In the name of God

دکتر فرشته شاهچراغیدانشیار-عضو هیأت علمی انستیتو

پاستور ایرانرییس بخش میکروب شناسی

آزمایشگاه کشوری سیاه سرفه

What is Pertussis (Whooping cough)

• Highly contagious respiratory infection caused by Bordetella pertussis

• Outbreaks first described in 16th century• Pertussis is a world wide disease• Bordetella pertussis is an exclusively human pathogen• Dramatic for neonates and infants but can be very

severe for children and adults.

Pertussis remains one of the top 10 causes of death in children under 1

years old worldwide

10 million cases worldwide400,000 deaths worldwide

90% in developing countries and mostly

in infants

Case fatality rates Developing countries 1 - 2% (important

problem) Developed countries 0.04% (re-emerging

problem

france, USA, Sweden, Japan, England, Netherland, Canada

Pertussis—as a re-emerging infection

Pertussis incidence in US

Duration of protection and waning immunity following infection and vaccination

Incomplete protection from vaccinationInfection source for infantsInfection source for adolescentsStrain polymorphismIncreased diagnosis and reporting.

Resurgence of Pertussis

Estimatingrates of pertussis is difficult

lack of access todiagnostic methods

misdiagnosis

Under reported

cases

different reporting criteria

between countries

Cause of pertussis?

• Gram negative coccobacillus (Bordetella pertussis)

• Isolated in 1906• Obligate aerobe•Non-motile• optimal growth at 35-37 °С with humidity•Fastidious•No growth on routine blood agar•Catalse and Oxidase positive• Slow growing, requires 3-10 days of culture for identification Media: Bordet-GengouRegan-lowe Colony: smooth, tiny, glistening

Appearance = “mercury-drop” or “pearl”

Bordetella spp.B.Pertussis, Bordet and Gengou(1900)

B. parapertussis, Bradford and Slavin (1937)

B.bronchiseptica, Ferry:1910

B. holmesii

B. avium

B. Hinzii

B. Trematum

B.petrii

.1Adhesions

.2Toxines

B. pertussis virulence factors

Pertussis Vaccine 1st Pertussis vaccine- whole cell

(1940s) Acellular vaccine (PT, FHA, PRN,

FIM)

Combination vaccines

Pathogenesis

The

bacteria

enter

the

mouth

or

nasopharynx

as

aerosols

The

bacteria

binds

to

ciliated

cells

in

the

respiratory

mucosa

produces a number of adhesins which aid in its ability to colonize

Ptx

is

also

released

into

the

extracellular

fluid

and

can

affect

host

cells

Kills

ciliated

epithelial

cell.

Inflammation in respiratory tract

Attack to lymphocytes of immune system

47% Mom or Dad

Mom32%

Dad15%Siblin

g20%

Grandparent8%

Other25%

20% sibling

25% Others

75% transmitted from close contacts

8% grandparents

0

2

4

6

8

10

12

<6 m

onth

6-11

mon

th

1-4

year

5-9

year

10-1

9 ye

ar

20+

year

● Vaccination of children● Treatment by azithromycine

and erythromycine 50 mg/kg in 10 days

● Sampling of other persons contact to patients

● Daily control of the family of patients

Prevention

What affects the clinical presentation of pertussis?

AgeAdults and older children are less likely to have typical symptoms—eg, simple coughVery young infants might present atypically—eg, with apnoea alone—and not coughPrevious infectionSubsequent infections are milderPrevious vaccinationTime since previous vaccination or infectionLonger time, increased severity of infectionCo-infection

Symptoms ………………… less typicalDuration of cough……….. 36-48 daysAccompanied……………. Other symptoms pool of frequently undiagnosed pertussis

cases ……….. Reservoir in very young patients

Pertussis in adults and adolescents

Laboratory diagnosis

اهمیت جمع آوری سویه های بالینی

بررسی ویژگی آنتی ژنی سویه های جمع آوریشده و مقایسه آن با سویه های قبلی جهت

مطالعه جهش ژنتیکی در خصوص تهیه واکسن بررسی گردش سویه ها در جامعه و بین بیماران و

نحوه انتشار این سویه ها ز سویه هایZتهیه مخزنی اBordetella pertussis

بالینی طی سالهای هایجمع آوری شده از نمونه متمادی

بررسی روند بهبود در تشخیص بیماری، نمونهگیری، ارسال نمونه و تشخیص آزمایشگاهی

باکتری در طی زمان

بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی سویه ها و تغییراتمقاومت در طول زمان

اهمیت نمونه برداریکیفیت نمونه بستگی دارد به:

جدی گرفتن از سوی پرسنل دستورالعملهای از اس77تفاده

مناسب و دقیق محیطهای و مواد از استفاده در

ترانسپورت انتقال در مناسب زمان رعای7ت

نمونه به آزمایشگاهSpecimens of bacterial culture must

not be stored for more than 24 hours prior to sending laboratory .

