Imunoloski bukvar

Mirko Simić

1. Molekuli imunskog prepoznavanja

Imunološki bukvar

U molekule imunskog prepoznavanja spadaju tri garniture

proteinskih molekula sposobnih da vezuju antigen i da na taj način

obavljaju prepoznavanje u imunskom sistemu.

To su: površinski imunoglobulini (Ig) koji služe kao receptori za

antigen zvani BCR (od engl. B cell receptor) na B limfocitima;

receptori za antigen na T limfocitima zvani TCR (od engl. T Cell

Receptor); i MHC molekuli klase I i II (od engl. Major Histocompability

Complex encoded molecules).

Svi su ovi molekuli strukturno homologni i evolucijski srodni, pa se

zato svrstavaju u superfamiliju Ig gena. Veruje se da svi potiču od

jednog pragena koji se javlja tokom evolucije pojavom multicelularnih i

višeslojnih životinja i prvobitno kontroliše sintezu primitivnih proteinskih

molekula kojima se ćelije međusobno prepoznavaju i komuniciraju

tokom histogeneze.

Zajedničko svojstvo svih molekula imunskog prepoznavanja je da

sadrže jednu ili više homolognih jedinica - domena - karakteristične

trodimenzijske strukture koja počiva na konformaciji zvanoj

imunoglobulinska.

Za imunoglobulinski domen je karakteristično da sadrži

evolucijski sačuvane amino kiseline koje omogućuju da polipeptid

svijanjem u prostoru formira globularnu tercijarnu konformaciju u

vidu “sendviča” od dva sloja, od kojih jedan sadrži 3, a drugi 4 niti

peptidnog lanca. U svakom sloju peptidne niti teku antiparalelno i

tvore β-ploču. Slojevi su grubo paralelni i povezani u “sendvič”

jednom disulfidnom (S-S) vezom koju ostvaruju evolucijski

konzervisani cisteini u imunoglobulinskom domenu.

Shematski prikaz globularnog Ig domena

S

S

N-kraj peptida

C-kraj peptida

β-ploča

β-ploča

Imunoglobulinski domen

Receptorski polipeptidi

Svi polipeptidni lanci u sastavu BCR (Ig) i TCR molekula sadrže

segmente duge oko 110–120 amino kiselina, od kojih svaki

nezavisnim svijanjem u prostoru formira kompaktnu funkcionalnu

jedinicu u vidu domena karakteristične imunoglobulinske

konformacije. Lanci se međusobno razlikuju po broju domena koje

sadrže. Domena u BCR i TCR polipeptidnim lancima može biti 2, 4, ili

5.

Svi su BCR (Ig) i TCR lanci izvanredno raznoliki u pogledu svog

aminokiselinskog redosleda.

Ova molekulska raznolikost je od suštinskog značaja za

funkcionisanje imunskog sistema pošto obezbeđuje strukturnu osnovu

za zadivljujuće širok spektar različitih specifičnosti mesta za vezivanje

antigena na BCR i TCR molekulima. Naime, različiti aminokiselinski

redosledi proizvode različite fizičke, hemijske i konformacijske varijacije

u delu molekula kojim se vezuje antigen. Na taj način oni obezbeđuju

bezbroj različitih mogućnosti vezivanja antigena i time omogućuju

imunskom sistemu da specifično prepozna bilo koju od mnogo miliona

različitih molekulskih konformacija – epitopa.

Raznolikost aminokiselinskog redosleda, međutim, nije ravnomerno

raspoređena duž celog lanca, već je koncentrisana u krajnjem N-

terminalnom, tzv. varijabilnom (V) domenu polipeptidnih lanaca, dok su

preostali domeni više evolucijski konservisani i relativno su konstantni,

zbog čega se i nazivaju konstantnim (C) domenima.

Shematski prikaz strukture BCR i TCR peptidnihlanaca, njihovi nazivi, kao i nomenklatura koja se koristi za obeležavanje njihovih domena odnosno

regiona

N

C

S

S

IgLκ lanac

Vκ

Cκ

Cμ1

Cμ2

Cμ3

Cμ4

V H

C (KONSTANTNI)

V (VARIJABILNI)

TransmembranskiN

C

REGIONIBCR (Ig) LANCI

Ig LAKI (L) LANCI

Ig TEŠKI (H) LANCI Membranski oblik

TCR LANCI

N

C

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

IgHδ lanac

IgHγ lanac

IgHα lanac

IgHε lanac

C ε1

C ε2

C ε3

C ε4

C α1

C α2

C α3

Cδ1

Cδ2

Cδ3

C γ1

C γ2

Cγ3

VH VH VH

VH

N N

N

C C C C

N

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

SS

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

DOMENI

S

S

S

S

S

S

S

S

TCRβ lanac

TCRγ lanac

TCRδ lanac

Vβ Vγ Vδ

Cβ Cγ Cδ

N N N

C C C

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

IgHμ lanac

IgLλ lanac

V

C

N

C

S

S

S

S

Vλ

Cλ

TCRα lanac

Vα

Cα

S

S

Šta više, varijabilnost aminokiselinskog redosleda Ig i TCR

polipeptidnih lanaca nije ravnomerno raspoređena ni duž varijabilnog

V domena, već je pretežno koncentrisana u tri segmenta peptidnog

lanca, dugih desetak amino kiselina svaki, i uređenih u vidu petlji koje

strče iz lanca. Nazivaju se hipervarijabilnim regionima. Hipervarijabilni

regioni su međusobno razdvojeni relativno konstantnim regionima

potke lanca.

