In vitro experiments in radiobiology and examples of ...

In vitro experiments in radiobiology and examples of

systems radiation biology approaches

Gabriele Babini et al. Dipartimento di Fisica, Università di Pavia

Email: [email protected]

Website: http://radbiophys.unipv.eu/

G. Babini - Congresso del Dipartimento di Fisica – UniPv - 13/14 Settembre 2018

mailto:[email protected]

Il nostro gruppo

PostDocs

Prof. Ordinario Andrea Ottolenghi

RTDa Giorgio Baiocco

PhD student Sofia Barbieri

Contratto di collaborazione per H2020-Concert Vere Smyth

Laureandi: • Leonardo Lonati (Fisica) • Giuseppina Borsci (Biotecnologia)


Jacopo Morini

Gabriele Babini

Il focus del nostro gruppo Particolare attenzione alla deposizione di energia al DNA ma non solo: ciclo cellulare, segnalazione proteica e funzioni cellulari vengono fortemente perturbate dalle diverse dosi di radiazioni e in maniera differente a seconda del tipo di radiazione incidente!


Le attività del gruppo RadBioPhys

RadBioPhys RadBioPhys

Esperimenti in vitro (irraggiamenti e

analisi)

Citofluorimetria (facility

interdipartimentale)

Bioinformatica e Systems Biology Space research

Simulazione di interazioni radiazioni

materia (e.g. DNA)

Modellizzazione matematica di

fenomeni biologici


Progetti e finanziamenti per attività di ricerca

• Europei (EURATOM, Agenzia Spaziale Europea)

• Nazionali:

– INFN: Meridian, Radiostem, etc,

– Associazione Italiana Sindrome di Swachman,

– Agenzia Spaziale Italiana


RadBioPhys Lab Lab “Sterile” per colture cellulari

Lab per effettuare analisi di campioni

biologici

J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223

PBMC CYTOKINES

Caco-2 monolayer

X-RAYS

Le cellule Caco-2 sono cellule epiteliali del carcinoma del colon-retto. In vitro creano una barriera impermeabile agli ioni, come nell’intestino.

I PBMC sono invece i globuli bianchi presenti nel sangue

Un esempio: Esperimento INFN-Meridian

Analisi effettuate

J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223 J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223

Studio dell’espressione delle giunzioni serrate

Studio dei livelli di rilascio di proteine di segnalazione

Resistenza Elettrica Trans-Epiteliale

A 48h

A 48h

Ogni 3-4 ore

Vitalità cellulare

A 24h e 48h

J. Morini, G. Babini et al, Frontiers in Immunology, 8:223. doi: 10.3389/fimmu.2017.00223

PBMC CYTOKINES

Caco-2 monolayer

X-RAYS

Una seconda pubblicazione legata all’esperimento INFN-MERIDIAN è

focalizzata sul protocollo sperimentale:

https://www.jove.com/video/56908/a-co-culture-method-to-investigate-crosstalk-between-x-ray-irradiated


Citofluorimetria @RadBioPhys Lab

A partire da Gennaio 2017 è in funzione nel nostro laboratorio un citofluorimetro Attune NxT (Thermo Fisher Scientific)

Caratteristiche tecniche del nostro Attune NxT:

• Blue laser (488nm, 50mW) con FSC, SSC e 4 canali (530/30nm, 574/26nm, 695/40nm, 780/60nm);

• Violet laser (405nm, 50mW) con 4 canali (440/50nm, 512/25nm, 603/48nm, 710/50nm) -> Upgrade a fine 2017 con il contributo economico del Dipartimento di Medicina Molecolare;

• Rate campionamento: 12.5 – 1000µl/min; Acquisizione dati fino a 35000 eventi/secondo;

• Acquisizione e analisi tramite Attune NxT software.

• RadBioPhys Lab effettua regolarmente analisi quali: contenuto di DNA, morte e proliferazione cellulare, e immunofenotipizzazione (analisi da 2 a 8 colori sullo stesso campione).


Flow Cytometer is made up of 3 subsystem: • Fluidics – To introduce and focus the cells for interrogation

•Optics – To generate and collect the light signals

•Electronics – To convert the optical signals to proportional electronic signals for computer analysis

from: Attune Nxt 2-Day Basic Training, Darmstadt, 2017


Di cosa è composto un citofluorimetro?

Principle of Flow Cytometry


Principi della citofluorimetria


Principle of Flow Cytometry

• Cells in a single profile pass through the flow cell

→ Cells Focusing • Laser hits individual cell

passing through the narrow tube called flow cell

→ Interrogation Point • Deflected light hits a

series of detectors (PMT) • The signals from

detectors are collected by a computer


Principi della citofluorimetria


What happens to light when it hits a cell?

Laser Light Scatter • When laser light interacts with a cell, light is scattered in all direction • The light scatter depends on size and internal complexity of the cell

• Forward Scatter (FSC) is proportional to cell surface area or size. • Side Scatter (SSC) is proportional to cell granularity/internal complexity of the cell.


Cosa succede alla luce quando colpisce la cellula?