نمونه های بالینی مشکوک به سیاه سرفه ارسال شده به انسZتیتو پاستور تهران

مراحل تشخيص آزمايشگاهي بيماري

از نمونه گيري بیمار توسط

پزشک

ارسال نمونه به مراکز ها

تشخیصی (پاستور)

كشتسرولوژي

PCR

تشخيص آزمايشگاهي

ایمونوفلورسنت

مقدمات نمونه گيري از بیمار

صورت پزشZك مربوطZه نمونZه گيري از طريZق •مي گيرد

آماده كردن بيمار بZا توضيZح در خصZوص نمونه •گيري

كامل كردن پرسش نامه •محیط • دو و ماسZک و دسZتكش كردن آماده

(از سواب سZواب داكرون و دو عدد ترانسZپورتپنبه ای نمی توان استفاده کرد)

محيZط ترانسZپورت رگان- لوحاوی سفالکسین •یخچال می در ماه دو تZا بسZته در (بZه صZورت

توان نگه داشت)

نام استان: نام بيمارستان,

دانشگاه, آزمايشگاه:

شماره تلفن : فاكس:

تاريخ اعالم بيماري به مركز بهداشت استان: نام پزشك معالج:نام و نام خانوادگي بيمار: جنسيت:

ن ز□ مرد □

تاريخ تولد: روز ماه سال

کد رهگیری بیمار: تاريخ شروع بيماري: روز ماه سالعالئم:

□ نامشخص□ خير□- سرفه هاي قطاري و ادامه دار : بله □ نامشخص □ خير□- حالت تهوع همراه با سرفه: بله□ نامشخص□خير □- بيمار تب دارد: بله

□ خير □ - آنتي بيوتيك مصرف كرده است؟ بله- نام دارو:

□ خير □ واكسيناسيون قبلي (ديفتري-كزاز-سياه سرفه) بلهتاريخ آخرين دز: روز ماه سال

□ خير □ موارد تماس با بيمار مشكوك به سياه سرفه: بله نوع نمونه هاي ارسالي:

بیمار روي محيط ناحیه نازوفارنکسز ا □ سياه سرفهترانسپورت

cough plateبه روش نوزادان ازسرفه □

تاريخ نمونه برداري:روز ماه سال

نام و نام خانوادگي فرد مسئول ارسال کننده نمونه: آدرس مركز:

شماره تلفن : فاكس:این قسمت توسط انستیتو پاستور تکمیل می گردد:

تاریخ دریافت نمونه:نام ونام خانوادگی فرد دریافت کننده نمونه:اشکاالت نمونه ارسال شده:

ارسال یک عدد محیط □ عدم رعایت زنجیره سرد□ تأخیر در ارسال به موقع به آزمایشگاه □ استفاده ازمحیط متفرقه□ترانسپورت

استفاده از سوآب پنبه ای در □ استفاده از محیط تاریخ گذشته□ نقص در اطالعات مربوط به بیمار□ نمونه گیری از بینی و یا حلق□نمونه گیری

بخش ميكروبشناسي-آزمایشگاه کشوری –انستیتو پاستور ایران– 69نشاني: تهران- خيابان پاستور-پالك سیاه سرفه

66953311- 20 - روزهاي تعطيل 66405535تلفکس:

فرم ارسال نمونه های مشكوك به

سياه سرفه-LA-FO :سند شماره

201-00

شماره 00:بازنگری

نمونه گيري از بیمار از کجا باید انجام شود؟

نازوفارنکس

نازالسوابآسپیره

ترين انتهايZي بZه را سZواب بخش بيني برده و چند لحظه نگZه مZي داريZم تZا ترشحات به آZن جذب شود و بالفاصZله به انتقال ترانسپورت محيZZط

داده مي شود.مورد ☻ در در نوزادان

در موفقیت عدم صZورت از گیری نمونه

نازوفارنکZس یZا نازال پليت حاوي محيZط كشت (برده-

را دهان 3ژانگZو) جلو بار سرفه هنگام در كودك داريم. مي نگZZه شديZZد

)cough plate( ساعت 48ايZن محيZط ابتدا بايZد ☻

دماي شده C°35در انكوبه ارسال آزمايشگاه بZZه سZZپس

.گردد

نحوه نمونه گيري از بیمار

شرايط نگهداري نمونه گرفته شده از بيمار

در صورتی که ارسال نمونه ها بالفاصله پس از نمونه گیری انجام •ارسال به آزمایشگاه( نمونه ساعت4فاصله زمانی شود )

و در دمای محیط نگهداریهاي جمع آوري شده را می توان در داخل ظرف درب دار حاوی پنبه نم دار انتقال داد.