Kako u Ig, tako i u TCR molekulu hipervarijabilne petlje V domena

dva polipeptidna lanca se konformacijom lanaca dovode prostorno u

blizinu, i udružuju se formirajući mesto u molekulu kojim se vezuje

antigen, i stoga se naziva mestom vezivanja antigena.

Shematski prikaz hipervarijabilnih regiona u okviru V regiona BCR i TCR polipeptidnih

lanaca

VVarijabilni

region

NCDR3 CDR2 CDR1

CIgL lanci

NCDR3 CDR2 CDR1

CTCR lanci

Ckonstantni

region

TMTransmembranskii

region

CDR3 CDR2 CDR1NIgH lanci

(membranski oblik)C

S obzirom na to da hipervarijabilni regioni učestvuju u

formiranju dela molekula koji vezuje antigen zato što je prostorno

komplementaran molekulskoj konformaciji vezanog antigena, oni se

takođe nazivaju i regionima koji određuju komplementarnost - CDR

regionima (engl. complementarity-determining regions).

Biološki značaj i prednost hipervarijabilnih regiona je u tome što

omogućuju da se ogromna raznolikost mesta vezivanja antigena, kako

u TCR tako i u BCR (Ig) molekulima, može stvarati menjanjem dužine

hipervarijabilnih petlji i aminokiselinskog redosleda u njima, a bez

remećenja ukupne trodimenzijske strukture peptidnih lanaca.

BCR

Imunoglobulini (Ig) su glikoproteini koje proizvode isključivo B

limfociti. Molekuli Ig mogu biti iskazani na ćelijskoj membrani B limfocita

kao receptori za antigen zvani BCR, ili ih B limfociti kada diferentuju u

plazma ćelije mogu lučiti kao antitela.

Membranski BCR molekuli strukturno se razlikuju od izlučenih

molekula antitela samo utoliko što prvi sadrže membranski tip teških

IgH lanaca, a za razliku od antitela u kojima se nalazi izlučivani tip

inače istovetnih teških IgH lanaca.

Razlika između ova dva tipa teških lanaca sastoji se samo u tome

što membranski tip IgH lanca na svom C-terminalnom kraju sadrži

dodatni niz od oko 20 hidrofobnih amino kiselina, tzv. transmembranski

domen, koji ga vezuje za ćelijsku membranu protežući se kroz

hidrofobski region lipidnog dvosloja ćelijske membrane B limfocita.

Molekul BCR (Ig) je simetričan i sastoji se od dva identična teška

polipeptidna lanca, teška zato što su veće molekulske mase, i dva

identična laka lanca, laka zato što su manje molekulske mase. Prvi su

nazvani IgH (H od engl. Heavy), a drugi IgL (L od engl. Light) lanci.

Lanci su u molekulu međusobno vezani disulfidnim vezama, i to

S-S vezom između dva teška lanca, kao i S-S vezama između lakih i

teških lanaca.

IgH lanci u molekulu Ig mogu biti pet različitih klasa označenih

grčkim slovima μ, δ, γ, α ili ε, dok IgL lanci mogu biti dva tipa zvana κ

ili λ.

Shematski prikaz strukture BCR

MEMBRANA B LIMFOCITA

Mestovezivanjaantigena

SS

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

SS

S-S S-S

S-S

2 IgHμ lanca

2 IgLκ ili λ lanca

Mestovezivanjaantigena

Varijabilni domenS

S

S

S Konstantni domen

Transmembranskidomen

Klasa teškog lanca koji se nalazi u molekulu Ig određuje kojoj

od pet klasa molekul pripada. Shodno tome, ako su u molekulu μ

teški lanci, onda je molekul klase IgM, ako su to δ teški lanci onda je

molekul klase IgD, ako su to γ lanci onda je klase IgG, ako su to α

lanci onda je klase IgA, i konačno, ako su to ε lanci onda molekul

pripada klasi IgE. Od klase kojoj pripada teški lanac, zavise

odgovarajuće biološke funkcije molekula Ig antitela, kao čto su

aktivacija sistema komplementa, opsonizacija, oslobađanje

medijatora rane preosetljivosti, citotoksičnost, itd.

U Ig molekulu bilo koje od 5 klasa laki IgL lanci mogu biti ili κ ili

λ.

IgH teški lanci u molekulu Ig određuju klasu antitela

Klasa IgH TEŠKOG LANCASekretovani oblik

5IgE

S-S veza

2 Serumski IgA

1

μ

5

ε

2

α

3

γ

4

δ

2IgA u sekretima

1 IgM

J lanac

J lanac

Sekretornakomponenta

3 IgG

4IgD

Mesto vezivanja antigena u Ig molekulu formira se interakcijom

V domena jednog teškog lanca i V domena za njega disulfidnom

vezom vezanog lakog lanca. U formiranju površine koja vezuje

antigen sadejstvuju po tri CDR regiona teškog i lakog lanca.

Osnovni molekul Ig po pravilu sadrži dva mesta vezivanja

antigena i stoga se za njega kaže da je bivalentan. Bivalentnost

površinskog BCR molekula je za imunsko prepoznavanje važna

stoga sto omogućuje unakrsno vezivanje receptora u kompleks

neophodan za endocitozu antigena od strane B limfocita.

Tokom svog razvića u kostnoj srži, nezreli prethodnici B limfocita

zvani pre-B ćelije, u početku sintetišu IgH μ lance koji se spajaju sa

peptidnim lancima koji u stvari nisu pravi već surogatni laki lanci, pa

su molekuli iskazani na ćelijskoj membrani nefunkcionalni.

