht Gruppen mit unterschiedlicher
biochemischer
Struktur üblich. Fünf Gruppen beinhalten frei sezernierte MMP,
während es
sich bei den übrigen drei Gruppen um membrangebundene MMP
handelt
(siehe Abb. 34) [Sternlicht et al.: 2001, 463-516].
-
4. Diskussion 60
Abb. 34: Proteinstruktur der Matrixmetalloproteinasen
[Sternlicht et al.: 2001,
463-516]
MMP bestehen alle aus der gleichen Grundstruktur. Eine
Prä-Domäne dient
als Signalfrequenz und ist verbunden mit der Pro-Domäne. Die
Pro-Domäne
besitzt eine freie SH-Gruppe als Liganden für das Zinkion des
katalytischen
Zentrums. Weitere Domänen, wie Hemopexin-, Vitronektin-,
Fibronektin-,
Transmembran-, Glycophoshatidyl-Inositol- oder
Cystein-Prolin-Domäne sind
charakteristisch bei einigen MMP-Untergruppen vorhanden
[Woessner et al.:
2000, 50-63; Sternlicht et al.: 2001, 463-516]. MMP werden als
inaktive
Zymogene (pro-MMP) synthetisiert. Durch Interaktion der
Pro-Peptiddomäne
mit dem Zinkion im katalytischen Zentrum wird die Inaktivität
aufrechterhalten,
weshalb eine Aktivierung der MMP die Abspaltung der
Pro-Peptiddomäne
erfordert [Sternlicht et al.: 2001, 463-516].
MMP werden physiologisch bei zahlreichen mit Abbau von
Extrazellulärmatrix
verbundenen Stoffwechselvorgängen wie Embryogenese bzw.
Organentwicklung [Brenner et al.: 1989, 848-859],
Schwangerschaft [Weeks et
-
4. Diskussion 61
al.: 1976, 205-214], Knochenaufbau und -abbau [Delaisse et al.:
1988, 264-
276] sowie Wundheilung [Armstrong et al.: 2002, 12-18]
exprimiert.
Eine Überexpression bzw. Aktivitätssteigerung findet sich bei
zahlreichen
pathologischen Prozessen wie Arthritiden [Masuhara et al.: 2000,
92-96] bzw.
rheumatoider Arthritis [Itoh et al.: 2002, 2643-2647],
Peridontitis [Birkedal-
Hansen: 1993, 474-484], neuroinflammatorische Erkrankungen wie
Multiple
Sklerose oder Guillain-Barré-Syndrom [Rosenberg: 2002,
586-595],
Keratokonjunktivitis [Abu El-Asrar et al.: 2001, 1505-1511]
sowie
Intimahyperplasie, Artherosklerose und Aneurysmabildung [Luttun
et al.: 2001,
124-132]. Besonders bedeutsam – auch für die vorliegende Arbeit
– ist die
Beteiligung von MMP an Tumorerkrankungen [Stetler-Stevenson et
al.: 1993,
1434-1441; Duffy et al.: 1998, 1343-1348]. MMP ermöglichen zum
einen
direkt, über den Abbau von Extrazellulärmatrix,
Tumorinvasion,
Tumorneoangiogenese und Metastasierung [Deryugina et al.: 1997,
3201-
3210; John et al.: 2001, 14-23], wirken aber zum anderen auch
indirekt bei
Tumorwachstum (z.B. durch Spaltung von IGF-BP), Tumorinvasion
(z.B. durch
Aktivierung von TGF-beta) und Tumorneoangiogenese (durch
Erhöhung des
proangiogenetischen Faktors VEGF) mit [Martin et al.: 1999,
881-892; Bergers
et al.: 2000, 737-744; Yu et al.: 2000, 163-176].
Die Auflösung der