اگر امکان ارسال نمونه ها به آزمایشگاه بالفاصله پس از نمونه •گیری فراهم نباشد، فرد مسئول نمونه گیری می بایستی نمونه

روز در 2های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت را ابتدا انکوبه کرده و پس از انکوباسیون C˚ 35انکوباتور در دمای

ساعت( 72 ) روز3طينمونه ها را می توان در دمای اتاق حداكثر به آزمایشگاه ارسال کند.داخل ظرف درب دار حاوی پنبه نم دار

بیش اگر پیش بینی می شود که ارسال نمونه ها به آزمایشگاه •ساعت طول می کشد، جهت انتقال نمونه فرد مسئول 72از

ابتدا باید نمونه های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت را به رعایت انکوبه کرده و سپس با C˚ 35 روز در دمای 2مدت

. در این صورت نمونه ها به آزمایشگاه انتقال دهد زنجیره سرد روز قابلیت نگهداری خواهند داشت. 8تا

كشتدر ميان روشهاي آزمايشگاهي اسZتاندارد طاليZي روش

است كشZت نمونZه هاي ارسZالي بر روي محيZط برده ژانگو •

و رگان لو(با سفالكسين و بدون سفالكسين)باكتري تا و كنترل كشZت C37-35 ° انكوباسZيون در •

با رطوبتدر شرايط مناسب همراه روز 10 در صZورت رشZد باكتري بر روي محيZط، تهيZه اZسمير •

از كلني هاي مشكوك و رنگ آميزي گرم در صورت مشاهده كوكوباسيلهاي گرم منفي:• انجام تسZتهاي تشخيصZي اكسZيداز (+) و حركت (-) •

APIو با استفاده ازاساليد آگلوتيناسيون انجام تست •آنتZي سZرمهاي پلZي كلونال براي تاييد باكتري بوردتال •

پرتوسيس و پارا پرتوسيس

محيط برده ژانگواولين محيط برايZ رشد باكتري بوردتال

پرتوسيسحاوی سفالکسین و بدون سفالکسین

:شامل% گلیسرول1عصاره سیب زمینی،

% خون دفيبرينه گوسفندي15و كلني هاي كوچك، براق و مرواريد مانند

محيط رگان لو (رگان لو شاركل آگار)

محيط مناسب ترانسپورت براي گونه هاي بوردتال

حاوي سفالكسين:شامل

عصاره گوشت، كازئين هضم شده با آنزيمهاي

ذغال پانكراتيك، نشاسته، 10نياسين و فعال، %

خون دفيبرينه حیوانی

چه مواد و عناصري باعث تقويت و یا مهار رشد باكتري می شوند؟

تقويت كننده هاي رشد مهار كننده هاي رشد

Fatty acides اسيدهاي چرب ●Metal ions يونهاي فلزي ●Sulfides سولفيدها ●Peroxides پراكسيدها ●CO2 میزان زیاد دی اکسید کربن ●

Starch نشاسته ●Charcoal ذغال فعال ●Serum albumin سرم آلبومين ●Cyclodextrin سايكلودكسترين ●

IgG(سرولوژي عبارت اسZت از تعيين تيتر آنتي بادي ●and IgA توکسین ژنهای آنتZی عليZه بر ايجاد شده (

و پرتوسيس FHA(Filamentousبوردتال hemagglutinin)در سرم خون فرد بيمار

ايZن تسZت بيانگZر حضور آنتZي بادي در خون چZه در اثر ●است واكسZيناسيون اثZر در چZه و بيماري بZه ابتال (بنابرايZن هZم در افراد مبتال و هZم در افراد واكسينه

نتيجه مثبت خواهد داشت)باالي ● افراد براي در 11 و گيرد مي صZورت سZال

پيشنهاد مي شود PCRصورت منفي بودن كشت و

سرولوژی

جهت بررسیفرد واكسينه به دليل توليد آنتي بادي در در اثر ابتال به بیماریZ، در IgG , IgAمیزان افزایش

نیاز است.دو نمونه سرم تست سرولوژیZ به مربوط به تیتر آنتی بادی Zبهترین تست سرولوژیIgG

) است که ویژه بوردتال PTعلیه توکسین پرتوسیس (پرتوسیس بوده بیانگر ایجاد بیماری حاد در فرد مبتال می