Kad u ćelijama otpočne sinteza IgL lanaca, oni se spajaju sa IgH μ

lancima istiskujući surogatne lake lance. B limfociti u tom stadijumu

svog razvića iskazuju na membrani funkcionalne receptore klase IgM

sposobne da prepoznaju antigene, i nazivaju se zrelim devičanskim B

limfocitima, devičanskim zato što se još nisu susreli sa antigenom.

Mnogi devičanski B limfociti ubrzo počinju da sintetišu i IgH δ

lance sa V domenom koji je identičan V domenu IgH μ lanaca, tako

da većina zrelih devičanskih B limfocita na svojoj membrani iskazuju

dve klase površinskih BCR molekula, IgM i IgD. Pošto oni sadrže IgH

μ i δ lance sa identičnim V domenom, obe molekulske vrste

receptora iste su specifičnosti za antigen.

Svaki zreli B limfocit na svojoj membrani iskazuje oko 100 000

površinskih BCR molekula. Memorijski B limfociti za razliku od

devičanskih, iskazuju površinske BCR molekule u čijem sastavu se

mogu naći membranski oblici IgH γ, α ili ε lanaca.

TCR

TCR su glikoproteini koje jedino proizvode T limfociti i isključivo ih

iskazuju na svojoj ćelijskoj membrani kao receptor za antigen, a ne

mogu da ih luče u spoljnu sredinu.

TCR molekuli većine T limfocita su heterodimeri sačinjeni od TCR

lanaca zvanih α i β koji su vezani disulfidnom vezom. Manjina T

limfocita iskazuje na svojoj ćelijskoj membrani heterodimere koji se

sastoje od TCR lanaca zvanih γ i δ.

Slično membranskom tipu IgH lanaca, TCR lanci takođe na C-

terminalnom kraju imaju transmembranski region koji se sastoji od

20-24 pretežno hidrofobske amino kiseline. Tipičan T limfocit iskazuje

oko 20 000 TCR molekula na svojoj ćelijskoj membrani.

Shematski prikaz strukture TCR

ĆELIJSKA MEMBRANA T LIMFOCTA

S-S

Mesto vezivanja kompleksaMHC-peptid

S

S

S

S

S-S

S

S

S

S

TCR γ

lanac

TCR δ

lanac

Mesto vezivanja kompleksaMHC-peptid

Varijabilni domenS

S

S

S Konstantni domen

Transmembranskidomen

S

S

S

S

TCR α

lanac

S

S

TCR β

lanac

S

S

S

S

TCR predstavlja jedan jedinstveni receptor sa posebnim regionima

kojima se specifično prepoznaju kako determinante na peptidnom

fragmentu, tako i polimorfne determinante na MHC molekulu. Što se

peptidnog fragmenta vezanog u MHC molekulu tiče, posebnim

aminokiselinskim ostacima ostvaruje se njegov kontakt sa TCR, s jedne

strane, i kontakt sa MHC molekulom s druge strane.

Mesto vezivanja antigena u TCR molekulu takođe se formira

interakcijom varijabilnih V domena oba peptidna lanca. Slično kao i

kod Ig, u formiranju specifične konformacije kontaktne površine sa

antigenom neposredno učestvuju CDR regioni oba peptidna lanca.

Molekul TCR poseduje jedno mesto vezivanja antigena.

Shematski prikaz načela prepoznavanjaproteina od strane T ćelija

Prepoznaje polimorfne determinante MHC

Prepoznaje determinantepeptida

TCR α

TCR βMHC β lanac

MHC α lanac

Mesto kontakta sa TCR

Peptid

Mesto kontakta sa MHC

Prepoznaje polimorfne determinante MHC

BCR i TCR

kompleksi

Molekuli BCR i TCR osposobljavaju B odnosno T limfocite da

specifično prepoznaju antigene. Međutim, ovi molekuli nisu u stanju da

stvaraju, niti da sprovode u ćeliju signale koji je podstiču da proliferiše i

diferentuje u efektorsku ćeliju. Stoga aktivacija ćelije zavisi od signala

koje stvaraju i sprovode drugi molekuli fizički povezani u

multipolipeptidne komplekse sa BCR i sa TCR.

BCR kompleks sastoji se od 2 teška (H) i 2 laka (L) lanca spojenih sa

najmanje jednim, a obično sa dva dimera koji su sastavljeni od jednog

Ig-α i jednog Ig-β lanca povezanih disulfidnom vezom. Svojim

ekstracelularnim domenima oba lanca pripadaju Ig supefamiliji.

Shematski prikaz BCR kompleksa

Ig-α

S

S

Ig-β

S

S

SS

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

SS

SS

SS

S

S

S

S

S

S

SS

S-S S-S

S-S

BCR Ig-α Ig-β

P

S

S

S

SS-SS-S

MEMBRANA B LIMFOCITA

Molekuli povezani sa TCR čine kompleks zvan CD3. Kompleks se

sastoji od pet posebnih polipeptidnih lanaca: γ lanca, δ lanca, ε lanca ,

ζ lanca i η lanca. U CD3 kompleksu prisutan je po jedan γ, δ i dva ε

lanca. 90% TCR molekula imaju homodimer od dva disulfidnom vezom

spojena ζ lanca, dok 10% imaju heterodimer sastavljen od jednog ζ

lanca povezanog disulfidnom vezom sa jednim η lancem. Svojim

ekstracelularnim domenima γ,δ i ε lanci pripadaju Ig supefamiliji.