Immunofenotipizzazione attraverso 10-parametri per l’identificazione di multipli subsets di cellule T e mieloidi

from: www.thermofisher.com, application note

Un esempio di applicazione: Immunofenotipo


Whole Blood

CD45+

CD3+

(all T cells)

CD4+

(only T helper)

CD8+

(only T killer)

CD3-

(no T cells)

CD19+

(only B cells)

CD56+

(only NK cells)

Come individuare sottopopolazioni cellulari?


Interfaccia software


Linfociti CD4+ Vs CD8+


Collaborazioni attive (UNIPV) per l’uso dell’Attune NxT:

• Prof. L. Stivala, Dr. M. Savio et al (Dip. Medicina Molecolare)

• Dr. G. Guidetti, Dr. I. Canobbio et al (Dip. Biologia e Biotecnologie)

• Prof. A. Forlino, Dr. R. Besio et al (Dip. Medicina Molecolare)

• Prof. L. Visai, Dr. N. Bloise et al (Dip. Medicina Molecolare)


Bioinformatica e

Systems (Radiation) Biology


Silverman et al, Discov Med 14 (75): 143-52 (2012)

Today

Systems Biology’s iterative cycle


Time-series “omics” integration

Avendo a disposizione informazioni in merito a geni/mRNAs/proteine a differenti punti temporali permette la stima delle dinamiche di ciascun elemento e, di conseguenza, l’identificazione di quali elementi sono maggiormente perturbati a seguito dello stress (e.g. radiazione ionizzante) in esame.

t1 t2 t3


Integrazione multi-scala di “omiche”

http://www.snubi.org/cancer.html




Alyass et al. BMC Medical Genomics, 8:33, (2015)

Studiare la variazione genetica della sindrome, per

poter correlare variazione genetica con i molteplici

aspetti del fenotipo SDS.

SCOPO DEL PROGETTO

Collaborazione tra RadBioPhys e Dipartimento di Medicina Molecolare (Prof. Cesare Danesino). J. Morini è stato titolare di 2 grant di ricerca annuali (finanziati dalla AISS) ed ha ricevuto un finanziamento ulteriore per l’anno 2018-2019.


n. case ID case SBDS mutations

1 UPN 20 258+2T>C/ 183_184TA>CT

2 UPN 6 258+2T>C/ 101A>T

3 UPN 68 258+2T>C/ 183_184TA>CT

4 UPN 57 258+2T>C/ G63C

5 UPN 58 258+2T>C/ 183_184TA>CT

6 UPN 15 258+2T>C/ 183_184TA>CT

7 UPN 65 258+2T>C/ 258+2T>C

8 UPN 64 258+2T>C/ 624+1G>C

Variant Call Format (VCF format)

Screening dell’esoma dei pazienti


Dal totale delle varianti geniche di ogni paziente SDS, è stata ottenuta la lista delle sole varianti genetiche caratterizzanti un set di geni di un pathway (cell cycle e pancreatic secretion) in tutti gli 8 pazienti SDS


Network tra i geni che presentano varianti geniche negli

8 pazienti SDS


Ce

ll cy

cle

pat

hw

ay

Algoritmi di clusterizzazione per facilitare

l’identificazione di somiglianze/differenze tra pazienti


Alcune pubblicazioni in collaborazione con C. Danesino et al. sullo studio di malattie rare

(solo nel 2018):

Oltre a:


Analisi di “omiche” in collaborazione con ENEA (Roma – Casaccia, M. Mancuso et al.)


B .Tanno, S Leonardi, G Babini, et al., Scientific Reports 2017, 7 (1), 14238 B. Tanno, G. Babini et al, Oncotarget 2016, 18;7(42):68253-68269. I. De Stefano, …, G. Babini, et al, Radiation research 2016, 186 (3), 315-321 G. Babini et al, submitted to Rad Prot Dosimetry (under second revision).

Obiettivi: Identificare quali sono le funzioni cellulari maggiormente perturbate a seguito dell’esposizione a basse dosi e/o nel confronto tessuto sano Vs tumorale a partire dall’analisi di interi set molecolari (mRNA, proteine, microRNA, etc).

Algoritmi di Machine Learning: dati grezzi -> classification trees -> random forests

Collaborazione con il Policlinico IRCCS Gemelli (Roma) – Prof. G. Scambia et al.

Obiettivi: Individuare biomarker diagnostici per alcuni tumori della donna e biomarker prognostici legati all’efficacia della terapia adottata.

Altri due lavori in preparazione su: - Tumore all’ovaio - Malattia di Paget vulvare


Acknowledgements

UniPv

Sofia Barbieri

Jacopo Morini

Andrea Ottolenghi

Gabriele Babini

Giorgio Baiocco

Vere Smyth

Giuseppina Borsci

Leonardo Lonati

ENEA (Rome, Italy)

M. Mancuso

S. Pazzaglia

A. Saran et al.

Policlinico Gemelli IRCCS (Rome, Italy) G. Scambia D. Gallo et al.

IRCCS S. Maugeri (Pavia, Italy) G. B. Ivaldi M. Liotta P. Tabarelli de Fatis C. Gaetano

Website: http://radbiophys.unipv.eu/

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