)EU/ml 125-100باشد. ( هفته زمان سرفه کردن بیمار استفاده از هر دو 2-3در

پیشنهاد می شود.PCRروش سرولوژی و

آنتي بادي فلورسنت مستقيم )Direct Fluorescent Antibody( DFA

معايب%) 18-78 حساسيت پايين (•)CFU/ml 104(< نياز به تعداد زياد باكتري • مناسب در مراحل اوليه بيماري• نياز به مهارت و تجربه در استفاده از ميكروسكوپ• آنتي بيوتيك درماني بر اتصال آنتي باديها ي فلورسنت•

بر ديواره سلولي باكتري موثر است %) مثبت كاذب7-44 اختصاصيت پايين ( •

مزاياسريعتر از كشت

عبارت است از تكثير ناحيه بسيار اختصاصي از ژنوم باكتري با استفاده از پرایمر و پروب اختصاصی

Real-Time PCR

بهترين و دقیقترین تست تشخيصيزمان كوتاه مورد نیاز جهت ارائه نتایج 1(>= (حساسيت باالCFU/ 5 µl sample( اختصاصيت باال عدم نياز به باكتري زنده (مشكالت ناشي از

نمونه گيري و طريقه انتقال نمونه را ندارد)

نسبت real-time PCRمزایای به کشت

نیاز به آماده سازیDNA باکتری نياز به وسايل و تجهيزات دقيق هزينه بسيار بيشتر از روش كشت وDFAعدم استاندارد سازي اين روش بازدارنده هايPCR واكنش متقاطع با گونه هاي ديگر باكتري مانند B. bronchiseptica, B. holmesii, در صورت

IS481استفاده از

Real Time PCRمعايب

استفاده از روش ملکولی جایگزین که هزینه کمتری داشته و امکان استفاده از آن در سراسر کشورفراهم باشد

نتایج

وضعیت موارد ارسالی مشکوک به سياه سرفه به 1391-1386انستیتو پاستور ایران طی سالهای

138613871388138913901391

263

688643

452

817

500

27329239133116

25102121

Chart TitleTotal PCR Culture

رقZیZشZرZذ

آZرانZه

Zت

ماZلZیZش

ZنZاZسخZرا ZمZق

ZانZرZدZنZزZا

م

ZیZغربZرZذ

آ

ZنZاZهZفاص

ZنZاZزگرم

ه

ZیZرZیاخZت

Zب ZلZاZح

رZمZاZهZچ

ZنZتاZسZوز

Zخ

ZنZستاZوچ

بZل وZنZستا

سZیZنZاZش

ZاZک ZنZرما

ZکZیالنZگ

ZزیZکمر Zزد

Zی0

20406080

100120140160180200

92

18

190

167

63

33

70

162

8 9 619

7 3 410 15

29

122

22

719

11

27

7 2 3

23

4

اZرZسZالZی ZرفهZس سZیZاه Zبه ZوکZکZمش Zنمونه ZلZک تعدZاد1392سZاZل

1392موارد کشت مثبت سال اشکاال

ت سن آنتی مصرفبیوتیک

واکسینه شده

کشت مثبت استان

4 زیر ماه6 8 6 12 آذربایجان

شرقی0 زیر

ماه6 0 0 1 البرز

0 زیر ماه6 4 4 5 تهران

0 زیر ماه6 1 1 2 خراسان

رضوی1 زیر

ماه6 نامشخص نامشخص 1 خراسانشمالی

0 زیر ماه6 0 1 1 زنجان

0 زیر ماه6 1 1 1 قم

0 زیر ماه6 1 1 1 کرمانشاه

0 زیر ماه6 2 4 5 مازندران

1 نامشخص نامشخص نامشخص 1 نامشخص

1386 1387 1388 1389 1390 1391 1392

263

688643

452

817

1301

900

2 5 10 2 1 34 30

از سرفه سیاه مثبت کZشZت موارد مقایسZه1392-1386

Total Culture

موارد مثبت سیاه سرفه از نظر گروه های سنی بیماران )1391 و 1390(مجموع سال

ماه-2زیرماه2

ماه-22ZالZس

2-10ZالZنامشخص10<س

374416

275231

21 66511

1017839265

کل تعZداد مZثZبZت کشت PCR تZبZمث

اشكاالت معمول در موارد ارسالي

ارسال یک محیط ترانسپورت

استفاده از سواب پنبه اي

ارسال نمونه بدون ترانسپورت

ارسال نمونه بدون سواب

ارسال نمونه بدون فرمآ لودگی محیط

فقط سرم ارسال شده است

فرم دیفتری پر شده است

نقص در تکمیل فرمبی نام وشماره تماس

استفاده از محیط ترانسپورت تاریخ گذشتهتاخیر در ارسال نمونه

Thank you