Iskazivanje TCR i CD3 molekula na membrani T ćelije i njihove funkcije

su međusobno zavisne.

Shematski prikaz TCR kompleksa

CD3 KOMPLEKS

TCR

S

S

S

S

S-S

S

S

S

S

ζ ζ (η)

S-S

ε

S

S

γ

S

S

δ

S

S

ε

S

S

S

S

S

S

S-S

S

S

S

S

TCR

MEMBRANA T ĆELIJE

DNApreuređenje

Bitna je karakteristika svih BCR (Ig) i TCR polipeptidnih lanaca to

da njihovih funkcionalnih gena nema u DNA zametne loze koja se

nasleđuje, kao sto je to slučaj sa drugim proteinima. Funkcionalni

geni za BCR i TCR polipeptidne lance sklapaju se tek naknadno,

tokom razvića limfocita, i to nezavisno u svakom pojedinačnom B

odnosno T limfocitu procesom somatskog DNA preuređenja i

nasumičnom rekombinacijom nasleđenih genskih segmenata.

Stoga svaki pojedinačni diferentovani B odnosno T limfocit, i

njegovo potomstvo koje čini jedan ćelijski klon, poseduje samo

sebi svojstvene funkcionalne gene za BCR(Ig) odnosno TCR

polipeptidne lance. Ovi su geni nastali nasumično, kao na ruletu,

putem jedne od sijaset mogućih rekombinacija genskih

segmenata.

Proces somatskog DNA preuređenja u B i T limfocitima je veoma

važan za imunski sistem s obzirom na to da on na krajnje ekonomičan

način i korišćenjem minimuma informacija zametne loze, nasumičnim

rekombinacijama nefunkcionalnih parčića gena obezbeđuje stvaranje

ogromnog broja funkcionalnih gena neophodnih za stvaranje

najraznolikijih imunskih receptora.

Somatsko DNA preuređenje jedinstveno je za imunski sistem,

odnosno za B i T limfocite u kojima do njega jedino dolazi, i u kojima

jedino preuređeni i rekombinovani funkcionalni geni za BCR(Ig)

odnosno TCR peptidne lance vrše svoj posao. U ostalim ćelijama,

međutim, BCR(Ig) i TCR genski lokusi ostaju u nefunkcionalnoj

konfiguraciji zametne loze.

Dve vrste receptora u imunskom sistemu

RECEPTORI RECEPTORI ČČIJI SE GENI NASLEĐUJUIJI SE GENI NASLEĐUJU((iskazaniiskazani nana makrofagimamakrofagima i NKi NK ććelijamaelijama))

RECEPTORI RECEPTORI ČČIJI GENI NASTAJU SOMATSKIM PREUREĐENJEM DNAIJI GENI NASTAJU SOMATSKIM PREUREĐENJEM DNA((iskazaniiskazani nana B i T B i T ććelijamaelijama))

Mogući funkcionalnigeni

Funkcionalni gen za receptor

nastaje nasumičnom

rekombinacijomgenskih

segmenata

Funkcionalnigen za receptor koji se nasleđuje

InformacijskaRNA

Transkripcija

Polipeptidreceptora

Translacija

Mogući polipeptidireceptora

Translacija

InformacijskaRNA

Transkripcija

Nasleđuju se grupe

nefunkcionalnhgenskih

segmenata

1 2 3

Geni koji kodiraju BCR(Ig) i TCR polipeptidne lance raspoređeni su

u sedam posebnih lokusa : IgH za teške lance, IgLκ i IgLλ za lake

lance, i TCR α,β,γ,δ za TCR lance.

Genomska organizacija svih ovih genskih lokusa u konfiguraciji koja

se nasleđuje je veoma slična. Svaki lokus sadrži više grupa genskih

segmenata koji tek kada se spoje u kontinualni niz stvaraju

funkcionalan gen sposoban da započne i upravlja sintezom polipeptida.

Počev od 5’ kraja DNA lanca, svi lokusi sadrže brojne

varijabilne V genske segmente, zatim grupu spojnih J genskih

segmenata, kao i nekoliko konstantnih C genskih segmenata

prema 3’ kraju. Uz svaki V segment prema 5’ kraju nalazi se L

ekson koji kodira liderski peptid neophodan za vodjenje

nascentnog peptida. Sem toga, IgH lokus i TCRβ lokus sadrže

pored navedenih, i grupe genskih segmenata raznolikosti - D

genskih segmenata.

Genomska organizacija mišijih lokusa TCRβ i IgHμlanaca u konfiguraciji kakva se nasleđuje

3’

3

LOKUS TCR β LANCA

DH (1 - 12) JH (1 - 4)

Cγ2b Cγ2a Cε Cα

L1 VH1 L1000VH1000

5’

GENSKI SEGMENTI

L LiderskiV VarijabilniD RaznolikostiJ Spojni

Dβ1

C Konstantni

Jβ1 (1 - 7)Cβ1

pseudogenski segment*

L1 Vβ1 L50

5’

Vβ50

’

Dβ2 Cβ2

*

Jβ2 (1 - 7)

LOKUS IgH μ LANCA

Cμ Cδ Cγ3 Cγ1

Somatsko preuređenje DNA kojim se tokom razvića limfocita

sklapa funkcionalni gen za BCR ili TCR polipeptidne lance,

odigrava se posredstvom posebne, za određeno mesto na DNA

specifične, rekombinacije nefunkcionalnih V,D,J genskih

segmenata. Rekombinacija se obavlja aktivnošću zajedničkog

tkivno specifičnog enzimskog sistema poznatog pod kolektivnim

nazivom VDJ rekombinaze.

Rekombinacija V,D,J segmenata podrazumeva pre svega

prepoznavanje signalnih evolucijski veoma konzervisanih RS sekvencija

na DNA molekulima koji se spajaju. One se nalaze bočno prema 3’

kraju svakog V segmenta, prema 5’ kraju svakog J segmenta i s obe

strane svakog D genskog segmenta.

RS sekvencije služe kao mesta prepoznavanja za rekombinacijski

sistem, čime se obezbeđuje da se samo odgovarajući genski segmenti

rekombinišu. V segment se prevashodno spaja samo sa J ili sa D

segmentom, ali se gotovo nikad ne spaja sa nekim drugim V

segmentom.

Za V,D,J rekombinaciju od ključnog su značaja evolucijski izrazito

konzervisani aktivacijski geni rekombinaza, RAG-1 i RAG-2 geni (RAG

od engl. recombinase activation gene), koji pod uslovom da su

istovremeno iskazani obezbeđuju generisanje aktivnosti V,D,J

rekombinaza. Eksperimentalno razaranje bilo kog od ova dva gena

dovodi do toga da u genskim lokusima BCR(Ig) ili TCR polipeptidnih

lanaca ne može doći do preuređenja DNA, što je popraćeno zastojem u

razviću limfocita u vrlo ranoj fazi diferencijacije.

Miševi kod kojih je jedan od ova dva gena nefunkcionalan, nemaju

funkcionalnih B i T limfocita i ispoljavaju sindrom teške kombinovane

imunodeficijencije - SCID (engl. severe combined immunodeficiency

syndrom).

Rekombinacija genskih segmenata odigrava se određenim

preciznim redosledom. Na primer, u slucaju IgH lokusa prilikom

sazrevanja B limfocita, prvo se neki od više D genskih segmenata

(recimo treći po redu u grupi D segmenata, segment D3) pomera da

precizno prilegne i da se spoji sa nekim od više J genskih segmenata

(recimo sa drugim po redu u grupi J segmenata, sa segmentom J2).

Sledstveno D3J2 spajanju, neki od velikog broja V genskih segmenata

(recimo prvi u grupi V segmenata, segment V1) spaja se sa D3J2

kompleksom čime nastaje rekombinovani funkcionalni V1D3J2 gen

koji kodira V domen IgH lanca.

Shematski prikaz rekombinacije genskih segmenata u funkcionalni gen

3’

C2J2 (1 -6)

D2C1J1 (1 -6)

D1VnLnV1L1

5’

Prvo preuređenje DNA (spajanje D3 - J2)

Drugo preuređenje DNA (spajanje V1 - D3J2 )

J2 (1 -6)J1

3’5’

4 5 6

L1 V1 Ln Vn D1 C1 D2 C2

5’ 3’

J (1- 4 )D (1 - 12)VnLnV1L1 C αCμ

STVARANJE PRIMARNOGTRANSKRIPTA RNA

Funkcionalni gen koji se transkribuje Funkcionalni gen koji se transkribuje

Informacijska RNA za IgHμ lanac

STVARANJEINFORMACIJSKE RNA

OBRADOM

3’5’

4 5 6

L1 V1 D1J1

C1 D2J2 (1 -6)

C2

5’ 3’L1 V1 D1 J1 C1 D2 J2 (1 -6) C2

4 5 6

AAACμJ2D3V1L1

D - J SPAJANJEPrvo preuređenje DNA (spajanje D1 - J14 )

V - D J SPAJANJEDrugo preuređenje DNA

(spajanje V1 - D1J14)

Obrada RNA

5’ 3’

J2 J3 J4D3V1L1 C αCμ

5’ 3 ’J2 J3 J4D3V1L1 C αCμ

5’ 3’

J2 J3 J4D1VnLnV1L1 C αCμD2 D3

Nasleđena DNA (nefunkcionalni genski segmenti)

Informacijska RNA za TCRβ lanac

AAAC1J14D1V1L1

Nasleđena DNA (nefunkcionalni genski segmenti

Obrada RNA

Pošto se preuređenje DNA obavi, započinje transkripcija.

Prvonastali primarni RNA transkript za IgH μ lanac sadrži prepis kako

spojenih V1D3J2 genskih segmenata, tako i prepis suvišnih J3 i J4

segmenta, kao i verovatno prepis svih C genskih segmenata.

Međutim, sledstvenom obradom RNA stvara se informacijska mRNA u

kojoj su samo prepisi genskih segmenata V1, D3, J2 i Cμ sačuvani i

nalaze se u kontinuitetu, dok su preostali prepisi uklonjeni.

Sinteza TCRβ i IgHμ polipeptidnih lanaca

IgHμ LANAC

CJDVLNH2 COOH

COOH

V D J CNH2

V REGIONC REGIONCDR1 CDR 2 CDR 3

CμJ2D3V1L1AAA

INFORMACIJSKA RNA

TRANSLACIJA RNA U NASCENTNI POLIPEPTID

PROCESOVANJE I GLIKOZILACIJA U ZRELI POLIPEPTID

TCR β LANAC

CJDVLNH2 COOH

C1J14D1V1L1AAA

V D J CNH2 COOH

V REGIONC REGIONCDR1 CDR 2 CDR 3

Translacijom obrađene mRNA konačno se stvara IgH μ polipetidni

lanac. Na sličan način se odigrava i preuređenje DNA u TCR β lokusu u T

limfocitima, koje dovodi do nastanka rekombinovanog VDJ gena koji

kodira Vβ region TCR β lanca.

Posebno treba uočiti da se u slučaju oba polipeptidna lanca VDJ

spojevi nalaze u okviru CDR3, tj. trećeg hipervarijabilnog regiona za koji

se smatra da je izuzetno važan za specifično vezivanje i prepoznavanje

antigena.

Generisanjeraznolikosti

Tokom formiranja funkcionalnih gena za BCR ili TCR polipeptide,

nasumični proces somatskog preuređenja DNA na više načina

učestvuje u generisanju raznolikosti imunskih receptora.

Pre svega, znatan broj V,D,J genskih segmenata koje svaka jedinka

nasleđuje od oca i majke, već sam po sebi omogućuje priličnu

raznolikost imunskih receptora. Međutim, rekombinacijsko spajanje ovih

segmenata tokom somatskog razvića limfocita, znatno uvećava ovu

raznolikost s obzirom na to da je mogući broj različitih V,D,J

kombinacija koje određuju specifičnost receptora, u svakom genskom

lokusu jednak proizvodu broja V,D,J genskih segmenata u datom

lokusu.

Na primer, nasumično rekombinacijsko spajanje V,D,J genskih

segmenata u mišijem IgH lokusu može generisati 1 - 4 x 104 (tj. 250 -

1000 V x 12 D x 4 J) različitih VDJ kombinacija, odnosno toliki broj

različitih V domena IgH lanca.

Međutim, rekombinacija čak i istih V,D,J genskih

segmenata, može proizvesti različite redoslede amino kiselina u

mestu VJ, VD, i DJ spojeva. Do ove raznolikosti u spojevima

dolazi dejstvom dva mehanizma poznatih pod nazivima:

neprecizno DNA preuređenje i diversifikacija N regiona.

Iako je u većini slučajeva spajanje segmenata DNA precizno,

dešava se da dolazi do nepreciznog preuređenja DNA zbog toga sto

različiti broj nukleotida može nestati sa krajeva genskih segmenata

koji se spajaju.

Naziv diversifikacija N regiona se odnosi na proces dodavanja

nukleotida kojih inače nema u genomu, u mesta VJ, VD i DJ

spojeva. Dodavanje se obavlja posredstvom terminalne

deoksinukleotidil trasferaze (TdT) koja na taj način kvalitativno

modifikuje V,D,J spoj.

Raznolikost Ig i TCR molekula zato što su sastavljeni od dva

peptidna lanca, nastaje i usled kombinacijskog sparivanja različitih

parova peptidnih lanaca. Naime, mesto vezivanja antigena kako u

BCR(Ig), tako i u TCR molekulima, formira se kooperativnom

interakcijom V domena dva peptidna lanca. Stoga je razumljivo, na

primer, da se kombinacijskim sparivanjem 104 razlicitih V domena IgH

μ lanaca sa 103 različitih V domena IgLκ lanaca, teorijski može dobiti

107 tj. čak deset miliona različitih mesta vezivanja antigena na Ig

molekulima.

Mogući doprinos različitih diversifikacijskihmehanizama u generisanju raznolikosti BCR i

TCR molekula

TCRα lanac

TCRβ lanac

250 -1000 250

12 0

4 4

1-5 x 104 103

75 25

0 2

50 12

4 x 103 6 x 102

BCR MOLEKUL TCR MOLEKUL

Ig H μ lanac

Ig Lκ lanac

Broj V segmenata

Broj D segmenata

Broj J segmenata

Ukupni potencijaluključujući spojnu

raznolikost

Kombinacijskosparivanje V domena

Rekombinacijskospajanje segmenata

107 106

10 11 1016

Alelskaekskluzija

Heterozigotni organizmi nasleđuju po dve grupe – jednu od oca

a drugu od majke – BCR(Ig) i TCR genskih segmenata pa bi njihovim

somatskim preuređenjem u funkcionalne gene trebalo da pojedinačni B

i T limfociti iskazuju imunske receptore specifične za više različitih

antigena. Međutim, pojedinačni B ili T limfociti iskazuju monospecifićne

receptore za samo jedan antigen.

Genski mehanizmi kojima se ostvaruje ovo za normalno

funkcionisanje imunskog sistema veoma važno iskazivanje

monospecifičnih BCR i TCR receptora podrazumevaju alelsku ekskluziju

i ekskluziju Ig L izotipa.

Oba mehanizma su specifična za imunski sistem i događaju se

isključivo u slučaju gena koji kodiraju BCR(Ig) i TCR polipeptidne lance.

Alelska ekskluzija obezbeđuje da se u svakom pojedinačnom B

limfocitu prilikom razvića preuređuju genski segmenti samo u jednom

od dva nasleđena IgH, odnosno samo u jednom od dva nasleđena IgLκ

ili IgLλ genska lokusa. Uporedo, ekskluzija Ig L izotipa blokira

istovremeno preuređenje oba IgLκ i IgLλ lokusa, već dozvoljava samo

jedno. Slično tome, alelska ekskluzija obezbeđuje da se u svakom

pojedinačnom T limfocitu tokom razvića preuređuje i iskazuje samo

jedan od dva nasleđena TCR α, odnosno samo jedan od dva nasleđena

TCR β lokusa.

MHC

Molekuli MHC su u početku otkriveni i opisani kao veoma

polimorfni molekuli ćelijskih membrana koji su odgovorni za imunsko

odbacivanje transplantiranih organa i tkiva kod jedinki iste životinjske

vrste. Stoga su nazvani alotransplantacijski antigeni.

Docnije, međutim, utvrđeno je da im glavna uloga nije u ometanju

uspešnog rada transplantacijskih hirurga, već da su MHC molekuli

neophodni za prepoznavanje proteinskih antigena od strane T limfocita.

Bez njihove pomoći T limfociti jednostavno ne mogu da “vide”

proteinske molekule i stoga je imunski odgovor na većinu proteina

uslovljen i kontrolisan MHC molekulima.

Glavna funkcija MHC molekula je da usmere T limfocite na one

ćelije u organizmu koje prikazuju proteinske antigene na svojoj

ćelijskoj membrani u vidu peptidnih fragmenata vezanih za njih kao

kompleks MHC-peptid.

Ovo jedinstveno svojstvo T limfocita biološki je veoma važno zato

što omogućuje precizno usmeravanje aktivisanih T limfocita na mesto

gde se prepoznavanje odigralo. Kao što je, na primer, usmeravanje

citotoksičkog TC limfocita direktno na ćeliju inficiranu virusom koju

selektivno treba da ubije ostavljajući ostale neinficirane ćelije na miru.

Iskazivanje MHC molekula na ćelijskoj membrani je različito za

MHC molekule klase I ili klase II.

Kod ljudi praktično sve ćelije sa jedrom, uključujući i trombocite,

normalno iskazuju na svojoj membrani MHC molekule klase I. To je i

biološki potpuno razumljivo s obzirom na to da mnoge vrste ćelija

mogu biti inficirane virusima što treba signalisati citotoksičkim TC

limfocitima zaduženim da inficirane ćelije eliminišu.

Za razliku od MHC molekula klase I, MHC molekule klase II

normalno iskazuju samo ćelije koje imaju posebnu ulogu u imunskom

sistemu da prikazuju proteinske antigene pomoćničkim TH limfocitima,

a to su APC (od engl. Antigen Presenting Cells) tj. ćelije koje prikazuju

antigen.

Količina iskazanih MHC molekula bitno utiče na odgovor T

limfocita. Tako na primer, virusom inficirane ćelije u kojima ju virus

poremetio sintezu i/ili membransko iskazivanje MHC molekula klase I,

postaju teško prepoznatljive za specifične antivirusne citotoksičke TC

limfocite, i ovi ih stoga ne mogu pronaći niti uništiti. Faktori koji

indukuju ili stimulišu sintezu i membransko iskazivanje MHC molekula

igraju važnu ulogu u kontroli i regulaciji imunskog odgovora. Među

njima najvažniji je citokin gama-interferon (IFNγ). IFNγ povećava

iskazivanje MHC molekula klase I u gotovo svim ćelijama.

MHC geni takođe određuju potencionalnu sposobnost imunskog

sistema da prepozna i odgovori na neki određeni protein. Oni to čine

preko uloge koju MHC molekuli igraju u oblikovanju receptorskog

repertoara T limfocita procesom pozitivne selekcije prilikom sazrevanja

T limfocita u timusu. Na taj način MHC geni kontrolišu imunsku

reaktivnost neke jedinke na proteinske antigene, i u tom smislu oni

funkcionišu kao geni imunskog odgovora.

Geni koji kodiraju MHC molekule klase I i klase II smešteni su u

sklopu glavnog kompleksa gena histokompatibilnosti zvanog MHC

(od engl. Major Histocompatibility Complex), koji se kod čoveka

naziva HLA (od engl. Human Leukocyte Antigen) kompleksom. Bitna

im je karakteristika da su izuzetno polimorfni što podrazumeva da u

populaciji neke životinjske vrste postoji izuzetno velik broj, čak

stotinu i više, alela, odnosno alternativnih oblika istog gena, kao i da

je učestalost svakog alela u nekoj populaciji relativno velika.

Jedinka može imati isti alel na MHC genskim lokusima oba

hromozoma, kada se za nju kaže da je homozigotna, ili može imati

različite alele na svakom od hromozoma kada je heterozigotna.

Većina ljudi, naravno, su heterozigoti, a samo su jednojajni blizanci

homozigoti.

Izuzetna polimorfnost MHC molekula klase I i klase II nađena je u

svim životinjskim vrstama koje su u tom cilju ispitivane. Smatra se da

je polimorfnost nastala evolucijom, i da se održava u svakoj vrsti

prirodnom selekcijom s ciljem da jedinke date vrste kao celina mogu na

svojim ćelijama iskazivati veliki broj različitih MHC molekula sposobnih

da vežu mnoge različite peptidne fragmente. Na taj se način bitno

smanjuje opasnost da mutacijama mikroba nastanu mikrobski peptidi

koji se neće moći vezati za MHC molekule prisutne u genomu neke

životinjske vrste.

MHC molekul klase I sastoji se od dva posebna nekovalentno

spojena polipeptidna lanca. Jedan od njih je transmembranski α lanac

klase I kodiran polimorfnim MHC genima klase I, dok je drugi mali

ekstracelularni protein zvan β2-mikroglobulin koji kodira nepolimorfni

gen koji nije u MHC kompleksu.

U HLA kompleksu čoveka, postoje tri genska lokusa zvana HLA-A,

HLA-B i HLA-C. U njima su smešteni MHC geni klase I koji kodiraju tri

tipa α lanaca klase I.

Svaki tip α lanca poseduje tri ekstracelularna domena nazvanih α1,

α2 i α3. Domeni α1 i α2 čine N-terminalni ekstracelularni region koji

formira udolinu za vezivanje peptidnog fragmenta. Domen α3

homologan je Ig domenu, slično kao i β2-mikroglobulin.

Shematski prikaz MHC molekula klase I

ĆELIJSKA MEMBRANA

α1 domen

Udolina zavezivanjepeptida

α lanac

α2 domen

Vezanipeptid

α3 domenβ2 mikroglobulinS

S

S

S

S

SIg domen

Transmembranski domen

MHC molekul klase II je heterodimer koji se sastoji od dva

nekovalentno spojena transmembranska polipeptidna lanca, od α i β

lanaca klase II. Lanci su kodirani polimorfnim MHC genima klase II.

U HLA kompleksu čoveka postoje nekoliko MHC lokusa klase II, od

kojih su najvažniji lokusi HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR. Svaki lokus sadrži

polimorfne gene koji kodiraju najmanje jedan α lanac i najmanje jedan

β lanac.

Lanci poseduju po dva ekstracelularna domena: Ig domenu

homologne domene zvane α2 i β2, kao i N-terminalne α1 i β1 domene

koji formiraju udolinu za vezivanje peptidnog fragmenta.

Shematski prikaz MHC molekula klase II

α1 domen β1 domen

β lanac

Vezani peptid

α2 domen β2 domenS

S

S

S

ĆELIJSKA MEMBRANA

S

SIg domen

Transmembranski domen

Udolina zavezivanjepeptida

α lanac

Interakcijom α1 i α2 domena α lanca klase I oblikuje se udolina za

vezivanje peptida na MHC molekulu klase I. Udolina ima dno i bočne

zidove. Dno formiraju osam antiparalelnih niti β-nabrane ploce, a bočne

zidove čine dve paralelne α-spirale. Četiri niti β-nabrane ploče i jedna od

α-spirala sastoje se od amino kiselina α1 domena, dok se preostale četiri

niti β-nabrane ploče i druga α-spirala sastoje od amino kiseline α2

domena. Udolina je zatvorena na oba svoja kraja što, kao i njena

veličina, uslovljava da se preferencijalno vezuju peptidi veličine od 8 - 12

amino kiselina.

Shematski prikaz udoline za vezivanjepeptida MHC molekula klase I

α2

C

α1Ν

N N-terminalni kraj lanca

β-ploča

C C-terminalni kraj lanca

α spiralaα spirala

peptid

Polimorfne amino kiseline u MHC molekulu klase I, tj. one

varijabilne amino kiseline na osnovu kojih se razlikuje jedan alelski oblik

α lanca od drugih, odgovorne su kako za razlike u sposobnosti različitih

alelskih oblika MHC molekula klase I da vezuju različite peptide, tako i

za specifičnost kojom se TCR T limfocita vezuje za MHC molekul.

Zbog toga se gotovo sve polimorfne amino kiseline α lanca nalaze u

udolini i prostorno su tako orijentisane da su im bočni lanci usmereni

kako prema unutrašnjosti udoline gde se peptid vezuje, tako i prema

vrhu α-spirala da budu dostupni TCR receptoru. Peptidni fragment koji

leži u udolini u molekulskom kontaktu sa dnom i bočnim zidovima ima

posebne amino kiseline za kontakt sa MHC molekulom, a takođe i

posebne amino kiseline koji strče iz udoline za specifično vezivanje za

TCR.

Isti MHC molekul klase I sposoban je da veže mnoštvo peptida

različitog aminokiselinskog redosleda. Međutim, različiti “specifični

džepovi” duž udoline obezbeđuju da svaka alelska forma MHC molekula

vezuje i prikazuje sebi svojstvenu grupu peptida. Na taj način, različiti

tipovi MHC molekula klase I u nekoj jedinki mogu vezivati i prikazivati

širok spektar stranih peptida T limfocitima, iako to oni verovatno čine

na različit način u svakoj pojedinačnoj jedinki.

Vezivanje peptidnog fragmenta za MHC molekul se značajno

stabilizuje interakcijom T limfocita specifičnog za peptid i kompleksa

MHC-peptidni fragment. Ova stabilizacija time što sprečava recikliranje

kompleksa je važna prilikom aktivacije T limfocita.

Udolinu za vezivanje peptidnog fragmenta u MHC molekulu klase II

oblikuju svojom interakcijom α1 i β1 domeni α i β lanaca klase II. Ona

je kako strukturno tako i funkcionalno veoma slična udolini MHC

molekula klase I. Ima dno sačinjeno od antiparalelnih niti β-nabrane

ploče i bočne zidove koje čine α-spirale. Četiri niti β-nabrane ploče i

jednu α-spiralu formira α1 domen, a preostale četiri niti β-nabrane

ploče i drugu α-spiralu formira β1 domen. Polimorfne amino kiseline α i

β lanaca klase II koncentrisani su u regionu koji vezuje peptid i

pretežno oblažu udolinu.

MHC molekuli ne prave razliku između peptidnih fragmenata

poreklom od stranih ili od sopstvenih proteina, već ih na podjednak način

vezuju. Sopstveni peptidni fragmenti vezani za sopstvene MHC molekule

su od ključnog značaja prilikom pozitivne i negativne selekcije u timusu u

toku sazrevanja T limfocita.